专利名称：治疗和/或预防非病毒性上皮损伤的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗和/或预防非病毒性上皮损伤的药物。本发明还提供治疗和/或预防非病毒性上皮损伤的方法。
在整个身体都发现了上皮层，其中它们执行许多作用，包括机械保护和与例如体内稳态或食物吸收关联的活性转运。上皮组织的实例包括皮肤的表皮(诸如头皮)和消化系统、肺和血管的内层。
上皮频繁地受到削弱上皮正常功能的非病毒性的损伤。这种非-病毒损伤可以由广泛范围的方式所引起，所述方式包括通过机械伤害，通过感染试剂诸如细菌和真菌的作用，通过细胞毒性化学试剂，或通过其它损伤源，诸如辐射损伤。
通常，上皮组织共享许多共同的特点。例如，以前在胃肠上皮上进行的研究已经证明了是其它上皮中的损伤反应和再生过程的良好指示物(Potten，C.S.(1991).Regeneration in epithelial proliferative units asexemplified by small intestinal crypts.Ciba Found Symp 160，54-71；discussion 71-56)。非病毒损伤的效应变化，并且取决于损伤的上皮层的性质。例如，消化系统的损伤可以导致疾病诸如腹泻、粘膜炎和结肠炎，而头皮的上皮损伤可以导致毛发损失(脱发症)。
癌症疗法诸如化学疗法和放射线疗法代表了损伤上皮的常见原因。由于这些医源性疾病作为选择性治疗的结果而发生，它们特别地代表被设计为预防或治疗(i)上皮损伤和/或(ii)由这种损伤导致或表征的疾病的疗法的合适的靶目标。而且，能改善上皮损伤的这些疗法适合于治疗由未计划地或意外地暴露于有害刺激而损伤的上皮组织。
目前，可获得的用于预防和/或治疗非病毒性上皮损伤和由这种损伤导致或表征的疾病的药物是有限的。因此，认可开发合适的新药物的需要。
按照本发明第一方面，提供磷酸盐转运蛋白活性的抑制剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防和/或治疗非病毒性的上皮损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病。
需要无机磷酸盐作为许多细胞作用，即细胞代谢、信号转导、脂质合成和酶活性的调节的关键细胞养分(Kavanaugh M.P.，Miller，D.G，ZhangW，Law，W.，Kozak，S.L.，Kabat，D.，和Miller，A.D.(1994).Cell-surfacereceptors for gibbon ape leukemia virus and amphotropic murine retrovirus areinducible sodium-dependent phosphate symporters.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，7071-7075.)。无机磷酸盐可以通过被动作用和通过经由磷酸盐转运蛋白的载体介导的过程进入细胞。磷酸盐体内稳态的紊乱可以影响许多细胞过程的功能并且因此磷酸盐转运蛋白的作用已经成为一些最近研究的目标。(Bottger，P.，和Pedersen，L.(2002).Two highly conserved glutamateresidues critical for type III sodium-dependent phosphate transport revealed byuncoupling transport function from retroviral receptor function.J Biol Chem277，42741-42747)。
本发明基于发现可以将包含磷酸盐转运蛋白活性抑制剂的药物的施用用于预防和/或治疗非病毒性上皮损伤，和/或预防和/或治疗由非病毒性上皮损伤引起或表征的疾病。可以将按照本发明的治疗预防性地用于预防非病毒性的上皮损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病，或作为对现存的非病毒性上皮损伤或由这种损伤导致或表征的疾病治疗。例如，当个体接触已知会诱导上皮损伤的试剂诸如许多化疗试剂时，按照本发明的治疗可以有利地在诱导损伤的试剂之前或同时进行施用，并且优选地与诱导损伤的试剂结合施用。
可以通过已建立的测定诸如磷酸盐吸收测定来评价抑制磷酸盐转运蛋白活性的试剂的能力。Kavanaugh及其同事描述了一种这样的测试实例(Kavanaugh，M.P.，Miller，D.G.，Zhang，W.，Law，W.，Kozak，S.L.，Kabrt，D.，和Miller，A.D.(1994).Cell-surface receptors for gibbon ape leukemiavirus and amphotropic murine retrovirus are inducible sodium-dependentphosphate symporters.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，7071-7075)。简言之，与包括一部分放射性磷酸盐的一类已知磷酸盐浓缩物(concentrations)一起培养合适的细胞系。在37℃培养固定时间诸如20分钟后，将细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤并用闪烁光谱学确定放射性磷酸盐吸收的程度。
磷酸盐转运蛋白活性的抑制剂优选钠依赖型磷酸盐转运蛋白活性抑制剂，并且更优选钠依赖型磷酸盐转运蛋白活性特异性抑制剂。有四组已知的钠-磷酸盐共转运蛋白I型、IIa型、IIb型(大多数局限于肾)和III型转运蛋白(其具有更普遍的组织表达模式)。预期III型转运蛋白具有10个跨膜结构域，其中靠近每个分子中心的大亲水性结构域被认为是转运蛋白的形成孔的区域。预期I型和II型组成员仅具有6-8个具有中心孔区域的这种跨膜区域。III型转运蛋白与I型和II型组共有少于20％的氨基酸同一性。(描述于Fernandes，I.，Beliveau，R.，Friedlander，G.，和Silve，C.(1999).NaPO(4)cotransport type III(PiTl)expression in humanembryonic kidney cells and regulation by PTH.Am J Physiol 277，F543-551)。
III型组包括磷酸盐转运蛋白Pit1(也称为长臂猿白血病病毒受体或Glvr1)和Pit2(也称为鼠双嗜性逆转录病毒受体或Glvr2或Ram2)(Kavanaugh，M.P.，Miller，D.G.，Zhang，W.，Law，W.，Kozak，S.L.，Kabat，D.，和Miller，A.D.(1994).Cell-surface receptors for gibbon apeleukemia virus and amphotropic murine retrovirus are induciblesodium-dependent phosphate symporters.Proc Natl Acad Sci USA91，7071-7075.Olah，Z.，Lehel，C.，Anderson，W.B.，Eiden，M.V.，和Wilson，C.A.(1994).The cellular receptor for gibbon ape leukemia virus is a novelhigh affinity sodium-dependent phosphate transporter.J Biol Chem 269，25426-25431)。Pit1和Pit2具有约60％的氨基酸序列相似性。
优选地，所述抑制剂是III型钠依赖型磷酸盐转运蛋白活性抑制剂，更优选地是特异性抑制剂。最优选地，所述抑制剂是Pit1和/或Pit2的特异性抑制剂。
已知许多不同类型的磷酸盐转运蛋白活性的抑制剂。例如，存在一类适合于按照本发明应用的磷酸盐转运蛋白活性的化学抑制剂。这种抑制剂的优选实例包括膦酰基-羧酸，以及这种酸的药用衍生物，诸如盐或酯。
因为膦酰基-羧酸和它们的衍生物是有效的，以致按照本发明的第二个方面提供将膦酰基-羧酸或其药用衍生物用于制备预防和/或治疗非病毒性上皮损伤或由这种损伤导致或表征的疾病的药物的应用。
按照本发明应用的膦酰基-羧酸可以是式R1R2P(O)-Ln-CO2H，其中n是0或1，R1和R2是相同的或不同的并且是酯残基的任一羟基基团，并且L是具有至多8个碳原子的烃基团。还可以按照本发明使用这些酸的药用衍生物，例如盐和酯。
L可以是具有全碳(all-carbon)主链的脂族、脂环族或芳香族基团。这种基团的实例包括亚烷基，环亚烷基，环亚链烯基(cycloalkenylene)，亚苯基，亚链烯基(alkenylene)，亚炔基(alkynylene)，环烷基亚烷基，环链烯基亚烷基和苯基亚烷基，苯基亚链烯基和苯基亚炔基基团。
如果L是脂环烃基团，那么其将在环中优选地包括多至7个碳原子，更优选地包括多至6个碳原子。
至于如果L是芳香族基团，那么其最优选地是苯核。
作为L的实例的亚烷基基团，可以是直链或支链的并且优选地具有1-6个碳原子，更优选地具有1-4个碳原子。碱性基团可以例如是亚甲基、亚乙基或亚丙基。
可以使用的环亚烷基基团或任何具有3-8个环碳原子的实例，例如环亚丙基、环亚丁基或任何在环中具有5、6、7或8个碳原子的相似二价基团。
亚链烯基基团的实例是衍生自乙烯、1-丙烯、2-丙烯、异丙烯、丁烯、1，4-丁二烯、戊烯和已烯的那些。
环亚链烯基基团的实例包括，但不限于，衍生自环丙烯、环丁烯、环戊烯、环戊二烯和环己烯的那些。
亚炔基基团的实例是具有2-8个碳原子，更典型地具有2-6个碳原子，例如2-4个碳原子的那些。亚炔基基团的实例包括，但不限于，衍生自乙炔(acetylene)和2-丙炔基团的那些。
L基团可以任选地被一个或多个取代基团所取代。取代基团的实例包括具有多至4个碳原子的烃基，例如烷基基团，诸如甲基或乙基。取代基团另外的实例包括卤素原子，例如一个或多个选自氟、氯和溴的卤素。
基团R1和R2是相同的或不同的并且每个是羟基或酯残基。酯残基的实例是芳烷基和烷基酯基团诸如苄氧基和烷氧基基团，特别的实例是乙氧基。
在一个优选的化合物基团中，R1和R2是相同的，并且都是羟基。
按照本发明应用的膦酰基羧酸的优选实例是其中n是0或n是1并且L是C1-4碱性基团的那些的任一个。如果n是1，那么L优选地是亚甲基或亚乙基基团。
特别优选的膦酰基羧酸是膦酰基-甲酸、膦酰基-乙酸和α-氯-α-溴膦酰基乙酸。
还可以使用膦酰基羧酸的酯的盐。
本发明的膦酰基-羧酸磷酸盐转运蛋白抑制剂化合物可以以其游离酸或盐或酯的形式存在。
所述盐可以是任何与药用阳离子一起形成的药用盐。盐的实例包括碱和碱土金属盐、过渡金属元素盐和取代或非取代的铵盐。特别的金属盐包括诸如锂、钠、钾、钙、镁、锌、锰和钡盐的那些，钠盐是一个优选的具体实例。所述盐(例如碱金属盐诸如钠盐)可以是例如二盐或三盐(例如，二钠或三钠盐)，三钠盐是优选的。铵盐的实例包括与氨本身，或与伯胺、仲胺、叔胺或季胺一起形成的那些。
铵盐的具体实例包括与形成盐组分一起形成的那些，所述形成盐组分诸如NH3，CH3NH2，C2H5NH2，C3H7NH2，C4H9NH2，C5H11NH2，C6H13NH2，(CH3)2NH，(C2H5)2NH，(C3H7)2NH，(C4H9)2NH，(C5H11)2NH，(C6H13)2NH，(CH3)3N，(C2H5)3N，(C3H7)3N，(C4H9)3N，(C5H11)3N，(C6H13)3N，C6H5CH2NH2，HOCH2CH2NH2，(HOCH2CH2)2NH，(HOCH2CH2)3N，C2H5NH(CH2CH2OH)，C2H5N(CH2CH2OH)2，(HOH2C)3CNH2，哌啶，吡咯烷和吗啉。
季铵盐的实例是与季铵离子诸如(CH3)4N，(C2H5)4N，(C3H7)4N，(C4H9)4N，(C5H11)4N，，(C6H13)4N和C2H5N(CH2CH2OH)3一起形成的那些。
如果所述化合物以羧酸酯的形式存在，酯可以是，例如取代的或未取代的芳烷基酯诸如苄酯或烷基酯，例如，C1-4烷基酯诸如乙基酯。
按照本发明应用的优选的膦酰基-羧酸包括膦酰基甲酸和膦酰基乙酸，以及这些酸的药用衍生物(Swaan，P.W.，和Tukker，J.J.(1995).Carrier-mediated transport mechanism of foscarnet(trisodium phosphonoformate hexahydrate)in rat intestinal tissue.J Pharmacol Exp Ther 272，242-247.Szczepanska-Konkel，M.，Yusufi，A.N.，VanScoy，M.，Webster，S.K.，和Dousa，T.P.(1986).Phosphonocarboxylic acids as specific inhibitorsof Na+-dependent transport of phosphate across renal brush border membrane.J Biol Chem 261，6375-6383.Tsuji，A.，和Tamai，1.(1989).Na+and pHdependent transport of foscarnet via the phosphate carrier system acrossintestinal brush-border membrane.Biochem Pharmacol 38，1019-1022.)。适合于按照本发明应用的膦酰基甲酸或膦酰基乙酸的衍生物包括这些酸的药用盐。通常，优选应用膦酰基甲酸或膦酰基乙酸的碱性金属盐，更具体地，钠盐。所述钠盐可以是二或三钠盐。最具体地，优选使用三钠盐。
或者，如美国4,215,113的实施例2所公开的，所述盐可以是单、二或三铵盐，伯、仲或叔胺盐或季铵盐。
膦酰基-羧酸的优选衍生物可以是由其类名膦甲酸的膦酰基甲酸三钠盐六水合物，其是众所周知的抗病毒试剂。
膦酰基-羧酸的特别优选的衍生物的另一个实例是α-Cl-α-Br-膦酰基乙酸酯(盐)，其具有三倍大于膦酰基甲酸的抑制活性(Hoppe，A.，McKenna，C.E.，Harutunian，V.，Levy，J.N.，和Dousa，T.P.(1988).Alpha-Cl-alpha-Br-phosphonoacetic acid is a potent and selective inhibitor ofNa+/Pi cotransport across renal cortical brush border membrane.BiochemBiophys Res Commun 153，1152-1158)。所有的这些试剂在结构上类似于磷酸盐分子并且因此作为钠依赖型磷酸盐共转运蛋白系统的竞争性抑制剂。
适合于按照本发明应用的磷酸盐转运蛋白活性抑制剂可以包括能直接或间接调节血清磷酸盐水平的物质。最近，已经将血清磷酸盐的生理调节剂统称为″phosphatonins″，并且这种调节剂代表按照本发明应用的磷酸盐转运蛋白活性的优选抑制剂。可以使用的适当phosphatonins的实例包括成纤维细胞生长因子23(FGF23)和分泌的与卷曲相关的(frizzled-related)蛋白4(FRP4)(Schiavi，S.C.和R.Kumar(2004).″The phosphatonin pathwayNew insights in phosphate homeostasis.″Kidney Int 65(1)1-14)。
按照本发明应用的适当的磷酸盐转运蛋白活性抑制剂还包括能干扰磷酸盐转运蛋白活性的试剂。这些试剂包括这类转运蛋白的化学和蛋白拮抗剂，其包括试剂诸如可以“封闭”转运蛋白活性的中和抗体。
将理解还可以通过减少由上皮细胞表达的磷酸盐转运蛋白的数量来抑制磷酸盐转运蛋白的活性。可以通过减少编码磷酸盐转运蛋白的基因转录或通过减少由这种转录产生的mRNA的翻译来引起适当的减少。适合于以这种方式实现抑制的试剂包括基因表达的特异性抑制剂，反义寡核苷酸，反义mRNA或寡核苷酸，RNAi和基因特异性核酶(Wang，H.，Hang，J.，Shi，Z.，Li，M.，Yu，D.，Kandimalla，E.R.，Agrawal，S.，和Zhang，R.(2002).Antisense oligonucleotide targeted to RIalpha subunit ofcAMP-dependent protein kinase(GEM231)enhances therapeutic effectivenessof cancer chemotherapeutic agent irinotecan in nude mice bearing humancancer xenograftsin vivo synergistic activity，pharmacokinetics and hosttoxicity.Int J Oncol 21，73-80；Song，E.，Lee，S.K.，Wang，J.，Ince，N.，Ouyang，N.，Min，J.，Chen，J.，Shankar，P.，和Lieberman，J.(2003).RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis.NatMed 9，347-351；Abounader，R.，Lal，B.，Luddy，C.，Koe，G，Davidson，B.，Rosen，E.M.，和Laterra，J.(2002).In vivo targeting of SF/HGF and c-metexpression via UlsnRNA/ribozymes inhibits glioma growth and angiogenesisand promotes apoptosis.Faseb J16，108-110))。或者，还可以使用干扰负责控制磷酸盐转运蛋白表达的调控路径的方法。
可以通过按照本发明制备的药物将能干扰磷酸盐转运蛋白活性的抑制剂“直接”进行施用(即，施用抑制剂本身)。备选地，或此外，可以将这种抑制剂，例如通过施用包含编码适当抑制剂的赋形剂的载体进行“间接”施用。这种赋形剂可以，例如，包含编码产物的核酸，所述产物能干扰负责控制磷酸盐转运蛋白表达的调控路径。例如，所述赋形剂可以包含编码磷酸盐转运蛋白转录抑制剂的基因。
技术人员将理解还可以将磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和/或膦酰基-羧酸(或其药用衍生物)用于预防和/或治疗非病毒性上皮损伤或由这种损伤导致或表征的疾病的方法中。
因此，按照本发明的第三个方面，提供一种预防和/或治疗非病毒性上皮损伤或由这种损伤导致或表征的疾病的方法，所述方法包含向需要这种预防和/或治疗的患者施用有效量的磷酸盐转运蛋白活性的抑制剂。
另外，按照本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗非病毒性上皮损伤或由这种损伤导致或表征的疾病的方法，所述方法包含向需要这种预防和/或治疗的患者施用有效量的膦酰基-羧酸或其药用衍生物。
按照本发明的治疗药物或方法的应用特别适合于预防和/或治疗上皮的产克隆干细胞的非病毒性损伤，和预防和/或治疗由这种损伤导致或表征的疾病。所述药物的作用可以是保护克隆产生干细胞免受损伤(即，预防损伤发生)，或提高产克隆干细胞从损伤中恢复的能力(即，在损伤后提高细胞存活)，或这两种作用方式的组合。
在所有测试的上皮组织中，本发明的治疗药物和方法适合于预防和/或治疗上皮损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病。本发明人相信本发明的治疗药物和方法可以有效地用于治疗由器官移植和组织移植引起的上皮损伤(包括受体上皮细胞和供体上皮细胞二者的损伤)以及与上皮组织的伤口关联的上皮损伤，和疾病诸如银屑病和脱发。磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和膦酰基-羧酸(和它们的衍生物)的应用也在组织和细胞培养的方法中具有效用。
我们已经发现按照本发明的治疗药物或方法的应用特别适合于用在预防和/或治疗由针对消化上皮的非病毒性损伤导致或表征的疾病。所谓“消化上皮”指涉及消化的任何组织的上皮，特别是胃肠道的上皮(对于本发明，将其限定为从口到肛门的管道，包括所有的口腔粘膜)。更优选，消化上皮可以是肠的上皮或口腔粘膜的上皮。
本发明的治疗的药物和方法还适合用于预防和/或治疗表皮的非病毒性损伤(或由这种损伤导致或表征的疾病)，所述表皮包括表皮附件诸如毛发滤泡。还可以将本发明的药物和治疗用于预防和/或治疗表皮损伤诸如晒伤，以及相关的由日光照射引起的水疱。
在消化上皮的损伤中，可以将按照本发明的治疗的药物或方法用于预防和/或治疗疾病诸如腹泻、结肠炎、溃疡性结肠炎、粘膜炎、溃疡、外科手术或意外创伤以及反应性疾病诸如炎性肠疾病(例如，局限性回肠炎等)。
发明人已经发现按照本发明的治疗药物和或方法对于治疗和/或预防由应用在癌症治疗中的疗法，具体地化学疗法和放射性疗法导致的上皮损伤，以及治疗和/或预防由这种上皮损伤导致或表征的疾病是特别有效的。
癌症在大多数发达国家中是第二大常见致死原因。估计在目前活着的美国人中有1/3将最终发展成癌症。化学疗法和放射性疗法是治疗癌症的最常见疗法，然而认识到它们具有许多不利的副作用。在这些副作用中，有许多是由对健康上皮细胞造成的损伤所导致的。经常发生的实例包括由对消化上皮的损伤导致的腹泻和由对见于皮肤诸如头皮中的毛发滤泡的上皮细胞的损伤导致的脱发。按照本发明的治疗的药物和或方法在预防和或治疗由施用于癌症患者的放射性疗法或化学疗法所引起的腹泻中是特别有效的。
因此，按照本发明的第五个方面，提供了将磷酸盐转运蛋白活性抑制剂用于制备预防和/或治疗由放射性疗法和/或化学疗法导致的粘膜炎和/或腹泻的药物的应用。
在本发明的第六个方面中，提供了将膦酰基-羧酸，或其药用衍生物用于制备预防和/或治疗由放射性疗法和/或由化学疗法所引起的粘膜炎和/或腹泻的药物的应用。
在本发明的第七个方面中，提供了一种预防和/或治疗由放射性疗法和/或化学疗法引起的粘膜炎和/或腹泻的方法，所述方法包括向需要这种预防和/或治疗的患者施用有效量的磷酸盐转运蛋白活性抑制剂。
在本发明的第八个方面中，提供了一种预防和/或治疗由放射性疗法和/或化学疗法引起的粘膜炎和/或腹泻的方法，所述方法包括向需要这种预防和/或治疗的患者施用有效量的膦酰基-羧酸，或其药用衍生物。
除了由癌症疗法引起的消化上皮的损伤及其后的腹泻，通过微生物感染，胃肠道损伤和/或腹泻也频繁发生。
因此，由非病毒性微生物导致的粘膜炎和/或腹泻组成可以按照本发明被治疗和或预防的优选的疾病。
可以导致针对胃肠上皮的损伤的非病毒性微生物包括细菌和真菌。已知有助于导致疾病诸如腹泻的上皮损伤的微生物的具体实例包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、Cryptosporidiumparvum、大肠杆菌(Escherichia coli)(包括大肠杆菌O157H7和也称作STEC的产志贺菌毒素的大肠杆菌non-O157)、Giardia intestinalis、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和非伤寒，志贺杆菌属(包括痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Toxoplasma gondii、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnficus)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterolitica)。
优选地，将磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和膦酰基-羧酸，或其药用衍生物配制成按照本发明的药物。随后的段落提供可以用在制备这种药物中的适当制剂的细节。如用在随后段落中，将术语“活性剂”用于指磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和/或膦酰基-羧酸(或其药用衍生物)。
通常将活性剂与药用载体结合施用于患者，尽管将理解所述活性剂也可以不与载体物质一起使用。适当的载体包括固体、半固体或液体稀释剂或可吸收的胶囊。
可以配制按照本发明的药物以针对它们意欲预防和/治疗的上皮损伤。例如，可以配制意欲预防和/或治疗针对“易受影响的”上皮，诸如口的消化上皮或头皮的上皮的损伤的药物以进行局部施用。
相反，可以配制意欲预防和/或治疗“不易受影响的”上皮，诸如小肠或结肠的消化上皮的损伤的药物以进行全身施用(例如，通过口或直肠或吸入施用)从而使其进入血流并且接着被传递到上皮的靶目标。或者，可以摄取活性剂，然后其通过胃肠道将直接作用于消化上皮。
局部施用的适当的制剂包括溶液、混悬液、胶冻、凝胶、乳膏剂、软膏剂、喷雾剂、泡沫、粉末、脂质体、锭剂、口香糖、牙膏和漱口剂。在局部应用于消化上皮的情形中，可以特别优选对药物进行配制以进行口服施用或直肠施用(例如，作为栓剂)，并且在局部施用于头皮的情形中，药物可以被配制成香波。在呼吸上皮的非病毒性损伤的情形中，可以将药物配制成，例如，滴鼻剂、鼻内喷雾剂或吸入气溶胶。
适合向皮肤施用的局部组合物可以包括增湿剂和晒黑乳剂(san tanlotion)以及乳膏剂。这种组合物特别适合于用于预防和/或治疗上皮损伤，诸如由目光照射引起的晒伤和水疱的活性剂的施用。
在施加于皮肤的局部应用组合物的情形中，用于携带活性剂的赋形剂可以需要是能穿过皮肤的角质层的那种。满足此目的的适当赋形剂的实例包括二甲亚砜和乙酸。由这种局部组合物提供的活性剂的量是变化的，但典型地可以在介于活性剂的0.05重量％-20重量％之间。已知许多制备局部应用的组合物的方法。例如，活性剂可以混合以已知载体物质诸如异丙醇、丙三醇、石蜡、十八烷醇、聚乙二醇等。
适当的组合物还可以包括已知的化学吸收促进剂。吸收促进剂的实例是例如，二甲基乙酰胺(美国专利号3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美国专利号3,891,757)，某些醇及其混合物(英国专利号1,001,949)。局部应用于未破损的皮肤的载体物质还在英国专利说明书1,464,975中有所描述，其公开了由包含40-70％(v/v)异丙醇和0-60％(v/v)丙三醇以及平衡剂(balance)的溶剂组成的载体物质，所述平衡剂，如果有，是不超过溶剂总体积40％的稀释剂的惰性组分。
或者，技术人员将理解局部施用可以通过局部注射，例如真皮内注射来实现。
所述药物还可以有利地包括为全身施用配制的活性剂。例如，可以以适合于口服施用的方式，诸如片剂、泡腾粉末、胶囊、糖衣丸或液体制剂来配制活性剂。
或者，全身施用可以通过其它路径，诸如直肠给药(在这种情形中，可以将活性剂配制成栓剂)以及鼻内给药(通过，例如，适合于吸入的鼻内喷雾剂或气溶胶)来实现。全身施用的适当制剂还包括可注射的制剂，其中所述活性剂可以，例如，包括膦酰基-羧酸的水溶性药用盐的水溶液。可注射制剂可以在水溶液中任选地包括稳定剂和/或缓冲物质，例如中和缓冲盐溶液。可注射制剂可以以0.5-10％的浓度包含活性剂。溶液的剂量单位可以以安瓿的形式有利地进行提供。
在制备适合用于口服施用的本发明的药物中，活性剂可以混合以固体、粉状的载体以形成片剂、糖衣丸等。这些载体可以被压缩以形成片剂或糖衣丸的核心。适当的载体的实例包括乳糖，蔗糖(saccharose)，山梨糖醇和甘露糖醇，淀粉诸如马铃薯淀粉、支链淀粉，昆布粉末或柑桔果肉粉末，纤维素衍生物或明胶，并且还可包括润滑剂诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙或碳蜡或其它聚乙二醇蜡。如果需要糖衣丸，所述核心可以被，例如可以被浓缩糖溶液或备选地被溶解于易挥发有机溶剂或有机溶剂混合物中的薄膜形成试剂所包被，所述浓缩糖溶液可以包含阿拉伯树胶、滑石和/或二氧化钛。例如，可以将染料加入这些包衣中以区分活性剂中的不同成分。对于制备由明胶和，例如，甘油作为增塑剂组成的软明胶胶囊，或类似的密封胶囊，活性剂可以混和以碳蜡或适当的油诸如芝麻油、橄榄油或花生油。硬明胶胶囊可以包含与固体、粉状载体诸如乳糖、蔗糖(saccharose)、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉(例如，马铃薯淀粉、玉米淀粉或支链淀粉)、纤维素衍生物或明胶一起的活性剂的颗粒，并且还可以包括硬脂酸镁或十八酸作为润滑剂。
可以将用在治疗和/或预防消化上皮的非病毒性损伤中的按照本发明的药物配制成片剂、胶囊或类似物进行口服给药。将理解的是，当以这种方式施用时，所述药物可以在胃肠道中降解，这可能会减少活性剂的有效性，并因此减少药物的有效性。还将理解，治疗在胃肠道中的一个或多个具体位点发生的非病毒性损伤，而不是将胃肠道作为一个整体治疗可能是理想的。因此，可以优选提供具有包衣的口服施用的药物，所述包衣赋予，至少部分的对消化的抗性。还可以将这些包衣用于提供给出持续或延迟释放的活性剂的制剂。已知制备这种包衣的许多方法。
例如，可以通过使用被缓慢溶解的包衣隔开的数层活性剂来制备持续释放的片剂。制备持续释放的片剂的另一种方法是将活性剂的剂量划分为与不同厚度的包衣一起进行提供的颗粒。可以将这种颗粒作为胶囊的内容物进行施用，或将所述颗粒与载体物质一起进行压缩以形成片剂。还可以将活性剂掺入由，例如脂肪和蜡物质诸如生理惰性可塑性物质组成的缓慢溶解的片剂中。
可以将相似的包衣用于产生被配制以在特定位点释放活性剂的药物。例如，可以以“肠溶”包衣提供片剂等，即用抗胃液的肠溶包衣的薄膜层或具有在胃中酸性pH下不溶解的特性的包衣进行提供。在这种肠溶衣包被的药物中，活性剂将直到制剂到达肠时才释放。已知适当肠溶衣的许多实例，并且包括醋酸纤维素邻苯二甲酸酯和hydroxypropulmethylcellulosephtalates(诸如以商品名HP55和HP50和EudragitL以及EudragitS出售的那些)。
泡腾粉末提供另外的优选实施方案，其中可以对按照本发明的药物进行配制以进行口服施用。这些粉末可以通过使活性剂与非毒性的碳酸盐或氢碳酸盐(诸如碳酸钙、碳酸钾和碳酸氢钾)混和，和/或与固体、非毒性酸(诸如酒石酸、抗坏血酸和柠檬酸)混和进行制备。还可以与适当的调味剂和/或甜味剂一起提供泡腾粉末以增加适口性。
进行口服施用的液体制剂代表将其中按照本发明的药物进行配制以进行口服施用的另一种形式。液体制剂的适当形式包括酏剂、糖浆或混悬液。这种液体制剂可以包括约0.1重量％-20重量％的活性剂，并可以另外包含成分诸如糖、乙醇、水、丙三醇、丙二醇和调味剂和/或甜味剂。液体制剂还可以包括分散剂，诸如羧甲基纤维素。
活性成分施用的剂量可以响应许多不同的因子而变化。例如，在由非病毒微生物感染引起的上皮损伤中，感染的严重性可以影响施用的活性剂的量。所需活性剂的量还可以取决于因素诸如被治疗的患者的年龄以及损伤的上皮的区域而发生变化。
将理解的是，可以将包含活性剂的药物组合物适当配制从而使它们作为单一剂量或多剂量单位形式提供在本文预期范围内的剂量。
通常，当本发明药物用于治疗现有的上皮损伤，或由其导致或表征的疾病时，应在损伤一发生或疾病一被诊断时就施用药物。然而，这种损伤或疾病可以发展数天或甚至数周。因此，通过施用本发明的药物，即使是在损伤发生或疾病发展或被诊断后的数天或甚至数周后进行施用，被治疗的受试者可以很好地从中获益。所述药物的治疗性应用可以一直持续到损伤或疾病已经消退到了临床医师的满意程度。
当用作预防药(例如，在癌症疗法诸如化学疗法或放射性疗法之前)时，本发明药物应在一旦意识到上皮损伤的风险时即进行施用。例如，可以优选在以癌症疗法进行治疗时，或在治疗前数小时或数天时施用所述药物。
可以配制按照本发明的制备的药物从而使它们给接受药物的人提供多至每千克体重500mg活性剂的每日剂量。优选地，可以对所述药物进行配制从而使它们提供多至每千克体重250mg的每日剂量，更优选地多至每千克体重120mg的每日剂量，甚至更优选地多至每千克体重60mg的每日剂量。例如，按照本发明的药物可以提供每千克体重50mg的每日剂量，或更优选地每千克30mg，15mg，或5mg的每日剂量，并且最优选地每千克1mg的每日剂量。
优选的施用频率将取决于选定活性剂的生物半衰期。典型地，应将按照本发明药物施用给靶组织从而使在损伤的上皮中的活性剂的浓度，或有风险被损伤的上皮中的活性剂浓度维持在适合于获得治疗效果的水平。这可能需要每日施用或甚至一天数次地施用。
本发明人已经发现在本发明优选的实施方案中，可以将按照本发明的活性剂在施用导致非病毒性上皮损伤的试剂之前(例如，在施用化学治疗剂，或放射性治疗之前)进行施用。例如，可以在上皮损伤发作多至24小时之前，更优选地损伤发作多至12小时之前，并且最优选地在损伤发作一小时之前，将活性剂进行施用。
在施用损伤剂之后的阶段中，可以重复施用活性剂。因此，例如，可以在施用化学疗法或放射性疗法的第一天和随后的时期中，优选地在损伤发作后的至少前两天中，更优选地在损伤发作后的至少三天中，并且更优选地在损伤发作后的至少7天中施用活性剂。
特别优选可以在损伤发作之前和之后都施用按照本发明的活性剂。通过实施例，本发明人已经发现如果在上皮损伤发作之前和损伤之后的至少三天内都施用本发明的药物，其特别有效。
本发明人已经令人惊讶地发现当施用能够导致上皮损伤的多剂量的试剂，诸如化疗剂或辐射时，如果在损伤发作之前而不是在每次施用损伤剂之前或之后，以单剂量形式施用包含活性剂的药物，其可以是特别有效的。
将理解的是，当前述段落提供可能的非限制性实施例和优选的活性剂施用方案时，可以将已知方法，诸如被药物工业所常规应用的那些方法(例如，体内实验、临床试验等)用于确定具体的组合物制剂和精确的治疗方案(诸如活性剂的每日剂量和施用频率)。
按照本发明第九个方面，提供了包含磷酸盐转运蛋白抑制剂和至少一个适合于洗发的表面活性剂的香波组合物。
在本发明的第十个方面中，提供包含膦酰基-羧酸，或其药用衍生物，以及适合于洗发的至少一个表面活性剂的香波组合物。
本发明所认为的“香波”可以包含任何用于清洁、调理、定型或维护头发的任何产品。例如，按照本发明的香波可以是加入药品的香波，具有抗-头皮屑特性的香波，调理剂，沐浴凝胶或身体洗涤剂。还可以通过毛发凝胶、蜡、霜或其它定型制剂的方式来提供按照本发明的活性剂。
香波组合物可以优选地包含活性剂α-Cl-α-Br膦酰基乙酸酯(盐)，但是将理解的是被认为用在按照本发明制备的药物中的活性剂的范围也适合于用在按照本发明的香波中。
磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和/或膦酰基-羧酸(或其药用衍生物)预防和/或治疗由化学治疗引起的上皮损伤的能力是特别值得注意的用途。因此，优选将按照本发明第一个或第二个方面的制备的药物进行配制以产生与化学治疗化合物结合使用的药物。
确实，按照本发明第十一个方面，提供磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和化学治疗化合物的组合。此外，按照本发明第十二个方面，提供膦酰基-羧酸或其药用衍生物以及化学治疗化合物的组合。可以选择磷酸盐转运蛋白活性抑制剂或膦酰基-羧酸(或其药用衍生物)并如所述按照本发明的药物的配制方法对其进行配制。
可以将按照本发明第十一和第十二个方面的组合用于预防发生在经历化学治疗的患者中的上皮损伤，或用在已经患有上皮损伤或由这种损伤表征的疾病的化学治疗患者中，从而使化学治疗继续的同时，预防进一步的损伤发生。将理解的是，这些组合特别适合于用在施用化学治疗药物以治疗胃肠道癌症的背景中。
适合本发明第十一或第十二个方面的组合使用的优选活性剂是α-Cl-α-Br-膦酰基乙酸酯(盐)。化学治疗化合物可以优选地是氟尿嘧啶，其是最常用于胃肠道癌症的化学治疗药物。可以有利地用在按照本发明的组合的其它化学治疗化合物包括doxyrubicin(多柔比星)柔红霉素、甲氨蝶呤、长春新碱、长春碱、美法仑、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、博来霉素、放线菌素D、顺铂、普卡霉素、羟基脲和盐酸丙卡巴肼，已知所有这些都导致粘膜炎。
按照本发明的组合可以是其中活性剂和化学治疗化合物以单独剂型进行提供的组合。
或者，组合可以包括以剂型形式存在的活性剂和化学治疗化合物的混合物。
所谓“剂型”指适合于施用的形式，并且包括选定的活性剂和/或化学治疗化合物的剂量。这些剂量可以按照所需的活性剂或化学治疗化合物的量，以及所需施用的频率来确定。因此，剂型可以，例如，包括待施用的活性剂和化学治疗化合物的周剂量，或日剂量，或日剂量的部分。
现在将参考附图对实验数据进行描述，其中
图1.举例说明响应于由辐射或细胞毒性化学品导致的上皮损伤的磷酸盐转运蛋白表达的增加；图2.举例说明用膦甲酸，或用赋形剂对照治疗的被照射小鼠中腹泻的发生率；图3.举例说明在用对照治疗或膦甲酸治疗的动物中的覆盖舌前侧表面(ventral surface)的上皮的随时间的总体细胞构成，所述动物已经被用化学治疗剂5FU给药；图4.比较了在用膦甲酸治疗和对照治疗的动物中的覆盖舌前侧表面的上皮中的每单位面积的细胞数量；图5.举例说明了在膦甲酸治疗和对照治疗的动物中的肠腺细胞(intestinal crypt cell)的溴脱氧尿苷标记指数；图6.比较了在膦甲酸治疗和载体治疗的动物中的舌前侧表面上的每单位面积的细胞数量随时间的变化；和图7.比较了用膦甲酸治疗和用赋形剂治疗的动物中的覆盖舌前侧表面的上皮的每单位面积存在的额外细胞(extra cell)的平均数量。
实验数据实施例1对响应于上皮损伤的磷酸盐转运蛋白表达调节的研究如下陈述了小鼠受到的两种不同的上皮损伤的实验模型，一种导致化学损伤，另一种导致辐射损伤辐射损伤模型以0.7Gy/分钟的剂量用1Gy X-射线全身辐射处理第一组小鼠(n＝6)，并在辐射处理3小时后杀死小鼠，收集胃肠道组织进行研究。
以0.7Gy/分钟的剂量率用8Gy x-射线全身辐射处理第二组小鼠(n＝6)。辐射处理24小时后杀死被处理的小鼠，并收集胃肠道的组织进行研究。
化学损伤模型以6小时间隔，以40mg/kg体重通过两次IP注射5-氟尿嘧啶来向第三组小鼠(n＝6)给药。在第二次5-氟尿嘧啶处理后24小时杀死被处理的小鼠，并收集胃肠道组织进行研究。
所用的处理还提供向经过癌症治疗的患者施用的疗法的模型。辐射损伤模型提供放射线治疗的模型，并且化学损伤模型提供化学治疗的模型。
使用RNAqueousTM96RNA分离试剂盒(Ambion)从每个样品中制备总RNA。通过代表性总cDNA的实时定量PCR分析来研究上皮损伤对磷酸盐转运蛋白表达的影响(Al Taher，A.，Bashein，A.，Nolan，T.，Hollingsworth，M.和Brady，G.(2000).Global cDNA amplification combined with real-timeRT-PCRaccurate quantification of multiple human potassium channel genes atthe single cell level.Comp Funct GenomicsYeast 17，201-210.Brady，G.，Barbara，M.和Iscove，N.N.(1990).Representative in vitro cDNA amplificationfrom individual hemopoietic cells and colonies.Meth Mol Cell Biol 2，17-25.).
按照生产厂商的说明书所述使用Eurogentec SYBR greenTMcore试剂盒获得实时RT-PCR数据并在ABI PrismTM7000序列检测系统上进行。也称作Mus肌肉溶质载体家族20，成员1(Slc20a1)的用于Pit1的定量分析的寡核苷酸是5′-GCGGTTGTGGTTATTCTTCTGAG-3′(有义)和5′CCCAAAGTTCACATTCCACTTCA-3′(反义).
这些寡核苷酸基于序列登录号NM_015747.1。
图1显示收集自辐射处理、化学处理的动物和对照动物的结肠组织中Pit1表达的数据。对于每一组，给出的数据是6个独立动物的平均值，误差棒指示标准偏差。
辐射处理标记1Gy 3小时的小鼠对应于第一个实验动物组(被用0.7Gy/分钟的剂量率的1Gy X-射线全身辐射进行处理，并在辐射处理后3小时被杀死)，同时辐射处理标记8Gy 24小时的小鼠对应于第二个动物的实验组(被0.7Gy/分钟的剂量率的8Gy X-射线全身辐射进行处理，并在辐射处理24小时后被杀死)。处理标记5FU 24小时的小鼠对应于第三个实验组(以40mg/kg体重，间隔6小时接受两次5-氟尿嘧啶的IP注射并在第二次5-氟尿嘧啶处理后24小时被杀死)。
简而言之，显示于图1的结果举例说明了与未处理的对照动物相比，Pit1的mRNA在被处理动物的损伤的消化性组织中明显增加。这些结果证实响应于辐射-诱导和化学诱导损伤，都发生了Pit1磷酸盐转运蛋白mRNA的明显增加，并且还证实了对辐射处理的响应是剂量-依赖型的。
实施例2腹泻预防测定研究了消化上皮被放射性损伤后，膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防腹泻的能力。
所用的放射性损伤的模型是以0.7Gy/分钟的剂量率用14Gy X-射线部分身体辐射(头和胸被铅屏蔽)进行的处理。这种辐射处理提供施用给经过癌症治疗的患者的放射线治疗的模型。
建立了3个实验组，每组5只小鼠，如下所示组1在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的5天的每天都接受另外一次相同的注射。
组2在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的100mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的5天的每天都接受另外一次相同的注射。
组3赋形剂对照。组1在辐射处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的5天的每天都接受另外一次相同的注射。
在辐射处理后7天过程中测量实验动物中的腹泻(通过每日两次评估肛周soilage进行测量)和致病的发生率。将结果显示于下面的表1&图2中
表1
如可以观察到的，用50mg/千克体重的膦甲酸进行的处理彻底保护免受辐射处理的有害作用。类似地，与赋形剂对照相比，以100mg/千克体重的膦甲酸进行的处理导致了腹泻发生率或相关致病率的减少。这些结果举例说明了本发明的处理预防由消化上皮的辐射损伤导致的腹泻以及相关致病的能力。
实施例3肠上皮产克隆干细胞的体内保护-辐射损伤独立实验1随后的实验举例说明了膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防消化上皮的产克隆干细胞被放射线损伤的能力。
所用的放射性损伤的模型是以0.7Gy/分钟的剂量率用13Gy X-射线的全身辐射进行的处理。这种辐射处理提供了一种施用给经过癌症治疗的患者的放射性疗法的模型。
建立了4个实验组，每组6只小鼠，如下所示组1在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组2在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的100mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组3赋形剂对照。在辐射处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组4未处理的对照。即没有接受注射也没有接触辐射的组。
在处理后的第四天，将每组的动物处死并收集肠组织进行组织学分析。用haemotoxylin和曙红对组织切片进行染色，并对再生肠腺的存在进行分析。再生肠腺衍生自一个或多个存活的产克隆干细胞，而在两天的辐射过程中，无菌的腺管(不包含存活的干细胞)消失。对每个肠环状面的再生腺管的数量进行计数，并且测量平均腺管宽度。然后按照如下等式对每个动物的评分进行校正以说明优先评估更大的腺管的可能性 对于每次处理，使用如下等式计算保护因子 将结果显示于下表2和3中，并且举例说明施用给组1和组2的处理(分别为50mg膦甲酸和100mg膦甲酸)都导致了接触辐射后实验动物中肠腺(intestinal crypt)数量的增加。这说明所述处理保护了肠上皮产克隆干细胞，因为按照定义，它们是能起动这种再生的仅有的细胞。用50mg的膦甲酸处理的小鼠的肠上皮在50mg/kg膦甲酸处理后包含几乎50％更多的腺管(与只用赋形剂处理的小鼠的肠上皮相比)，说明至少50％更多的小肠产克隆干细胞存活。
由于每种产克隆干细胞能产生指数数量的子细胞，这种在存活中大于50％的增加将在细胞增殖后，导致上皮细胞构成的大大的增加。如在实施例1中举例说明的，这种细胞存活和增殖可以减少腹泻，以及溃疡形成(粘膜炎)和其它相关疾病。
表2
表3
实施例4肠上皮产克隆干细胞的体内保护-化学治疗药物损伤通过如下实验举例说明膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防针对消化上皮的产克隆干细胞的细胞毒性损伤的能力。
所用的细胞毒性损伤的模型是用2次服用400mg或500mg 5-氟尿嘧啶/千克体重的5-氟尿嘧啶进行的处理，2次间隔为6小时。这种细胞毒性处理提供施用给经过癌症治疗的患者的化学治疗的模型。建立了5个实验组，每组5只小鼠，如下所示组1在第一次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组2在两次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组3赋形剂对照。在两次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组4在两次细胞毒性处理(500mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受在灭菌水中包含50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组5赋形剂对照。在两次细胞毒性处理(500mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后3天的每天都接受另外一次相同的注射。
在处理后的第四天，将每组的动物处死并收集肠组织进行组织学分析。用haemotoxylin和曙红对组织切片进行染色，并对再生肠腺管的存在进行分析。再生肠腺管衍生自一个或多个存活的产克隆干细胞，而在两天的辐射过程中，无菌的腺管(不包含存活的干细胞)消失。对每个肠环状面的再生腺管的数量进行计数，并且测量平均腺管宽度。然后按照如下等式对每个动物的评分进行校正以说明优先评估更大的腺管的可能性
对于每次处理，使用如下等式计算保护因子
将结果显示于下表4和表5中，并且举例说明施用给组1、组2和组4的处理都导致了接触5-氟尿嘧啶后实验动物中肠腺管数量的增加。这说明所述处理保护了肠上皮产克隆干细胞，因为按照定义，它们是能起动这种再生的仅有的细胞。来自组1的小鼠的肠上皮在50mg/kg膦甲酸处理后包含几乎50％更多的腺管(与只用赋形剂处理的小鼠的肠上皮相比)，说明至少50％更多的小肠产克隆干细胞存活。
由于每种产克隆干细胞能产生指数数量的子细胞，这种在存活中大于50％的增加将在细胞增殖后，导致上皮细胞构成的大大的增加。这种细胞存活和增殖可以减少腹泻，以及溃疡形成(粘膜炎)和其它相关疾病。
表4
表5
实施例5肠上皮产克隆干细胞的体内保护-辐射损伤独立实验2随后的实验举例说明了膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防针对消化上皮的产克隆干细胞的放射线损伤的能力。
所用的放射线损伤的模型是以0.7Gy/分钟的剂量率用13Gy X-射线的全身辐射进行的处理。这种放射线处理提供了一种施用给经过癌症治疗的患者的放射线治疗的模型。
建立了3个实验组，每组6只小鼠，如下所示组1在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组2在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的25mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
组3赋形剂对照。在辐射处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的3天的每天都接受另外一次相同的注射。
在处理后的第四天，将每组的动物处死并收集肠组织进行组织学分析。用haemotoxylin和曙红对组织切片进行染色，并对再生肠腺管的存在进行分析。再生肠腺管衍生自一个或多个存活的产克隆干细胞，而在两天的辐射过程中，无菌的腺管(不包含存活的干细胞)消失。对每个肠环状面的再生腺管的数量进行计数，并且测量平均腺管宽度。然后按照如下等式对每个动物的评分进行校正以说明优先评估更大的腺管的可能性
对于每次处理，使用如下等式计算保护因子
将结果显示于下表6和7中，并且举例说明施用给组1和组2的处理(分别为50mg膦甲酸和25mg膦甲酸)都导致了接触辐射后实验动物中肠腺管数量的增加。这说明所述处理保护了肠上皮产克隆干细胞，因为按照定义，它们是能起动这种再生的仅有的细胞。用50mg的膦甲酸处理的小鼠的肠上皮在50mg/kg膦甲酸处理后包含几乎50％更多的腺管(与只用赋形剂处理的小鼠的肠上皮相比)，说明至少50％更多的小肠产克隆干细胞存活。
由于每种产克隆干细胞能产生指数数量的子细胞，这种在存活中大于50％的增加将在细胞增殖后，导致上皮细胞构成的大大的增加。这种细胞存活和增殖可以减少腹泻，以及溃疡形成(粘膜炎)和其它相关疾病。
表6
表7
实施例6化学治疗损伤后口腔粘膜的体内保护通过如下实验举例说明膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防针对口腔粘膜的细胞毒性损伤的能力。
所用的细胞毒性损伤的模型是用6小时间隔的400mg/千克体重的5-氟尿嘧啶的两次给药进行的处理。这种细胞毒性处理提供施用给经过癌症治疗的患者的化学治疗的模型。
建立了试验组，每组5只小鼠，如下所示组1未处理的对照。
组2在第一次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受另外一次相同的膦甲酸的注射(50mg/千克体重)。在处理后的第四天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组3在第一次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受另外一次相同的膦甲酸的注射(50mg/千克体重)。在处理后的第六天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组4在第一次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受另外一次相同的膦甲酸的注射(50mg/千克体重)。在处理后的第八天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组5赋形剂对照。在两次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后的三天的每天都接受一次另外相同的水的注射。在处理后的第四天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组6赋形剂对照。在两次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前1小时，接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后的三天的每天都接受另外一次相同的水的注射。在处理后的第六天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组7赋形剂对照。在两次细胞毒性处理(400mg 5-氟尿嘧啶/千克体重)前一小时，接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受一次另外的相同的水注射。在处理后的第八天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
用硫堇对组织切片进行染色，并使用Zeiss AxioHOME，在舌前侧表面的基底层和上基层上都对细胞的数量进行评估。沿着基底层的长度测量从基底层到角质层粒层的界面的面积。在从舌尖后2mm的5个连续的区域内进行这种测量。通过这种测量，可以将5FU造成的对舌的损伤评定为舌的总细胞构成或细胞的总数/单位面积(mm2)。
将实施例6的结果显示于图3和图4。
在两次间隔6小时的5FU注射发生之前1小时施用膦甲酸(50mg/kg体重)或单独的赋形剂。然后，每日另外施用膦甲酸或赋形剂，施用3天。
图3和图4中指出的时间是5FU处理后的天数。
图3举例说明了在施用化疗剂5FU后随着时间的流逝，覆盖舌前侧表面的上皮的总细胞构成。线条显示关于膦甲酸处理和单独的赋形剂的值。
图4比较了膦甲酸处理的动物和对照处理的动物的覆盖舌前侧表面的上皮中的每单位面积的细胞数量。该结果显示通过膦甲酸处理获得的每单位面积的额外细胞的数量。
实施例7肠上皮产克隆干细胞的体内保护-化学治疗药物损伤-独立实验2在随后研究中将阐述实施例4中出现的数据，其中使用随后的实验研究了膦甲酸(膦酰基-甲酸三钠盐六水合物)预防针对消化上皮的产克隆干细胞的细胞毒性损伤的能力。
所用的细胞毒性损伤的模型是用以6小时间隔，400mg的5-氟尿嘧啶/千克体重的两次给药进行的处理。这种细胞毒性处理提供施用给经过癌症治疗的患者的化学治疗的模型。
建立了8个实验组，每组6只小鼠，如下所示组1在第一次细胞毒性处理前1小时，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受另外一次相同的注射。
组2在第一次细胞毒性处理前1小时，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。
组3在细胞毒性处理后三天的每一天都接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/kg体重的腹膜内注射。
组4在第一次细胞毒性处理前5分钟，接受包含在无菌水中的50mg膦甲酸/kg体重的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每一天都接受一次另外的相同注射。
组5赋形剂对照。在第一次细胞毒性处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后的每天都接受一次另外的相同的注射。
组6赋形剂对照。在第一次细胞毒性处理前1小时，接受无菌水的腹膜内注射。
组7赋形剂对照。在细胞毒性处理后三天的每天都接受无菌水的腹膜内注射。
组8赋形剂对照。在第一次细胞毒性处理前5分钟接受无菌水的腹膜内注射。在细胞毒性处理后三天的每天都接受一次另外的相同注射。
在处理后的第四天，将每组的动物处死并收集肠组织进行组织学分析。用haemotoxylin和曙红对组织切片进行染色，并对再生肠腺管的存在进行分析。再生肠腺管衍生自一个或多个存活的产克隆干细胞，而在两天的辐射过程中，无菌的腺管(不包含存活的干细胞)消失。对每个肠环状面的再生腺管的数量进行计数，并且测量平均腺管宽度。然后按照如下等式对每个动物的评分进行校正以说明优先评估更大的腺管的可能性 对于每次处理，使用如下等式计算保护因子 将结果显示于下表8和9中，并且举例说明施用给组1、组2、组3和组4的处理都导致了接触5-氟尿嘧啶后实验动物中肠腺管数量的增加。这说明所述处理保护了肠上皮产克隆干细胞，因为按照定义，它们是能起动这种再生的仅有的细胞。组1的小鼠的肠上皮在经过50mg/kg膦甲酸处理后包含几乎50％更多的腺管(与只用赋形剂处理的小鼠的肠上皮相比)，说明至少50％更多的小肠产克隆干细胞存活。
由于每种产克隆干细胞能产生指数数量的子细胞，这种在存活中50％的增加将在细胞增殖后，导致上皮细胞构成的大大的增加。这种细胞存活和增殖可以减少腹泻，以及溃疡形成(粘膜炎)和其它相关疾病。
表8
表9
实施例8膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)的口服施用后的上皮细胞的动力学评价通过随后的实验举例说明口服施用膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)后对肠上皮细胞的刺激作用。
建立了两个实验组，每组三只小鼠，如下所示组1接受包含在无菌水中的500mg膦甲酸/千克体重的口服管饲，一天一次，共4天。在第5天，所述动物接受脉冲输送的10mg的溴脱氧尿苷(BrdUrd)，并且40分钟后将其杀死，收集小肠和肾进行分析。
组2接受无菌水的口服管饲，一天一次，共4天。在第5天，所述动物接受脉冲输送的10mg的溴脱氧尿苷，并且40分钟后将其杀死，收集小肠和肾进行分析。
要注意的是，用在实施例9中的膦甲酸口服施用剂量大于在前述实施例中所用的腹膜内注射施用剂量。这说明了口服施用是可以提供膦甲酸从而影响上皮细胞活性的适当路径，并且还说明相对高剂量的膦甲酸可以被耐受而没有显著的毒性。
在实验过程中，在任何组中都没有发现死亡或疾病迹象，并且在处理阶段的结尾，通过组织学切片判断，没有组显示明显的肾损伤的迹象。
对载玻片进行BrdUrd的免疫组织化学标记并用硫堇进行复染以评价肠上皮细胞动力学随膦甲酸的口服施用发生的变化。为了评价上皮细胞的动力学变化，基于细胞定位基础，对每只动物的50个小肠腺管定量在腺管中每个细胞位置的阳性标记的S-相细胞的数目。定量在腺管的底部(细胞位置1)开始并沿着腺管一侧向上直至腺管绒毛汇合处，依次评估每个细胞。
在图5中举例说明实施例8的结果，其显示在膦甲酸处理的动物和对照处理的动物的肠腺管细胞中的BrdUrd标记指数(计算为细胞总数的百分比)。图5举例说明与赋形剂对照相比，膦甲酸具有对肠腺管细胞的刺激效应。
实施例9辐射损伤后口腔粘膜的体内保护通过随后的实验举例说明膦甲酸(膦酰基甲酸三钠盐六水合物)预防针对口腔粘膜的放射线损伤的能力。
所用的细胞毒性损伤的模型是以0.7Gy/分钟的剂量率用20Gy X-射线进行的处理(仅头部)。这种辐射处理提供了一种施用给经过癌症治疗的患者的放射治疗的模型。
建立了实验组，每组4只小鼠，如下所示组1在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的2天的每天都接受另外一次相同的注射。在辐射后的第三天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组2在辐射处理前1小时接受包含在灭菌水中的50mg膦甲酸/千克体重的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的4天的每天都接受另外一次相同的注射。在辐射后的第五天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组3在辐射处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的2天的每天都接受另外一次相同的注射。在辐射后的第三天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
组4在辐射处理前1小时接受无菌水的腹膜内注射。在辐射处理后接下来的4天的每天都接受另外一次相同的注射。在辐射后的第五天，将动物处死，并收集口腔组织进行分析。
用溴脱氧尿苷对组织切片进行免疫组织化学标记，并用硫堇进行复染。使用Zeiss AxioHOME，在舌前侧表面的基底层和上基层上都对溴脱氧尿苷标记和未标记的细胞的数量进行评估。沿着基底层的长度测量从基底层到角质层粒层的界面的面积。在从舌尖后2mm的5个连续的区域内进行这种测量。通过这种测量，可以将辐射造成的对舌的损伤评定为舌的总细胞构成或细胞的总数/单位面积(mm2)。
将实施例9的结果举例说明于图6和图7中。
图6比较了膦甲酸处理和赋形剂处理的动物的舌的前侧表面上的每单位面积的细胞数量随时间的变化。图6中显示的结果举例说明与赋形剂对照(无菌水)相比，前侧舌的总细胞构成随时间被辐射前和辐射后的膦甲酸处理所增加。
图7比较了膦甲酸处理和赋形剂处理的动物的覆盖舌前侧表面的上皮中每单位面积的额外细胞的平均数量。该结果显示与赋形剂(灭菌水)对照相比，用膦甲酸处理后，每单位面积的平均细胞数量增加。
对于图6和图7二者而言，处理是在20Gy辐射(仅头部)之前用膦甲酸(50mg/kg体重)或灭菌水进行注射，然后，一天一次直到取出样品(最后1次注射在处死前24小时)。图6和图7的X轴显示的时间都是辐射后的天数。
讨论出现在实施例1-9的累积实验数据清楚显示磷酸盐转运蛋白活性抑制剂膦甲酸有效减少了上皮损伤。
膦甲酸能减少肠上皮的两种损伤，并因此减少腹泻的病例，和对口腔粘膜的损伤。而且，由于以前用上皮保护性试剂诸如角质形成细胞生长因子(KGF)进行的研究已经显示肠上皮的保护是有效保护口腔粘膜和减少脱发的有力指示物(Booth，C.，和Potten，C.S.(2000).Keratinocyte growth factorincreases hair follicle survival following cytotoxic insult.J Invest Dermatol114，667-673；Farrell，C.L.，Bready，J.V.，Rex，K.L.，Chen，J.N.，DiPalma，C.R.，Whitcomb，K.L.，Yin，S.，Hill，D.C.，Wiemann，B.，Starnes，C.O，等(1998).Keratinocyte growth factor protects mice from chemotherapyand radiation-induced gastrointestinal injury and mortality.Cancer Res 58，933-939；Farrell，C.L.，Rex，K.L.，Chen，J.N.，Bready，J.V.，DiPalma，C.R.，Kaufman，S.A.，Rattan，A.，Scully，S.，和Lacey，D.L.(2002).The effects of keratinocyte growth factor in preclinical models of mucositis.Cell Prolif35Suppl 1，78-85)，实施例1-9中出现的数据还指示磷酸盐转运蛋白活性抑制剂，诸如膦甲酸和相关化合物，将保护广泛范围的上皮免受非病毒性的损伤。
实施例10制剂如下产生可以按照本发明使用的不同制剂的实例。
参考优选以其三钠盐的形式使用的膦酰基甲酸举例说明所述制剂，，但是要理解这种制剂对于其它磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是适合的。
10.1香波组合物组成 量(重量份)Ammonium Laureth Sulfate25gAmmonium Lauryl Sulfate 16.666g瓜耳胶hydroxypropyltrimonium chloride 0.833g膦酰基-甲酸 0.2-20g
1-癸烯均聚物0.42Trimethylpropane capyl caprylate0.42Dimethieone 2.08乙二醇二硬脂酸酯(distearate)2.08Cocamide MEA1.25十六烷醇1.875g丙二醇 0.208g羟苯甲酸甲酯0.208g水和minors 加足到100.0g方法将介于1/3和全部之间的ammonium laureth sulfate(被加入作为25重量％的溶液)加入有套层的混和桶中，并将其加热到约60℃-约80℃，伴随缓慢搅拌以形成表面活性剂溶液。将Cocamide MEA和脂肪族醇加入桶中并使其分散。将盐(例如氯化钠)和pH改性剂(例如，柠檬酸、柠檬酸钠)加入桶中并使其分散。将乙二醇二硬脂酸酯(“EGDS”)加入混和容器中并使其融化。EGDS融化和分散后，将防腐剂(羟苯甲酸甲酯)加入表面活性剂溶液。把得到的混和物冷却至约25℃-约40℃并收集在最后的桶中。作为此冷却步骤的结果，EGDS结晶以在产物中形成晶体网络。将包括硅氧烷和膦酰基甲酸的ammonium laureth sulfate和其它成分的剩余物加入最后的桶中，伴随搅拌以确保均匀混和。阳离子聚合物分散在水中成约0.1％-约10％的水溶液，并然后将其加入最终的混合物中。一旦已经加入所有的成分，如果需要，可以加入另外的粘性和pH改性剂到混合物中以调节产物的粘性和pH到所需的程度。
10.2应用到头皮的泡沫成分量膦酰基甲酸 0.2-20g十六烷醇BP 1.10g十八烷-1-醇BP0.50 1.10g
Polysorbate 60BP 0.40g乙醇 57.79g丙二醇BP 2.00g无水柠檬酸BP 0.073g柠檬酸钾 0.027g丁烷/丙烷 4.30g水和minors 加足到.100.0g方法将十六烷醇(HYFATOL 1698，Efkay Chemicals Limited，London)，十八烷-1-醇(HYFATOL 1898，Efkay Chemicals Limited，London)，Polysorbate60(CRILLET3，Croda Chemicals，North Humberside)和乙醇以正确比例混和并将其加热到约45℃，同时持续搅拌直到混合物变得澄清。将膦酰基甲酸缓慢转移到混合物中，同时持续搅拌直到混合物变得澄清。(醇相)将纯化的水单独加热到45℃，并将无水柠檬酸BP和柠檬酸钾BP转移到水中，同时持续搅拌直到溶解。(水相)于室温将醇相和水相每个都经过75微米的筛网过滤并将所需重量填充到罐中(铝，环氧衬里)。连接上阀后，将丁烷/丙烷推进剂(推进剂P70)加入罐中的混和物中以达到所需重量，并将调节器(actuator)加入阀中。
所述组合物在从罐喷射到皮肤上去后，产生不耐热的(thermophobic)的泡沫，其在皮肤产生的热量下分解以释放活性化合物到表皮。
10.3吸入的气溶胶
10.4片剂
10.5栓剂
10.6糖浆(I)
10.7注射溶液
10.8吸入溶液
10.9舌下片剂
10.10滴剂(I)
10.11糖浆(II)
10.12注射用溶液
10.13吸入溶液
10.14滴剂(II)
10.15局部使用的溶液
10.16凝胶
10.17软膏剂(I)
还已经制备了含0.2、0.5、1.0和2.0g的膦酰基甲酸三钠盐的制剂。
10.18软膏剂(II)
10.19软膏剂(III)
10.20抗胃液片剂如上所述，用下列组成的包囊涂料溶液包被片剂。
在常规涂布盘上通过倾倒方法或通过在一个盘状喷雾片剂涂布器上喷雾来进行包被。
权利要求
1.磷酸盐转运蛋白活性抑制剂用于制备预防和/或治疗上皮的非病毒性损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病的药物中的应用。
2.按照权利要求1的应用，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是膦酰基-羧酸，或其药用衍生物。
3.按照权利要求2的应用，其中所述膦酰基-羧酸是式R1R2P(O)-Ln-CO2H，或其盐或酯，其中n是0或1，R1和R2是相同的或不同的，并且每个是羟基或酯残基；并且L是具有1-8个碳原子的烃基。
4.按照权利要求3的应用，其中所述膦酰基-羧酸是膦酰基甲酸或膦酰基乙酸。
5.按照权利要求2-4任一项的应用，其中所述药用衍生物是所述酸的盐或酯。
6.按照权利要求4的应用，其中所述药用衍生物是膦酰基乙酸或膦酰基甲酸的碱金属盐。
7.按照权利要求6的应用，其中所述碱金属盐是钠盐。
8.按照权利要求7的应用，其中所述钠盐是三钠盐。
9.按照权利要求8的应用，其中所述三钠盐是膦酰基甲酸三钠盐。
10.按照权利要求2-4任一项的应用，其中所述衍生物是胺或季铵盐。
11.按照权利要求1的应用，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是phosphatonin。
12.按照权利要求11的应用，其中phosphatonin是成纤维细胞生长因子23(FGF23)。
13.按照权利要求11的应用，其中phosphatonin是卷曲-相关蛋白4(FPF4)。
14.按照前述权利要求任一项的应用，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是钠-依赖型磷酸盐转运蛋白活性抑制剂。
15.按照权利要求14的应用，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是III型钠依赖型磷酸盐转运蛋白活性抑制剂。
16.按照前述权利要求任一项的应用，其中所述损伤针对上皮的产克隆干细胞。
17.按照前述权利要求任一项的应用，其中所述上皮是消化上皮。
18.按照权利要求17的应用，其中所述损伤出现于疾病中，所述疾病选自包含下列的组粘膜炎、腹泻、结肠炎、溃疡、外科手术或意外损伤以及反应性疾病诸如炎性肠疾病。
19.按照权利要求1-16任一项的应用，其中所述上皮是头皮的上皮。
20.按照前述权利要求任一项的应用，其中所述非病毒性损伤由癌症治疗所导致。
21.按照权利要求20的应用，其中所述非病毒性损伤由化学疗法所导致。
22.按照权利要求20的应用，其中所述非病毒性损伤由放射疗法所导致。
23.按照权利要求1-19任一项的应用，其中所述非病毒性损伤由微生物感染所导致。
24.按照权利要求1-19任一项的应用，其中所述非病毒性损伤由反应性疾病诸如炎性肠疾病所导致。
25.按照前述权利要求任一项的应用，其中配制所述药物以适于注射。
26.按照权利要求1-24任一项的应用，其中配制所述药物以适于口服施用。
27.按照权利要求1-24任一项的应用，其中配制所述药物以适于直肠施用。
28.按照前述权利要求任一项的应用，其中配制所述药物以适于全身施用。
29.按照权利要求1-27任一项的应用，其中配制所述药物以适于局部施用。
30.按照权利要求29的应用，其中将所述药物配制成香波。
31.按照前述权利要求任一项的应用，其中对所述药物进行配制以与化学治疗化合物结合使用。
32.按照权利要求31的应用，其中所述药物包含磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和化学治疗化合物的混合物。
33.按照权利要求31的应用，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和化学治疗以单独的剂型进行提供。
34.权利要求31-33任一项的应用，其中化学治疗化合物是氟尿嘧啶。
35.选自包含膦酰基乙酸和膦酰基甲酸，及其药用衍生物的组中的化合物用于制备预防和/或治疗由放疗和/或化学疗法导致的腹泻和/或粘膜炎的药物中的应用。
36.选自包含膦酰基乙酸和膦酰基甲酸，及其药用衍生物的组中的化合物用于制备预防和/或治疗由非病毒性微生物感染导致的腹泻的药物中的应用。
37.一种香波组合物，其包含磷酸盐转运蛋白活性抑制剂和至少一种适合于洗发的表面活性试剂。
38.按照权利要求37的香波组合物，其中所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂是膦酰基-羧酸，或其药用衍生物。
39.按照权利要求38的香波，其中所述膦酰基-羧酸化合物是乙酸或甲酸形式。
40.膦酰基-羧酸，或其药用衍生物用于制备预防和/或治疗上皮的非病毒性损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病的药物中的应用。
41.按照权利要求40的应用，其中所述膦酰基-羧酸或衍生物是如权利要求3-10任一项所认为的酸或衍生物。
全文摘要
本发明提供了磷酸盐转运蛋白活性抑制剂用于制备预防和/或治疗上皮的非病毒性损伤，或由这种损伤导致或表征的疾病的药物的应用。所述磷酸盐转运蛋白活性抑制剂可以任选地是膦酰基－羧酸，或这种酸的药用衍生物。本发明还提供使用这些抑制剂，酸和衍生物进行治疗的方法。
文档编号A61K45/06GK1787813SQ200480013085
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月11日 优先权日2003年3月14日
发明者G·布雷迪 申请人:艾皮斯托姆有限公司