专利名称：炎症性肠病预防和/或治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及炎症性肠病的预防和/或治疗剂，更详细而言涉及溃疡性大肠炎或克隆氏病等炎症性肠病的预防和/或治疗剂。
背景技术：
人炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，下面简称为“IBD”)是大肠和小肠的粘膜发生慢性炎症或溃疡，呈慢性经过的炎症性疾病，该疾病的病因还不知道(例如，参见非专利文献1)。上述IBD除包括溃疡性大肠炎或克隆氏病以外，广义上还包括肠道型白塞氏病或缺血性肠炎等，上述溃疡性大肠炎主要侵袭大肠粘膜，是一种形成糜烂或溃疡的原因不明的弥漫性非特异炎症，上述克隆氏病是伴随纤维化或溃疡、以及非特异性肉芽肿的炎症性疾病。目前，在日本，上述疾病的患者越来越多，根据前年厚生劳动省难治愈性肠管障碍研究班报告，溃疡性大肠炎、克隆氏病已经波及共10万人，特别是在10多岁～20多岁的年轻人中多见，目前无法根治，毕生都要与上述疾病斗争、是一种痛苦的疑难病。
炎症的作用机制和IBD的免疫应答还不明确，但目前已经明确肿瘤坏死因子(下面称为“TNF”)α或巨噬细胞游走阻止因子等各种炎症介质与病变或恶化有关。(例如，参见非专利文献2至5)。
目前针对IBD的治疗主要是使用5-氨基水杨酸(5-aminosalicylicacid、简称为“5-ASA”)、糖皮质激素、免疫抑制剂或免疫控制剂。但是，也存在对上述治疗具有耐性的患者。最近，作为新型治疗剂，开发了抗TNF-α单克隆抗体(例如，参见非专利文献6和7)。上述抗体抑制TNF-α的活性，快速改善克隆氏病患者的肠炎症状。但是，常常并发感染和恶性肿瘤等副作用(例如，参见非专利文献8和9)。上述副作用使抗TNF-α单克隆抗体的治疗难以继续。
热休克蛋白质(下面简称为“HSP”)是显示保护性质、控制免疫应答的应激诱导型蛋白质(例如，参见非专利文献10)。HSP的主要功能是作为针对异常折叠或变异蛋白质的细胞内侣伴蛋白(chaperone)发挥作用，在应激条件下，赋予细胞细胞保护机能。作为多种HSP的一种，有因分子量约为70kDa而得名的HSP70。其亚科中，有针对作用于胃、肝脏和心脏的应激具有很强的细胞保护功能的蛋白质(例如，参见非专利文献11至14)。HSP70转基因小鼠对心脏损伤模型显示抵抗型(例如，参见非专利文献15和16)。在人的肠道中，溃疡性大肠炎与大肠粘膜的非特异性大肠炎比较，HSP70的表达增加(参见非专利文献17)。但是，对于HSP在IBD的疾病进展中的作用还没有进行充分的研究。
但是，香叶基香叶基丙酮(geranyl geranyl acetone)(下面简称为“GGA”)是保护胃免受溃疡等损伤的非环式聚异戊烯化合物。已知该化合物不影响胃酸分泌，有效地保护胃粘膜免受各种应激(例如，参见非专利文献18至20)。另外，GGA不仅合成或分泌胃粘蛋白(参见非专利文献21)，还增强糖蛋白质或表面活性磷脂成分的合成或分泌(参见非专利文献22)。几年前，报导了GGA诱导胃粘膜细胞中HSP70的表达(参见非专利文献23)。而且，GGA经口给药，在体内多处局部组织诱导HSP70的表达，保护组织免于破坏和炎症(参见非专利文献24至26)。
另外，已经提交了记载GGA对炎症性肠病有效的专利申请(参见专利文献1)，但只是在权利要求范围中记载，在详细的说明中完全没有记载显示香叶基香叶基丙酮对炎症性肠病有效的实验例，所以对炎症性肠病是否有效还不明确。
为了研究诱导肠内炎症或免疫应答的因子，利用了很多实验动物模型。在上述模型中，考虑到模型本身的可靠性和便利性，广泛利用葡聚糖硫酸钠(下面简称为“DSS”)或2，4，6-三硝基苯磺酸(下面简称为“TNBS”)诱导肠炎模型(例如，参见非专利文献27至29)。
另一方面，作为同样的胃粘膜保护剂，已知依卡倍特钠(ecabetsodium)，虽然已知其用作如本发明的炎症性肠病的预防、治疗剂(例如，参见专利文献2)，但依卡倍特钠与GGA的化学结构并不相似，而且因为经口给药难以到达大肠等下部消化道，所以为了用于炎症性肠病的治疗，如上述专利文献1中几个实验例所示，至少需要灌肠给药。在所述灌肠的情况下，由于在炎症部位周围直接给药，因此除给患者带来很大的负担以外，还存在因药物不能到达降大肠或横大肠的一部分而限定治疗范围的问题。
非专利文献1Podolsky DK.Inflammatory bowel disease.N Engl JMed 2002；347417-29.
非专利文献2Sartor RB.Pathogenesis and immune mechanisms ofchronic inflammatory bowel disease.Am J Gastroenterol 1997；92(12Suppl.)5S-11S.
非专利文献3Papadakis KA，Targan SR.Role of cytokines in thepathogenesis of inflammatory bowel disease.Annu Rev Med 2000；51289-98.
非专利文献4de Jong YP，Abadia-Molina AC，Satoskar AR，et al.Development of chronic colitis is dependent on the cytokine MIF.2001；21061-66.
非专利文献5Ohkawara T，Nishihira J，Takeda H，et al.Ameliorationof dextran sulfate sodium-induced colitis by anti-macrophage migrationinhibitory factor antibody in mice.Gastroenterology 2002；123256-70.
非专利文献6van Dullemen HM，van Deventer SJ，Hommes DW，et al.Treatment of Crohn’s disease with anti-tumor necrosis factor chimericmonoclonal antibody(cA2).Gastroenterology 1995；109129-35.
非专利文献7Targan SR，Hanauer SB，van Deventer SJ，et al.Ashort-term study of chimeric monoclonal antibody cA2to tumor necrosisfactor alpha for Crohn’s disease.Crohn’s Disease cA2Study Group.N Eng JMed 1997；3371029-35.
非专利文献8Bickston SJ，Lichtenstein GR，Arseneau KO，et al.Therelationship between infliximab treatment and lymphoma in Crohn’s disease.Gastroenterology 1999；1171433-37.
非专利文献9Keane J，Gershon S，Wise RP，et al.Tuberculosisassociated with infliximab，a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent.N Engl J Med 2001；3451098-104.
非专利文献10Pockley AG.Heat shock protein as regulators of theimmune response.Lancet 2003；9；362(9382)469-76.
非专利文献11Nakamura K，Rokutan K，Marui N，et al.Induction ofheat shock proteins and their implication in protection againstethanol-induced damage in cultured guinea pig gastric mucosal cells.Gastroenterology 1991；101161-166.
非专利文献12Mestril R，Chi SH，Sayen MR，et al.Expression ofinducible stress protein 70 in rat heart myogenic cells confers protectionagainst stimulated ishemia-induced injury.J Clin Invest 1994；93759-767.
非专利文献13Urayama S，Musch MW，Retsky J，et al.Dexamethasone protection of rat IEC against oxidant injury mediated byinduction ofheat shock protein 72.J Clin Invest 1998；1021860-1865.
非专利文献14Fujimori S，Otaka M，Otani S，et al.Induction of a72-kDa heat shock protein and cytoprotection against thioacetamide-inducedliver injury in rats.Dig Dis Sci 1997；421987-1994.
非专利文献15Marber MS，Mestril R，Chi SH，et al.Overexpression ofthe rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increasesthe resistance of the heart to ischemic injury.J Clin Invest 1995；951446-56.
非专利文献16Hutter JJ，Mestril R，Tam EK，et al.Overexpression ofheat shock protein 72 in transgenic mice decreases infarct size in vivo.Circulation 1996；941408-11.
非专利文献17Ludwig D，Stahl M，Ibrahim ET，et al.Enhancedintestinal expression of heat shock protein 70 in patients with inflammatorybowel disease.Dig Dis Sci1999；441440-47.
非专利文献18Terano A，Shiga J，Hiraishi H，et al.Protective action oftetraprenylacetone against ethanol-induced damage in rat gastric mucosa.Digestion 1986；35182-88.
非专利文献19Pappas TN，Mulvihill SJ，Goto Y，et al.Advances indrug therapy for peptic ulcer disease.Arch Surg 1987；122447-50.
非专利文献20BilskiJ，Sarosiek J，Murty VL，et al.Enhancement ofthe lipid content and physical properties of gastric mucus bygeranylgeranylacetone.BiochemPharmacol 1987；364059-65.
非专利文献21Fujimoto M，Yamanaka T，Bessho M，et al.Effects ofgeranylgeranylacetone on gastrointestinal secresion.Eur J Pharmacol 1982；77113-18.
非专利文献22Ito M，Tanaka T，Suzuki Y.Increasing action ofteprenone，a new antiulcer agent，on high-molecular-weight glycoprotein ingastric mucus during the healing process of acetic acid-induced ulcer in rats.Jpn J Pharmocol 1986；41117-25.
非专利文献23Hirakawa T，Rokutan K，Nikawa T，et al.Geranylgeranylacetone induces heat shock proteins in cultured guinea piggastric mucosal cells and rat gastric mucosa.Gastroenterology 1996；111345-57.
非专利文献24Ooie T，Takahashi N，Saikawa T，et al.Single oral doseof Geranylgeranylacetone induces heat-shock protein 72 and rendersprotection against ischemia/reperfusion injury in rat heart.Circulation 2001；1041837-43.
非专利文献25Yamagami K，Yamamoto Y，Ishikawa Y，et al.Effectsof geranyl-geranyl-acetone administration before heat shock preconditioningfor conferring tolerance against ischemia-reperfusion injury in rat livers.JLab Clin Med 2000；135465-75.
非专利文献26Unoshima M，Iwasaka H，Eto J，et al.Antiviral effectsof geranylgeranylacetoneenhancement of MxA expression andphosphorylation of PKR during influenza virus infection.Antimicrob AgentsChemother 2003；472914-21.
非专利文献27Elson CO，Sartor RB，Tennyson GS，et al.Experimentalmodels of inflammatory bowel disease.Gastroenterology 1995；1091344-67.
非专利文献28Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novelmethod in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerativecolitis in mice.Gastroenterology 1990；98694-702.
非专利文献29Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the ratcolon.Gastroenterology 1989；96795-803.
专利文献1WO02/098398号公报专利文献2特开2002-104962号公报发明内容本发明的目的是提供一种新型制剂，该制剂不给患者带来很大负担、并且在整个肠道的炎症性肠病的预防和/或治疗中安全有效。
本发明人等进行了深入研究，结果发现特定的非环状聚类异戊二烯化合物在肠道中诱导HSP，对于炎症性肠病的预防和/或治疗是有效的，从而实现了本发明。
即，本发明的第一种方案提供含有热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物作为有效成分的肠病预防和/或治疗剂。
本发明的肠病预防和/或治疗剂的优选方案是上述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮(prenylketone)类化合物。
本发明的肠病预防和/或治疗剂的优选方案是上述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本发明的肠病预防和/或治疗剂的优选方案是上述肠病是炎症性肠病。
本发明的肠病预防和/或治疗剂的优选方案是上述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
本发明的肠病预防和/或治疗剂的优选方案是上述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
另外，本发明提供以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分的炎症性肠病的预防剂和/或治疗剂。
本发明的预防剂和/或治疗剂的炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
另外，本发明的第二种方案提供包括给予热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物的步骤的肠病预防和/或治疗方法。
本发明的肠病预防和/或治疗方法的优选方案是上述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮类化合物。
本发明的肠病预防和/或治疗方法的优选方案是上述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本发明的肠病预防和/或治疗方法的优选方案是上述肠病是炎症性肠病。
本发明的肠病预防和/或治疗方法的优选方案是上述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
本发明的肠病预防和/或治疗方法的优选方案是上述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
另外，本发明提供以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分的炎症性肠病的预防方法和/或治疗方法。
本发明的预防方法和/或治疗方法所适用的炎症性肠病是包括克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
而且，本发明的第三种方案提供热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物在制备肠病预防和/或治疗剂中的用途，上述肠病预防和/或治疗剂含有热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物作为有效成分。
本发明的上述用途的优选方案是上述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮类化合物。
本发明的上述用途的优选方案是上述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本发明的上述用途的优选方案是上述肠病是炎症性肠病。
本发明的上述用途的优选方案是上述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
本发明的上述用途的优选方案是上述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
另外，本发明提供热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物在制备炎症性肠病的预防剂和/或治疗剂中的用途，上述炎症性肠病的预防剂和/或治疗剂含有式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分。
本发明用途中的炎症性疾病包括克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
根据本发明，本发明的化合物6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮在肠中诱导热休克蛋白质70，对于肠病，更具体而言对于炎症性肠病的预防和/或治疗是有效的。另外，由于本发明的化合物可以不通过灌肠给药，而进行口服给药，所以能在不给患者带来过度负担的情况下预防和/或治疗肠病。
图1表示本发明中GGA经口给药对DSS给药7天后的临床效果的结果。腹泻和直肠出血的数据是通过F检验分析的。体重损失的变化数据是利用Studentt检验分析的。所有的值都与DSS和对照药处理的小鼠进行比较。另外，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01、***表示P＜0.001，a表示以给药当天为100％时的比率。
图2表示香叶基香叶基丙酮(GGA)对饮用水中含有3％葡聚糖硫酸钠(DSS)给药7天后的大肠短小化的抑制效果的结果。左边的棒图表示正常的对照小鼠的结果，中间的棒图表示给对照药的小鼠的结果，右边的棒图表示以300mg/kg的GGA处理的小鼠的结果。给以对照药的小鼠(n＝10)与GGA处理的小鼠(n＝10)的差异有统计学意义(p＜0.05)。同样的结果在3次独立实验中都得到确认。
图3表示GGA对DSS诱导BALB/c小鼠组织损伤的效果的组织学讨论结果。将大肠组织沿长轴方向展开，用10％的中性缓冲福尔马林固定，然后浸渍在石蜡中。从载玻片上薄薄的组织切片中除去石蜡后，用HE将样品染色。(A)表示只给饮用水的小鼠大肠显微镜照片。(B)表示用3％DSS溶液处理7天的小鼠大肠显微镜照片。观测到重症炎症性细胞浸润和上皮细胞破坏。(C)表示每隔1日对给予3％DSS溶液的小鼠给予对照药的小鼠大肠显微镜照片。呈现与(B)相同的组织学外观。(D)表示每隔1日(共4次)对给予3％DSS溶液的小鼠用300mg/kg的GGA进行处理的小鼠大肠显微镜照片。GGA抑制粘膜和粘膜下组织内的炎症性细胞浸润，并显示出保护大肠粘膜上皮细胞免于破坏的作用。另外，本图中的倍率为100倍。
图4表示3％DSS给药7天后的小鼠的大肠组织学评分结果。在组织损伤的组织学评价中，用显微镜评价炎症性病变程度，利用本说明书的实施例中所述的方法定量。具有小点的棒图表示给对照药的小鼠(n＝10)的结果，黑色棒图表示GGA处理的小鼠(n＝10)的结果。GGA处理的小鼠(n＝10)的结果与给对照药的小鼠(n＝10)的结果比较，组织损伤和病变程度都有意义地被抑制。
图5表示在3％DSS诱导大肠炎的大肠中，HSP25、40、70、90的Western Blot分析结果。大肠组织匀浆是由GGA给药前和给药12小时后的小鼠的大肠配制的。利用SDS-PAGE分离蛋白质，然后转印到硝基纤维素上，使用HSP或β-肌动蛋白特异性抗体免疫印迹HSP25、40、70、90的表达。与给对照药的小鼠比较，GGA处理的小鼠的HSP70表达显著增加。同样的结果在3次独立的实验中都得到确认。
图6表示DSS诱导大肠炎的大肠中HSP70的免疫组织化学的分析结果。表示用抗HSP70抗体或羊IgG处理的小鼠的大肠照片(50倍)。(A)表示取自用羊IgG处理的正常小鼠的大肠粘膜切片照片。(B)表示取自用抗HSP70抗体处理的正常小鼠的大肠切片照片。(C)表示用抗HSP70抗体处理的媒介物(vehicle)处理小鼠的大肠切片照片。(D)表示取自用DSS和GGA处理的小鼠的大肠切片照片。与未处理组和对照药给药组小鼠比较，表面上皮细胞和浸润单核细胞中HSP70的表达增加。显微镜照片表示由实验得到的具有代表性的切片。所有试料具有同样的外观。
图7表示小鼠经3％DSS诱导大肠炎处理7天后，大肠的髓过氧化物酶(MPO)的活性结果。左边的棒图表示正常的对照小鼠的结果，中间的棒图表示媒介物处理小鼠的结果，黑色棒图表示经300mg/kg的GGA处理的小鼠的结果。GGA的经口给药能抑制因给予DSS而引起的MPO活性提高。对照药给药组的小鼠(n＝10)和GGA处理小鼠(n＝10)的差异有统计学意义。
图8表示经3％DSS处理7天后，大肠的TNF-α和IFN-γ的生成结果。利用本说明书的实施例中所述的ELISA分析细胞因子含量。左边的棒图表示正常的对照小鼠的结果，中间的棒图表示媒介物处理小鼠的结果，黑色棒图表示经300mg/kg的GGA处理的小鼠的结果。经GGA处理的小鼠(n＝10)的大肠中的TNF-α和IFN-γ的生成与对照药给药组小鼠(n＝10)比较，有意义地减少。
图9表示GGA对TNBS诱导的重症大肠炎存活率的影响结果。GGA对用TNBS(270mg/kg)处理的BALB/c小鼠的存活率的影响在7天后进行评价。左边的棒图表示正常的对照小鼠的结果，中间的棒图表示经TNBS和媒介物处理的小鼠的结果，黑色棒图表示经TNBS和300mg/kg的GGA处理的小鼠的结果。由3次独立实验得到的结果以平均±SE表示。
图10表示GGA对TNBS诱导大肠炎的体重损失的预防结果。表示GGA对TNBS诱导7天后导致的体重损失的保护效果。白色棒图表示未经处理的小鼠(n＝10)的结果，具有斜线的棒图表示经TNBS和媒介物处理的小鼠(n＝6)的结果，黑色棒图表示经TNBS和300mg/kg的GGA处理的小鼠(n＝6)的结果。结果以平均±SE表示。
图11是DSS肠炎模型小鼠的对照组的病理组织图。
图12是DSS肠炎模型小鼠的GGA给药组的病理组织图。
具体实施例方式
下面的实施方式是为了说明本发明的示例，并不是将本发明限定于该实施方式。本发明只要不脱离其要旨，可以以各种方式实施。
本发明提供对肠病、尤其是炎症性肠病的治疗有效、毒性小的预防剂和/或治疗剂。下面详细说明本发明。
作为本发明的有效成分的化合物是以式(I)表示的异戊烯酮类化合物。
本发明中优选使用的化合物的化学名为6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮(别名香叶基香叶基丙酮，通用名替普瑞酮，下面简称为“GGA”)。本发明使用的GGA在其结构中具有4处双键，一共存在8种几何异构体，但本发明中没有特别限定，可以使用任一种异构体，也可以为2种或2种以上的混合物。上述化合物中，作为优选的化合物可以举出(5E，9E，3E)-6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮和(5Z，9E，13E)-6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本发明使用的GGA是公知的化合物，可以作为试剂、工业原料购入。作为GGA的合成方法，例如，可以按照特开昭53-145922号公报中公开的方法合成。
本发明中使用的有效成分GGA中可以存在多晶型，没有特别限定，可以单独使用任一种结晶型，也可以使用结晶型混合物。而且，本发明中使用的GGA在生物体内分解产生的代谢产物也包括在本发明的权利要求范围内。
本发明的预防剂和/或治疗剂可以直接使用GGA，或配合下述通常用作医药品制剂的原料的成分，通过常用方法制成制剂，上述成分包括公知的药理学上可接受的载体等，例如，赋形剂(具体可以举出乳糖、白糖、淀粉、甘露醇等)、粘合剂(具体可以举出α-淀粉、阿拉伯胶、羧基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等)、润滑剂(具体包括硬脂酸镁、滑石等)、崩解剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化剂等。另外，根据需要还可以配合血流促进剂、杀菌剂、消炎剂、细胞激活剂、维生素类、氨基酸、保湿剂、角质溶解剂等成分。
作为本发明的预防剂和/或治疗剂的制剂化的剂型，可以举出片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、包衣片剂、胶囊剂、糖浆剂、含片剂、吸入剂、栓剂、注射剂、冻干剂、软膏剂、眼膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、糊剂、洗剂等。
另外，在本发明中，对GGA的给药方式没有特别限定，优选经口给药。GGA可以以商品名为“Selbex”(卫材株式会社制)的产品购入。
本发明的含有GGA的预防剂和/或治疗剂对哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、马、猴等)的肠病的预防和/或治疗是有用的，特别是对人的肠病的治疗和/或预防有用。
本发明的含有GGA的预防剂和/或治疗剂的给药量根据症状、年龄、体重等条件适当选择，成人一日20～2000mg，优选50～1000mg，进一步优选100～500mg。
本发明的GGA化合物治疗的疾病是肠病，可以举出克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病、单纯性溃疡、放射线肠炎和缺血性肠炎等，尤其对克隆氏病或溃疡性大肠炎有效。
利用下面的实施例更详细地说明本发明，但本发明的范围并不限定于此。基于本发明的说明，本领域技术人员可以进行各种变更、修饰，上述变更、修饰也包括在本发明中。
实施例实施例1(实验动物)小鼠使用8-10周龄、体重22～25g的SPF(specific pathogen free)BALB/c雄性小鼠(Charles River Japan(株))。全部小鼠都给予标准的实验饲料，使其自由摄食饮水。本发明遵守赫尔辛基宣言，已经得到北海道大学医学部动物实验伦理规定委员会的批准。
(统计分析)只要没有特别说明，后述的全部数据都以平均值±标准偏差表示。使用F检验和Student t检验(StatView，SAS Institute，Cray，NC)，对结果进行统计分析。P＜0.05认为有统计学意义。
(GGA的配制和经口给药)将GGA(商品名“Selbex”、卫材株式会社制)由5％阿拉伯胶溶液和0.0008％生育酚混合后进行使用。通过1ml注射器上带有的金属管，以300mg/kg/次的给药量，将以体积表示为5ml/kg/次的GGA经口给予小鼠。对照组小鼠给以含有相同量的生育酚的阿拉伯胶(以下称为对照药)。各组小鼠在DSS给药前2小时和第一次DSS给药后，连续7天，每隔一天给予GGA或对照药一次(共4次)。在DSS大肠炎的临床评价中，剂量依赖性实验是通过GGA的不同给药量(50、100、300、500mg/kg)进行评价的。为利用Western Blot法分析GGA对HSP70的诱导效果，将小鼠以300mg/kg GGA单次经口给药进行处理。收集GGA或对照药给药前后的各小鼠大肠组织的样品。
(葡聚糖硫酸钠DSS大肠炎的诱导和评价)通过使小鼠在7天内自由摄入3.0％DSS(分子量40,000；ICNBiochemicals Inc制，美国加利福尼亚州)的水溶液，诱导肠炎。从给药开始，每天观察小鼠的体重、直肠出血和腹泻。称量各小鼠的体重。在实验的各阶段，为进行组织学评价，测定细胞因子、HSP和髓过氧化物酶(下面称为“MPO”)的活性，以各种时间间隔采集大肠组织。将大肠保存在-80℃直至使用前。大肠炎的严重程度通过在DSS给药开始7天后的大肠长度和组织学检查进行评价。
图1表示在本发明的实施例中，对照药给药组和GGA处理组的小鼠在DSS诱导大肠炎时腹泻和直肠出血的频率。由图1可知，与对照药给药组比较，300mg/kg/次和500mg/kg/次的GGA处理组中腹泻和直肠出血的频率有意义地减少。另外，在对照药给药组中，以DSS给药前的体重作为100％，DSS给药7天后，小鼠体重减少至86.3±2.4％，而在GGA处理组中，与处理组比较，体重的变化有意义地降低(300mg/kg/次的组为93.8±4.1％，500mg/kg/次的组为94.7±5.0％)。在GGA剂量依赖性效果的临床评价中，发现GGA300mg/kg/次的给药量就能充分抑制疾病发作。
已知大肠的短小化与组织的变化存在紧密关系，通常将大肠的长度用作炎症程度的形态学参数。为了评价大肠的长度，在规定的时间处死各组小鼠。图2表示DSS给药7天后大肠的长度。图2表示GGA处理组的大肠长度(6.8±0.3cm)有意义地长于对照药处理组的大肠长度(5.1±0.1cm)。
(DSS大肠炎的组织学分析)将大肠组织沿长轴方向切开并展开，用10％中性福尔马林缓冲液固定，浸渍在石蜡中。在载玻片上除去上述组织部分的石蜡后，用苏木精曙红(以下称为“HE”)染色。作为组织损伤的组织学评价，利用显微镜观察炎症性病变区域，对Cooper等的方法(Benjamin IJ，McMIllan DR.Stress(heat shock)proteins molecular chaperones.Circ Res.199827；83117-32.)进行若干修改，由二位病理学专家进行定量。将大肠损伤分为6个阶段。即，0粘膜正常，1炎症细胞浸润，2半数或半数以下的腺窝发生短小化，3半数以上腺窝发生短小化，4腺窝消失，5上皮细胞脱落(溃疡形成或侵蚀)。此外，还评价炎症病变的范围。将大肠整体的病变范围分为6个阶段。即，00％，11～20％，221～40％，341～61％，461～80％，581～100％。
图3表示本发明的DSS大肠炎的组织学分析结果。DSS处理的BALB/c小鼠的大肠组织学是利用HE染色，为评价GGA对组织损伤的效果而进行研究的。大肠浸润细胞的数目在DSS处理前最小(参见图3A)，DSS处理7天后，浸润细胞的数目增加，同时腺窝消失，上皮细胞坏死增加(参见图3B)。在GGA处理组，组织损伤得到有意义地改善，与对照药处理组比较，浸润炎症细胞的数目减少(参见图3C及D)。在GGA处理的小鼠中，包括组织损伤和病变范围的病理组织学评分结果与未处理组或对照药处理组小鼠相比，有意义地降低(参见图4)。另外，图4表示本发明的3％DSS给药7天后的小鼠大肠组织学评分结果。
(Western Blot分析)使用Polytron均化器(Kinematica，Lucerne Switzerland)粉碎组织。将等量的组织匀浆溶解在含有2-巯基乙醇(1％)、SDS(2％)、丙三醇(20％)和溴酚蓝(0.04％)的20μl 50mM(pH6.8)Tris-HCl中，将样品在100℃加热5分钟。接下来，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离上述样品，然后，经电泳转印到硝基纤维素膜上。用PBS溶液中的1％无脂肪干燥乳固定上述膜，使用抗HSP25、40、70、90抗体(Stressgen，Victoria，BC Canada)和β-肌动蛋白(Sigma，St Loius，MO)进行探测，然后使其与结合有辣根过氧化酶(以下称为“HRP”)的羊抗兔IgG抗体反应。为了用于基于制造商操作指示的检出系统，对残留的复合体进行处理。使用Micro BCA蛋白质检查试剂盒定量细胞组织匀浆的蛋白质浓度。
(免疫组织化学)HSP70免疫组织化学的分析是基于制造商操作指示，使用VectastainABC试剂盒进行的。将石蜡浸渍的大肠组织切成4μ厚的薄片。将上述薄片在3％H2O2中，于4℃进行10分钟前处理，接下来，在室温下，用10％的正常羊血清处理30分钟，然后在4℃用抗HSP70抗体(以1∶200进行稀释，Stressgen，Victoria，BC Canada)培养1夜。利用二氨基联苯胺(diaminobenzidine)将HSP70阳性染色，使其可视化。
图5是在3％DSS处理的大肠炎模型小鼠的大肠中，HSP25、40、70、90的Western Blot分析结果。使用HSP25、40、70、90对应的抗体，利用Western Blot分析研究HSP的表达。HSP70在GGA添加(300mg/kg)前检出较弱，但在GGA处理12小时后其表达水平增大。另一方面，HSP25、40和90的表达，经GGA处理没有变化(参见图5)。
图6表示本发明的DSS诱导大肠炎的大肠中HSP70的免疫组织化学的分析结果。为了确认患有DSS诱导大肠炎的小鼠的大肠中HSP70的表达部位，利用大肠组织中HSP70的特异性抗体进行HSP70的免疫组织学评价。HSP70的免疫反应性在上皮细胞和正常小鼠的腺窝处是弱阳性(参见图6B)。在DSS诱导和对照药处理小鼠的大肠中HSP70阳性的染色细胞几乎不存在。更有趣的是，GGA处理的小鼠大肠组织的染色比对照药处理小鼠的染色强很多(参见图6D)。上述现象支持了GGA在大肠诱导内因性HSP的假说。
(大肠中髓过氧化物酶活性的测定)组织MPO活性是根据将Krawisz等的方法(Krawisz JE，Sharon P，Stenson WF.Quantitative assay for acute intestinal inflammation based onmyeloperoxidase activity.Assessment of inflammation in rat and hamstermodels.Gastroenterology 1984；871344-50.)进行若干修改后的方法测定的。即，使用Polytron型均化器，将各试料分别置于冰浴中，在缓冲液(pH6.0、50mM磷酸钾缓冲液中的、0.5％十六烷基三甲基溴化铵)中粉碎组织试料(约300mg)，共进行3次，每次30秒。在4℃以20，000xg的条件将上述样品离心分离20分钟，收集上清液。将100μl上述样品加入到2.9ml含有0.167mg/ml的邻联二茴香胺盐酸盐和0.0005％过氧化氢的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)中，在25℃使用分光器进行测定。为了校正，使用Bradford测试试剂盒(Bio-rad laboratories，Hercules，CA)确定上清液的蛋白质浓度，并使用来源于人白细胞(Sigma，St.Loius，MO)的精制MPO将其值标准化。
作为炎症的其他参数，有大肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的活性水平。MPO是主要由多核白细胞产生的酶，是与组织的粒细胞相关的酶。图7表示本发明中3％DSS诱导大肠炎处理7天后的小鼠大肠的MPO活性结果。在DSS给药的媒介物处理小鼠中，MPO活性水平显著增大(参见图7)。与媒介物处理组的MPO活性水平(2.8±0.3units/g)比较，GGA处理小鼠的MPO活性水平有意义地降低(1.4±0.4units/g、P＜0.03)。上述结果证实了GGA阻碍粒细胞浸润。
(针对细胞因子的酶免疫测定法)利用TNF-α特异性ELISA试剂盒(GT，Minneapolis，MN)测定大肠组织中的TNF-α。将溶解在50ml的磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的抗小鼠TNF-αIgG单克隆抗体加到96孔板的各孔中，于室温放置30分钟。将上述板用蒸馏水冲洗3次后，在全部孔中加入用于固定的含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，于室温放置20分钟。除去固定溶液后，向各孔添加2次血浆或组织样品，于室温培养1小时。使用添加了肝素的注射器利用心脏穿刺采集血浆。为制备大肠组织样品，用Polytron均化器(Kinematica，Lucerne Switzerland)粉碎含有蛋白酶抑制剂(根据制造商操作指示调制，每20mg组织使用1μl蛋白酶抑制剂)的混合物的PBS中的组织，然后以12，000xg的条件离心分离10分钟，检测上清液。为了得到标准曲线利用小鼠重组TNF-α蛋白质。用含有0.05％Tween-20(冲洗缓冲液)的PBS冲洗3次孔板以后，向各孔中加入50μl结合有生物素的抗TNF-α抗体。于室温培养1小时后，再次用冲洗缓冲液将孔板冲洗3次。接下来，向各孔中加入结合有抗生物素蛋白的羊抗兔IgG抗体，将上述孔板于室温培养15分钟。用冲洗缓冲液冲洗3次后，向各孔中加入50μl基质溶液。上述10μl基质溶液中含有8μg邻苯二胺和4μl 30％H2O2的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)。于室温培养20分钟后，用25μl的4N硫酸停止反应。使用ELISA孔板读数器(Bio-rad，Model 3550，Hercules，CA，USA)在492nm下测定吸光度。
同样，组织中的小鼠IFN-γ也使用IFN-γ特异性ELISA试剂盒进行测定。
为从GGA处理抑制大肠中细胞因子生成的观点说明作用部位，使用ELISA测定大肠组织中TNF-α和IFN-γ的生成。图8表示3％DSS处理7天后的大肠中TNF-α和IFN-γ的生成结果。在大肠组织中，TNF-α和IFN-γ的含量，在DSS处理7天后增加(分别为7.9±1.0和9.7±1.2pg/mg蛋白)。另一方面，GGA处理小鼠的上述细胞因子的生成与媒介物处理小鼠相比有意义地减少(分别为4.2±0.8和4.1±0.8pg/mg蛋白)。上述结果暗示GGA抑制大肠中促炎(proinflammatory)细胞因子的生成。
(2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS大肠炎的诱导和评价)使上述BALB/c小鼠诱导TNBS大肠炎。即，禁食一夜后腹腔注射苯巴比妥(70mg/kg)，麻醉小鼠。为评价TNBS大肠炎的存活率，利用具有聚乙烯插管(intramedic PE-20；Beckton Dicknson社制；加利福尼亚州圣荷西)的1ml注射器对肠管内腔(距离肛门外缘约3cm)注射50％乙醇溶液中的100μl TNBS(250mg/kg)。为测定体重与第一天相比的变化，以50％的乙醇中的给药量为100mg/kg的TNBS处理小鼠。
为评价不同大肠炎模型中GGA的效果，研究了GGA对TNBS诱导大肠炎的存活率和体重损失的效果。在该模型中，由于270mg/kg的TNBS给药量诱导重症炎症，因此很多小鼠在TNBS给药7天后死亡。
图9表示本发明的GGA对TNBS诱导的重症大肠炎的存活率的影响结果。对照药处理和TNBS处理小鼠的存活率减少至23.3±8.8％(参见图9)。而通过GGA经口给药，TNBS诱导大肠炎的存活率有意义地增加至56.7±3.3％。
图10表示GGA对TNBS诱导大肠炎的体重损失的预防效果的结果。与存活率相同，与对照药处理小鼠比较(22.1±3.3％)，GGA处理小鼠的体重损失最小(-5.6±1.2％)(参见图10)。
实施例2(DSS模型中大肠炎的出现)使8周龄的小鼠(Balb/c小鼠，Charles River，静冈)(n＝10)在7日内自由饮用3％葡聚糖硫酸钠(以下称为“DSS”)水溶液，出现肠炎。小鼠在DSS水溶液给药第5～6天，出现腹泻、便血、体重减少。在DSS给药前和DSS给药3天后，使用探测装置将GGA(卫材株式会社制)100mg/kg混合在生理盐水中给药。
(GGA给药对大肠炎模型的炎症抑制效果)DSS给药开始7天后取小鼠肠管，肉眼评价组织学现象。非给药组和给药组的病理组织图分别如图11和图12所示。其结果是图11的对照组中发生组织损伤，另一方面，在GGA给药组中几乎未见组织损伤。而且，针对发明人制定的6阶段评分，对炎症导致的组织损伤程度、炎症范围分别进行评分。评分基准如下所示。
炎症导致的组织损伤程度0无炎症1炎症细胞轻度浸润2腺窝轻度短小化3腺窝高度短小化4腺窝消失5上皮细胞脱落炎症的范围0无11～20％221～40％341～60％461～80％581～100％。
GGA给药组和非给药组的评分比较，其结果如表1所示。由表1可知，给予GGA能抑制组织损坏的程度，而且缩小炎症的范围。另外，同样地比较腹泻的发病率、便血的发病率、体重减少率、肠管长度。其结果如表2所示。由表2可知，GGA给药能抑制DSS肠炎引起的腹泻或便血的发病，并且也具有抑制体重减少或肠管收缩的效果。
由此可知，GGA对作为炎症性肠病模型的DSS肠炎是非常有效的。
表1、GGA给药对DSS肠炎的抑制效果的组织学评分
表2、GGA给药对DSS肠炎的抑制效果
以上结果证实了GGA经口给药抑制DSS诱导的腹泻和直肠出血、以及体重损失等临床疾病症状。而且，GGA经口给药，在大肠中诱导HSP70的表达，抑制MPO的活性水平和促炎细胞因子的生成。另外，在与DSS肠炎模型不同的TNBS诱导大肠炎中，GGA的效果也得到确认。已知对于小鼠，急性TNBS诱导大肠炎比DSS诱导肠炎严重。TNBS的高剂量给药处理的小鼠的存活率可以通过GGA的经口给药得到改善，体重损失也由于GGA而被有意义地抑制。由上述结果可知GGA通过HSP70的高表达显示抗炎症作用，在人IBD的治疗中有效。
产业上的可利用性根据本发明，通过GGA给药，在大肠中诱导热休克蛋白质，对肠病，特别是炎症性肠病的预防和/或治疗有效，因此本发明提供含有GGA作为有效成分的肠病的预防和/或治疗剂。
权利要求
1.一种肠病预防剂和/或治疗剂，其含有热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物作为有效成分。
2.如权利要求1所述的肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮类化合物。
3.如权利要求2所述的肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
4.如权利要求1～3任一项所述的肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述肠病是炎症性肠病。
5.如权利要求4所述的肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
6.如权利要求1～5任一项所述的肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
7.一种炎症性肠病预防剂和/或治疗剂，其以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分。
8.如权利要求7所述的炎症性肠病预防剂和/或治疗剂，其中所述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
9.一种肠病的预防方法和/或治疗方法，其包括给予热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物的步骤。
10.如权利要求9所述的肠病的预防方法和/或治疗方法，其中所述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮类化合物。
11.如权利要求10所述的肠病的预防方法和/或治疗方法，其中所述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
12.如权利要求9～11任一项所述的肠病的预防方法和/或治疗方法，其中所述肠病是炎症性肠病。
13.如权利要求12所述的预防方法和/或治疗方法，其中所述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
14.如权利要求9～13任一项所述的肠病的预防方法和/或治疗方法，其中所述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
15.一种炎症性肠病的预防方法和/或治疗方法，其以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分。
16.如权利要求15所述的预防方法和/或治疗方法，其中所述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
17.热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物在制备含有热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物作为有效成分的肠病预防剂和/或治疗剂中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述热休克蛋白质诱导剂是异戊烯酮类化合物。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述异戊烯酮类化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
20.如权利要求17～19任一项所述的用途，其中所述肠病是炎症性肠病。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述炎症性疾病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
22.如权利要求17～21任一项所述的用途，其中所述热休克蛋白质是热休克蛋白质70。
23.热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物在制备含有式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作为有效成分的炎症性肠病的预防剂和/或治疗剂中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述炎症性肠病是选自克隆氏病、溃疡性大肠炎、肠道型白塞氏病和缺血性肠炎的疾病。
全文摘要
本发明的目的是提供对肠病，特别是炎症性肠病有效的制剂。上述目的是通过含有热休克蛋白质诱导剂或其盐或上述化合物的水合物作为有效成分的肠病的预防剂和/或治疗剂而实现的。具体而言，本发明提供含有作为异戊烯酮类化合物的6，10，14，18－四甲基－5，9，13，17－十九碳四烯－2－酮作为有效成分的肠病的预防剂和/或治疗剂。
文档编号A61P29/00GK1791394SQ20048001357
公开日2006年6月21日 申请日期2004年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者浅香正博, 西平顺, 大川原辰也, 武田宏司 申请人:卫材株式会社, 浅香正博