专利名称：抗过敏的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对过敏反应的预防和治疗有用的抗过敏组合物，特别是以具有高抗过敏活性的乳酸菌为有效成分的抗过敏用组合物，以及该乳酸菌的获得方法，此外还涉及该抗过敏用组合物作为食品及饮料等的应用。
背景技术：
过敏是发达国家中患病率最高的疾病之一。通常将过敏的发病机制分为I型～IV型4种。I型过敏与IgE抗体有关，以花粉病、哮喘、荨麻疹、过敏性休克等为代表。II型过敏与IgG抗体、IgM抗体有关，是活化补体系统而致的细胞毒性反应，胎儿骨髓成红细胞增多症和自身免疫性溶血性贫血属于这一类型。III型过敏是由抗原抗体复合物引起的组织伤害反应，以Alex反应和血清病、肾小球肾炎为代表。IV型过敏是迟发性过敏(迟发型过敏反应)，与T细胞有关，以结核菌素反应和和接触性皮炎为代表。其中，I型、II型及IV型与食物过敏的发生有关。另一方面，环境过敏，即花粉病、特异性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等过敏主要是I型的发病机制。
上述I型过敏反应以过敏原特异的IgE的诱导和组胺、白三烯等化学介质的释放为特征。免疫应答是各种细胞间的相互作用而产生的，辅助性T细胞(Th)是与此相关的细胞中的一种。辅助性T细胞属于T细胞亚群，其作用是识别抗原，产生各种细胞因子(辅助性因子)，调节免疫应答的诱导。根据其产生细胞因子的能力将辅助性T细胞分为Th1细胞和Th2细胞。IL-4、IL-5、IL-13等Th2细胞因子对引起B细胞的抗体类别转换、产生IgE抗体等是必要的。实际上，已经知道过敏患者的淋巴细胞中Th2细胞增加。外源侵入的过敏原由树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞，以其一部分与MHCII分结合的形式呈递给T细胞，使Th2细胞活化、分化。Th2细胞释放的Th2细胞因子可诱导B细胞类别转换、产生IgE抗体，IgE抗体与组织内的肥大细胞和血中的嗜碱性细胞表面的FcR结合。当过敏原第二次侵入机体时，被结合于肥大细胞和血中嗜碱性细胞表面的IgE抗体识别，与IgE抗体间形成架桥。这种刺激作为一触发点，使肥大细胞和嗜碱性细胞爆发性释放化学介质，呈现各种过敏症状。
预防、治疗由IgE和化学介质介导的过敏的方法有，例如通过拮抗性结合的方式与组胺受体结合从而阻碍来源于末梢神经的信号传导的抗组胺剂，通过减弱化学介质产生细胞的活性而减轻症状的抗过敏剂，通过减弱免疫反应性而减轻炎症的类固醇剂，通过定期注射过敏原诱导耐受的减敏疗法等。但是，任何一种都存在副作用，且效果也并不确定。
近年，为抑制IgE调节Th2细胞因子产生的方法受到关注。有报道，结核菌、溶血性链球菌、乳酸菌等某些细菌通过增强Th1免疫、抑制Th2免疫，结果降低IgE(临床免疫、1999年、第32卷、454页；International Archives of Allergy and Immmunology、1998年、第115卷、278页；特开平9-2959号公报)。
其中，从安全性方面考虑，乳酸菌易于用于食品等，是有用的材料。但是，对于乳酸菌而言，并不是所有的乳酸菌都具有增强Th1免疫的效果，必须选择有用的菌株。作为抗过敏乳酸菌，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)LGG株众所周知，有报道通过孕妇摄取，可抑制胎儿的特异性皮炎(Lancet(柳叶刀)、2001年、第357卷、1076页)。用乳酸菌作为抗过敏剂的应用也有几篇专利公报。例如，特开平9-2959号公报中公开了用乳酸菌作为抗过敏剂应用，其中添加嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、短乳杆菌(L.Brevis)、布氏乳杆菌(L.Buchnerii)、及干酪乳杆菌(L.casei)等乳酸菌培养小鼠淋巴细胞时IgE产量为30ng/ml以下；特开平10-309178号公报中公开了用婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium.infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium.breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium.longum)及两歧双歧杆菌(Bifidobacterium.bifidum)等双歧杆菌作为特别治疗食物过敏的抗过敏剂应用，及特开2000-95697号公报中公开了用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus leuteri)等乳酸菌作为过敏性支气管哮喘、过敏性鼻炎及特异性皮炎等I型过敏的抑制剂应用等。
另一方面，乳酸菌等增强Th1免疫就意味着通过产生IL-12和IFN-γ等活化巨噬细胞和杀伤性T细胞、NK细胞等细胞性免疫，从而对抗病毒和细菌感染、癌的产生等。具体而言，巨噬细胞产生的IL-12可通过促使未分化的辅助性T细胞向Th1细胞分化，活化单核巨噬细胞·NK细胞，而获得对外源敌、癌的抵抗性。因此，这提示可诱导产生强IL-12的乳酸菌株可作为免疫活性剂使用(Cancer ImmunologyImmunotherapy，vol.49，p.157，2000；特开平7-228536号公报；特开2002-80364号公报)。
另外，由于乳酸菌活着到达肠道才发挥各种各样的效果，所以有必要耐受胃酸、胆汁酸等消化液(Symposium on Intestinal Flora 3，“Intestinal Flora and probiotics”，Gakkai Shuppan Center，p.41-55，edited by Tomotari Mitsuoka 1998)。另外，已知对肠道粘附性高的乳酸菌能逗留在肠道充分发挥其效果。因而，当经口摄取乳酸菌时优选该乳酸菌不仅功能性高而且能活着到达肠道。
近年认为因特异性皮炎和花粉病等过敏引发体质变化的人很多，成为社会问题。其中尤其对症状严重的患者使用各种药剂进行治疗。但是，实际情况是，大部分患者治疗不到一个完整的疗程，为了保证日常生活的基础上，他们进行包括民间疗法在内的对症疗法。
鉴于这种状况，最近在积极开展通过食物抑制过敏的研究。结果在多种饮食品的成分中，例如日本罗勒油和鱼油、特殊的茶多酚等发现抗过敏效果，用它们来进行治疗。
已知具有抗过敏效果的饮食品的成分与上述特定乳酸菌有相似的效果，应用该乳酸菌的酸奶和乳酸菌饮料，已作为具有抗过敏效果的饮食物部分进行了开发。用这类抗过敏用饮食品进行预防或治疗可在安全且温和的条件下摄取，但有必要每日连续摄取，且有必要以能消化的量每日连续摄取以发挥作用。但是，目前为止，由于筛选、获得具有高抗过敏活性菌株的方法尚未明确，还未获得满意的菌株，不能满足实际应用。再者，传统上乳酸菌的使用中，象酸奶和乳酸菌饮料中那样，将用乳酸菌发酵作为主要目的，而将抗过敏作用置于次要地位；再者，对于酸奶和乳酸菌饮料，由于其必须在冷冻条件下运输，且大多数不能长期保质，可操作的自由度少等问题，所以作为每日可连续摄取的能有效预防或治疗过敏的饮食品并不尽如人意。因而目前迫切需要开发满足这些条件、有效的抗过敏用组合物，及应用它们的饮食品等。
本发明的目的在于提供对过敏的预防、治疗有用的抗过敏用组合物，特别提供以具有高抗过敏活性的乳酸菌为有效成分的抗过敏用组合物，及该乳酸菌的获得方法，此外还提供具有抗过敏功能的食品及饮料等。这里所说“具有抗过敏功能”是指能发挥过敏的预防、治疗效果，和/或能改善、缓和过敏症状。
本发明者以预防、治疗花粉病、特异性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎等环境过敏为目的，对其有效成分进行了探索。首先，从安全性方面考虑着眼于乳酸菌，进行了深入研究，结果通过筛选出能阻碍Th2活化、适当平衡Th1活化的乳酸菌，发现可获得具有高抗过敏活性的乳酸菌，由此完成了本发明。
也就是说，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌的获得方法，其特征在于，它是着眼于Th1/Th2平衡的方法。传统的方法是通过测定IgE来评价抗过敏活性，虽然IgE与过敏的关系勿庸置疑，但另一方面，例如正如已知的遗传性过敏性患者中有IgE高的人也有IgE低的人一样，IgE的程度并不能说明一切。已知除IgE以外，过敏的发病与嗜酸性细胞增加和引起淋巴细胞局部浸润的趋化因子的释放等多种事件综合相关。因此，本发明以能综合说明IgE增加、嗜酸性细胞增加和趋化因子的Th1/Th2平衡为着眼点，以该平衡为指标，通过开发评价、分离抗过敏性菌株的方法，成功获得了具有高抗过敏活性的乳酸菌。
本发明的抗过敏用组合物包括能特别平衡作为Th2活化指标的白细胞介素4(IL-4)及作为Th1免疫活化指标的白细胞介素12(IL-12)的生成量的乳酸菌为有效成分的抗过敏用组合物将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌(L.paracasei)KW3110株作为待检乳酸菌时相同，或是白细胞介素12的产量为用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。本发明中，具有上述本发明的抗过敏活性的乳酸菌包括以与KW3110株相比，白细胞介素12的产量为其70％以上的乳酸菌；白细胞介素12的产量达其70％以上且白细胞介素4的产量不到其40％的乳酸菌为活性成分的乳酸菌。此外，本发明中获得的具有抗过敏活性的乳酸菌还包括以与KW4110、KW3925、KW3926的抗过敏活性相比，其抗过敏活性同等或高于KW4110的乳酸菌；抗过敏活性等同或高于KW3925的乳酸菌；抗过敏活性等同或高于KW3926的乳酸菌为活性成分。
本发明还包括具有高抗过敏活的乳酸菌的获取方法，该乳酸菌是本发明的抗过敏用组合物的有效成分。此外，本发明还包括本发明的抗过敏用组合物的在饮食品中的利用，及通过制剂化，作为经口施用的抗过敏剂的利用。本发明的抗过敏用组合物的有效成分之一类干酪乳杆菌KW3110株是能耐受消化液、对肠道的附着性高的乳酸菌，作为抗过敏剂经口施用时尤能发挥优良效果。
本发明中作为抗过敏用组合物的有效成分使用的类干酪乳杆菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110，根据专利程序中微生物保藏的布达佩斯条约，以FERM BP-08634保藏在作为国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所所特许生物保藏中心。
本发明的抗过敏用组合物的在饮食品中的利用包括，特别提供本发明的抗过敏用组合物的有效成分—具有高抗过敏活性的乳酸菌用于茶饮料类的饮料，使之成为具有抗过敏功能的饮料。本发明的具有抗过敏功能的饮料可以制备成味道好，保质期长，可每天连续摄取的形式，且所述可连续摄取的量是可以发挥作用的量。本发明中具有高抗过敏活性的乳酸菌，可应用加热杀菌等处理进行杀菌，例如可通过将本发明中的乳酸菌加热杀菌后添加到已灭菌的密封容器中制备成饮料商品，使保持饮料自身的香味、保持饮料制品的稳定性、且具有抗过敏功能。而且，制备装入密封容器的饮料时，可通过调整所用乳酸菌的浓度而制备成保持抗过敏功能、且增加饮料保持自身香味的功能、味道好、保质期长的饮料。从抗过敏作用及制品的保存、稳定性观点来考虑，本发明不包括乳成分，也就是说，特别优选各种类型的非乳饮料，例如包含果汁的清凉饮料或茶饮料等非乳饮料。
本发明的抗过敏用组合物在饮食品中的利用，可联合应用2种以上根据本发明而获得的具有高抗过敏活性的乳酸菌。此时，可根据各饮食品和乳酸菌而调配各种组合或配比量。此外，也可配合或联合应用其它抗过敏用组合物。
发明内容
也就是说，本发明提供抗过敏用组合物(权利要求1)，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。权利要求1的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的75％以上(权利要求2)。权利要求1或权利要求2的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的40％(权利要求3)。权利要求1～3任一权利要求的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与周类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的75％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的40％(权利要求4)。权利要求1～4任一权利要求的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的80％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的30％(权利要求5)。抗过敏用组合物，其特征在于，所述的如权利要求1～5任一项中所述的小鼠脾脏由来淋巴细胞的白细胞介素12及白细胞介素4生成量的乳酸菌为类干酪乳杆菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110株、植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)KW4110株、类干酪乳杆菌KW3925株、类干酪乳杆菌KW3926株或唾液链球菌(Streptococcus.salivarius)KW3210(权利要求6)。提供抗过敏用组合物，其有效成分是类干酪乳杆菌KW3110株，该菌株显示权利要求1～5任一项中小鼠脾脏由来淋巴细胞的白细胞介素12及白细胞介素4生成量、且耐受消化液、对肠道的附着性高(权利要求7)。权利要求1～7任一项中的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的过敏为花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎(权利要求8)。权利要求8的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的抗过敏用组合物为药物(权利要求9)。权利要求8的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的抗过敏用组合物为饮食品(权利要求10)。
另外，本发明包括具有高抗过敏活性的乳酸菌的获得方法，其特征在于，分离出具有以下效果的乳酸菌将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％(权利要求11)。具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，用培养基培养根据权利要求11的方法分离出的乳酸菌，使之增殖(权利要求12)。权利要求12的具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，确认用培养基培养、增殖了的乳酸菌的抗过敏活性(权利要求13)。权利要求13的具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，所述的增殖了的乳酸菌的抗过敏活性的确认是通过将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，测定白细胞介素12及白细胞介素4的产量进行(权利要求14)。装入密封容器的药品或饮食品的制造方法，其特征在于，将根据权利要求12～14任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法而制备的乳酸菌配合药品或饮食品，填充到容器中，进行密封(权利要求15)。过敏疾病的预防和/或治疗方法，其特征在于，将权利要求1～10任一项中的抗过敏用组合物用于过敏疾病的预防和/或治疗的处理(权利要求16)。权利要求16的过敏疾病的预防和/或治疗方法，其特征在于，所述的过敏性疾病为花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎(权利要求17)。权利要求1～10中任一项抗过敏用组合物的在过敏性疾病的预防和/或治疗中的应用(权利要求18)。权利要求18的抗过敏用组合物的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病的预防和/或治疗是指花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎的预防和/或治疗(权利要求19)。
此外，本发明还包括具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，添加权利要求1～7任一项中具有抗过敏活性的乳酸菌作活性成分(权利要求20)。权利要求20的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，每日摄取的饮食品中可含有5×109个以上具有抗过敏活性的乳酸菌(权利要求21)。权利要求20或21的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，所述的饮料或食品不包含成为过敏的原因的成分(权利要求22)。权利要求22的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，所述的饮料或食品是不包含成为过敏原成分的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、或饮料剂(权利要求23)。权利要求20～21任一项中具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，应用灭菌了的乳酸菌(权利要求24)。具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，添加权利要求1～7任一项中具有抗过敏活性的乳酸菌作活性成分(权利要求25)。权利要求22中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的饮料是不含乳成分的装入密封容器的饮料(权利要求26)。权利要求25或26中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的饮料是装入密封容器的果汁清凉饮料或茶饮料(权利要求27)。权利要求25～27任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的装入密封容器的饮料中添加的乳酸菌是每100g饮料109～1011个乳酸菌的范围(权利要求28)。权利要求20～28任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的添加的乳酸菌为类干酪乳杆菌KW3110或其突变株(权利要求29)。权利要求20～29任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的食品或饮料作为健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品进行制备(权利要求30)。具有抗过敏功能的装入密封容器的饮食品的制造方法，其特征在于，在基本上无菌状态下，向灭菌的食品或饮料中配合权利要求1～7任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌、或其经过杀菌的乳酸菌，填充到容器，密封(权利要求31)。乳酸菌的抗过敏活性的测定方法，其特征在于，将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏由来淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养，测定培养时产生的白细胞介素12和/或白细胞介素4的量(权利要求32)。权利要求32所述的乳酸菌抗过敏活性的测定方法，其特征在于，添加待检乳酸菌进行培养所产生的白细胞介素12和/或白细胞介素4的量，与应用类干酪乳杆菌KW3110株的情况进行比较，从而进行评价(权利要求33)。抗过敏剂，其特征在于，向权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌中添加载体、赋形剂和/或其它辅助剂，制剂化(权利要求34)。由权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌制备的药品(权利要求35)。具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，用权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制备的或含有乳酸菌的饮料或食品(权利要求36)。具有抗过敏功能的饮料或食品的制造方法，其特征在于，用权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制备的或含有乳酸菌的饮料或食品的乳酸菌(权利要求37)。
本发明包括具有高抗过敏活性的乳酸菌作有效成分的抗过敏用组合物，该乳酸菌能特异平衡作为Th2活化指标的白细胞介素4(IL-4)及作为Th1免疫活化指标的白细胞介素12(IL-12)的生成量。
(本发明的有效成分乳酸菌)本发明的有效成分-具有高抗过敏活性的乳酸菌是具有以下效果的乳酸菌将用卵清蛋白(以下，简作“OVA”)致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含OVA的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，作为待检乳酸菌，其白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时同等或是其60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。作为更优选的本发明的有效成分，上述乳酸菌的特征为将用OVA致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含OVA的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同或是其75％以上。此外，作为优选的本发明的有效成分，上述乳酸菌的特征为将用OVA致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含OVA的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的40％。
本发明中具有高抗过敏活性的乳酸菌，其最优选的实施方案是将用卵清蛋白(以下，简作“OVA”)致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含OVA的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，作为待检乳酸菌，其白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同或是其80％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的30％。
作为本发明中有效成分应用的具有高抗过敏活性的乳酸菌的获得方法是分离出具有以下功效的乳酸菌将用过敏原致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含该过敏原的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，作为待检乳酸菌，其Th1诱导细胞因子产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同或是其60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。也就是说，可通过分离出具有以下功效的乳酸菌而获得应用众所周知的乳酸菌菌株或新分离出的乳酸菌菌株，将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含OVA的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，基本上，作为待检乳酸菌，其白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同或是其60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。如前所述，作为本发明有效成分应用的乳酸菌，业内人士可很容易的筛选获得可通过进行体外评价抗过敏活性的实验方法，根据本发明的指标，从各种公知的或新分离的乳酸菌中获得。详细的情况如实施例1中所述。
作为本发明有效成分应用的具有高抗过敏活性的乳酸菌，例如类干酪乳杆菌KW3110株、干酪乳杆菌L14株，可从日本乳业技术协会购入。根据日本乳业技术协会的所述，L14株即干酪乳杆菌，这是本发明者们应用QUALICON公司制RiboPrinter，用RFLP(限制性片段长度多态性)及AFLP(扩增片段长度多态性)进行分析，该株即为类干酪乳杆菌，所以本发明中记做类干酪乳杆菌(L.paracasei)。本发明中作为抗过敏用组合物的有效成分使用的类干酪乳杆菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110，也可如上所述从日本乳业技术协会购入，此外，根据专利程序中微生物保藏的布达佩斯条约，它以FERM BP-08634保藏在作为国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所所特许生物保藏中心。
另外，作为本发明中抗过敏用组合物的有效成分使用的植物乳杆菌KW4110株可作为植物乳杆菌JCM1149株、类干酪乳杆菌KW3926株可作为类干酪乳杆菌JCM8132株从JCM(Japan Collection ofMicroorganisms，RIKEN)购入，以及类干酪乳杆菌KW3925株可作为类干酪乳杆菌NRIC1917株从NRIC(东京农业大学)购入。
筛选作为本发明有效成分应用的乳酸菌时，可筛选除抗过敏作用外，还具有传统已知的益生菌功能，如对于大多数乳酸菌而言的调整肠道作用、降低胆固醇作用、降压作用等的乳酸菌。另外，经口施用本发明的有效成分乳酸菌时，由于乳酸菌逗留在肠道能充分发挥其功效，所以将根据以上述标准选择获得的乳酸菌，再对来源于人肠道的细胞系Caco-2进行体外粘附性试验，筛选出具有更高黏附能力的细胞，从而获得有效性更高的乳酸菌。本发明有效成分之一的类干酪乳杆菌KW3110株是对消化液有抗性、对肠道的粘附性高的乳酸菌，作为抗过敏剂经口施用时，能特别发挥上述优良效果。
本发明的有效成分乳酸菌，在M.R.S.(de Man，Rogosa，Sharpe)培养基等业内人士已知的乳酸菌培养用培养基中进行适当培养、增殖后，活菌或灭菌处理，必要时可进行冷冻干燥或喷雾-烘干粉末化后，可作为本发明组合物的有效成分使用。另外，为了进行工艺管理，必要时，可测定所得乳酸菌菌体的抗过敏活性。作为该抗过敏活性的测定方法，是将用过敏原致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含过敏原的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，测定所产生的Th1诱导细胞因子和/或Th2诱导细胞因子的量。
本发明中也可对用本发明的方法获得的具有高抗过敏活性的乳酸菌进行突变，制备、应用抗过敏活性等高的突变株。作为菌株突变的手段，可应用UV等公知的突变手段，例如用突变手段对具有高抗过敏活性的乳酸菌KW3110株进行突变，应用本说明书中记载的乳酸菌抗过敏活性的评价方法，而获得、应用抗过敏活性增加或其它特性发生突变的具有优选特性的突变株。另外，也可对KW4110株、KW3210株、KW3925株、及KW3926株等进行突变应用。
(衍生株的选择)本发明中可将从本发明获得的乳酸菌株产生出的特征不同的菌株作为衍生株进行选择、应用。该菌株的选择方法以KW3110为例进行说明方法如下用MRS培养基样的培养基培养KW3110株，静置培养直至到达所定温度、所定菌数，用新鲜的MRS培养基希释培养液后，将本菌体悬浮液以10％的比例悬浮到用盐酸将pH调为3.0的PBS(以指定的浓度溶解Dainippoin Pharmacutical制的药片)中、37℃培养3小时。用PBS希释经酸处理的菌体悬浮液，转入MRS平板培养基中，使之形成菌落。以颜色为指标选择所形成的菌落，再从根据颜色选择出的菌落中选择1株，用MRS培养基培养48小时。用本发明的抗过敏活性的测定法(实施例2的方法)测定该培养物的抗过敏活性，判定各菌落的抗过敏活性。通过该方法可从试验菌株中选择获得高抗过敏活性的菌株。本发明的实施例中，将分离出的菌株命名为No.90株，作为KW3110(Lactobacillus.Paracasei)株的衍生株，根据专利程序中微生物保藏的布达佩斯条约，以FERM BP-08635保藏在作为国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所所特许生物保藏中心。
(抗体的制备)本发明中，为了对本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌制品的质量管理和制造工艺进行管理，有必要分离、检测本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌，并进行其乳酸菌的鉴定和含有量的检查。为了分离、检测该乳酸菌可制备并应用抗体。作为能与本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌特异结合的抗体，具体的例子包括单克隆抗体、多克隆抗体等免疫特异性抗体。它们均可以上述乳酸菌作抗原用常规方法进行制备，但从特异性考虑，其中更优选单克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体的产生方法，可根据已知的方法进行。例如，可参照Koehler，G.及C.Milstein，Nature256,495-497(1975)、及Davis，B.，R.Dulbecco，H.Eisen，H.Ginsberg及W.Wood，Principles of Microbiology andImmunology第2卷、Harper & Row，New York，1973的方法。即，单克隆抗体的产生是，例如用本发明的乳酸菌免疫小鼠后，将该小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，由所得杂交瘤细胞产生抗体。应用与本发明的乳酸菌特异性结合的抗体检测本发明的乳酸菌时，可通过应用公知抗体的免疫学检测方法实施。作为该免疫学的测定方法，可列举如RIA法、ELISA法、荧光抗体法等公知的免疫学测定法。
(本发明的有效成分乳酸菌的抗过敏作用)过敏是，因抗原刺激而产生IgE抗体，IgE抗体与组织内的肥大细胞和血中的嗜碱性细胞表面的Fc受体结合。第二次抗原刺激(过敏原的再侵入)时，被结合于肥大细胞和血中的嗜碱性细胞表面IgE抗体识别，与IgE抗体间形成架桥。这种刺激作为一触发点，使肥大细胞和嗜碱性细胞爆发性释放化学介质，呈现各种过敏的症状。因此，为了进行过敏的治疗、预防有必要抑制IgE，为了该目的，有必要增强Th1免疫抑制Th2免疫。
本发明的乳酸菌，在应用小鼠淋巴细胞的体外体系中，能强有力的诱导作为Th1免疫指标的白细胞介素12(IL-12)的产生，且能强有力的抑制作为Th2免疫指标的白细胞介素4(IL-4)的产生。因此，本发明的乳酸菌，通过增强Th1免疫抑制Th2免疫，而抑制IgE抗体的产生，本发明的乳酸菌基于此作用机制而具有过敏的治疗、预防效果。
因而，本发明的抗过敏用组合物对花粉病、特异性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、支气管哮喘等环境过敏发挥特殊效力。此外，本发明中的乳酸菌，除具有上述抗过敏作用之外，还同时具备大多数乳酸菌所具有的调整肠道作用、降低胆固醇作用、降压作用等传统已知的益生菌功能。已确认本发明有效成分乳酸菌之一的KW3110株，除具有强力抗过敏、免疫刺激活性之外，还有很好的肠道细胞粘附性、对胃酸、胆汁酸的耐受性，再者，从前述的益生菌功能方面考虑，其效果也是令人期待的。
(本发明的抗过敏用组合物的施用)本发明的抗过敏用组合物，是将本发明的有效成分与生理学上许可的载体、赋形剂、结合剂、希释剂等混合，制剂化后，作为抗过敏剂应用的。本发明的抗过敏剂，可经口或非经口施用。作为经口服用的制剂，可列举颗粒剂、粉剂、片剂(包括糖衣片剂)、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂。作为非经口制剂，可列举注射剂(例如，皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、点滴剂、外用剂(例如，经鼻施用制剂、经皮制剂、软膏剂)、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)。这些制剂，可通过应用该领域中通常应用的手段，添加药学上许可的赋形剂、添加剂进行制剂化。进行制剂化时，为了使本发明的抗过敏组合物能在生物体内适时且有效地发挥其功能，优选控制开始溶出的时间、添加作为苦味掩蔽剂的功能、提高对氧和湿度的稳定性的形式，例如专利3349677中所述的用以酵母细胞壁为主成分的包被剂进行包被的包被处理物，和按照常规方法在软胶囊和硬胶囊中进行胶囊化而得的胶囊剂，在医药制剂和健康食品等可优选应用。作为药学上许可的赋形剂和添加剂，可列举载体、结合剂、香料、缓冲剂、增粘剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮化剂、防腐剂等。作为药学上许可的载体，包括，例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、砂糖、乳糖、胶质、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低融点石蜡、可可脂等。
制剂可如下制备。即，经口剂，作为有效成分，可添加，例如赋形剂(例如、乳糖、白糖、淀粉、甘露醇)、分解剂(例如、碳酸钙、羧甲基纤维素钙)、结合剂(例如、α-淀粉、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素)或润滑剂(例如、滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000)、压缩成形，然后根据需要，为了掩蔽味道、肠溶性或持续性等目的，可用公知的方法，通过包被等进行制备。作为包被剂，可应用，例如乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙二醇、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙邻苯二甲酸纤维素及eudragit(Rhom德国公司制、甲基丙稀酸丙稀酸共聚物)等。
注射剂的制备是，可将有效成分与分散剂(例如、吐温(Tween)80(Atlas Powder公司制、美国)、HCO60(Nikko Chemicals公司制)、聚乙二醇、羧甲基纤维素、藻酸钠等)、防腐剂(例如、羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲醇、氯丁醇、苯酚)、等渗剂(例如、氯化钠、丙三醇、山梨糖醇、葡萄糖、转化糖)一起溶解、混悬到水性溶剂(例如、蒸馏水、生理盐水、Ringer溶液等)或油性溶剂(例如、橄榄油、芝麻油、棉子油、玉米油等植物油、丙稀醇)等中进行乳化。此时，根据所希望的添加溶解辅助剂(例如、水杨酸钠、醋酸钠)、稳定剂(例如、人血清白蛋白)、无痛化剂(例如、氯化卞烷铵、盐酸普鲁卡因)等添加物。
外用剂的制备，可将有效成分制备成固体状、半固体状或液状的组合物。例如、上述固体状组合物的制备是，将有效成分直接、或添加赋形剂(例如、乳糖、甘露醇、淀粉、微结晶纤维素、白糖)、增粘剂(例如、天然树胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物)等，混合，制成粉状。上述液状组合物的制备可与注射剂时同样。半固体状的组合物可是水性或油性的胶剂、或油膏状。另外，这些组合物均可包括pH调节剂(例如、碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠)、防腐剂(例如、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、氯卞烷铵)等。栓剂，可将有效成分制备成油性或水性的固体状、半固体状或液状的组合物。该组合物中所用的油性基质包括，例如高级脂肪酸的甘油酯〔例如、可可脂、ウイテプヅル类(Dynamit Nobel公司制)〕、中级脂肪酸〔例如、Migliores类(Dynamit Nobel公司制)〕、或植物油(例如、芝麻油、大豆油、棉子油)。水性基剂包括聚乙二醇类、丙乙二醇。另外，作为水性胶质基剂，包括天然胶类、纤维素衍生物、乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物。
(配合饮食品的利用)本发明的抗过敏用组合物可配合饮食品作为具有抗过敏功能的饮食品应用。将本发明的抗过敏用组合物配合饮食品应用时，可在饮食品的制造原料阶段或制造出产品阶段等添加、配合该有效成分的有效量。这里所述的“有效成分的有效量”是指，对于不同的饮食品，当摄取常规饮食量时，所摄取的有效成分的含量在下述范围内。
也就是说，本发明中有效成分在饮食品中的有效量的施用量或摄取量的确定有赖于受试者、受试者的年龄及体重、症状、施用时间、剂形、施用方法、药剂的组合等。例如，当本发明的有效成分作为药品经口施用时，每个成人0.1～100mg/kg体重(优选1～10mg/kg体重)，非经口施用时0.01～10mg/kg体重(优选0.1～1mg/kg体重)，一日分1～3次施用。与本发明的有效成分联合应用的具有其它作用机制的药剂，也要以其临床上的用量为基准，适当选择。
当用乳酸菌的菌数表示本发明的有效成分在饮食品中的有效量的施用量或摄取量时，优选每日的摄取量为5×109个以上，更优选每日1×1010个以上、最优选5×1010个以上。因而，要根据通常每日摄取的饮食品的量，确定各食品中所含有的乳酸菌的菌数。例如、作为食品(酸奶)摄取时，成人1人每日的摄取量为50～500g、优选60～200g的范围，可根据这样的摄取量将本发明的有效成分配合到食品中。
本发明中，本发明的抗过敏用组合物的有效成分可直接或以上述制剂的形式配合到食品中。更具体而言，本发明的饮食品可采用多种多样的利用形式可将本发明的有效成分与适宜原料配合，直接作为饮食品进行制备，或再配合各种蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类等，制备成液状、半液体状或固体状，此外也可添加、配合到一般的饮食品中。
目前，在利用乳酸菌的饮食品的领域中，根据其实用方案分类，可大致分为乳制品类、肉类、面包类、饮料、及蔬菜类。通过应用本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌作为这些利用乳酸菌的饮食品制造中的乳酸菌或其一部分，或作为制造出的饮食品的添加物，可赋予该饮食品抗过敏功能。
作为本发明的其它实施方案，当有效成分乳酸菌添加到饮食品中时，不必要考虑乳酸菌自身的发酵，且想保持饮食品自身的香味时，特别优选通过例如加热杀菌等处理对乳酸菌进行杀菌。另外，本发明的具有高抗过敏功能的饮食品，为了防止其它微生物和异物混入、保持内容物的品质，优选将饮食品病人装入密封容器中。
作为本发明的食品，可制备成保持抗过敏功能的健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品。另外，对食品的形式无特殊限定，也可以是保持抗过敏功能的饮料。由于本发明的有效成分具有抗过敏作用，所以通过将本发明的有效成分配合到日常摄取的食品中和作为补充而摄取的健康食品和功能性食品等中，即可提供可连续摄取、同时保持预防及治疗过敏发生功能的食品。通过将本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌配合到其中不含引发过敏成分的饮食品中，例如、茶类和饮剂或药片等，即可提供完全避免了过敏问题的具有抗过敏功能的饮食品。另外，本发明中，用本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌部分或全部代替用乳酸菌制造的或含乳酸菌的饮料或食品中的乳酸菌，即可得到具有高抗过敏功能的饮料或食品。
(饮食品制剂形式中的利用)本发明中，作为配合本发明的有高抗过敏活性乳酸菌的健康食品及功能性食品，可有各种各样的示例，与这些健康食品及功能性食品的制造相关的，除常用的食品素材、食品添加物之外，可在应用赋形剂、增量剂、结合剂、分解剂、润滑剂、分散剂、保存剂、湿润化剂、溶解辅助剂、防腐剂、稳定化材料、胶囊基剂等辅助剂的饮食品制剂形态中利用。该辅助剂的具体例示，包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、碳酸镁、合成硅酸镁、滑石、硬脂酸镁、碳酸钙、甲基纤维素、羧甲基纤维素、或其盐、阿拉伯胶、聚乙二醇、糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、柠檬酸、氯化钠、亚硫酸钠、磷酸钠、支链淀粉、角叉菜胶、糊精、还原巴拉金糖(palatinose)、山梨糖醇、木糖醇、stevia、合成甜味料、柠檬酸、维生素C、酸味料、碳酸氢钠、蔗糖酯、植物硬化油脂、氯化钾、红花油、蜂蜡、大豆卵磷脂、香料等。与这些健康食品、功能性食品的制备相关的，可参考药品制剂的参考书，例如“Practical guide of Japanese Pharmacopoeia(General rule onformulation)”(Hirokawa Shoten)等。
本发明中，特别与健康食品及功能性食品相适合的形状有，片状、胶囊状、颗粒状、粉末状、悬浮液状、乳化液状等，从本发明要解决的课题考虑，优选配合本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌的健康食品及功能性食品，联合应用了不含特定过敏原的原材料。
具体例示片状健康食品及功能性食品的制造法，包括可将配合了本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌的物质压成一定形状，或将用水或乙醇等溶剂湿润了的混合物灌注到具有一定形状的模具中，使之成型。具体例示胶囊状健康食品及功能性食品的制造法，包括将配合了本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌的物质，以液状、悬浮状、糊状、粉末状或颗粒状形态填充到胶囊中，或用胶囊基剂如硬胶囊剂及软胶囊剂等被包成型。
(向食品中的配合)另外，本发明中可通过将本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌配合到食品中而制备成持有抗过敏功能食品。具体而言，这样的食品多种多样，包括例如布丁、小甜饼、饼干、薯条、小点心、面包、蛋糕、巧克力、油炸圈饼、果冻等西点，煎饼、羊羹、大福(daifuku)、おはぎ、以及馒头、蛋糕等日本点心，冷点心(糖果等)、口香糖等面包、菓子类和、切面、荞麦面条、扁面条等的面类和鱼糕、火腿、鱼肉香肠等的鱼肉制品和、火腿、香肠、牛肉饼、牛肉罐头等的肉类食品和盐、胡椒、豆酱、大豆酱油、酱油、调味品、蛋黄酱、番茄酱、甜味佐料、辛味佐料等的调味类和软章鱼球(akashiyaki)、章鱼球(takoyaki)、半熟的黑绉绸样薄烤饼(monjayaki)开胃薄煎饼(okonomiyaki)等烧烤食品和奶酪、硬型酸奶等的乳制品和发酵豆、压制豆腐、豆腐、山药糊、泡菜饭团、鱼酱、饺子、烧麦、炸肉饼、三明治、比萨饼、汉堡包、色拉等各种制品和各种粉末(牛肉、猪肉、鸡肉等畜产物，虾、扇贝、蛤、海带等水产物，蔬菜水果类，植物、酵母、藻类等)和油脂类、香料类(香草、柑橘类、鲣鱼等)的粉末固体制品和粉末饮食品(速溶咖啡、速溶红茶、速溶奶粉、速溶汤粉、日本豆酱汤等)等各种食品，但并不限定于此。
特别地，乳制品中含有本发明的有效成分时，将本发明的有效成分以活菌形式加入到乳原料中，使菌增殖/发酵，可制成酸奶等发酵乳酸菌饮食品。
(向饮料中的配合)本发明的高抗过敏活性的组合物，特别是以饮料形式应用，可提供可每日连续摄取的具有抗过敏功能的饮料，且在连续摄取的可能摄入量范围内发挥功效。饮料中配合本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌时，为了制备保持饮料自身香味和稳定性的饮料，优选应用加热杀菌形式的乳酸菌。
饮料中配合本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌时，可适当决定乳酸菌的配合量，但通常采用的配合量是，作为饮料可连续摄取的摄入量范围内能充分发挥乳酸菌的抗过敏活性。用乳酸菌的菌数表示本发明有效成分在饮食品中的有效量的施用量或摄取量，优选每日的摄取量为5×109个以上，更优选每日1×1010个以上，最优选5×1010个以上。因此，通常依照每日摄取的饮料量，按照上述指标可确定出各种饮料中所含有的乳酸菌的菌数。例如，若每日摄取100g饮料，则优选每100g饮料中添加109个以上的菌。另一方面，考虑到乳酸菌的添加不破坏饮料的香味和外观，优选其用量在1011个以下。更优选5×1010个以下。因此，作为具有抗过敏功能且稳定性好，口味、保存性高的饮料的乳酸菌浓度，特别优选每100g饮料，109～1011个。乳酸菌菌体数与干菌重量的关系是，例如、对于类干酪乳杆菌KW3110株而言，菌体数为1012个时，相当于1g干菌的重量。
本发明中，配合本发明的有高抗过敏活性的乳酸菌的饮料各种各样，制备这些饮料时，可使用通常的饮料处方设计中所应用的糖类、香料、果汁、食品添加物等任一种。关于饮料的制造，可参考已有的参考书，例如“Revised new editionsoft drinks”(Kohrin)等。
本发明中，从抗过敏作用及制品的保存、安定化考虑，作为特别适于配合的饮料，优选不含乳成分，即，优选例如含果汁的清凉饮料或茶饮料等不含乳成分的饮料。
配合的饮料的具体例示包括，酒精饮料(威士忌酒、波旁酒、烈性酒、利口酒、葡萄酒、果酒、黄酒(清酒)、中国酒、白酒、啤酒、酒精度数1％以下的非酒精啤酒、发泡酒、充二氧化碳的白酒等)和非酒精饮料(饮用型酸奶、苹果、蜜桔、葡萄、香蕉、梨、李子、西瓜等果汁，土豆、胡萝卜、芹菜、黄瓜等蔬菜汁、清凉饮料、牛乳、豆乳、咖啡、可可粉、红茶、绿茶、麦茶、糙米茶、煎茶、玉露茶、焙烤茶、乌龙茶、姜黄茶、红茶、Rooibos茶、玫瑰茶、菊花茶、薄荷茶、茉莉花茶等的各种药草茶、运动饮料、矿泉水、营养饮料等)等各种饮料。
根据饮料类别进行例示的话，可列举绿茶、乌龙茶、红茶、麦茶、混合茶等茶系饮料和咖啡、果汁饮料、蔬菜饮料、运动饮料、营养饮料等。
本发明中，将具有抗过敏功能的饮料产品化时，可依照食品卫生法规定的方法，对饮料进行适当的杀菌。至于杀菌方法，可根据饮料的pH，使用巴斯德杀菌、热装杀菌、UHT杀菌、蒸馏瓶杀菌等方法。
此外，至于产品形式，特别优选常规产品形式中使用的密封容器形式，至于密封容器，可用罐、瓶、PET、纸容器任一种形式。另外，对于体积无特殊限制，通常从消费者对饮料的日常摄取量和、配合的乳酸菌的菌数和1日的必要菌数考虑，适当确定。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于此。
实施例1(本发明的实施例中应用的乳酸菌)本发明的实施例中应用的乳酸菌及获得如
图1(No.1)及图2(No.2)所示。本发明中所有的菌株均以KW开头的序号标识。这些试验株有的是独自分离的，有的是商品化的乳制品中使用的，有的从公共机关获得的，为了方便，统一了其识别名称。各KW株与获得来源间的关系如图1(No.1)及图2(No.2)。图1的“获得地”中，“JCM”代表Japan Collection of Microorganisms，“IFO”代表前财团法人发酵研究所(现在的独立行政法人制品评价技术机构生物资源中心(NBRC))。
实施例2(乳酸菌群体外抗过敏活性的评价)1.样品在M.R.S.(de Man，Rogosa，Sharpe)培养基(OXOID)中培养乳酸菌的各菌株48小时，用灭菌水洗涤3次，悬浮到灭菌水中后，100℃处理30分钟，杀菌。将之冷冻干燥，悬浮到PBS中。所使用的乳酸菌参照图1(No.1)及图2(No.2)。
2.实验动物、饲养在第0天和第6天，给7-10周龄BALB/c小鼠(Charles River)腹腔内注射卵清蛋白(OVA)1mg和佐剂Alum 2mg。第13天解剖，分离脾脏，制备淋巴细胞。实验中，n＝6。
3.脾细胞IL-4、IL-12的测定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)进行IL-4、IL-12的测定。
4.实验条件用RPMI1640(SIGMA)+10％FCS(Rosche)+1mg OVA培养基培养“2.实验动物、饲养”的方法中制备的脾脏淋巴细胞，混悬成2.5×106细胞/ml浓度。再添加0.1或1μg/ml的待试验的乳酸菌。1周后，回收培养上清，分别检测Th1型细胞因子IL-12和Th2型细胞因子IL-4。
5.实验结果各乳酸菌产生的Th1型细胞因子IL-12量如图3及表2所示。乳酸菌的添加量为1μg/ml。可以看到产量因菌株而异。大约100株菌中，显示最强Th1诱导能力的为类干酪乳杆菌KW3110株。数据都是以KW3110株产生的IL-12产量为100％时的比率表示。为了方便，把产量为KW3110株75％以上的评为A，50％以上～不到75％评为B，25％以上～不到50％评为C，10％以上～不到25％评为D，不到10％的评为E。
各乳酸菌产生的成为过敏原因的Th2型细胞因子IL-4的生成量如图4及表2所示。乳酸菌的添加量为0.1μg/ml。其抑制效果因菌株而异。约100株中显示最强的Th2抑制能力的为类干酪乳杆菌KW3110株。数据全是以对照(未添加乳酸菌)的IL-4产量为100％时的比率表示。为了方便，将产量为不到对照的30％的评为A，30％以上～50％的评为B，50％以上～不到70％评为C，70％以上～不到100％评为D，100％以上评为E。“抗过敏乳酸菌评价结果”如表1及表2所示，表中总结了Th1、Th2各自的参数A～E。
(表1)
(表2)
将Th1参数为KW3110株的60％以上、Th2参数为对照的50％以下的菌株作为抗过敏乳酸菌，这样的菌株有KW3110株、T株、NRIC1917株、JCM8132、JCM1149株共5株。另外，将为KW3110株的75％以上显示强大的Th1诱导能力的菌株作为免疫激活乳酸菌，这样的菌株有KW3110株、KW4510株、JCM1149株、T株、NRIC1917株、JCM1059株，共6株。这样，用本说明书所述的方法可制备免疫激活用组合物(药品、饮食品)，其中的乳酸菌是具有与KW3110株等同免疫激活活性的乳酸菌，或者具有与KW4510株、JCM1149株、NRIC1917株、JCM1059株等同或其以上免疫激活活性的乳酸菌。此外，作为抗过敏乳酸菌而知的嗜酸乳杆菌L-92株，其IL-12的产量为KW3110株的11.7％左右，对于IL-4的抑制活性，KW3110株为对照(无添加)的26.4％，与此相对L-92株为对照的74.6％，这提示无论哪个参数，与KW3110株这样强的抗过敏乳酸菌相比，均呈现绝对的劣势(图5)。本发明的乳酸菌株及对照乳酸菌株的抗过敏活性的测定结果如表3所示。
(表3)
实施例3(衍生株的选择)本实施例是从本发明获得的乳酸菌株KW3110株衍生出的菌株中选择具有抗过敏活性的菌株的例子。在MRS培养基中37℃静置培养KW3110株，直到其OD600值为0.8～1.0。
用新鲜的MRS培养基将培养液稀释成OD600＝0.5后，将本菌体悬浮液以10％的比例悬浮到用盐酸将pH调为3.0的PBS(以指定的浓度溶解Dainippoin Pharmacutical制的药片)中、37℃培养3小时。用PBS希释经酸处理的菌体悬浮液，转入MRS平板培养基中，使之形成菌落。可以看到所形成的菌落中有色淡的菌落。选择该菌落，用MRS培养基培养48小时。将该菌株命名为No.90株。用实施例2的方法测定No.90株的抗过敏活性。与野生株比较，No.90株产生IL-12的能力与之相同(图6)。图中“比活性(％)”是以KW3110株的IL-12产生能力为100时，衍生株(No.90)的IL-12产生能力。No.90株以FERM BP-08635保藏在独立行政法人产业技术总合研究所特许生物保藏中心。
实施例4(体外高抗过敏活性株KW3110株的体内评价)1.施用样品用MRS培养基培养类干酪乳杆菌KW3110株48小时，用灭菌水洗涤3次，悬浮到灭菌水中后100℃、处理30分，杀菌。将之冷冻干燥，按一只小鼠1日摄取1mg的量混合到标准粉末饲料AIN93(按照美国国立营养研究中心的标准组合物)，作成混合饲料。
2.实验动物、饲养用8周龄BALB/c。1组6只BALB/c小鼠，让小鼠自由摄取CE-2(日本CLEA)及水，驯化饲养1周。第0天抗原致敏后，对照组用使用纯化原料制作的AIN93粉末饲料饲养，KW3110组用向AIN93中混合了KW3110菌的混合饲料饲养。
3.血中IgE、脾细胞IL-4、IL-12的测定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)进行IgE、IL-4、IL-12的测定。
4.实验条件作为实验组，设立对照组(AIN93)、向AIN93中添加KW3110株，1mg/只鼠/天的KW3110组。对照组、KW3110组每天给用水调成糊状粉末饲料4g直至实验终了(第98天)。饮水是自由摄取。用卵清蛋白(OVA)的过敏致敏是用100μg OVA和佐剂Alum 2mg一起，于第0、14、42、70、94天共腹腔注射5次。此间，每间隔1周从眼底静脉取血。实验终了时取全血并取脾、制备淋巴细胞(图7)。用RPMI1640(SIGMA)+10％FCS(Rosche)+100μg OVA培养基，37℃、5％CO2的条件下将脾脏淋巴细胞培养1周，回收培养上清。对血液样品进行IgE量的测定，对脾脏淋巴细胞培养上清样品进行IL-4、IL-12的测定。
5.实验结果98日间的实验期间中血中IgE的变动如图8所示。图中显示第48天时，与对照组相比KW3110组血中IgE显著性降低，p＜0.05。第48天及解剖时第98天的血中IgE用斑点显示于图9中。图中显示第98天同样与对照组相比KW3110组血中IgE显著性降低。对照组、KW3110组的98日解剖时脾细胞培养上清中IL-12产量如图10所示，IL-4产量如图11所示。与对照组相比KW3110组IL-12产量显著性增高。对于IL-4没有显著性差异，与对照组相比有降低趋势。以上结果提示，通过摄取KW3110株可使体内的免疫平衡向Th1转换，改善过敏状态。另外，如图12所示，第30天时，对照组无一例外鼻周边出现脱毛，而KW3110组中无一例外未引起脱毛。此时对照组中可观察到频繁的抓鼻行为。第60天前后，KW3110组与对照组同样可观察到鼻周边的脱毛及抓鼻行为。抓鼻行为的观察结果提示实际上KW3110组抑制了过敏症状。
实施例5(与公知的抗过敏乳酸菌、KW4610株(L.rhamnosus LGG株)的比较)1.施用样品用MRS培养基培养KW3110株、KW4610株48小时，用灭菌水洗涤3次，悬浮到灭菌水中后100℃、处理30分，杀菌。冷冻干燥，按一只小鼠1日摄取1～10mg的量混合到标准粉末饲料AIN93(按照美国国立营养研究中心的标准组合物)，作成混合饲料。
2.实验动物、饲养用8周龄BALB/c。1组6只BALB/c小鼠，让小鼠自由摄取CE-2(日本CLEA)及水，驯化饲养1周。从抗原致敏21天前摄取KW3110株、KW4610株的混合饲料或AIN93粉末饲料。
3.血中IgE的测定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)进行IgE的测定。
4.实验条件实验组设立对照组(AIN93)、以10mg/只鼠/天向AIN93中添加KW3110株或KW4610株的KW3110组、KW4610组。每天给予对照组、KW3110组、KW4610组用水调成糊状粉末饲料4g直至实验终了(第133天)。饮水是自由摄取。用卵清蛋白(OVA)的过敏致敏是用100μg OVA和佐剂Alum2mg一起，于第0、14、42、70、98、126天共腹腔注射6次。此间，每间隔1周从眼底静脉取血(图13)。对血液样品进行IgE量的测定。
5.实验结果试验期间中血中IgE量的变动如图14所示，施用OVA5次、6次后每个个体血中IgE量用斑点表示，如图15所示。可以确认，随着用OVA抗原致敏，血中IgE水平在所有的组中均上升，但与对照组相比，KW3110组在OVA施用5次后血中IgE量显著性下降。另一方面、与对照组相比，KW4610组血中IgE量未观察到显著性下降，这提示KW3110株的抗过敏活性更强。另外，提示10mg摄取组比1mg摄取组IgE降低效果更强。
实施例6(乳酸菌的耐酸性及胆汁酸耐性)由于乳酸菌活着到达肠道才能发挥益生菌效果，所以有必要耐受胃酸、胆汁酸等消化液。为了验证KW3110株是否满足这样的条件，体外测定耐酸性及胆汁酸耐性。
1.方法耐酸性的测定是，将乳酸菌培养到对数增殖期后，用PBS(pH6.5)调成OD600＝0.5，向菌体中添加1/10量的用盐酸调成pH3.0的MRS培养基，37℃培养。培养开始后1小时、2小时、3小时取样，用MRS琼脂培养基测定活菌率。
2.实验结果胆汁酸耐性的测定是，向MRS液体培养基中添加终浓度2％的胆汁酸(OXOID 社 Bile Salts)，接种1％的KW3110株预培养液，用Oriental Instruments公司的BIOPLOTTER测定OD630，以此来测定生长速度。
所有实验中均用德氏乳杆菌的标准株KW3317株(JCM1012株)作对照。结果提示，耐酸性试验(图16)中3小时有约50％的KW3110株生存。另外，胆汁酸耐性试验(图17)中，即便用含2％胆汁酸的培养基培养，KW3110株也充分生长发育，提示它对胆汁酸有耐性。另一方面，提示KW3317株对酸、胆汁酸任一种的耐性均低。
实施例7(乳酸菌的肠道粘附性)由于乳酸菌活着到达肠道才能发挥益生菌效果，所以有必要逗留在肠道。作为乳酸菌逗留在肠道，充分发挥其效果的指标，人们常经常应用体外对人肠道来源的细胞系Caco-2的粘附性试验。于是测定KW3110株对Caco-2细胞粘附能力。
1.方法按照Coconnier等的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology，Vol.58，p.2034，1992)进行Caco-2细胞的培养。在载玻片上培养1.2×104个/cm2的Caco-2细胞大约1～2周，直到铺满后。用MRS培养基培养KW3110株，37℃、培养2晚，收集菌株，用PBS洗涤1次后，用PBS调成OD600＝1.0。在制备的KW3110液2ml中，浸入培养Caco-2细胞的载玻片，37℃、10％二氧化碳存在下接触1小时，其后用DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养基将载玻片洗涤3次。接着用甲醇固定载玻片，用革兰氏染色法(Medical Technology，Vol.23，p.205，1995)对KW3110株进行染色。显微镜下计数粘附到Caco-2细胞的乳酸菌数，每4个视野的平均值作为粘附数。另外，对15株干酪乳杆菌进行了同样的检测，类干酪乳杆菌包括KW3913株(JCM8130株)及KW3115株(JCM1134株)为标准株。
2.实验结果各乳酸菌对Caco-2细胞的粘附能力的试验结果如表3所示。0uwehand等报道了类干酪乳杆菌、干酪乳杆菌对Caco-2细胞的粘附能力低(Food microbiology and safety，vol.66，p.856，2001)，这次的实验证明KW3110株以外的株粘附能力低。但是，KW3110株在类干酪乳杆菌、干酪乳杆菌菌中，有显著高的Caco-2细胞粘附能力，提示是一株可期待具有良好益生菌效果的菌株。
(表4)
实施例8(KW3110株对花粉抗原的花粉病·气道炎症的改善效果)1.实验方法(动物种类)购入BDF1雌性小鼠4周龄(Charles River)。
(实验组)实验A通过点鼻进行抗原致敏(花粉病模型)对照组施用标准饲料(AIN-76base)的组别KW组施用KW 1mg/小鼠(1mg KW3110/3gAIN-76base)的组别实验B用喷雾器进行抗原致敏(气道炎症模型)对照组施用标准饲料(AIN-76base)的组别KW组施用KW 1mg/小鼠(1mg KW3110/3gAIN-76base)的组别(试剂·仪器)雪松花粉提取物CP(LSL公司)ALUM(Sigma公司)超音波式喷雾器XE-U12(OMRON公司)细胞离心机Cytospin4(ThermoBioAnalysis公司)(评价方法)实验A
购入BDF-1小鼠后驯化1周，将眼球采血所得的血浆按血中总IgE浓度分组(n＝7)。分组后开始施用实验食物。从分组后第3周开始腹腔内施用CP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/小鼠)，周1次/3周。从第3次CP+ALUM溶液施用后第2周开始给小鼠两鼻点CP溶液(1mg/mI)，每次10μl。另外，还设定未刺激模型(Basal)小鼠，点鼻时使用生理盐水。点鼻实施5日，数点鼻后5分钟的喷嚏次数(第1、3、5天)和鼻部搔抓次数(第3、5天)。
实验B购入BDF-1小鼠后驯化1周，将眼球采血所得的血浆按血中总IgE浓度分组(n＝7)。分组后开始施用实验食物。从分组后第3周开始腹腔内施用CP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/小鼠)，每周1次/3周。从第3次CP+ALUM溶液施用后第2周开始在密闭容器内用喷雾器给小鼠喷CP溶液(40μg/ml)，喷15分钟。另外，设定未刺激模型(Basal)，给小鼠喷雾生理盐水。喷雾实施5天。另外，分别在CP腹腔内施用时(第0天)、喷雾器开始时(第35天)、解剖时(第40天)进行眼球取血，测定血中总IgE浓度。第5天，麻醉下收集支气管肺胞洗涤液(BALF)，BALF中的细胞计数，鉴定BALF中的细胞，测定BALF中的细胞因子。BALF的获得是，麻醉下切开小鼠颈部，进行气管插管，用加入0.1％BSA的盐水Saline0.7ml×3次(共2.1ml)洗涤。离心后收集上清及细胞，计数细胞数。还制备图片标本，通过亮吉姆萨染色鉴定细胞。
2.实验结果(实验A)关于点鼻后5分钟喷嚏的次数，考虑到物理刺激的影响，分为点鼻后0～1分、1～5分，对总次数进行评价。结果，与用生理盐水点鼻几乎无喷嚏症状相对，对照组因反复用抗原点鼻喷嚏频度增加。另一方面、KW组中观察到抑制喷嚏症状的倾向(图18a、b、c)。
另外，关于鼻部搔抓行为，以点鼻后5分钟的连续搔抓行为为1点(总点数)。另外，还分为轻度搔抓(连续1～4次的搔抓行动)和重度搔抓(连续5次以上的搔抓行动)进行点评价。与对照组相比，KW组能抑制搔抓行动，可以看到对5第天的轻度搔抓点数有显著性抑制(图19a、b)。
(实验B)与对照组相比，喷雾前及解剖时KW组可显著性抑制血中总IgE浓度的上升(图20)。BALF中的细胞的种类通常是单核细胞，以巨噬细胞为主。但是，经抗原刺激后，对照组的BALF中嗜酸性细胞占65％左右，单核细胞的比率减少。另一方面，与对照组相比，KW组中可观察到抑制嗜酸性细胞％上升的倾向(图21A)。另外，与对照组相比，KW组中同样可观察到抑制嗜酸性细胞局所浸润的倾向(图21b)。
另外，测定BALF上清中的细胞因子时显示与对照组相比，KW组中IL-5的值低，IL-5是Th2型细胞因子，参与嗜酸性细胞的增殖、分化(图22)。
以上的结果提示，通过摄取KW3110，可抑制因雪松花粉抗原引发的喷嚏、搔抓行动，这些症状与速发型过敏中花粉病的临床症状相近。另外发现，KW3110通过抑制IgE上升而抑制针对因抗原暴露而引发气道炎症产生的IL-5，还抑制嗜酸性细胞的浸润。IL-5与气道炎症、嗜酸性细胞的关系在J.Allergy Clin.Immunol 88(6)935-942，1991中有述，这提示施用KW3110对以气道炎症为主要症状的过敏性哮喘有效。
实施例9(KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果)应用涂抹三硝基氯苯的特异性皮炎模型验证KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果。(引用文献·应用药理59(6)123-134，2000)1.实验方法(动物种类)购买NC/Ng a TndCyj小鼠雄性5周龄(Charles River)(实验组)对照组施用标准饲料(AIN-76base)11周KW1mg-11wk组施用1mg KW3110/3g AIN-76base11周KW10mg-11wk组施用10mg KW3110/3g AIN-76base11周KW1mg-8wk组施用标准饲料3周后，施用1mg KW3110/3gAIN-76base8周(试剂)
三硝基氯苯PCI(东京化成工业)致敏用溶液5％溶液(乙醇∶丙酮＝4∶1)腹部···100μl，后肢部···两足25μl攻击用溶液0.8％溶液(橄榄油)外耳部···两面·两耳各10μl(共40μl)，背皮部···50μl(评价方法)购入NC/Nga小鼠后驯化1周，根据眼球采血所得血清中总IgE浓度进行分组(n＝10)。分组、施用实验食物3周后，将PCl致敏用溶液涂到脱毛了的腹部和后肢部两侧，1周后进行攻击，攻击时将攻击用溶液涂到两外耳部、两面及脱毛了的背皮部。攻击每2周进行一次，共进行77次。另外，为了确认攻击用溶液溶剂未引起耳阔肥厚，在涂布橄榄油后于0、1、4、24、72、96、120、144、168小时用刻度厚度计量器(dial thickness gage)测定耳阔肥厚度。再在第1，3次攻击后，同样于0、1、4、24、72、96、120、144、168h用刻度厚度计量器测定耳阔肥厚度，评价浮肿度。另外，致敏后每周眼球采血，致敏后周2次进行临床得分评价。最终于第7次攻击1周后屠杀，收集血清及外耳部组织。对血清进行总IgE浓度的测定，对外耳部组织进行HE染色、甲苯胺蓝染色。
(临床得分)对外耳部的搔痒症、发红·出血·糜烂、浮肿、擦伤·组织缺损、痂皮形成、干燥等5项，头皮部的脱毛、发红·出血·糜烂、痂皮形成·干燥等3项共8项进行打分，症状无(0分)、轻度(1分)、中度(2分)、重度(3分)，加起来作为评价得分。
(统计)统计采用分散分析以及针对对照组的Dunnett多重比较，各分析中，风险率在5％以下具有显著性差异。
2.实验结果血中总IgE浓度对照组从PCl攻击后4周开始大幅上升，与此相对，所有KW3110摄取组中均能抑制这种上升，KW 10mg-11wk组与KW1mg-8wk组从第4次攻击开始，KW1mg-11wk组从第6次攻击开始显著性抑制其上升(图23)。
临床得分对照组从早期即可观察到耳部和头皮的病情恶化，即可确认得分的上升。另一方面，所有KW3110摄取组中可抑制其上升，KW1mg-11wk组、KW10mg-11wk组从第2次攻击开始，KW1mg-8wk组从第3次攻击后开始显著性抑制其上升。对于仅外耳部临床得分、仅头皮的临床得分，同样可在所有KW3110摄取组中看到显著性差异(图24、25、26)。另外，从头部的照片可确认外耳部的糜烂、组织缺损等在KW摄取组受到抑制(图27)。
关于PCI攻击所致耳阔肥厚未看到致敏阶段实施的溶剂造成耳阔的肥厚，但可确认因PCI攻击造成的耳阔肥厚·发红·浮肿。对照组中，第1次攻击后1、4小时观察到与速发型反应相关的1期外耳部肥厚，48小时出现与迟发型反应相关的2期肥厚，再在120～144小时出现与速发型反应相关的3期外耳部肥厚。
另一方面，KW3110摄取组3组均发现显著性抑制与速发型反应相关的1、4小时出现的肥厚，KW10mg-11wk组还显著性抑制144小时、KW1mg-8wk组显著性抑制24、144小时出现的肥厚。第3次攻击后，对照组在涂布后继续肥厚，而KW3110摄取组出现整体的肥厚抑制倾向，KW1mg-11wk组、KW10mg-11wk组中可确认出现显著性抑制(图28、29)。
外耳部的病理学评价结果是，对照组观察到真皮及表皮出现肥厚、浮肿等炎症；所有KW摄取组中均可确认，与对照组相比肥厚整体受到抑制(图30)。另外，根据甲苯胺蓝染色进行的病理组织评价，可以确认肥大细胞数KW摄取组比对照组少(图31)。
以上的结果确认，通过KW摄取抑制血中总IgE浓度的上升，抑制半抗原刺激诱发的耳阔肥厚，在临床水平抑制症状恶化。因此，这提示通过KW3110摄取，对NC/Nga小鼠中半抗原诱发的特异性皮炎的症状有改善效果。
实施例10(人体中KW3110株对花粉病的效果)为了验证KW3110株在人体中的效果，对花粉病志愿者进行下述试验。
1.试验方法(试验样品)
用实施例2中Th1、Th2两参数评价均为E的德氏乳杆菌B株或类干酪乳杆菌KW3110株制作原味酸奶。包含的菌数是2×108cfu/ml。
(试验对象)企业中工作的花粉病患者志愿者28名。本试验遵照赫尔辛基宣言，事前就与试验内容、方法相关的内容对所有试验对象进行了充分说明，获得知情同意书后进行。
(试验组)将28名试验对象随机分为2组。1组摄取对照酸奶德氏乳杆菌B株酸奶，另1组摄取类干酪乳杆菌KW3110株酸奶，一日摄取200ml(相当于KW3110株干燥菌体40mg)。至于分组结果，由管理信息的第3者进行双盲试验，一直到试验结束。
(试验时间)2003年1月20日～4月14日。
(测定项目)于0周(试验开始时)、4、8、12周目(试验结束时)对试验对象进行采血。在Falco Biosystem公司对血液进行以下项目的测定NK细胞活性、Th1及Th2细胞数比(Th1/Th2比)、嗜酸性细胞数、ECP值、血中总IgE量、血中雪松花粉特异的IgE量。
试验结束后对这些数据进行统计处理，使之数据化。
另外，采血时试验对象回答表中所示的调查表，分5个水平(3+高度；2+中等度；+轻度；±轻微；-无)。3+为4分，2+为3分，+为2分，±为1分，-为0分，得分化后进行统计处理。
(表5)
(表6)
2.实验结果如图32所示，试验开始时与结束时进行比较时，对照德氏乳杆菌(L.delbrueckii)B株酸奶组(对照组)中Th1/Th2比出现显著性降低，如图33所示，ECP值出现显著性上升。另一方面，类干酪乳杆菌KW3110株酸奶组(KW组)中，无论哪个值试验前后均未发现显著性变化。另外，如图34所示，至于自觉症状的得分化，对于咽喉痛、眼睛痛、眼皮发沉等，KW组出现比对照组低的倾向。以上的结果表明KW3110株对人花粉病也表现出有效性。
以下，对本发明的具有抗过敏活性的乳酸菌用于饮料制造的实施例进行阐述。
实施例11(作为饮料添加原料的乳酸菌菌体的制备方法)制备例1.乳酸菌KW3110株菌体的制备使用培养用培养基(葡萄糖1％、酵母提取物S(Takeda-Kirin公司)1％、MgSO4·7H2O 50ppm、MnSO4·5H2O 50ppm)进行乳酸菌的培养。将乳酸菌KW3110株接种到培养用培养基10ml中，37℃静置20～24Hr，进行预培养。培养时，将预培养液0.6ml接种到120ml的培养用培养基中，用200ml的发酵桶(模型BMJ-25、Able公司)，28℃培养。通气量为0.12L/min，搅拌速度为500rpm。pH用25％NaOH溶液进行控制，调到pH4.5以下。培养48小时。
培养结束后，8500Xg离心10分钟，收集菌体。悬浮到30ml灭菌蒸馏水中，8500Xg离心10分钟，收集菌体。反复洗涤3次，除去来源于培养基的成分。将洗涤菌体悬浮到10ml灭菌水中，高压锅中100℃、处理30分钟后，进行冷冻干燥。最后，获得乳酸菌干燥菌体50～70mg。确认所得乳酸菌菌体的抗过敏活性。
实施例12(茶系饮料的制造)向用85℃热水提取的乌龙茶、红茶、绿茶、焙烤茶、茉莉茶的提取液中添加去离子水，使茶叶的使用率为0.8重量％。此时，添加维生素C使其达0.025重量％，然后用碳酸氢钠将pH调成适于饮用。再向该调合液中添加乳酸菌，每100g调合液添加乳酸菌KW3110株的菌数为1.5×1010个、3×1010个，然后按常规方法进行UHT杀菌，填充到350mlPET瓶中。
由专门小组对这10个实施例(5种茶×2种乳酸菌浓度)进行感官评价。结果对任一种饮料的香味均满意，并因可每日连续饮用而得到高评价。但由于添加3×1010个的样品外观上出现沉淀，所以更优选添加1.5×1010个的饮料。
实施例13(麦茶的制造)用10kg热水将250g大麦茶煮30分钟，过滤后，离心分离。向所得提取液中添加乳酸菌KW3110株，最终每100g制品添加8×1010、1.5×1010、3×1010个，然后再添加维生素C和碳酸氢钠调味，再度添加去离子水使重量达10kg。然后按常规方法进行UHT杀菌，无菌填充到500ml的PET瓶中。
进行感观评价时，均具有满意的香味，因可每日连续饮用而得到较高评价。但由于添加3×1010个的样品外观上出现沉淀，所以更优选低于该数目的饮料。
实施例14(果汁饮料的制造)向900g混浊苹果果汁和1g香料中添加规定量的乳酸菌菌体，再添加去离子水，共达1kg后，按常规方法热包装到180ml玻璃瓶中，制备成苹果果汁饮料。该调合液100g中添加乳酸菌KW3110株的菌数为2×1010个、或4×1010个。
感观评价的结果，任何样品中均未因配合乳酸菌而有任何香味的异常，外观上也不存在任何问题。
实施例15(运动饮料的制造)向包含砂糖4.5重量％、柠檬酸0.2重量％、柠檬酸钠0.05重量％、香料0.1重量％的调合液中添加0.0143重量％(每100g制品添加1.5×1010个)的乳酸菌KW3110株。再将该溶液加热到90℃杀菌，热包装到PET瓶中，制备成运动饮料。感观评价的结果，外观、香味均满意。离心分离本饮料中的乳酸菌菌体后，用纯水洗涤2次后，进行冷冻干燥，得到干燥菌体。用应用小鼠淋巴细胞的体外体系评价已完成的制品，结果保持了规定的活性(图35)。
实施例16(土豆汁的制造)向土豆汁中添加规定量的乳酸菌菌体后，填充到190g罐中，按常规方法进行蒸馏瓶杀菌。乳酸菌KW3110株的添加是，每100g该调合液中添加的菌数达2.5×1010个或5×1010个。
感观评价的结果，任何样品均未因配合乳酸菌而出现异样感，外观上也无任何问题。
实施例17(咖啡的制造)用95℃的热水抽提粉碎了的咖啡焙煎豆(Columbia)，得到咖啡提取液。向其中添加去离子水，将可溶性固体成分稀释到1.4％。每100g该调合液中添加的乳酸菌KW3110株的菌数为2×1010个、4×1010，然后，填充到190g罐中，按常规方法进行蒸馏瓶杀菌。
感观评价的结果，任何样品均未因配合乳酸菌而出现异样感。但是，当倒到杯中时，添加4×1010个的样品外观上乳酸菌出现沉淀，更优选1.5×1010个。但从罐中直接饮用时没问题。
以下，对本发明的具有抗过敏活性的乳酸菌用于食品制造时的实施例进行描述。
实施例18(酸奶的制造)将包括乳的原材料(牛奶、脱脂奶粉、奶油、砂糖液体、稳定剂、香料、水)混合均匀，128℃、加热15秒进行杀菌，冷却到40℃以下后，添加乳酸菌启动器W3110，在发酵罐中维持在37℃开始发酵。乳酸菌KW3110分解混合液中的乳糖生成乳酸，大约18小时pH成为4.6，通过乳蛋白的等电点凝集，到达胶体化稳定点时搅拌冷却。将经搅拌而成膏状的酸奶填充到纸容器中密封，在10℃以下的冷藏库中冷却保管。冷却后，经感观检查，可以确认具有酸奶的适当的食物味道和特性。酸奶原材料的配合比例如表7所示。另外，原材料中的脂肪成分、SNF(无脂固体成分)的比例及甜味度如表8所示。以应用小鼠淋巴细胞的体外体系评价已完成的制品，结果保持了规定的活性(图36)。
(表7)
(表8)
以下，对本发明的具有抗过敏活性的乳酸菌用于健康食品制剂制造时的实施例进行描述。
实施例19(片状健康食品的制造)将还原巴拉金糖、山梨糖醇、木糖醇及阿拉伯树胶等糖类适当加入到制备的67g乳酸菌KW3110株干燥粉末中，用水作粘合剂进行加热造粒，用柠檬酸、stevia、香料等调味，为了易于成型，加入粉末油脂和蔗糖酯，得到1000g的混合物，用打片机制成片状。其后，打片，每粒1.5g，制备成香味上乘的片状健康食品。此时，乳酸菌KW3110株的菌数是每粒5×1010个。
实施例20(硬胶囊状健康食品)向制备的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精50g，混合均匀，填充到由支链淀粉、植物油、角叉菜胶、氯化钾组成的硬胶囊原料中，获得硬胶囊包裹的1胶囊213mg的健康食品。此时，乳酸菌KW3110株的菌数是每1胶囊5×1010个。
实施例21(硬胶囊状健康食品)向制备的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精50g，混合均匀，填充到明胶和甘油构成的硬胶囊原料中，获得硬胶囊包裹的1胶囊213mg的健康食品。此时，乳酸菌KW3110株的菌数是每1胶囊5×1010个。
实施例22(软胶囊状健康食品)将制备的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末与红花油180kg、蜂蜡20kg、大豆卵磷脂5kg的混合物均等混悬，用以角叉菜胶、淀粉、甘油为主成分的胶囊原料包被，制成1胶囊450mg的椭圆状软胶囊。此时，乳酸菌KW3110株的菌数是每1胶囊5×1010个。
实施例23(软胶囊状健康食品)将制备的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末与红花油180kg、蜂蜡20kg、大豆卵磷脂5kg的混合物均等混悬，用以明胶和甘油为主成分的胶囊原料包被，制成1胶囊450mg的椭圆状软胶囊。此时，乳酸菌KW3110株的菌数是每1胶囊5×1010个。
实施例24(颗粒状健康食品)将制备的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末用棒(stick)状填充机进行填充，1棒填充1g，获得每1棒5×1011个乳酸菌KW3110株的健康食品。
实施例25(颗粒状健康食品)向制备的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精900kg，以水作粘合剂，应用流动层造粒机进行匀混和、加热、造粒，获得颗粒物1000kg。其后用棒状填充机对颗粒物进行填充，1棒1g，获得每1棒5×1010个乳酸菌KW3110株的健康食品。用应用小鼠淋巴细胞的体外体系评价已完成的制品，结果保持了规定的活性(图37)。
实施例26(粉末状健康食品)向制备的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精900kg，以水作粘合剂，应用流动层造粒机进行匀混和、加热、造粒，获得颗粒物1000kg。其后粉碎该颗粒物，直到18号筛能全部通过，用棒填充机进行填充，1棒1g，获得每1棒5×1010个乳酸菌KW3110株的粉末状健康食品。
实施例27(悬浮液状健康食品)向制备的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加甘蓝叶的榨汁液10kg，为了使乳酸菌在液体中易于分散，用藻酸钠10g调整粘度，获得悬浮液状健康食品。
实施例28(悬浮液状健康食品)将制备的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末与葡萄糖0.7kg、蒸馏水5kg和葡萄香料5g混和，加热杀菌后，无菌填充1个50ml的密封容器中，获得糖浆状的悬浮液状健康食品。小儿对该食品无讨厌感，所以受到好评。
附图简述图1是本发明的实施例中所用乳酸菌及其购入地的一览表(No.1)。
图2是本发明的实施例中所用乳酸菌及其购入地的一览表(No.2)。
图3表示本发明的实施例中，各种乳酸菌产生的Th1型细胞因子IL-12的生成量。
图4表示本发明的实施例中，各种乳酸菌产生的Th2型细胞因子IL-4的生成量。
图5表示本发明的实施例中，用本发明的乳酸菌株(KW3110)和对照株(L-92株)，体外比较IL-12和IL-4产量的结果。
图6表示对No.90株进行抗过敏活性测定的结果，该菌株是由在本发明的实施例中选择的KW3110株衍生的。
图7是本发明的实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验流程图，该菌株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图8是本发明的实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验中，98天实验间血中IgE的变动图，KW3110株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图9是本发明实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验中，用斑点表示第48天及解剖时第98天时血中IgE量，KW3110株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图10是本发明实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验中，对照组及KW3110组的98日解剖时脾细胞培养上清中IL-12的产量，KW3110株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图11是本发明实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验中，对照组及KW3110组的98日解剖时脾细胞培养上清中IL-4的产量，KW3110株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图12是本发明实施例中体内测定KW3110株抗过敏能力的实验中，观察到对照组及KW3110组鼻周边脱毛结果的照片，KW3110株是本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株。
图13是本发明的实施例中，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株KW3110株与作为抗过敏乳酸菌而公知的KW4610株进行比较时，用该乳酸菌株的混合饲料进行预防效果试验的实验流程图。
图14是本发明的实施例中，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株KW3110株与作为抗过敏乳酸菌而公知的KW4610株进行比较时，用该乳酸菌株的混合饲料进行预防效果试验期间血中IgE量的变动。
图15是本发明的实施例中，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株KW3110株与作为抗过敏乳酸菌而公知的KW4610株进行比较时，用该乳酸菌株的混合饲料进行预防效果试验的过程中，施用OVA5次、6次后每个个体的血中IgE量，用圆点表示。
图16表示本发明的实施例中，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株KW3110株的耐酸性试验结果。
图17表示本发明的实施例中，本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌株KW3110株的胆汁酸耐性试验结果。
图18表示本发明的实施例中KW3110株对应用花粉抗原诱发的花粉病·气道炎症的改善效果，图16a、b、c(图18a、b、c)是对模型小鼠的喷嚏行为进行试验的结果。
图19表示本发明的实施例中KW3110株对应用花粉抗原诱发的花粉病、气道炎症的改善效果，图17a、b(图19a、b)是对模型小鼠的搔抓行为进行试验的结果。
图20表示本发明的实施例中KW3110株对应用花粉抗原诱发的花粉病、气道炎症的改善效果，模型小鼠血中总IgE浓度上升的抑制进行试验的结果。
图21表示本发明的实施例中KW3110株对应用花粉抗原诱发的花粉病、气道炎症的改善效果，是对模型小鼠嗜酸性细胞上升的抑制(图19a)及嗜酸性细胞局部浸润的抑制(图19b)进行试验的结果。
图22表示本发明的实施例中KW3110株对应用花粉抗原诱发的花粉病气道炎症的改善效果，是对模型小鼠中IL-5的值进行试验的结果。
图23表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对血中总IgE浓度的上升进行试验的结果。
图24表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对模型小鼠总临床得分进行测定的结果。
图25表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对模型小鼠的临床得分(外耳部)进行测定的结果。
图26表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对模型小鼠的临床得分(头皮部)进行测定的结果。
图27表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是抑制模型小鼠头部外耳部糜烂、组织缺损状的照片。
图28表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对模型小鼠的耳阔肥厚(图26a)及模型小鼠攻击1次后耳阔肥厚的抑制倾向(图26b)进行试验的结果。
图29表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是对模型小鼠攻击3次后耳阔肥厚的抑制倾向进行试验的结果。
图30表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是针对模型小鼠耳阔肥厚的抑制，用HE染色对外耳部进行病理学评价的结果。
图31表示本发明的实施例中KW3110株对特异性皮炎模型小鼠的改善效果，是针对模型小鼠耳阔肥厚的抑制，用甲苯胺蓝染色进行外耳部病理学评价的结果。
图32表示本发明的实施例中KW3110株在人体中对花粉病的效果，应用酸奶的试验中，测定Th1/Th2比值变化的结果。
图33表示本发明的实施例中KW3110株在人体中对花粉病的效果，应用酸奶的试验中，对试验开始前与开始后ECP的变化进行测定的结果。
图34表示本发明的实施例中KW3110株在人体中对花粉病的效果，应用酸奶的试验中，对试验开始前与开始后花粉病自觉症状的变化进行观察的结果。
图35表示本发明的实施例中应用KW3110株，实施各种加工处理产品化时，对抗过敏活性的维持进行试验的结果，及作为清凉饮料水产品化时对IL-12的产量进行试验的结果。
图36表示本发明的实施例中应用KW3110株，实施各种加工处理产品化时，对抗过敏活性的维持进行试验的结果，及配合到酸奶中产品化时对IL-12的产量进行试验的结果。
图37表示本发明的实施例中应用KW3110株，实施各种加工处理产品化时，对抗过敏活性的维持进行试验的结果，及片剂化时对IL-12及IL-4产量进行试验的结果。
产业上利用的可能性根据本发明，可获得有高抗过敏活性的乳酸菌，获得以该乳酸菌为有效成分的表现高抗过敏效果的组合物。本发明的抗过敏用组合物尤其对花粉病、特异性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等环境过敏有效。特别是，正如花粉病数据和以花粉作抗原的哮喘治疗实验数据中所显示的，对花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等粘膜过敏症疾病的预防、治疗有显著效果。本发明的抗过敏用组合物的有效成分之一的类干酪乳杆菌KW3110除具有强大的抗过敏、免疫激活活性外，还具有优良的肠道细胞的粘附性、胃酸、胆汁酸耐性，所以通过经口施用该乳酸菌乃至应用该乳酸菌的制品，可期待作为能同时发挥抗过敏功能及调整肠道作用、降低胆固醇作用、降压作用等传统已知的益生菌功能的药剂或饮食品利用。本发明的具有高抗过敏功能组合物，特别以饮料形式应用时可每日连续摄取，且在可能连续摄取的摄入量内能发挥功效，所以可提供保持抗过敏功能且味道良好、保存性高的饮料。
PCT/RO/134表
受理官厅记入栏
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约根据条约7.1颁布的国际保藏单位原始保藏证明保藏人姓名(名称)麒麟麦酒株式会社社长 荒蒔康一郎先生地址 104-8288东京中央区新川2丁目10番1号
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约根据条约7.1颁布的国际保藏单位原始保藏证明体藏人姓名(名称)麒麟走酒株式会社社长 荒蒔康一郎先生地址 104-8288东京中央区新川2丁目10番1号
权利要求
1.一种抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。
2.权利要求1的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的75％以上。
3.权利要求1或2的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的40％。
4.权利要求1～3中任一权利要求的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的75％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的40％。
5.权利要求1～4任一权利要求的抗过敏用组合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的80％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的30％。
6.一种抗过敏用组合物，其特征在于，显示权利要求1～5任一项中小鼠脾脏由来淋巴细胞的白细胞介素12及白细胞介素4生成量的乳酸菌为类干酪乳杆菌KW3110株、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KW4110株、类干酪乳杆菌KW3925株、类干酪乳杆菌KW3926株或唾液链球菌KW3210。
7.以类干酪乳杆菌KW3110株为有效成分的抗过敏用组合物，该菌株显示权利要求1～5任一项中小鼠脾脏由来淋巴细胞的白细胞介素12及白细胞介素4生成量、且耐受消化液、对肠道的附着性高。
8.权利要求l～7任一项中的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的过敏为花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎。
9.权利要求8的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的抗过敏用组合物为药物。
10.权利要求8的抗过敏用组合物，其特征在于，所述的抗过敏用组合物为饮食品。
11.一种具有高抗过敏活性的乳酸菌的获得方法，其特征在于，分离出具有以下效果的乳酸菌将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。
12.一种具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，用培养基培养根据权利要求11的方法分离出的乳酸菌，使之增殖。
13.权利要求12的具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，确认用培养基培养、增殖了的乳酸菌的抗过敏活性。
14.权利要求13的具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，所述的增殖了的乳酸菌的抗过敏活性的确认是通过将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，测定白细胞介素12及白细胞介素4的产量进行。
15.一种装入密封容器的药品或饮食品的制造方法，其特征在于，将根据权利要求12～14任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌的制造方法制备的乳酸菌配合药品或饮食品，填充到容器中，进行密封。
16.一种过敏疾病的预防和/或治疗方法，其特征在于，将权利要求1～10任一项中的抗过敏用组合物用于过敏疾病的预防和/或治疗的处理。
17.权利要求16的过敏疾病的预防和/或治疗方法，其特征在于，所述的过敏性疾病为花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎。
18.权利要求1～10中任一项抗过敏用组合物在过敏性疾病的预防和/或治疗中的应用。
19.权利要求18的抗过敏用组合物的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病的预防和/或治疗是指花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、或特异性皮炎的预防和/或治疗。
20.一种具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，添加权利要求1～7任一项中具有抗过敏活性的乳酸菌作活性成分。
21.权利要求20的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，每日摄取的饮食品中可含有5×109个以上具有抗过敏活性的乳酸菌。
22.权利要求20或21的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，所述的饮料或食品不包含成为过敏的原因的成分。
23.权利要求22的具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，所述的饮料或食品是不包含成为过敏原成分的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、或饮料剂。
24.权利要求20～21任一项中具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，应用灭菌了的乳酸菌。
25.一种具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，添加权利要求1～7任一项中具有抗过敏活性的乳酸菌作活性成分。
26.权利要求22中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的饮料是不含乳成分的装入密封容器的饮料。
27.权利要求25或26中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的饮料是装入密封容器的果汁清凉饮料或茶饮料。
28.权利要求25～27任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的装入密封容器的饮料中添加的乳酸菌是每100g饮料109～1011个乳酸菌的范围。
29.权利要求20～28任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的添加的乳酸菌为类干酪乳杆菌KW3110或其突变株。
30.权利要求20～29任一项中具有抗过敏功能的饮料，其特征在于，所述的食品或饮料作为健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品进行制备。
31.具有抗过敏功能的装入密封容器的饮食品的制造方法，其特征在于，在基本上无菌状态下，向灭菌的食品或饮料中配合权利要求1～7任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌、或经过杀菌的上述乳酸菌，填充到容器，密封。
32.乳酸菌的抗过敏活性的测定方法，其特征在于，将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏由来淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养，测定培养时产生的白细胞介素12和/或白细胞介素4的量。
33.权利要求32的乳酸菌抗过敏活性的测定方法，其特征在于，添加待检乳酸菌进行培养所产生的白细胞介素12和/或白细胞介素4的量，与应用类干酪乳杆菌KW3110株时的情况进行比较，从而进行评价。
34.一种抗过敏剂，其特征在于，向权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌中添加载体、赋形剂和/或其它辅助剂，制剂化。
35.一种药品，它包含权利要求1～7任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌。
36.一种具有抗过敏功能的饮食品，其特征在于，用权利要求1～7任一项中所述的具有高抗过敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制备的或含有乳酸菌的饮料或食品。
37.具有抗过敏功能的饮料或食品的制造方法，其特征在于，用权利要求1～7任一项中具有高抗过敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制备的或含有乳酸菌的饮料或食品的乳酸菌。
全文摘要
本发明的目的是提供对过敏的预防、治疗有用的抗过敏用组合物，其制备法及其作为食品及饮料等的利用。解决手段包含抗过敏用组合物，该组合物以具有以下效果的乳酸菌作为有效成分将用卵清蛋白致敏的小鼠脾脏来源的淋巴细胞悬浮到含卵清蛋白的培养基中，添加待检乳酸菌进行培养时，白细胞介素12的产量与用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时等同，或是用类干酪乳杆菌KW3110株作为待检乳酸菌时的60％以上，且白细胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的对照的50％。本发明包含作为本发明的抗过敏用组合物的有效成分的有高抗过敏活性的乳酸菌的获得方法，及本发明的抗过敏用组合物在食品及饮料等中的应用，此外包含通过制剂化，作为经口施用的抗过敏剂的应用。
文档编号A61P11/06GK1767839SQ200480006779
公开日2006年5月3日 申请日期2004年2月27日 优先权日2003年3月13日
发明者井上小夜, 藤井敏雄, 藤原大介, 斋木朗, 高桥实, 山内浩一郎, 后藤正巳, 西田聪, 出内桂二, 若林英行, 米田俊浩 申请人:麒麟麦酒株式会社