预防和治疗脑膜炎球菌疾病的新颖免疫原性组合物的制作方法

专利名称：预防和治疗脑膜炎球菌疾病的新颖免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及奈瑟球菌属ORF2086蛋白(亚科A和亚科B)和免疫原性蛋白和/或所述蛋白的生物等价物，该蛋白可分离自如奈瑟球菌菌种的细菌菌株，包括脑膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)菌株、淋病奈瑟球菌菌株和乳糖奈瑟球菌菌株。本发明也涉及能免疫特异性结合所述蛋白质、其免疫原性部分和/或生物等价物的抗体。此外，本发明涉及含有编码上述蛋白、其免疫原性部分、生物等价物和/或抗体的核酸序列的分离的多核苷酸。另外，本发明涉及免疫原性组合物与它们在预防、治疗和/或诊断脑膜炎奈瑟球菌所导致的脑膜炎球菌感染中的用途，以及制备所述组合物的方法。本发明还涉及该蛋白的重组形式和天然来源的分离形式，以及脂质化和非脂质化形式。
背景技术：
尽管已有许多抗生素可用，脑膜炎球菌性脑膜炎仍是能在几小时之内杀死儿童和年轻人的破坏性疾病。Pizza等，2000，Science 2871816-1820。脑膜炎的特征在于脑膜炎症导致的强烈头疼、发烧、食欲丧失、对光和声不能忍受、肌肉僵硬(特别是颈部)，严重的病例可发生惊厥、呕吐和癫狂而死亡。脑膜炎球菌性脑膜炎的症状出现迅速并且在脑膜炎球菌性败血症伴有其特征性的出血性皮疹时达到顶点。任何存活机会的关键是快速诊断和立刻用大剂量的抗生素治疗。2000.Bantam Medical Dictionary，第三版302。
脑膜炎球菌性脑膜炎由脑膜炎奈瑟球菌(脑膜炎球菌)所引起，这是一种革兰氏阴性荚膜细菌，可分为几种病原性血清群，包括A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E。脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株是世界上导致脑膜炎球菌性疾病的主要原因。例如，据医学文献报道，血清群B在美国和欧洲造成婴儿和儿童感染细菌性脑膜炎的约50％。现今还没有能预防脑膜炎奈瑟球菌血清群B导致的脑膜炎球菌疾病的疫苗。
自从Goldschneider等30多年前开始工作以来，开发预防血清群B脑膜炎球菌疾病的免疫原性组合物已成为对科研工作者的一项挑战。Goldsclneider等，1969，J Exp.Med 129(6)1307-26；Goldschneider等1969，J Exp.Med 129(6)1327-48；Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.129(6)1385-95；和Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.129(6)1367-84。与第二次世界大战后事实上就从北美消失的血清群A疾病(Achtman，M.，1995，Trends inMicrobiology 3(5)186-92)不同，血清群B和C细菌导致的疾病仍是经济发达世界许多地区的地方病。该病的发病率从地方病罕见的＜1/100,000到流行期间高危人群的200/100,000而不同。
已开发了以多糖偶联物为基础的抗脑膜炎奈瑟球菌血清群A和C的疫苗，显示可有效地预防疾病。当前，用血清群A、C、Y和W-135的荚膜多糖制造的免疫原性组合物已可得到。Ambrosch等，1983，新颖四价疫苗的免疫原性和副作用(Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent)，Bulletinof the World Health Organization 61(2)317-23。然而，这种免疫原性组合物只引发T-细胞不依赖性免疫应答，对幼儿无效并且不覆盖导致高达50％脑膜炎球菌疾病的血清群B菌株。
其他人也尝试了利用荚膜多糖开发免疫原性组合物。近来，通过将血清群C的荚膜物质与蛋白质偶联制备的用于血清群C疾病的免疫原性组合物已批准在欧洲应用。然而，血清群B的荚膜不适合作为候选疫苗，因为其荚膜多糖由聚唾液酸组成，这与发育中的人神经组织上的糖基部分相似。该糖基部分被识别为自体抗原，因此在人体内的免疫原性很差。
已开发了外膜蛋白(OMP’S)作为血清群B疾病的替代疫苗抗原。能与PorA的可变区结合的单克隆抗体确定了脑膜炎球菌血清亚型的结构。由于PorA蛋白可引发杀菌抗体(Saukkonen，1987，Microbial Pathogenesis3(4)261-7)，它可作为脑膜炎球菌菌株的亚型抗原(Abdillahi等，1988，Microbial Pathogenesis 4(1)27-32)并被积极地研究作为血清群B免疫原性组合物的成分(Poolman，1996，Adv.Exp.Med.Biol.39773-7)。认为杀菌抗体是保护力的一种指标并且认为任何新的候选免疫原性组合物应该能引发这种功能性抗体。
在人和动物中的研究表明血清亚型抗原PorA能引发杀菌抗体。然而，对PorA的免疫应答一般是血清亚型特异性的。特别是，血清亚型数据表明由PorA制备的免疫原性组合物可能是每个血清亚型需要一种PorA才能被这种免疫原性组合物所覆盖，可能需要6到9种之多。因此，需要6-9种PorA来覆盖70-80％的血清群B菌株。所以，该蛋白的易变本性需要多价疫苗组合物来保护以抵抗足够数量的脑膜炎球菌血清亚型临床分离物。
开发用于血清群B脑膜炎球菌的免疫原性组合物非常困难，近来几个研究小组测定了代表血清群A和B菌株的基因组序列以帮助鉴定新的候选免疫原性组合物。Tettelin，2000，Science，287(5459)1809-15；Pizza等，2000，Science，2871816-1820。即使具有奈瑟球菌的基因组的知识，鉴定新的候选免疫原性组合物也是一种挑战过程，因为现在没有充足的数学算法。事实上，近来的一份报道说尽管鉴定了数百个理论上含有跨膜结构域的开放读框(“ORFs”)，但其表达、纯化、诱导表面反应性和功能活性抗体等问题使研究者仅确定了7个候选的血清群B脑膜炎球菌免疫原性组合物。同上。其中一个是已知的。
因此，仍需要符合以下条件的免疫原性组合物(1)能引发针对多种奈瑟球菌菌株的杀菌抗体；(2)能与多种菌株的表面反应；(3)能赋予抗活菌攻击的被动性保护；和/或(4)能防止细菌寄居。
发明概述为满足这些或其它的需求，并且考虑到其目的，本发明提供了奈瑟球菌ORF2086蛋白(“2086蛋白”)，其包括2086亚科A蛋白和2086亚科B蛋白。每种2086蛋白可分离自天然奈瑟球菌株，包括脑膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)、淋病奈瑟球菌和乳糖奈瑟球菌的菌株。2086蛋白也可用重组技术制备。
具体说，本发明提供了2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物等价物、能免疫特异地结合任何上述物质的抗体和含有编码任何上述物质的核酸序列的多核苷酸。本发明包括组合物、免疫原性组合物与其在预防、治疗和/或诊断的脑膜炎球菌感染，特别是脑膜炎奈瑟球菌所引起的脑膜炎球菌疾病中的用途，以及制备所述组合物的方法。本发明的2086蛋白包括重组形式和从天然来源的分离形式，以及脂质化和非脂质化形式。
本发明出人意料地和优选地提供具有以下特点的组合物(1)能引发针对多种奈瑟球菌菌株(例如脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌和/或乳糖奈瑟球菌)的杀菌抗体；(2)能与多种菌株的表面反应；(3)能赋予抵抗活菌攻击的被动性保护力；和/或(4)防止细菌寄居，以及使用所述组合物和制备所述组合物的方法。以下描述本发明的各种实施方案。
附图简述

图1A描述鉴定奈瑟球菌膜蛋白抽提物实验所获得的蛋白诸组分中两种主要蛋白的SDS-PAGE凝胶图，该膜蛋白抽提物能引发抗异源菌株的杀菌抗体。
图1B描述了用蛋白酶消化和反相N-末端测序分析TMAE流穿成分来鉴定这两种主要蛋白的实验结果。
图2描述了rLP2086纯化方案和用SDS-PAGE测定的同源性。
图3描述了用LC-MS/MS和相应的SDS-PAGE分析TMAE流穿成分来鉴定这两种主要蛋白和一种次要蛋白的实验结果。
图4是2086重组表达的蛋白的SDS-PAGE凝胶图。
图5是本文实施例所述的质粒pPX7340的示意图。
图6是本文实施例所述的质粒pPX7328的示意图。
图7是本文实施例所述的质粒pPX7343的示意图。
图8说明了各种菌株的2086基因的N-末端区域。
图9A是显示鉴定奈瑟球菌株免疫原性成分基本步骤的流程图。
图9B是显示鉴定奈瑟球菌株免疫原性成分最终步骤的流程图。
图10A是能驱动P4信号/ORF2086融合蛋白表达来表达本文实施例所述的脂质化形式的rP2086的pBAD阿拉伯糖可诱导性启动子的示意图。
图10B是用于重组表达ORF2086的非脂质化形式的pET9a-T7载体的示意图。
图11A是表达rLP2086蛋白的大肠杆菌B的全细胞裂解物的照片。
图11B是表达rP2086蛋白的大肠杆菌B的全细胞裂解物的照片。
图12是本发明的实施，显示ORF2086蛋白的诸亚科和诸群的组织关系的种系发生树。
图13是说明rLP2086亚科A抗血清的全细胞ELISA数据的图示。
图14是说明rLP2086亚科B抗血清的全细胞ELISA数据的图示。
图15是说明rLP2086混合研究-WCE滴度的结果的图示。
图16是说明rLP2086/rPorA混合研究-WCE滴度的结果的图示。
图17是显示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚科B脑膜炎奈瑟球菌全细胞裂解物的反应性的Western印迹图。
图18是显示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚科A脑膜炎奈瑟球菌和乳糖奈瑟球菌全细胞裂解物的反应性的Western印迹图。
图19是本发明的实施，显示ORF2086蛋白的诸亚族和诸群的组织关系的种系发生树。
图20是比较本发明各多肽的序列排列对比。
序列总结SEQ ID NOS.用于研究的序列SEQ ID NO1当与天然的前导序列结合后编码来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO2使用天然的前导序列制备的来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO3当与P4前导序列结合后编码来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO4使用P4前导序列制备的来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO5编码来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO6来自L3 6275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO7当与天然的前导序列结合后编码来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO8使用天然的前导序列制备的来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO9当与P4前导序列结合后编码来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO10使用P4前导序列制备的来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO11编码来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO12来自CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO13当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO14使用天然的前导序列制备的来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO15当与P4前导序列结合后编码来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO16使用P4前导序列制备的来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO17编码来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO18来自CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO19当与天然的前导序列结合后编码来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO20使用天然的前导序列制备的来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO21当与P4前导序列结合后编码来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO22使用P4前导序列制备的来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO23编码来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO24来自L4 891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO25当与天然的前导序列结合后编码来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO26使用天然的前导序列制备的来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO27当与P4前导序列结合后编码来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO28使用P4前导序列制备的来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO29编码来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO30来自B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO31当与天然的前导序列结合后编码来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO32使用天然的前导序列制备的来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO33当与P4前导序列结合后编码来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO34使用P4前导序列制备的来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO35编码来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO36来自W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO37当与天然的前导序列结合后编码来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO38使用天然的前导序列制备的来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO39当与P4前导序列结合后编码来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO40使用P4前导序列制备的来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO41编码来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO42来自C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO43当与天然的前导序列结合后编码来自Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO44使用天然的前导序列制备的来自Y(ATCC35561)菌株的成熟的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO45当与P4前导序列结合后编码来自Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO46使用P4前导序列制备的来自Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO47编码来自Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO48来自Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO49当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO50使用天然的前导序列制备的来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO51当与P4前导序列结合后编码来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO52使用P4前导序列制备的来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO53编码来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO54来自M98 250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO55当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO56使用天然的前导序列制备的来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO57当与P4前导序列结合后编码来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO58使用P4前导序列制备的来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO59编码来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO60来自M98 250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO61当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO62使用天然的前导序列制备的来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO63当与P4前导序列结合后编码来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO64使用P4前导序列制备的来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO65编码来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO66来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO67当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO68使用天然的前导序列制备的来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO69当与P4前导序列结合后编码来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO70使用P4前导序列制备的来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO71编码来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO72来自M97 252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO73当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO74使用天然的前导序列制备的来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO75当与P4前导序列结合后编码来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO76使用P4前导序列制备的来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO77编码来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO78来自CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO79当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO80使用天然的前导序列制备的来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO81当与P4前导序列结合后编码来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO82使用P4前导序列制备的来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO83编码来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO84来自CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO85当与天然的前导序列结合后编码来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO86使用天然的前导序列制备的来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO87当与P4前导序列结合后编码来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO88使用P4前导序列制备的来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO89编码来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO90来自L8 M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO91当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO92使用天然的前导序列制备的来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO93当与P4前导序列结合后编码来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO94使用P4前导序列制备的来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO95编码来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO96来自M97 252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO97当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO98使用天然的前导序列制备的来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO99当与P4前导序列结合后编码来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO100使用P4前导序列制备的来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO101编码来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO102来自M97 252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO103当与天然的前导序列结合后编码来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO104使用天然的前导序列制备的来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO105当与P4前导序列结合后编码来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO106使用P4前导序列制备的来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO107编码来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO108来自6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO109当与天然的前导序列结合后编码来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO110使用天然的前导序列制备的来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO111当与P4前导序列结合后编码来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO112使用P4前导序列制备的来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO113编码来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO114来自2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO115当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO116使用天然的前导序列制备的来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO117当与P4前导序列结合后编码来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO118使用P4前导序列制备的来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO119编码来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO120来自M97 252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO121当与天然的前导序列结合后编码来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO122使用天然的前导序列制备的来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO123当与P4前导序列结合后编码来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO124使用P4前导序列制备的来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO125编码来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO126来自M97 251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO127当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO128使用天然的前导序列制备的来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO129当与P4前导序列结合后编码来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO130使用P4前导序列制备的来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO131编码来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO132来自CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO133当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO134使用天然的前导序列制备的来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO135当与P4前导序列结合后编码来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO136使用P4前导序列制备的来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO137编码来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO138来自M98 250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO139当与天然的前导序列结合后编码来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO140使用天然的前导序列制备的来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO141当与P4前导序列结合后编码来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO142使用P4前导序列制备的来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO143编码来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO144来自870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO145当与天然的前导序列结合后编码来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO146使用天然的前导序列制备的来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO147当与P4前导序列结合后编码来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO148使用P4前导序列制备的来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO149编码来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO150来自M97 253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO151当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO152使用天然的前导序列制备的来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO153当与P4前导序列结合后编码来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO154使用P4前导序列制备的来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO155编码来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO156来自M98 250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO157当与天然的前导序列结合后编码来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO158使用天然的前导序列制备的来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO159当与P4前导序列结合后编码来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO160使用P4前导序列制备的来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO161编码来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO162来自L5 M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO163当与天然的前导序列结合后编码来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO164使用天然的前导序列制备的来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO165当与P4前导序列结合后编码来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO166使用P4前导序列制备的来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO167编码来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO168来自NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO169当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO170使用天然的前导序列制备的来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO171当与P4前导序列结合后编码来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO172使用P4前导序列制备的来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO173编码来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO174来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO175当与天然的前导序列结合后编码来自A4 Sanford；M97 251836 PART；M97 251957；M97 251985；M97 252060；M97251870；M97 251994；M98 250024；M97 251905；M97251876；M97 251898或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO176使用天然的前导序列制备的来自A4 Sanford；M97251836 PART；M97 251957；M97 251985；M97 252060；M97251870；M97251994；M98 250024；M97 251905；M97251876；M97 251898或M97 251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO177当与P4前导序列结合后编码来自A4 Sanford；M97251836 PART；M97 251957；M97 251985；M97 252060；M97251870；M97251994；M98 250024；M97 251905；M97251876；M97 251898或M97 251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO178使用P4前导序列制备的来自A4 Sanford；M97 251836PART；M97 251957；M97 251985；M97 252060；M97 251870；M97 251994；M98 250024；M97 251905；M97 251876；M97 251898或M97 251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO179编码来自A4 Sanford；M97 251836 PART；M97251957；M97 251985；M97 252060；M97251870；M97 251994；M98 250024；M97 251905；M97 251876；M97 251898或M97 251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO180 A4 Sanford；M97 251836 PART；M97 251957；M97251985；M97 252060；M97 251870；M97 251994；M98 250024；M97 251905；M97 251876；M97 251898或M97 251830来自M98 250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO181当与天然的前导序列结合后编码来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO182使用天然的前导序列制备的来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO183当与P4前导序列结合后编码来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO184使用P4前导序列制备的来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO185编码来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO186来自CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO187当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO188使用天然的前导序列制备的来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO189当与P4前导序列结合后编码来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO190使用P4前导序列制备的来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO191编码来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO192来自M97 252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO193当与天然的前导序列结合后编码来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO194使用天然的前导序列制备的来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO195当与P4前导序列结合后编码来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO196使用P4前导序列制备的来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO197编码来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO198来自870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO199当与天然的前导序列结合后编码来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO200使用天然的前导序列制备的来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO201当与P4前导序列结合后编码来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO202使用P4前导序列制备的来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO203编码来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO204来自H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO205当与天然的前导序列结合后编码来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO206使用天然的前导序列制备的来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO207当与P4前导序列结合后编码来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO208使用P4前导序列制备的来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO209编码来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO210来自H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO211当与天然的前导序列结合后编码来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO212使用天然的前导序列制备的来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO213当与P4前导序列结合后编码来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO214使用P4前导序列制备的来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO215编码来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO216来自8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO217当与天然的前导序列结合后编码来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO218使用天然的前导序列制备的来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO219当与P4前导序列结合后编码来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO220使用P4前导序列制备的来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO221编码来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO222来自6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO223当与天然的前导序列结合后编码来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO224使用天然的前导序列制备的来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO225当与P4前导序列结合后编码来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO226使用P4前导序列制备的来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO227编码来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO228来自M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO229当与天然的前导序列结合后编码来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO230使用天然的前导序列制备的来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO231当与P4前导序列结合后编码来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO232使用P4前导序列制备的来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO233编码来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO234来自880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO235当与天然的前导序列结合后编码来自M97 253524、M97 251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO236使用天然的前导序列制备的来自M97 253524、M97251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO237当与P4前导序列结合后编码来自M97 253524、M97251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO238使用P4前导序列制备的来自M97 253524、M97251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO239编码来自M97 253524、M97 251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO240来自M97 253524、M97 251885和M97 251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO241当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO242使用天然的前导序列制备的来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO243当与P4前导序列结合后编码来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO244使用P4前导序列制备的来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO245编码来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO246来自M98 250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO247当与天然的前导序列结合后编码来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO248使用天然的前导序列制备的来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO249当与P4前导序列结合后编码来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO250使用P4前导序列制备的来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO251编码来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO252来自CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO253编码来自乳糖奈瑟球菌菌株的2086蛋白的部分核酸序列。
SEQ ID NOS254-259 2086蛋白家族相关蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NOS260-278与2086亚科A的蛋白相关的氨基酸序列。
SEQ ID NOS279-299与2086亚科B的蛋白相关的氨基酸序列。
SEQ ID NO300按照本发明的实施方案，对应于2086蛋白家族(“2086蛋白”)的氨基酸共有序列。
SEQ ID NO301按照本发明的实施方案，对应于2086蛋白亚科A的氨基酸共有序列。
SEQ ID NO302按照本发明的实施方案，对应于2086蛋白亚科B的氨基酸共有序列。
SEQ ID NO303含有BamHI限制性位点的反向引物的核酸序列(化合物号4623)。
SEQ ID NO304含有NdeI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号4624)。
SEQ ID NO305正向引物的核酸序列(化合物号4625)。
SEQ ID NO306正向引物的核酸序列(化合物号5005)。
SEQ ID NO307反向引物的核酸序列(化合物号5007)。
SEQ ID NO308含有BglII限制性位点的反向引物的核酸序列(化合物号5135)。
SEQ ID NO309含有BamHI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号5658)。
SEQ ID NO310含有SphI限制性位点的反向引物的核酸序列(化合物号5660)。
SEQ ID NO311含有BamHI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号6385)。
SEQ ID NO312含有BglII与NdeI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号6406)。
SEQ ID NO313正向引物的核酸序列(化合物号6470)。
SEQ ID NO314反向引物的核酸序列(化合物号6472)。
SEQ ID NO315含有BamHI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号6473)。
SEQ ID NO316含有BglII与NdeI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号6474)。
SEQ ID NO317正向引物的核酸序列(化合物号6495)。
SEQ ID NO318反向引物的核酸序列(化合物号6496)。
SEQ ID NO319含有SphI限制性位点的反向引物的核酸序列(化合物号6543)。
SEQ ID NO320含有BglII限制性位点的反向引物的核酸序列(化合物号6605)。
SEQ ID NO321含有BglII与NdeI限制性位点的正向引物的核酸序列(化合物号6721)。
SEQ ID NO322 P4前导序列的核酸序列。
SEQ ID NO323天然2086前导序列变体1的核酸序列。
SEQ ID NO324天然2086前导序列变体2的核酸序列。
SEQ ID NO325天然2086前导序列变体3的核酸序列。
SEQ ID NO326天然2086前导序列变体4的核酸序列。
SEQ ID NO327 P4431的氨基酸序列。
SEQ ID NO328 P5163的氨基酸序列。
SEQ ID NO329本发明的一个实施方案的氨基酸序列。
SEQ ID NO330当与天然的前导序列结合后编码来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO331使用天然的前导序列制备的来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO332当与P4前导序列结合后编码来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO333使用P4前导序列制备的来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO334编码来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO335来自880049菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO336当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO337使用天然的前导序列制备的来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO338当与P4前导序列结合后编码来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO339使用P4前导序列制备的来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO340编码来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO341来自CDC-937菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO342当与天然的前导序列结合后编码来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO343使用天然的前导序列制备的来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO344当与P4前导序列结合后编码来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO345使用P4前导序列制备的来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO346编码来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO347来自M97 252097菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO348当与天然的前导序列结合后编码来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO349使用天然的前导序列制备的来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO350当与P4前导序列结合后编码来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO351使用P4前导序列制备的来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO352编码来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO353来自B40菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO354当与天然的前导序列结合后编码来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO355使用天然的前导序列制备的来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO356当与P4前导序列结合后编码来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO357使用P4前导序列制备的来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO358编码来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO359来自B40菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO360当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO361使用天然的前导序列制备的来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO362当与P4前导序列结合后编码来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO363使用P4前导序列制备的来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO364编码来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO365来自CDC-1343菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO366当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO367使用天然的前导序列制备的来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO368当与P4前导序列结合后编码来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO369使用P4前导序列制备的来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO370编码来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO371来自CDC-1343菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO372当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO373使用天然的前导序列制备的来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO374当与P4前导序列结合后编码来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO375使用P4前导序列制备的来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO376编码来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO377来自CDC-2367菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO378当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO379使用天然的前导序列制备的来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO380当与P4前导序列结合后编码来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO381使用P4前导序列制备的来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO382编码来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO383来自CDC-2367菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO384当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO385使用天然的前导序列制备的来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO386当与P4前导序列结合后编码来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO387使用P4前导序列制备的来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO388编码来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO389来自CDC-5315菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO390当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO391使用天然的前导序列制备的来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO392当与P4前导序列结合后编码来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO393使用P4前导序列制备的来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO394编码来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO395来自CDC-5315菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO396当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO397使用天然的前导序列制备的来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO398当与P4前导序列结合后编码来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO399使用P4前导序列制备的来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO400编码来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO401来自CDC-852菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO402当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO403使用天然的前导序列制备的来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO404当与P4前导序列结合后编码来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO405使用P4前导序列制备的来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO406编码来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO407来自CDC-852菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO408当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO409使用天然的前导序列制备的来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO410当与P4前导序列结合后编码来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO411使用P4前导序列制备的来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO412编码来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO413来自CDC-983菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO414当与天然的前导序列结合后编码来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO415使用天然的前导序列制备的来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO416当与P4前导序列结合后编码来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO417使用P4前导序列制备的来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO418编码来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO419来自CDC-983菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO420当与天然的前导序列结合后编码来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO421使用天然的前导序列制备的来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO422当与P4前导序列结合后编码来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO423使用P4前导序列制备的来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO424编码来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO425来自M97 250571菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO426当与天然的前导序列结合后编码来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO427使用天然的前导序列制备的来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO428当与P4前导序列结合后编码来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO429使用P4前导序列制备的来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO430编码来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO431来自M97 250571菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO432当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO433使用天然的前导序列制备的来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO434当与P4前导序列结合后编码来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO435使用P4前导序列制备的来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO436编码来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO437来自M98 250716菌株的2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO438当与天然的前导序列结合后编码来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO439使用天然的前导序列制备的来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO440当与P4前导序列结合后编码来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO441使用P4前导序列制备的来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO442编码来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO443来自M98 250716菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NOS444-449与2086亚科B的蛋白相关的氨基酸序列。
SEQ ID NOS450-452与2086亚科A的蛋白相关的氨基酸序列。
发明详述具有抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B交叉功能性杀菌活性的新抗原类型不需要采用多价PorA方法来免疫以抗感染。发明人出乎意料地鉴定到了这种抗原予以描述和申报权利要求。这种抗原首先发现于脑膜炎球菌菌株的可溶性外膜蛋白(sOMP)的复合性混合物中。然后经过一系列分级和蛋白质的纯化步骤直至该感兴趣的蛋白混合物中仅含有几种蛋白质才鉴定了该抗原的杀菌活性。通过N-末端氨基酸测序和肽图鉴定该混合物中的主要蛋白质。鉴定出表现有杀菌活性的感兴趣蛋白质为ORF2086蛋白，这是一种脂质化蛋白(更具体地说也指LP2086)。“ORF2086蛋白”指由奈瑟球菌属的开放读码框2086(ORF2086)所编码的蛋白质。
如文中所述，以奈瑟球菌种类的ORF2086蛋白(也称“2086蛋白”或“ORF2086”蛋白，两个概念在文中可交换使用，或者指该蛋白的非脂质化形式的P2086和脂质化形式的LP2086)为基础的新型候选免疫原性组合物从脑膜炎奈瑟球菌分离得到，通过联用细胞组分级、差异性洗涤剂抽提、蛋白质纯化与抗血清制备以及使用多种菌株的杀菌活性试验进行鉴定。作为上述参考文献披露的潜在免疫原性组合物和诊断方法的一种替代品，本发明涉及通过使用蛋白质、其免疫原性部分和其生物等价物与编码所述多肽、部分和等价物的基因以及能免疫特异地结合这些物质的抗体，治疗和/或预防脑膜炎球菌性感染的组合物和方法。
按照本发明的一个实施方案，基于所述药物表现出的交叉反应性或非菌株特异性的能力，出乎意料地鉴定到可作为免疫原性候选物的以2086蛋白(包括其分离的多肽、免疫原性部分和/或其生物等价物)为基础的免疫原性制剂。具体说，鉴定到的候选物对象出乎意料地表现出以下能力(1)能引发针对多种奈瑟球菌菌株和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)能与多种菌株的表面反应；(3)能赋予抗活菌攻击的被动性保护力；和/或(4)防止细菌寄居。因此，本发明提供的免疫原性组合物含有所述免疫原性制剂，包括其分离的多肽、其免疫原性部分和/或其生物等价物，和提供使用这些物质对抗脑膜炎奈瑟球菌感染的方法。(见文中实施例1用于鉴定2086蛋白的方法)。
文中所用的术语“非菌株特异性”指抗原引发有效地针对一种以上脑膜炎奈瑟球菌菌株(例如，异源性脑膜炎球菌菌株)的免疫应答的特性。文中所用的术语“交叉反应”与术语“非菌株特异性”可互换使用。文中所用的术语“免疫原性非菌株特异性脑膜炎奈瑟球菌抗原”描述了一种可从脑膜炎奈瑟球菌分离得到的抗原，虽然其也可从其它细菌(例如，其它奈瑟球菌株，例如淋球菌菌株)分离得到或用重组技术制备。
本发明的2086蛋白包括脂质化和非脂质化的蛋白。此外本发明也考虑采用可作为中间体混合物/组合物对应于每种蛋白质的不成熟蛋白或前蛋白。
根据本发明的实现方式，本发明也提供能与前述免疫原性制剂免疫特异性结合的抗体。此外，本发明涉及含有编码任何前述物质的核酸序列的分离多核苷酸。另外，本发明提供了组合物和/或免疫原性组合物以及它们在预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌性脑膜炎(特别是血清群B脑膜炎球菌性疾病)中的用途和制备所述组合物的方法。
本发明的组合物表现出高度的免疫原性并能引发产生杀菌抗体。这些抗体可与血清群、血清型和血清亚型的异源性脑膜炎球菌菌株发生交叉反应。因此，本发明的组合物显示能引发针对异源奈瑟球菌株的杀菌抗体从而克服了以前试用进行的脑膜炎奈瑟球菌疫苗的缺陷。所以，本发明的其它优点之一是中提供了含有几种组分组合的免疫原性组合物，它引发的保护作用可与以往使用的制剂相比。文中的组合物或免疫原性制剂(例如，并不限于多肽、其免疫原性部分或片段和生物等价物等)可单独使用或与其它抗原或制剂联合使用来引发针对脑膜炎球菌感染和疾病的免疫保护力，以及诱导针对其它病原体导致的感染和/或疾病的免疫保护力。通过减少产生抗多种菌株的保护所需的抗原数目，可简化抗脑膜炎球菌性感染的免疫原性组合物的设计。事实上，纯化的2086蛋白可显著地出乎意料地降低了提供充足的免疫原性所需的蛋白数目，其免疫原性覆盖了引起脑膜炎球菌性疾病的诸菌株。2086蛋白可在大肠杆菌中重组表达为脂蛋白(该蛋白的野生型)，其表达水平远高于天然脑膜炎球菌。
因为发现直接针对单一株细菌的2086蛋白的抗体能杀灭无关的(即，异源性)菌株，尝试特征分析了大量异源菌株中是否存在“2086同源物”，并测定了其序列保守的水平。尽管通过PCR测试到约70％的菌株具有可利用引物扩增菌株8529的原初2086基因的扩增的2086同源物，但剩余约30％的菌株在此测试中呈阴性。发现这些剩余约30％的菌株所含有的2086同源物有约60％的氨基酸序列与2086基因衍生的原始8529具有同源性。鉴定了其它能扩增这约30％的菌株2086同源物的引物。测试的脑膜炎奈瑟球菌菌株依照能扩增2086同源物的引物组，划分属于亚科A或亚科B。这些实验的细节概述于以下实施例5。
许多血清亚型中存在的2086蛋白为确定脑膜炎奈瑟球菌菌株之间2086基因的序列保守水平，克隆了来自亚科A和亚科B的几个代表株的全长基因并进行DNA序列分析。使用文中披露的引物(见，例如表IV)鉴定了24个血清群B脑膜炎球菌性菌株，这些菌株表达不同的血清亚型抗原，也表达共有的蛋白质P2086。文中给出了作为成熟DAN序列(即所有的在半胱氨酸残基处被切断的脂蛋白信号序列)的这些序列的例子。见(但不限于)例如偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中的氨基酸序列。
虽然2086蛋白在野生型菌株中存在量不大，但它可作为杀菌抗体的靶位。不同于对PorA反应时所产生的那些抗体，这些抗体能杀死表达异源血清亚型的菌株。
针对2086蛋白的抗体也能被动性保护幼大鼠免遭脑膜炎球菌的攻击。(见表VII)重组表达2086蛋白使得能用2086蛋白作为预防脑膜炎球菌疾病的免疫原性组合物。所有近来在临床实验中采用的候选脑膜炎球菌性免疫原性组合物都是复合混合物或含有许多不同蛋白质的外膜蛋白制剂。提供血清亚型特异性的PorA蛋白需要在一种免疫原性组合物中包括6到9种变体来覆盖约70-80％的疾病相关血清亚型。相反，文中清晰阐明了针对单一2086蛋白的抗血清能单独杀死6个血清亚型的代表细菌，它们占西欧和美国该病分离菌株的约65％。因此，纯化的2086蛋白有可能减少要提供充分覆盖引起脑膜炎球菌疾病血清亚型的免疫原性组合物所需的蛋白数目。
蛋白、免疫原性部分和生物等价物本发明提供的2086蛋白是分离的蛋白质。术语“分离的”指用人工方法改变其天然状态。如果“分离的”组合物或物质天然存在，则要改变它或将其从原始环境中取出，或二者皆是。例如，如文中所用的术语，天然存在于活动物中的多肽或多核苷酸是非“分离的”，但将其与从天然状态的共存物质中分离的同一多肽或多核苷酸就是“分离的”。因此，文中所用的术语“分离的蛋白质”包括从天然来源中分离的蛋白质和使用重组技术制备的蛋白质以及结合了其它抗原和/或添加剂(例如药学上可接受的运载体、缓冲液、佐剂等)的这种蛋白质。
按照本发明的一个实施方案，2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物等价物含有选自下列的氨基酸序列ADIGxGLADA(SEQ ID NO254)，其中x是任何氨基酸；IGxGLADALT(SEQ ID NO255)，其中x是任何氨基酸；SLNTGKLKND(SEQ ID NO256)；
SLNTGKLKNDKxSRFDF(SEQ ID NO257，其中x是任何氨基酸)；SGEFQxYKQ(SEQ ID NO258)，其中x是任何氨基酸；IEHLKxPE(SEQ ID NO259)，其中x是任何氨基酸；或其组合。
按照本发明的一个实施方案，2086亚科A蛋白、其免疫原性部分和/或其生物等价物含有选自下列的氨基酸序列GGGVAADIGx(SEQ ID NO260)，其中x是任何氨基酸；SGEFQIYKQ(SEQ ID NO261)；HSAVVALQIE(SEQ ID NO262)；EKINNPDKID(SEQ ID NO263)；SLINQRSFLV(SEQ ID NO264)；SGLGGEHTAF(SEQ ID NO265)；GEHTAFNQLP(SEQ ID NO266)；SFLVSGLGGEH(SEQ ID NO267)；EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP(SEQ ID NO268)；GKAEYHGKAF(SEQ ID NO269)；YHGKAFSSDD(SEQ ID NO270)；GKAEYHGKAFSSDD(SEQ ID NO271)；IEHLKTPEQN(SEQ ID NO272)；KTPEQNVELA(SEQ ID NO273)；IEHLKTPEQNVELA(SEQ ID NO274)；AELKADEKSH(SEQ ID NO275)；AVILGDTRYG(SEQ ID NO276)；AELKADEKSHAVILGDTRYG(SEQ ID NO277)；EEKGTYHLAL(SEQ ID NO278)；或其组合。
按照本发明的一个实施方案，2086亚科B蛋白、其免疫原性部分和/或其生物等价物含有任何选自下列的氨基酸序列LITLESGEFQ(SEQID NO279)；SALTALQTEQ(SEQ ID NO280)；
FQVYKQSHSA(SEQ ID NO281)；LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ(SEQ ID NO282)；IGDIAGEHTS(SEQ ID NO283)；EHTSFDKLPK(SEQ ID NO284)；IGDIAGEHTSFDKLPK(SEQ ID NO285)；ATYRGTAFGS(SEQ ID NO286)；DDAGGKLTYT(SEQ ID NO287)；IDFAAKQGHG(SEQ ID NO288)；KIEHLKSPEL(SEQ ID NO289)；ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV(SEQID NO290)；HAVISGSVLY(SEQ ID NO291)；KGSYSLGIFG(SEQ ID NO292)；VLYNQDEKGS(SEQ ID NO293)；HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG(SEQ ID NO294)；AQEVAGSAEV(SEQ ID NO295)；IHHIGLAAKQ(SEQ ID NO296)；VETANGIHHI(SEQ ID NO297)；AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO298)；或VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO299)；按照本发明的一个实施方案，2086蛋白含有以下共有序列和/或其免疫原性部分2086蛋白共有序列(SEQ ID NO300)CSSG-----GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTxxxGD---SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGxxITLxSGEFQxYKQxHSAxxALQ
xExxxxxxxxxxxxxxRxFxxxxxxGEHTxFxxLPxx-xAxYxGxAFxSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKxPExNVxLAxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxxGxxAQExAGxAxVxxxxxxHxIxxAxKQ在前述的共有序列中，“x”代表任何氨基酸，从氨基酸位置5到氨基酸位置9的区域可有0到5个氨基酸，从氨基酸位置67到氨基酸位置69的区域可有0到3个氨基酸，氨基酸位置156可有0到1个氨基酸。从氨基酸位置5到氨基酸位置9的区域优选有0、4或5个氨基酸。从氨基酸位置67到氨基酸位置69的区域优选有0或3个氨基酸。应该特别注意的是这些共有序列说明了2086蛋白的高度变异性。不希望受理论的束缚，据信这种高度变异性提供了有利的和出乎意料的交叉反应性。
按照本发明所实施的结果，2086蛋白的特征是具有免疫原性、无致病性和无菌株特异性。此外，按照本发明另一实施结果，尽管有约2％到40％的无保守性，这些蛋白出乎意料地表现出免疫原性。
文中所用的术语“无保守性”指可插入、取代和/或删除的氨基酸数目与蛋白质氨基酸总数的百分比。例如，如果一个蛋白是40％无保守性的，那么例如该蛋白质的263个氨基酸中有105个氨基酸位置处的氨基酸可取代。2086蛋白质也可删除一些氨基酸残基而不影响其免疫原性。
此外，2086蛋白质可根据不同区域的同源性分成亚科。例如(并不限于)，以下提供了两种亚科，亚科A和亚科B的共有序列2086亚科A序列(SEQ ID 310)CSSG----GGGVAADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTxxxGD---SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAVVALQI
EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVILGDTRYGxEEKGTYHLALxGDRAQEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ参数“x”是任何氨基酸。
从氨基酸位置5到氨基酸位置8的区域可有0到4个氨基酸。
从氨基酸位置66到氨基酸位置68的区域可有0到3个氨基酸。
从氨基酸位置5到氨基酸位置8的区域优选有0或4个氨基酸。从氨基酸位置66到氨基酸位置68的区域优选有0或3个氨基酸。
按照本发明所实施的结果，亚科A的2086蛋白含有选自以下的氨基酸序列KINNPDKIDSLINQ(SEQ ID NO450)；DEKSHAVILG(SEQ ID NO451)；KIGEKVHEIG(SEQ ID NO452)；和其组合。
按照本发明的另一个实施方案，亚科A的2086蛋白质含有的氨基酸序列由能在严谨条件下与编码SEQ ID NO450-452任一条的多核苷酸之一杂交的多核苷酸所编码。本领域的技术人员能鉴定和选择编码SEQ IDNOS450-452之一的多核苷酸(即，核酸序列)，和能在严谨条件下与编码SEQ ID NO450-452中任一条的多核苷酸之一杂交的多核苷酸。
2086亚科B(SEQ ID 302)
CSSGGGG-----VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQxQDxExSxKMVAKRxFxIGDIAGEHTSFDKLPKxxxATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ参数“x”是任何氨基酸。
从氨基酸位置8到氨基酸位置12的区域可有0到5个氨基酸。
从氨基酸位置8到氨基酸位置12的区域优选有0或5个氨基酸。
按照本发明所实施的结果，来自亚科A的2086蛋白质含有选自以下的氨基酸序列MVAKRQFRIG(SEQ ID NO444)；DIAGEHTSFDKLP(SEQ ID NO445)；YTIDFAAKQG(SEQ ID NO446)；GKIEHLKSPELNV(SEQ ID NO447)；HAVISGSVLYNQ(SEQ ID NO448)；AQEVAGSAEV(SEQ ID NO449)；和其组合。
按照本发明的另一个实施方案，亚科B的2086蛋白质含有的氨基酸序列由能在严谨条件下与另一条编码SEQ ID NO444-449之一的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。本领域的技术人员能鉴定和选择编码SEQ IDNOS444-449之一的多核苷酸(即，核酸序列)和能在严谨条件下与编码SEQID NO444-449中任一条的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
按照本发明所实施的结果，2086蛋白质亚科还可再分为簇。例如，按照本发明所实施的结果，提供了以下簇偶数编号序列SEQ ID NOS2-12；偶数编号序列SEQ ID NOS14-24；偶数编号序列SEQ ID NOS26-42；偶数编号序列SEQ ID NOS50-60；偶数编号序列SEQ ID NOS62-108；偶数编号序列SEQ ID NOS110-138；偶数编号序列SEQ ID NOS140-156；偶数编号序列SEQ ID NOS158-174和偶数编号序列SEQ ID NOS224-252。
本发明的多肽序列可与参考序列(例如，偶数编号序列SEQ IDNOS2-252或奇数编号序列SEQ ID NOS331-443)相同，即100％相同或者该序列与参考序列相比可含有一些氨基酸改变，这样相同性％就小于100％。这种改变包括至少一个氨基酸被删除、取代(包括保守或非保守取代)或插入。改变可发生在参考多肽序列的氨基-或羧基-末端位置，或这二末端位置之间的任何位置，既可单独散布在参考氨基酸序列的氨基酸中，也可散布在参考氨基酸序列中的一个或多个毗连群中。
所以，本发明也提供了与序列表所示氨基酸序列具有序列相同性的蛋白质(即，偶数编号序列SEQ ID NOS2-252或奇数编号序列SEQ IDNOS331-443)。序列的相同程度取决于具体的序列，优选大于60％(即，60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.9％或更大)。这些同源蛋白质包括突变体和等位变体。
在本发明优选的实施方案中，2086蛋白或其它2086多肽(例如，免疫原性部分和生物等价物)可产生针对同源脑膜炎球菌菌株和至少一种异源脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。特别是，针对2086多肽的抗体可被动性保护幼大鼠抵御脑膜炎球菌的攻击(例如鼻内)。在其它优选实施方案中，2086多肽对幼大鼠表现出对同源菌株和至少一种异源菌株的保护作用。该多肽可选自以上序列总结中所述的偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443，或者该多肽可是表中所列出多肽的任何免疫片段或生物等价物。该多肽宜选自以上序列总结中偶数编号序列SEQ IDNOS2-252或奇数编号序列SEQ ID NOS331-443。
本发明也涉及2086多肽的生物等价物的等位变体或其它变体。合适的生物等价物应表现出以下能力(1)能引发针对同源菌株和至少一种异源奈瑟球菌菌株和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)能与同源菌株和至少一种异源奈瑟球菌菌株和/或淋球菌菌株的表面反应；(3)能赋予抗活菌攻击的被动性保护力；和/或(4)防止细菌寄居。
倘若等价物能引发与本发明的2086蛋白之一基本相同的免疫原性，则合适的生物等价物与文中所述的2086多肽(即，偶数编号序列SEQ IDNOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443)之一具有的相似性至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约75％、再优选约80％、再更优选约85％、再更优选约90％、再更优选约95％或再优选约98％或再优选约99％。
或者，生物等价物具有与偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中的2086蛋白之一基本相同的免疫原性。按照本发明的实施方案，生物等价物具有与偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443相同的免疫原性。
可通过对本发明蛋白产生变体和修饰物获得生物等价物。通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸来改变氨基酸序列获得这些蛋白的变体和修饰。可修饰氨基酸序列(例如通过取代)以产生质量基本相同或提高的多肽。引入改变的优选方式包括通过定点诱变产生多肽的核酸序列的预定突变。
在本发明的多肽的结构中可产生修饰和改变并仍能得到具有脑膜炎奈瑟球菌免疫原性的分子。例如(但不限于)，在某序列中一些氨基酸可被其它氨基酸取代(包括非保守取代和保守取代)而不明显丧失其免疫原性。因为多肽的相互作用能力和性质确定了其生物功能活性，可在多肽序列中(当然，或者也可在其DNA编码序列中)取代一些氨基酸仍可得到具有类似性能的多肽。本发明考虑了文中多肽结构以及编码所述多肽的核酸序列的任何变化，仍可保留该多肽的免疫原性。因此，按照文中提供的指导，本领域的普通技术人员可容易地修饰披露的多肽和多核苷酸。
例如，已鉴定了允许取代或删除的某些可变区域。如前所述，按照本发明所实施的结果，2086共有序列体现了2086蛋白质家族的保守和非保守区域。
本领域技术人员已知的任何技术均可用于产生这种改变。例如(不限于此)，可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域一般都了解亲水性氨基酸指数在赋予多肽相互作用的生物功能中的重要性。Kyte等，1982，J.Mol.Bio.157105-132。
也可根据亲水性产生类似氨基酸的取代，特别是籍此产生的生物功能等价多肽或肽类是要用于免疫学实施方案的。文中引作参考的美国专利号4,554,101阐述了多肽最大的局部平均亲水性(受其毗连的氨基酸的亲水性影响)与其免疫原性相关，即与多肽的生物学性能相关。
多肽的生物等价物也可用定点特异诱变制备。定点特异诱变是通过对编码DNA的特异诱变用于制备第二代多肽、或从其序列衍生的生物功能等价多肽或肽的技术。这种改变可能在需要氨基酸取代时是需要的。该技术还提供了通过在DNA中引入一个或多个核苷酸变化来方便地制备和测试序列变体，例如在该DNA中加入一个或多个前述变化。定点特异的诱变使得能通过使用特异的寡核苷酸序列和充足数量的毗连核苷酸产生突变体，来提供充分大小和序列复杂度的引物序列，以在横跨删除接头的两侧形成稳定的双链，该特异的寡核苷酸编码所需突变的DNA序列。长17到25个核苷酸的引物是通常优选的，该序列接头的两侧约5到10个残基可被改变。
一般而言，定点特异性诱变是本领域熟知的。如同了解的一样，该技术一般使用以单链或双链形式存在的噬菌体载体。照此，定点特异的诱变一般首先获得单链载体，该载体在其序列内包括有编码所选择的脑膜炎奈瑟球菌多肽的所有或一部分序列的DNA序列。制备带有所需突变序列的寡核苷酸引物(例如，合成)。为完成带有突变的链的合成，该引物然后与单链载体退火，并用例如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段延伸。从而形成了异质性双链体，其中一条链编码原始的非突变序列而第二条链带有所需的突变。然后该异质性双链载体用于转化合适的细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)并选择带有该突变的重组载体的克隆。除了寡核苷酸引物，试剂盒与所有需要的试剂均市售可得。
2086多肽包括与偶数编号序列SEQ ID NOS 2-252之一的氨基酸序列的2086蛋白质具有基本序列相似性和/或生物等价物的任何蛋白质或多肽。此外，本发明的2086多肽不限于具体的来源。所以本发明为各种来源的多肽的一般性检测和分离做了准备。如同本领域技术人员所熟知的一样，以文中提供的指导为基础，2086多肽也可重组制备，或用本领域已知的其它合成方法制备。
本发明考虑宜将2086多肽切成片段用于进一步的结构或功能分析，或用于生产例如2086相关多肽和2086特异抗体制剂。这可通过用肽酶(例如，内切蛋白酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN))处理纯化的或未纯化的脑膜炎奈瑟球菌多肽来实现。用CNBr处理是另一种方法，通过该方法可从天然脑膜炎奈瑟球菌2086多肽产生多肽片段。重组技术也可用于产生2086蛋白的特异性片段。
文中使用的术语“变体”是分别与参考多核苷酸或多肽不同但却保留了基本性能的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变体与另一个参考多核苷酸相比在核苷酸序列上不同。变体核苷酸序列的变化能或不能改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸变化可导致参考多核苷酸编码的多肽中发生氨基酸取代、添加、删除、融合和截短。典型的多肽变体与另一个参考多肽相比在氨基酸序列上不同。一般来说差别是有限的，这样参考多肽和变体的序列在整体上是十分相似的并且在许多区域是相同的(即，生物等价物)。变体和参考多肽在氨基酸序列上有差别可通过任意组合的一个或多个取代、添加、删除而。取代或插入的氨基酸残基可以是或不是该遗传密码所编码。多核苷酸或多肽的变体可是天然存在的，例如等位变体；或可是不知道是天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在变体可通过诱变技术或直接合成制造。
本领域已知，“相同性”指两个或多个多肽序列或多核苷酸序列之间由序列比对确定的关系。本领域中，“相同性”也指多肽或多核苷酸序列之间的相关性的程度，可由这种序列串之间的匹配程度确定。“相同性”和“相似性”可用已知的方法方便地计算，包括(但不限于)计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，Oxford UniversityPress，New York，1988；生物计算信息学和基因组项目(BiocomputingInformatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，AcademicPress，New York，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，Academic Press，1987和序列分析引物(SequenceAnalysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，New York，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath.，481073(1988)。测定相同性的优选的方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性和相似性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性和相似性的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。BLASTX程序从NCBI和其它来源为公众可用(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
例如(不受其限制)，本发明的氨基酸序列可与参考序列(偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443)相同，即100％相同，或者它与参考序列相比含有一定数量的氨基酸变化，这样相同性％就小于100％。这种改变选自至少一个氨基酸删除、取代(包括保守和非保守取代)或插入，其中所述的变化可发生在参考多肽序列的氨基-或羧基-末端位置，或在这二末端位置之间的任何位置，既可单独散布在参考序列的氨基酸中，也可散布在参考序列的一个或多个毗连群中。对于给定相同性％，变化的氨基酸的数目通过将偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中的氨基酸总数乘以各自相同性百分率(除以100)的百分数，然后减去偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQID NOS331-443任一中的氨基酸总数的乘积来确定，或者na＝xa-(xa·Y)其中，na是变化的氨基酸的数目，xa是偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中的氨基酸总数，y是例如70％就是0.70，80％就是0.80，85％就是0.85等，其中任何非整数的xa和y的乘积在从xa中减掉之前四舍五入至最接近的整数。
在优选的实施方案中，上述多肽选自偶数编号序列SEQ ID NOS 2-252所示的蛋白质，例如2086蛋白的成熟加工的形式。2086蛋白或等价物等可是脂质化或非脂质化的。
带有天然的ORF2086信号序列的ORF2086可在大肠杆菌(E.coli)中表达。然而，需要发现一种改善该蛋白的表达方法。按照本发明的一个实施方案，前导序列产生了该蛋白的脂质化形式。例如，以下描述了不分类的(nontypable)流感嗜血菌蛋白的信号序列来提高蛋白表达。
细菌脂蛋白的加工始于含有信号序列的前体或原脂蛋白的合成，该原脂蛋白进而含有共有脂蛋白加工/修饰位点。该原脂蛋白首先经过革兰氏阴性细菌的内膜上或革兰氏阳性细菌的膜上的共同Sec系统。一旦被Sec系统固定在膜上，该原脂蛋白在共有位点被信号肽酶II切断并且暴露的N-末端半胱氨酸残基被甘油酯化和酰化。Hayashi等，1990，细菌中的脂蛋白(Lipoproteins in bacteria)，J.Bioenerg.Biomembr，Jun，22(3)451-71；Oudega等，1993，一种小的脂蛋白-细菌素释放蛋白-的表达和膜嵌入需要大肠埃希氏菌SecB、SecA和SecY蛋白(Escherichia coli SecB，SecA，and SecYproteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocinrelease protein，a small lipoprotein)，J.Bacteriol，Mar，175(5)1543-7；Sankaran等，1995，细菌脂蛋白的修饰(Modification of bacterial lipoproteins)，MethodsEnzymol.250683-97。
在革兰氏阴性细菌中，脂质化蛋白转移至外膜是由依赖于脂蛋白位置2处分选信号的具有膜特异性的独特ABC转运蛋白系统介导。Yakushi等，2000，一种介导脂类修饰蛋白从膜上分离的新的ABC转运蛋白(A new ABCtransporter mediating the detachment of lipid modified proteins frommembranes)，Nat Cell Biol，Apr，2(4)212-8。
与细菌脂蛋白及其信号序列融合用于在细菌表面展示重组蛋白。美国专利号5,583,038和6,130,085。交换脂蛋白信号序列可增加脂蛋白的生产。De等,2000，大肠埃希氏菌中表达的肺炎链球菌的棕榈酰化肺炎球菌表面粘附素A的纯化和性质鉴定(Purification and characterization ofStreptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin Aexpressed in Escherichia coli)，Vaccine，Mar 6，18(17)1811-21。
蛋白质的细菌脂质化已知可增强或修饰对蛋白质的免疫应答。Erdile等，1993.，结合的脂类对巴氏巯螺旋体OspA免疫原性中的作用(Role ofattached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA)，Infect.Immun，Jan，61(1)81-90；Snapper等，1995，细菌脂蛋白在对T-细胞不依赖性II型抗原的体液免疫应答中可取代细胞因子(Bacterial lipoproteins maysubstitute for cytokines in the humoral immune response to T cell-independenttype II antigens)，J.Immunol，Dec 15，155(12)5582-9。然而，细菌脂蛋白的表达可用加工过程的严谨性而复杂化。Pollitt等，1986，大肠埃希氏菌主要的外膜脂蛋白的信号肽切割位点中氨基酸取代的作用(Effect of aminoacid substitutions at the signal peptide cleavage site of the Escherichia colimajor outer membrane lipoprotein)，J.Biol.Chem，Feb 5，261(4)1835-7；Lunn等，1987，原脂蛋白信号肽突变对大肠埃希氏菌中杂交的原脂-β-内酰胺酶分泌的作用(Effects of prolipoprotein signal peptide mutations on secretion ofhybrid prolipo-beta-lactamase in Escherichia coli)，J.Biol.Chem.，Jun 15，262(17)8318-24；Klein等，1988，细菌脂蛋白信号序列的独特性能(Distinctive properties of signal sequences from bacterial lipoproteins)，ProteinEng.，Apr，2(1)15-20。细菌脂蛋白表达也可因其它问题而复杂化，例如毒性和表达水平低。Gomez等，1994，枯草芽孢杆菌脂蛋白LplA的核苷酸在大肠埃希氏菌中表达时造成细胞裂解(Nucleotide The Bacillus subtilislipoprotein LplA causes cell lysis when expressed in Escherichia coli)，Microbiology.，Aug，140(Pt8)1839-45；Hansson等.1995.在大肠埃希氏菌中表达截短的和全长形式的莱姆病疏螺旋体外表面蛋白A(Expression oftruncated and full-length forms of the Lyme disease Borrelia outer surfaceprotein A in Escherichia coli)，Protein Expr.Purif.，Feb，6(1)15-24；Yakushi等，1997，错定位的主要外膜脂蛋白与大肠埃希氏菌肽聚糖之间的共价连接的所致的死亡率(Lethality of the covalent linkage between mislocalizedmajor outer membrane lipoprotein and the peptidoglycan of Escherichia coli)，J.Bacteriol.，May，179(9)2857-62。
不可分类的流感嗜血杆菌表达命名为P4的脂蛋白(也称为蛋白质“e”)。使用天然的P4信号序列可在大肠杆菌中高度表达P4蛋白的重组形式。美国专利号5,955,580。当在大肠杆菌表达载体中用天然P4信号序列取代天然ORF2086信号序列时，增加了ORF2086的表达。
使用异源P4信号序列能增加表达的概念可延伸到其它的细菌脂蛋白。特别是，对细菌基因组的分析鉴定了许多可能引起兴趣的ORFs。试图在异源宿主细胞(例如大肠杆菌)中用其天然信号序列表达每种ORF，在使用各种信号序列中产生了一系列问题，包括稳定性、相容性等。为使这些问题减少至最小，使用P4信号序列来表达每种感兴趣的ORF。如上所述，P4信号序列增加了异源2086ORF的表达。通过删除感兴趣ORF的天然信号序列，然后将P4信号序列与ORF连接来构建表达载体。然后用表达载体转化、转染或感染合适的宿主细胞，ORF的表达相比使用ORF的天然信号序列得到增加。
某蛋白的非脂质化形式可通过缺失其原始前导序列或通过用不能在宿主细胞中指定脂肪酸酰化位点的序列部分取代的前导序列来产生。
除非另有特别指出，本发明的各种形式的2086蛋白质在文中均以“2086”蛋白质表示。除非另有指出，“2086多肽”也指2086蛋白质以及上述的其免疫原性部分或其生物等价物。
分离和纯化的全长脑膜炎奈瑟球菌2086蛋白质在10％到20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中测得的表观分子量约为28到35kDa。更具体说，该蛋白用质谱测得的分子量约为26,000到30,000道尔顿。
宜采用2086多肽和编码这种多肽的核酸来预防或缓解脑膜炎奈瑟球菌和/或其它种细菌导致的感染。
抗体本发明的蛋白质(包括SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ IDNOS331-443所示的氨基酸序列、它们的片段和其类似物、或表达它们的细胞)也可用作免疫原来产生本发明多肽的免疫特异性抗体。本发明包括针对免疫特异性多肽的抗体，和这种抗体在检测脑膜炎奈瑟球菌是否存在、提供被动性的保护力或在测定细胞、细胞或组织抽提物或生物液体中该多肽数量或浓度中的用途。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型抗体。多克隆抗体是得自用抗原免疫的动物血清的异质性抗体分子群。单克隆抗体是针对特异性抗原的基本上同质的抗体群。单克隆抗体可用本领域技术人员已知的方法获得，例如，Kohler和Milstein，1975，Nature，256495-497和美国专利号4,376,110。这种抗体可是任一类免疫球蛋白(包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD)和其任一亚类。
嵌合抗体是已知一种不同部分衍生自不同动物种类的分子，例如那些具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体及其制备方法为本领域所公知(Cabilly等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA813273-3277；Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 816851-6855；Boulianne等，1984，Nature.，312643-646；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公布)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公布)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公布)；Neuberger等，PCT申请WO86/01533(1986年3月13日公布)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公布)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公布)；Sahagan等，1986，J.Immunol.，1371066-1074；Robinson等，PCT/US86/02269(1987年5月7日公布)；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 843439-3443；Sunet等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 84214-218；Better等，1988，Science.，2401041-1043)。这些参考文献全文引入作为参考。
抗独特型(抗-Id)抗体是能识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。抗-Id抗体从单克隆抗体制备，它通过用所述的单克隆抗体免疫作为单克隆抗体来源的相同种和遗传型的动物(例如，小鼠株)来制备。免疫的动物通过产生针对这些同种型决定簇的抗体(抗-Id抗体)来识别免疫用抗体的独特型决定簇并对其发生应答反应。
因此，可利用产生的抗本发明多肽的单克隆抗体在合适的动物中诱导抗-Id抗体。这种免疫小鼠的脾细胞可用于产生分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。此外，可将抗-Id抗体可与载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH))偶联并用于免疫其它的BLAB/c小鼠。这种小鼠的血清含有对R-PTP酶表位特异性的最终mAb具有结合性能的抗-抗-Id抗体。因此该抗-Id抗体具有其独特型表位或与所评价过的表位具有结构相似的“独特位”，例如酿脓链球菌多肽。
术语“抗体”也指完整的抗体分子及其能结合抗原的片段，例如Fab。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，在循环中更快清除并且非特异性组织结合比完整抗体低(Wahl等，1983，J.Nucl.Med.，24316-325)。将会明白本发明有用的这些抗体的Fab和其它片段可按照完整抗体的方法用于检测和定量脑膜炎奈瑟球菌多肽。
本发明的抗体(例如抗-独特型(“抗-Id”)抗体)可用于治疗或预防哺乳动物宿主奈瑟球菌感染的方法中，包括给予免疫有效量的上述多肽的特异性抗体。抗-Id抗体也可用作“免疫原”在另一种动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id可与诱生抗-Id的原始mAb表位相同。所以，通过使用针对某mAb的独特型决定簇的抗体能鉴定到能表达相同特异性抗体的其它克隆。
该抗体可用在各种方法中，例如验证确定蛋白质的表达或验证蛋白质在何处表达。标记的抗体(例如，FACS的荧光标记抗体)与完整的细胞一起孵育，细菌表面出现标记即可验证，例如蛋白质的位置。
使用常规方法给予动物这些多肽或带有表位的片段、类似物或细胞来得到抗本发明多肽的抗体。任何通过连续细胞系培养生产抗体的技术均可用于制备单克隆抗体。
多核苷酸本发明的多核苷酸可包含作为伴随本发明蛋白质的核酸序列，该核酸序列与偶数编号序列SEQ ID NOS330-442这任一条相同，即100％相同，或者与参考序列相比它可含有包括一定数目的核苷酸改变。这种改变选自至少一个核苷酸被删除、取代(包括转换或颠换)或插入，其中所述的改变可发生在参考核苷酸序列的5’-或3’-末端位置或在这二末端位置之间的任何位置，既可单独散布在参考序列的核苷酸中，也可散布在参考序列的一个或多个毗连群中。偶数编号序列SEQ ID NOS330-442中任一条的核苷酸总数乘以各自的相同性百分率(除以100)的百分数，然后从所述序列的所述核苷酸总数中减去该乘积得到核苷酸改变的数目。
举例来说(不限于)，分离的脑膜炎奈瑟球菌多核苷酸含有与奇数编号序列SEQ ID NOS1-253和偶数编号序列SEQ ID NOS330-442中任一核酸序列具有70％相同性的多核苷酸序列、其简并变体或其片段，其中该多核苷酸序列可在奇数编号序列SEQ ID NOS1-253和偶数编号序列SEQ IDNOS330-442的核酸序列的整个多核苷酸区域中包括nn个核苷酸变化，其中nn是变化的最大数目并且可由下式计算nn＝xn-(xn·y)，其中，xn是奇数编号序列SEQ ID NOS1-253和偶数编号序列SEQ IDNOS330-442中任一条的核酸总数，y是0.70，其中任何非整数的xa和y的乘积在从xn中减掉之前四舍五入至最接近的整数。当然，当相同性％是80％y就是0.80，当相同性％是85％y就是0.85，当相同性％是90％y就是0.90，当相同性％是95％y就是0.95等。编码含有偶数编号序列SEQ IDNOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中任一条氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的改变可在该编码序列中产生无义、错义或移码突变并因此这种变化改变了该多核苷酸编码的多肽。
本发明某些实施方案涉及编码2086蛋白的多核苷酸(文中以“2086多核苷酸”或“ORF2086多核苷酸”表示)和抗2086蛋白的抗体。在优选的实施方案中，本发明分离的多核苷酸含有与选自奇数编号序列SEQ IDNOS1-253或偶数编号序列SEQ ID NOS330-442中任一核苷酸序列具有95％相同性的核苷酸序列、其简并变体或其片段。如文中所定义的，“简并变体”定义为由于遗传密码子的简并性致使与奇数编号序列SEQ IDNOS1和SEQ ID NOS253所示的核苷酸序列(及其片段)不同的多核苷酸，但该多核苷酸仍能编码相同的2086蛋白(例如，偶数编号序列SEQ IDNOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443)，该2086蛋白与由奇数编号序列SEQ ID NOS1-253和偶数编号序列SEQ ID NOS330-442所示核苷酸序列编码的蛋白相同。
在其它的实施方案中，该多核苷酸与选自奇数编号序列SEQ IDNOS1-253或偶数编号序列SEQ ID NOS330-442之一的核苷酸序列、其简并变体或其片段互补。在还有其它的实施方案中，该多核苷酸选自DNA、染色体DNA、cDNA和RNA并且还可含有异源核苷酸。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸在高度严谨杂交条件下与选自SEQ ID NOS1-253或偶数编号序列SEQ ID NOS330-442之一的核苷酸序列、其互补序列、其简并变体或其片段杂交。在还有其它的实施方案中，该多核苷酸能在中度的严谨杂交条件下杂交。
将会明白，2086多核苷酸可是天然、合成或半合成来源；此外，该核苷酸序列可是天然存在的序列或者是通过突变(包括一个或多个碱基取代、删除、插入和倒位)与这种天然存在的序列有关的序列，其前提是含有这种序列的核酸分子总能表达为上述的2086免疫原性多肽。该核酸分子可是RNA、DNA、单链或双链、线形或共价闭合环形。该核苷酸序列可含有与其毗连的表达控制序列，这种控制序列一般是异源的。一般来说，本发明核酸序列的重组表达要利用该核酸序列末端的终止密码子序列，例如TAA。
本发明也包括能在降低的严谨条件下(优选严谨条件、最优选高度严谨条件)与文中所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严谨条件的例子见以下的严谨条件表高度严谨的条件是至少如条件A-F一样严谨的条件；严谨条件是至少如条件G-L一样严谨的条件；降低的严谨条件是至少如条件M-R一样严谨的条件。
严谨条件-表I


<p>注意如果r＝1，形成n-氧化物

本发明也提供与这些多核苷酸完全互补的多核苷酸以及反义序列。本发明的反义序列(也指反义寡核苷酸)包括能阻断编码本发明多肽的多核苷酸表达的内部产生的和外部施加的序列。本发明的反义序列含有，例如约15-20个碱基对。该反义序列可按以下方式设计例如通过阻止启动子与上游的非翻译序列结合来抑制转录或通过阻止核糖体结合来阻止编码本发明多肽的转录物的翻译来抑制转录。
本发明的多核苷酸可用许多方法制备(例如，从DNA文库、从生物体自身化学合成)并可采取各种形式(例如，单链、双链、载体、探针、引物)。术语“多核苷酸”包括DNA和RNA，也包括其类似物，例如含有修饰骨架的类似物。
按照本发明其它实施的结果，本发明的多核苷酸组成了DNA文库，例如cDNA文库。
融合蛋白本发明也涉及融合蛋白。“融合蛋白”指由两种(通常是无关的)融合基因或其片段编码的蛋白。例如，融合蛋白含有免疫球蛋白分子恒定区的不同部分和另一个免疫原性蛋白或其一部分。在许多情况中，使用免疫球蛋白Fc区域作为融合蛋白的一部分对治疗和诊断是有利的，可导致，例如药代动力学性能的改善(见，例如，EP 0 232 262A1)。另一方面，对一些用途而言，需要在融合蛋白已被表达、检测和纯化后删除此Fc部分。本发明的2086多核苷酸用于重组生产本发明的多肽，该多核苷酸自身可包含有成熟多肽的编码序列，或在读码框内包含有成熟多肽的编码序列和其它编码序列，例如编码前导序列或分泌序列、前-、或原-或前原-蛋白序列或其它融合多肽部分的那些序列。例如，可编码有助于纯化2086多肽或融合蛋白的标记序列(见Gentz等，1989，其内容引作参考)。所以，本发明实施的结果中考虑制备允许表达产物的His-尾来纯化融合多肽的编码多核苷酸。该多核苷酸也可含有非编码的5’和3’序列，例如转录的、不翻译序列、剪接和聚腺苷酸化信号。这种融合多肽可用下述的重组DNA克隆载体转化/转染的或感染的宿主细胞来生产并随后可从宿主细胞分离来提供基本上无其它宿主细胞蛋白的该融合多肽。
免疫原性组合物本发明的一方面提供含有至少一种2086蛋白或编码所述蛋白的核酸的免疫原性组合物。前述的组合物要具有(1)能引发针对多种菌株的杀菌抗体；(2)能与多种菌株的表面反应；(3)能赋予抵抗活菌攻击的被动性保护力；和/或(4)防止细菌寄居。
配制这种免疫原性组合物是本领域技术人员熟知的。本发明的免疫原性组合物优选包括药学上可接受的运载体。合适的药学上可接受的运载体和/或稀释剂包括任一与所有常规的溶剂、分散介质、填料、固体运载体、水溶液、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延滞剂等。合适的药学上可接受的运载体包括，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等之一或多种和其组合。药学上可接受的运载体还可含有少量能提高抗体的储存时间和效力的辅助性物质，例如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液。药学上可接受的运载体的制备和使用方法是本领域熟知的。除了迄今与该活性成分不相容的任何常规介质或试剂，均考虑可用于本发明免疫原性组合物中。
这种免疫原性组合物可经肠道外给药，例如，皮下或肌肉内注射以及口服或鼻内给药。肌肉内免疫的方法见Wolff等和Sedegah等所述。其它给药方式使用，例如(不限于)口服制剂、肺制剂、栓剂和透皮应用。口服制剂，例如包括常规使用的赋形剂，如(不限于)药学级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
本发明的免疫原性组合物可含有一种或多种佐剂，包括(不限于)氢氧化铝；磷酸铝；STIMULONTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)；MPLTM(3-O-脱酰基化单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，MT)、529(一种氨基烷基磷酸葡糖胺化合物，Corixa，Hamilton，MT)、IL-12(Genetics Institute，剑桥，MA)；GM-CSF(Immunex Corp.，西雅图，华盛顿)；N-乙酰-胞壁酰--L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-正(nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，以nor-MDP表示)；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基-乙胺)(CGP 19835A，以MTP-PE表示)和霍乱毒素。其它可用的是霍乱毒素的无毒性衍生物，包括其A亚基、和/或脑膜炎奈瑟球菌多肽与霍乱毒素或其B亚基的偶连物或遗传工程融合物(“CTB”)、原霍乱类菌素、真菌多糖，包括裂裥菌素、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波醇酯、大肠杆菌热易变毒素、嵌段聚合物或皂甙。
在特定优选的实施方案中，本发明的蛋白用在口服给药的免疫原性组合物中，该组合物包含有一种粘膜佐剂并且用于治疗或预防人类宿主中脑膜炎奈瑟球菌感染。粘膜佐剂可是霍乱毒素，然而可用于本发明的霍乱毒素之外的优选粘膜佐剂包括霍乱全毒素的无毒性衍生物(其中A亚基发生突变)、化学修饰的霍乱毒素或通过修饰霍乱毒素的氨基酸序列产生的相关蛋白质。如公开的国际申请WO 00/18434(其内容引作参考)所披露的，在制备本发明的免疫原性组合物中特别有用的特异性霍乱毒素为突变体霍乱全毒素E29H。这些佐剂可加入本发明的多肽或与本发明的多肽偶联。同样的技术可用于其它具有粘膜佐剂或传递性能的分子，例如大肠埃希氏菌热易变毒素(LT)。可采用其它具有粘膜佐剂或传递活性化合物，例如胆汁、多聚阳离子(例如DEAE-葡聚糖和多鸟氨酸)、洗涤剂(例如十二烷基苯硫酸钠)、脂质偶联的物质、抗生素(例如链霉素)、维生素A和能改变粘膜表面的结构或功能的完整性的其它化合物。其它粘膜活性化合物包括微生物结构的衍生物，例如MDP；吖啶和甲腈咪胍。也可用如上所述的STIMULONTMQS-21、MPL和IL-12。
本发明的免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)的形式递送，ISCOMS含有CTB、脂质体或包裹在例如丙烯酸酯或聚(DL-交酯-共(co)-糖苷)中形成大小合适吸收的微球。也可将本发明的蛋白质包入油性乳剂。
多重抗原本发明的免疫原性制剂(包括蛋白、多核苷酸和等价物)可作为免疫原性组合物中唯一的活性免疫原被施用，或者该组合物可包含有其它免疫原，包括其它奈瑟球菌种类的免疫原性多肽、或一种或多种其它微生物病原体(例如但不限于，病毒、朊病毒、细菌或真菌)的免疫活性蛋白或荚膜多糖。该组合物可含有一种或多种需要的蛋白质、片段或用所选指标需要的药学化合物。如上所述，本发明的使用一种或多种核酸的组合物也可以相同方式在该免疫原性组合物中包含编码相同的各种蛋白质群的核酸。
本发明考虑了任何多重抗原或多价免疫原性组合物。例如，本发明的组合物可含有两种或多种2086蛋白的组合、2086蛋白与一种或多种PorA蛋白的组合、2086蛋白与脑膜炎球菌血清群A、C、Y和W135多糖和/或多糖偶联物的组合、2086蛋白与脑膜炎球菌和肺炎球菌组合物的组合，或任何前述物质适合于粘膜递送的形式的组合。本领域的技术人员能容易地配制这种多重抗原或多价免疫原性组合物。
本发明也考虑了多重免疫方案，此方案任何有用的抗病原体的组合物可与本发明组合物组合。例如(不限于)，可作为多重免疫方案一部分给予受试者本发明免疫原性组合物和另一种免疫组合物用于抗肺炎链球菌免疫。本领域的技术人员可容易地选择用于和本发明免疫原性组合物结合的免疫原性组合物来开发并实施多重免疫方案。
本发明具体的实施方案涉及在组合物中采用一种或多种本发明多肽、或编码这种多肽的核酸，或作为预防或减轻肺炎链球菌感染的治疗方案的一部分。2086多肽或2086多核苷酸可与任一免疫原性组合物结合用于抗肺炎链球菌。2086多肽或2086多核苷酸可与任何其它的基于蛋白质或多糖的脑膜炎球菌疫苗结合。
2086多肽、片段和等价物可用作偶联的免疫原性组合物的一部分，该组合物中一种或多种蛋白或多肽与载体偶联来产生一种具有抗多种血清型和/或抗多种疾病的免疫原性的组合物。此外，2086多肽之一种用作其它免疫原性多肽的载体蛋白。
本发明也涉及一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括向所述的动物提供本发明的免疫原性组合物的步骤。该免疫原性组合物在受治疗的动物或人中具有抗原性，因此这种组合物中含有的免疫有效量的多肽就可诱导所需的抗脑膜炎奈瑟球菌感染的免疫应答。优选的实施方案涉及一种治疗(包括改善或预防)人脑膜炎奈瑟球菌感染的方法，该方法包括向人施用免疫有效量的该组合物。
文中使用的短语“免疫有效量”指无论以单一剂量或一系列剂量中的一部分施用于哺乳动物宿主(优选人)的量，该剂量足以至少导致接受治疗个体的免疫系统产生应答反应而降低细菌感染的临床影响。其范围可从使细菌负荷降低最小到预防感染。理想的是受治疗的个体将不会出现细菌感染的更严重临床表现，此剂量取决于个体具体的情况而不同。该剂量可通过常规试验或本领域技术人员已知的方法确定。
本发明的另一个具体的方面涉及使用能表达本发明蛋白质或其免疫原性部分的载体或质粒作为免疫原性组合物。因此，本发明还有一方面是提供一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物提供能表达至少一种分离的2086多肽的载体或质粒。本发明的蛋白可使用含有能表达该多肽或免疫原性部分成为外源蛋白所需的遗传物质的活载体传送至哺乳动物，特别是使用活的重组细菌、病毒或其它活的事物。
按照本发明其它实施方式，提供了一种诊断哺乳动物细菌性脑膜炎的方法，该方法包括测定哺乳动物或所述哺乳动物的组织样品中是否存在免疫复合物，使所述哺乳动物或组织样品是与抗体组合物接触，该抗体组合物含有能与至少一种含有偶数编号序列SEQ ID NOS2-252和奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中任一氨基酸序列的多肽免疫特异性结合的抗体，此方法中所述的哺乳动物或组织样品在适合于形成免疫复合物的条件下与该抗体组合物接触。
病毒与非病毒载体优选的载体，特别是用于体外和体内细胞试验的载体是病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺-相关病毒、牛痘病毒、杆状病毒和其它带有所需的细胞嗜性的重组病毒。所以，编码2086蛋白或其免疫原性片段的核酸可用病毒载体在体内、活体外或体外引入，或可将DNA直接引入。靶组织内的表达可通过使转基因载体靶向特异性细胞而成功，例如利用病毒载体或受体配体、或利用组织特异性启动子或这两种方法。靶向基因的递送方法描述于全文引入作为参考的PCT出版号WO95/28494。
常规用在体内或活体外靶向和治疗过程的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(例如，Miller和Rosman，BioTechniques，1992，7980-990)。优选复制缺陷型的病毒载体，即它们不能自动在靶细胞内复制。优选的复制缺陷型病毒是最小的病毒，即它仅保留其基因组序列，这是包裹基因组来产生病毒颗粒所需的。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，例如(但不限于)单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺-相关病毒(AAV)等。优选完全或几乎完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒引入细胞后是无感染性的。使用缺陷型病毒载体使得可以给予细胞的特定、局部区域，而无需考虑载体会感染其它细胞。所以，可特异性地靶向具体的组织。具体载体的例子包括(但不限于)缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，1991，2320-330)、缺少甘油-蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒或其它缺陷型疱疹病毒(PCT出版号WO 94/21807和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等(J.Clin.Invest.，1992，90626-630；也见La Salle等，Science，1993，259988-990)所描述的载体；和缺陷型腺-相关病毒载体(Samulski等，J.Virol.，1987，613096-3101；Samulski等，J.Virol.，1989，633822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.，1988，83988-3996)，每篇文献均全文纳入作为参考。
生产可市售的病毒载体的各种公司包括(但不限于)Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)，Cell Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)，Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)，Genovo公司(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)，Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(Leiden，荷兰；腺病毒载体)，Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)，Norgen(腺病毒载体)，OxfordBioMedica(Oxford，英国；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg，法国；腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒和慢病毒)，这些均全文纳入作为参考。
腺病毒.腺病毒是真核DNA病毒，经修饰后能有效递送本发明的核酸至各种类型的细胞。腺病毒存在各种血清型。这些血清型中，本发明的范围内优选使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(见PCT出版号WO 94/26914)。用于本发明范围内的那些动物来源的腺病毒包括犬、牛、小鼠(例如Mavl，Beard等，Virology，1990，75-81)、羊、猪、鸟和猿(例如SAV)来源的腺病毒。动物来源的腺病毒优选犬腺病毒，更优选CAV2腺病毒(例如，Manhattan或A26/61病毒株，如ATCC VR-800)。各种复制缺陷腺病毒和最小腺病毒载体已有描述(PCT出版号WO 94/26914、WO 95/02697、WO 94/28938、WO94/28152、WO 94/12649、WO 95/02697、WO96/22378)。本发明的复制缺陷型重组腺病毒可用本领域技术人员公知的任何技术制备(Levrero等，Gene，1991，101195；欧洲专利出版号EP 185573；Graham，EMBO J.，1984，32917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659)。重组腺病毒使用本领域普通技术人员熟知的标准分子生物学技术回收和纯化。
腺-相关病毒.腺-相关病毒是尺寸较小的DNA病毒，可以稳定且位点特异性方式整合入感染的细胞基因组。它们能感染广谱的细胞而对细胞生长、形态或分化无任何诱导作用，并且它们似乎与人致病学无关。AAV基因组已得到克隆、测序并特征分析了其性质。在体外或体内使用得自AAVs的载体转运基因已见描述，PCT出版号WO 91/18088和WO 93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；欧洲专利出版号EP 488 528)。本发明的复制缺陷重组AAVs通过将两个质粒共转染入用人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系来制备，其中一个质粒所含有的感兴趣核酸序列侧接了两个AAV末端反向重复(ITR)区，另一个质粒携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)。得到的AAV重组子然后通过标准技术纯化。
逆转录病毒.在本发明另一实施方式中，核酸可用逆转录病毒载体引入，例如以下文献所述美国专利号5,399,346；Mann等，Cell，1983，33153；美国专利号4,650,764和4,980,289；Markowitz等，J.Virol.，1988，621120；美国专利号5,124,263；欧洲出版号EP 453 242和EP178 220；Bernstein等，Genet.Eng.，1985，7235；McCormick，BioTechnology，1985，3689；PCT出版号WO 95/07358和Kuo等，Blood，1993，82845，以上每篇文献均全文纳入作为参考。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合性病毒。逆转录病毒的基因组包含有两个LTR、一个衣壳化序列和三个编码区域(gag、pol和env)。重组逆转录病毒中的gag、pol和env基因一般是整体或部分被删除的并用感兴趣的异源核酸序列取代。这些载体可从不同类型的逆转录病毒构建，例如HIV、MoMuLV(“小鼠莫络尼白血病病毒”)、MSV(“小鼠莫络尼肉瘤病毒”)，HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾坏死病毒”)；RSV(“罗斯肉瘤病毒”)和Friend病毒。现有技术已描述了合适的包装细胞系，特别是细胞系PA317(美国专利号4,861,719)；PsiCRIP细胞系(PCT出版号WO 90/02806)和GP+envAm-12细胞系(PCT出版号WO 89/07150)。此外，重组逆转录病毒可在LTR内含有修饰以抑制转录活性，以及在其延伸的衣壳化序列中可能含有部分gag基因(Bender等，J.Virol.，1987，611639)。重组逆转录病毒载体通过本领域普通技术人员已知的标准技术纯化。
逆转录病毒载体可构建为具有感染颗粒的功能或经历单轮转染。在前一种情况中，修饰病毒以保留它的除负责致癌性转化性能以外的所有基因并能表达异源基因。制备无传染性病毒载体以破坏包装信号，但保留了结构基因，这是包装经工程改造以含有异源基因和异源包装信号的共导入病毒所需的。所以，得到的病毒颗粒不能产生其它的病毒。
逆转录病毒载体也可用DNA病毒引入，DNA病毒允许逆转录病毒复制一个循环并放大了转染效率(见PCT出版号WO 95/22617、WO 95/26411、WO 96/39036和WO 97/19182)。
慢病毒载体.本发明的另一个实施方式中，慢病毒载体可用作直接传送转基因并维持转基因在多种类型的组织中维持这些表达的制剂，这些组织包括脑、视网膜、肌肉、肝脏和血液。该载体可有效地转导这些组织中的分裂和非分裂细胞并实现感兴趣基因的长期表达。综述可见Naldini等，Curr.Opin.Biotechnol.，1998，9457-63；也可见Zufferey等，J.Virol.，1998，729873-80。慢病毒包装性细胞系是可用的并一般是本领域已知的。它们有助于产生用于基因治疗的高滴度的慢病毒载体。它们的一个例子是四环素可诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，该细胞系可产生滴度高于106IU/ml的病毒颗粒至少3到4天的(Kafri等，J.Virol.，1999，73576-584)。该可诱导细胞系产生的载体可在需要时浓缩用于有效地在体外或体内转导非分裂细胞。
非病毒载体.本发明的另一实施方式中，载体可作为裸DNA通过脂质转染法引入体内，或可用其它转染促进试剂(多肽、聚合物等)引入。合成的阳离子脂类可用于制备脂质体，该脂质体用于体内转染编码某标记的基因(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1987，847413-7417；Felgner和Ringold，Science，1989，337387-388；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1988，858027-8031；Ulmer等，Science，1993，2591745-1748)。有用的转运核酸的脂类化合物和组合物描述于PCT专利出版号WO95/18863和WO 96/17823，与美国专利号5,459,127。为靶向目的，脂类可化学偶联于其它分子(见Mackey等，同上)。靶向肽(例如激素或神经递质)和蛋白质(例如抗体)或非肽分子可用化学方法偶联于脂质体。
其它分子也可促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(例如，PCT专利出版号WO95/21931)，衍生自DNA结合蛋白的肽类(例如，PCT专利出版号WO 96/25508)或阳离子聚合物(例如，PCT专利出版号WO95/21931)。
将载体作为裸DNA质粒引入体内也是可能的。用于疫苗目的或基因治疗的裸DNA载体可通过本领域已知的方法(例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀)使用基因枪或使用DNA载体转运体(例如Wu等，J.Biol.Chem.，1992，267963-967；Wu和Wu等，J.Biol.Chem.，1988，26314621-14624；加拿大专利申请号2,012,311；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1991，882726-2730)引入需要的宿主细胞。也可使用受体介导的DNA输送方法(Curiel等，Hum.Gene Ther.，1992，3147-154；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，1987，2624429-4432)。美国专利号5,580,859和5,589,466披露了无转染促进试剂在哺乳动物中输送外源DNA序列的方法。近来，一种名为电转移的低电压、高效率体内DNA转运技术已见报道(Mir等，C.P.Acad.Sci.，1988，321893；PCT出版号WO 99/01157；WO 99/01158；WO 99/01175)。因此，本发明其它的实施方案中也涉及一种在人中诱导免疫应答的方法，该方法包括将一定量的编码本发明2086多肽的DNA分子任选与转染促进剂施用于所述的人，其中所述的多肽在表达时保留了免疫原性并且当该多肽掺入免疫原性组合物并施用于人时，可提供保护作用而不会在该人后来感染奈瑟球菌病原体(例如脑膜炎奈瑟球菌)时加重疾病。转染促进剂是本领域已知的，包括丁哌卡因和其它的局部麻醉剂(例如见美国专利号5,739,118)和阳离子聚胺(见公开的国际专利申请WO96/10038)，这些均引作参考。
本发明也涉及一种抗体，该抗体可是上述2086多肽的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。这种抗体可用本领域技术人员熟知的方法生产。
细菌表达系统和质粒本发明也提供含有表达控制序列和编码本发明多肽的核苷酸序列的重组DNA分子(例如载体或质粒)，该控制序列具有启动子序列和起始密码子序列，该核苷酸序列位于启动子和起始密码子序列的3’端。本发明还有另一方面提供了能表达2086多肽含有表达控制序列和编码2086多肽的核苷酸序列的重组DNA克隆载体，该控制序列具有启动子序列和起始密码子序列，该核苷酸序列位于启动子和起始密码子序列的3’端。本发明的其它方面提供了含有上述的重组DNA克隆载体和/或重组DNA分子的宿主细胞。合适的表达控制序列和宿主细胞/克隆载体的组合是本领域熟知的，例如在Sambrooket等，(1989)中有描述。
一旦表达本发明所需多肽的重组DNA克隆载体和/或宿主细胞通过用含有相应的2086多核苷酸的质粒转化、转染或感染这种克隆载体或宿主细胞来构建好后，克隆载体或宿主细胞在表达多肽的条件下培养。然后用本领域技术人员熟知的技术分离得到基本上无污染性宿主细胞成的多肽。
以下实施例阐述了本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应该了解，以下实施例披露的技术代表了发明人所发现的在本发明实践中发挥了良好功能的技术，所以这些技术可认为构成了实践本发明的优选方式。然而，就披露的内容而言，本领域的技术人员应该了解所披露的具体实施方案中在不脱离本发明的精神和范围的条件下可做出许多修改并仍能得到相同或类似的结果。
实施例实施例1鉴定能引发针对异源菌株的杀菌抗体的奈瑟球菌膜蛋白抽提物能引发杀菌抗体的LOS-删除的外膜蛋白制剂示于下表II。这些抗体经常直接针对各菌株的PorA。血清群B脑膜炎球菌菌株8529(B15P107b，3)的LOS-删除的外膜蛋白制剂很少是这种形式，因为它们出乎意料地能引发针对多个异源菌株的杀菌活性。
表II针对不同脑膜炎奈瑟球菌的抗-sOMPS的BC活性

为有助于分离能引发异源杀菌抗体的抗原并鉴定其性质，我们鉴定了最佳抽提抗原的洗涤剂。
菌株和培养条件来自冷冻管的脑膜炎奈瑟球菌菌株8529在GC平皿上划线接种。(脑膜炎球菌菌株8529得自RIVM，Bilthoven，荷兰)。平皿于36℃/5％CO2条件下孵育7.5小时。几个菌落接种至含有50ml改良的Frantz培养基+GC补充剂的烧瓶中。烧瓶于36℃孵育在空气摇床上，200RPM振荡4.5小时。5ml培养液接种于含有450ml改良的Frantz培养基+GC补充剂的Fernbach烧瓶。烧瓶于36℃孵育在空气摇床上，100RPM振荡1小时。所有的450ml培养液接种于含有8.5升改良的Frantz培养基+GC补充剂的10升发酵罐中。
改良的Frantz培养基的组成谷氨酸 1.3g/L半胱氨酸 0.02七水磷酸氢二钠 10氯化钾 0.09氯化钠 6氯化铵 1.25透析的酵母提取物(YE) 40ml(25％酵母提取物溶液用5倍体积的蒸馏水透析过夜，然后高压灭菌)GC补充剂100X，过滤灭菌右旋糖 400g/L谷氨酸 10辅羧化酶 0.02硝酸铁 0.5发酵中控制以下参数温度＝36℃；pH＝7.4；溶氧＝20％。加入几滴P-2000消泡剂来控制泡沫。培养物生长至稳定期。在OD650＝5.25时离心收集细胞。一般从～8.5升培养液中可收集总共100-300克湿细胞团。
引发异源性杀菌抗体的脑膜炎球菌外膜蛋白组分的部分纯化湿重100gms的细胞悬浮于5倍湿重体积的10mM HEPES-NaOH，pH7.4，1mM Na2EDTA中，并以～18,000psi流过装配有小室的110Y微流化器(microfluidizer)使之裂解。澄清细胞裂解物，10℃以300,000xg离心1小时分离得到细胞包膜。细胞包膜用匀浆器悬浮再如上述离心，用相同的缓冲液洗涤两次。然后用320ml含10mM HEPES-NaOH、pH7.4、1mMMgCl2中的1％(w/v)Triton X-100液抽提细胞包膜。下表III列出了使用TritonX-100和两性洗涤剂3-14依次差异性洗涤剂抽提，接着免疫小鼠得到的结果，这些结果让我们确定了能最佳抽提感兴趣候选物的Triton抽提物。这种Triton X-100抽提物能引发抗表III所列5种菌株中的4种的杀菌抗体应答反应，然后该抽提物在BioRad Rotophor单元中用制备型等电点聚焦(IEF)分级。两性浓缩物用1％pH3-10与1％pH4-6混合。如表III所示，几个组分均发现可引发异源杀菌应答反应。从IEF得到的组分聚焦在pH5.5-7.8的范围内，如杀菌实验所测定能引发对大多数菌株的异源性应答反应。浓缩合并的IEF组分并用乙醇沉淀除去两性电解质。将一些在pH约5.5-7.8得到的蛋白吸附到阴离子交换柱上实现进一步的纯化并且比较用吸附和不吸附蛋白在免疫小鼠后得到的杀菌活性。再次参考表II，尽管许多蛋白吸附到阴离子交换树脂上，但未被该柱吸附的蛋白引发了更多的异源性杀菌抗体。
表III

NT未测试*临床分离物539是8529的异源菌株，分离自同一爆发的流行病。
如图1A所示，通过SDS-PAGE测定不吸附组分中有两种主要蛋白质。为鉴定这些蛋白，进行了两类分析。一类分析是进行限制性蛋白酶降解(见图1A和图1B)，然后分离多肽并直接进行蛋白质测序。另一项分析是进行SDS-PAGE，然后切下凝胶、蛋白酶降解和LC-MS/MS(液相层析串联质谱)，以获得感兴趣制剂的成分的质谱信息(见图3)。(见本部分以后将描述的肽图和测序方法)脑膜炎奈瑟球菌A Sanger基因组序列分析用的方法和算法见Zagursky和Russell，2001，BioTechniques，31636-659所述。这种开采性分析产生了超过12,000个可能的开放读框(ORFs)。上述直接测序数据和质谱数据均表明不吸附组分的主要成分是Sanger数据库分析中存在的几种ORF的产物。用该方法鉴定的三种主要的蛋白质对应于ORF 4431、5163和2086(见图1B和3)。
虽然ORF 4431是这些组分中鉴定出的最主要蛋白质，但针对重组脂质化4431的小鼠抗体没有杀菌活性在动物模型中不提供保护性应答反应。其它对ORF 5163的分析正在进行中。
文中描述的制剂中第二主要成分对应于ORF 2086的产物。
免疫原性测定方法制备抗血清除了注明的地方，蛋白组合物/疫苗用25μg总蛋白配制并用20μg QS-21作佐剂。在0周和4周以0.2ml的剂量皮下(rump)注射入6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠。在0周和4周采集血样，并在第六周进行最终的放血。
杀菌实验杀菌实验基本上按照Mountzouros和Howell所述进行(见Mountzouros和Howell，2000，J.Clin.Microbiol.，38(8)2878-2884)。SBA的补体介导的抗体依赖性杀菌滴度，表示为杀死引入实验＞50％靶细胞的测试血清最高稀释度的倒数(BC50滴度)。
用于鉴定2086蛋白质的方法溴化氰切割和片段的直接测序阴离子交换不吸附组分(AEUF)的溴化氰切割。AEUF用90％冷乙醇沉淀并用70％甲醇配的10mg/ml溴化氰溶解直至蛋白质浓度达到1mg/ml、反应于室温在黑暗环境中进行过夜。切割的产物用速度真空器(speed vacuum)干燥，沉淀物用HE/0.1％还原TX-100溶解。进行SDS-PAGE，然后进行N-末端氨基酸测序来鉴定这种组分的成分。
蛋白酶消化/反向/N-末端测序来鉴定诸成分AEUF用GluC(V8)、LysC或ArgC消化。蛋白质与酶的比率是20μg蛋白质比1μg酶。消化于37℃进行过夜。消化的蛋白质混合物(30μg)通过7微米Aquapore RF-300柱，用0.1％三氟乙酸配中的10-95％乙腈梯度洗脱，手工收集流出峰。也要进行无蛋白质的空白对照，流出峰从样品层析中减去。仅在跑样品中出现的峰用质谱分析，分析那些具有清晰质量的样品的N-末端氨基酸测序分析。
N-末端氨基酸测序为检测从印迹上切下的条带，蛋白质样品从SDS凝胶转移至PVDF膜，用胺基黑染色(10％乙酸、0.1％胺基黑的去离子水溶液)，用10％乙酸脱色。然后用甲醇清洁的手术刀或小-Exacto刀从所有的10条电泳泳道上切下所需的蛋白质条带并置于Applied Biosystems 477A蛋白质测序仪的反应筒中。为在直接测序溶液中的样品，装配Prosorb筒并用60μl甲醇润湿PVDF膜。PVDF膜用50μl去离子水清洗并将样品(50μl)加载于PVDF膜上。用50μl去离子水清洗样品后，冲下Prosorb PVDF、干燥并置于AppliedBiosystems 477A蛋白质测序仪的反应筒中。就两种方法而言，AppliedBiosystems 477A蛋白质测序仪在最优化的印迹条件下进行12轮或更多轮(1轮是空白对照、1轮是标准品、10轮或更多轮进行所需的残基鉴定)并在Applied Biosystems 120A PTH分析仪上进行PTH-氨基酸测定。这些轮次的情况用模拟图表记录仪和提供仪器软件数字化收集。氨基酸比对使用模拟和数字化数据通过比较PTH-氨基酸标准品组和其各自在分析仪上的保留时间进行(半胱氨酸残基在转化过程中被破坏未检测到)。多条序列的信息可从单一残基获得并且基于信号强度可进行一级对二级的比对。
LC-MS/MS
IEF纯化得到的蛋白质样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析。通过考马斯蓝染色使蛋白质显色，手工切下感兴趣的条带，然后还原、烷化和使用自动化凝胶内胰蛋白消化机器人(1)用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)进行原位消化。消化后，肽类抽提物使用Savant速率真空浓缩仪(ThermoQuest，Holdbrook，NY)浓缩。
肽类抽提物使用自动化微量电喷雾反相HPLC分析。简言之，微量电喷雾界面含有Picofrit熔合的二氧化硅喷雾针，长50μm、内径75μm、喷嘴直径是8μm(New Objective，剑桥，MA)，装有10cm长的10μm C18反相珠子(YMC，Wilmington，NC)。Picofrit针装在光纤支架上(Melles Griot，Irvine，CA)，而光纤支架放在位于质谱仪检测器前部的自制底座上。柱的尾部垂直通入一钛元件来为电喷雾界面提供电连接。该元件通过熔合的二氧化硅毛细管(FSC)全长与FAMOS自动进样仪(LC-Packings，旧金山，CA)相连，而该自动进样仪与HPLC溶剂泵(ABI 140C，Perkin-Elmer，Norwalk，CT)相连。HPLC溶剂泵以50μl/分钟流速输送液体，该流速在使用PEEK微密封分裂三通(Upchurch Scientific，Oak Harbor，WA)时降低至250nl/分钟，然后使用FSC转移管线输送至自动进样仪。LC泵和自动进样仪分别使用它们的内部用户程序控制。样品注入自动进样仪小管、密封并用5μl样品环注射。
微细管HPLC-质谱仪从凝胶内消化物抽提的肽使用50分钟0-50％梯度的溶剂B(A0.1MHoAc，B90％MeCN/0.1M HoAc)通过微量电喷雾HPLC系统分离。用FinnganLCQ离子捕获质谱仪(ThermoQuest，San Jose，CA)以喷雾电压1.5kV和150℃的加热毛细管温度为操作条件进行肽类分析。以自动化MS/MS模式，使用该仪器提供的数据获取软件获得数据。获取方法包括1MS扫描(375-1200m/z)，然后对MS扫描中最丰富的顶部3种离子进行MS/MS扫描。使用动态排它和同位素排它功能来增加分析的肽离子数目(设置3amu＝排它宽度，3分钟＝排它时间，30秒＝预排它时间，3amu＝同位素排它宽度)。MS/MS数据的自动分析使用得自脑膜炎奈瑟球菌完全基因组的蛋白质数据库(从Sanger得到)以Finnigan Bioworks数据分析包(ThermoQuest，San Jose，CA)中加入的SEQUEST计算机算法进行。该研究的结果示于图3。
实施例2重组脂质化P2086(rLP2086)的克隆A.)天然前导序列材料来源ORF2086基因用PCR从命名为8529的血清群B的脑膜炎奈瑟球菌菌株的临床分离物中扩增。该菌株的血清群、血清型和血清亚型示于括号中；5829(B15，P17b，3)。该脑膜炎球菌菌株得自RIVM，Bilthoven，荷兰。文中提供的脑膜炎球菌菌株8529的成熟的2086蛋白基因序列为SEQ.ID.NO.212。
PCR扩增和克隆策略ORF2086的显色检查表明该基因具有潜在的脂蛋白信号序列。使用专有Hidden Markov模型脂蛋白算法进行的其它分析证实了ORF2086含有脂蛋白信号序列。为了以更天然的构型重组表达P2086，设计寡核苷酸引物来扩增具有完整信号序列的全长基因并且根据脑膜炎奈瑟球菌A ORF2086的Sanger序列对该引物(5′引物-CT ATT CTG CAT ATG ACT AGG AGC和3′引物-GCGC GGATCC TTA CTG CTT GGC GGC AAG ACC)分别是SEQ.ID.NO.304(化合物号4624)和SEQ.ID.NO.303(化合物号4623)进行分析(也见表IV)。2086基因从脑膜炎奈瑟球菌菌株8529用聚合酶链式反应(PCR)[ABI 2400热循环仪，Applied Biosystems，Foster City，CA]扩增。连接大小正确的扩增产物并克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。该质粒DNA用NdeI和BamHI限制性消化、凝胶纯化并且连接进pET-27b(+)载体(Novagen)。
文中所述的寡核苷酸引物在PerSeptive Biosystems寡核苷酸合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，使用P-氰基乙基亚磷酰胺化学(Applied Biosystems，Foster City，CA)合成。用于PCR扩增ORF2086基因家族的引物列于表IV，该表列出了本发明引物的非限制性例子。
表IV引物

使用天然前导序列表达rLP2086脂蛋白参考图5，质粒pPX7340转化/转染或感染进BLR(DE3)pLysS宿主细胞(Life Sciences)。选择一个转化子并接种进含有2％葡萄糖、卡那霉素(30μg/ml)、氯霉素(30μg/ml)和四环素(12μg/ml)的50ml Terrific肉汤培养基。过夜培养物的OD600是6.0。过夜培养物稀释进含有1％甘油和相同抗生素的1升Terrific肉汤培养基中。起始OD600为0.4。2小时后，OD600为1.6，得到预诱导样品。离心600＝1的细胞并弃去上清液。整个细胞沉淀重悬于150μl ris-EDTA缓冲液和150μl 2x SDS-PAGE样品缓冲液中。加入IPTG之终浓度为1mM。3.5小时后，取出如上所述的诱导后样品并用SDS-PAGE分析(见图4)。
rLP2086的纯化来自大肠杆菌的rLP2086在用分级洗涤剂抽提后溶解。与天然环境中的P2086不同，Triton X-100或两性洗涤剂3-12不能明显溶解rLP2086。rLP2086的大部分用十二烷基肌氨酸钠溶解，这说明十二烷基肌氨酸钠与大肠杆菌的外膜组分的相互作用与它在脑膜炎奈瑟球菌中的作用不同。一旦rLP2086溶解，它就可以和天然蛋白质相似的方式纯化，即许多污染性的大肠杆菌蛋白质可通过于pH8.0吸附到阴离子交换树脂来除去。尽管pH8.0比其理论PI高出1.5个pH值，rLP2086在pH8仍不吸附。通过于pH4.5将rLP2086吸附到阳离子交换树脂实现进一步的纯化。
SDS-PAGE后rLP2086的均一性示于图2。通过MALDI-TOF质谱分析测定rLP2086的质量为27,836。该质量与理论质量27,100相差了736，该值接近细菌脂蛋白中常见的N-末端脂质修饰物的值。天然的和rLP2086均表现为外膜脂蛋白。N-末端测序的尝试受阻，这符合末端修饰。
纯化方法表达P2086的冷冻BLR DE3 pLysS沉淀以20ml/g细胞湿重重悬在pH7.4的10mM HEPES-NaOH/1mM EDTA/1μg/mL Pefabloc SC蛋白酶抑制剂(Roche)(HEP)中并用微流化器(Microfluidics Corporation 110Y型)裂解。细胞裂解物以150,000xg离心1小时。沉淀用HEP洗涤和离心各两次，得到的膜沉淀物冷冻过夜。沉淀物用pH7.4的10mM HEPES-NaOH/1mMMgCl2/1％TX-100溶解30分钟，然后以150,000xg离心30分钟。该操作重复3次。如上所述，膜沉淀物用pH8的50mM Tris-HCI/5mM EDTA/1％的两性洗涤剂3-12洗涤两次，然后用pH8的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％的两性洗涤剂3-14和pH8的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％的两性洗涤剂3-14/0.5M NaCl各洗涤二次。
然后rLP2086用pH8的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％的十二烷基肌氨酸钠溶解。该十二烷基肌氨酸钠抽提物调节为1％两性洗涤剂3-14(Z3-14)并用超过30倍的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14透析两次。透析过的rLP2086抽提物用90％乙醇沉淀以除去残留的十二烷基肌氨酸钠，再用pH8的50mMTris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14(TEZ)溶解。离心除去不溶性物质，上清液流过阴离子交换层析柱，rPL2086收集在不结合的组分中。然后不结合的物质用超过30倍的pH4.5的25mM NaAc/1％Z3-14透析两次，并流过阳离子交换层析柱。用0-0.3M NaCl梯度洗脱rLP2086并用SDS-PAGE分析(考马斯染色)。合并的rLP2086用激光光密度测定法确定纯度为84％。
抗血清对rLP2086亚科B的表面反应性和杀菌活性参考表VII，针对来自亚科B的菌株8529的纯化的rLP2086的抗血清经全细胞ELISA测试表现出对所有10个2086亚科B菌株具有表面反应性。检测到对表达异源血清亚型抗原(PorA)的10个2086亚科B菌株中的9个有杀菌活性。这些菌株是在整个西欧、美国、澳大利亚和新西兰导致血清群B脑膜炎球菌性疾病的菌株的代表。杀菌实验中唯一未杀死的菌株870227经全细胞ELISA检测与抗-rLP2086(亚科B)血清强烈反应，表明了该菌株表达一种含有P2086的共同表位的蛋白质。
列于表VII中的2086亚科A菌株也通过全细胞ELISA测试的表面反应性。这些菌株中的三分之二表现出极低水平的反应性，表明了一些2086亚科A的菌株可能与rLP2086亚科B的抗体无交叉反应。菌株870446、NMB和6557也进行了用于从菌株8529中鉴定2086亚科B基因的PCR扩增程序。没检测到2086号亚科B的PCR扩增产物。
免疫原性检测方法抗血清的制备如以前实施例1所述配制疫苗。然而，使用的剂量是10μg。
全细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)灭菌的0.01M磷酸盐、0.137M NaCl、0.002M KCl(PBS)配的脑膜炎奈瑟球菌的全细胞悬浮液稀释至620nm光密度为0.1。该悬浮液中的0.1ml加入Nunc Bac T 96孔板(Cat#2-69620)的每孔中。细胞在板上于室温干燥3天，然后覆盖、翻转并于4℃保存。板用洗涤缓冲液(0.01M Tris-HCl、0.139MNaCl/KCl、0.1％十二烷基聚(氧乙烯乙二醇醚)n，n＝23(Brij-35，得自ICIAmericas，Inc.，Wihnington，Delaware)，pH7.0-7.4)洗涤3次。抗血清的稀释液用PBS、0.05％吐温-20/叠氮化物制备，取0.1ml至包被的板上。板于37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次。山羊-抗-小鼠IgG AP(SouthernBiotech)以1∶1500用PBS/0.05％吐温-20作稀释，向每孔加入0.1ml并于37℃孵育板2小时。洗涤板(如上所述)。通过用1M二乙醇胺/0.5M MgCl2稀释对-硝基苯磷酸酯(Sigma)至1mg/ml来制备底物溶液。底物以每孔0.1ml加到板上并于室温孵育1小时。用50μl/孔的3N NaOH终止反应并以690nm作参考在405nm处读板。
B.)P4前导序列PCR扩增与克隆策略为最优化rLP2086表达，2086基因克隆在不可分类流感嗜血杆菌的P4信号序列之前(Green等，1991)。用于脂蛋白克隆的引物列于表IV并通过化合物号5658、5660、6473、6543和6385辨别。ORF2086使用化合物号为5658和5660的引物从脑膜炎奈瑟球菌B菌株8529中扩增。ORF2086使用化合物号为6385和5660的引物从脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株CDC1573中扩增。ORF2086使用化合物号为6473和6543的引物从脑膜炎奈瑟球菌B菌株2996扩增。N-末端(5’)引物设计为与2086基因的成熟区域(始于半胱氨酸下游的氨基酸位置3处的丝氨酸残基)具有同源性。限制性位点BamHI(GGATTC)加入每个N-末端引物的5’端使成熟蛋白质的氨基酸位置2处插入一个甘氨酸残基。C-末端(3’)引物设计为与2086基因的C-末端具有同源性并且包括终止密码子以及用于克隆目的的SphI位点。各脑膜炎奈瑟球菌B菌株的扩增的片段克隆进中间载体并用序列分析筛选。
来自正确克隆的质粒DNA用BamHI和SphI限制性切酶消化(NewEngland Biolabs，(NEB))。选择名为pLP339的载体(受让人提供)作表达载体。该载体使用pBAD18-Cm骨架(Beckwith等，1995)并含有P4脂蛋白信号序列和不可分类的流感嗜血杆菌的P4基因(Green等，1991)。PLP229载体用限制性内切酶BamHI部分消化，然后用SphI消化。扩增的2086片段(BamHI/SphI)各自分别连接进pLP339载体(部分BamHI/SphI)。该克隆策略将成熟的2086基因置于P4脂蛋白信号序列之前。BamHI位点保留在P4信号序列与2086基因之间的的克隆接头区中(见图7所示的质粒构建物)。以下是位于BamHI克隆接头区该序列的例子[P4信号序列]-TGT GGA TCC-[剩余的2086成熟核酸序列][P4信号序列]-Cys Gly Ser-[剩余的2086成熟氨基酸序列]参考图7，将各扩增的片段克隆进含有P4前导序列的修饰的pBAD18-Cm载体。对表达rP4LP2086(重组P4脂质化2086)的重组大肠杆菌BLR pPX7343进行发酵，试图通过补加额外的葡萄糖来增加细胞密度。发酵罐装有10升补加了1％葡萄糖的按照Sambrook所述的完全M9基本培养基。
发酵罐中葡萄糖的起始浓度是45g/l。发酵罐以初始OD为～0.25接种。在OD为～25时补加20g/l的葡萄糖。在葡萄糖耗尽、OD为63.4时用1％阿拉伯糖诱导培养物。诱导后继续发酵3小时。在诱导后0、1、2、3小时取样并用BSA对蛋白质定量。在第3小时，蛋白质的产量是35g/l，细胞总蛋白是7％。收集10升左右培养物，湿菌团总重895克。
使用与以上实施例2，A部分中所述相同的方法纯化rP4LP2086。
实施例3非脂质化的成熟2086蛋白的发育遗传学进行P2086的非脂质化形式的克隆和表达来进一步评价2086蛋白质的免疫原性。
ORF2086的PCR基因扩增用于非脂质化2086基因的PCR扩增的寡核苷酸列于引物表-表IV。来自菌株8529的2086基因可用如表中所示化合物号为5135和6406(分别是SEQ ID NOS.308和312)的引物扩增。来自菌株CDC1573的2086基因可用化合物号为5135和6474(分别是SEQ ID NOS.308和316)的引物扩增。来自菌株2996的2086基因可用化合物号为6406和6605(分别是SEQ IDNOS.312和320)的引物扩增。
这些引物的特征包括每个引物中均有合成的BglII限制性位点、化合物号为6406和6474的中有合成的NdeI限制性位点并且在化合物号为5135和6605的所有3个读码框中均存在终止密码子。引物号为6406和6474的引物扩增具有和第二个氨基末端密码子(ACG)融合的ATG(Met)的2086基因，这表示成熟的2086多肽中有一个氨基酸取代(取代TGC中的C)。
PCR克隆载体是TOPO-PCR2.1(Invitrogcn，Valencia，CA)。
用于表达非脂质化的2086蛋白的载体是购自Novagen，Madison，WI的pET9a。
大肠杆菌克隆菌株是Top10(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
大肠杆菌表达菌株是BLR(DE3)pLysS(Novagen，Madison，WI)。
用于克隆目的的培养基是用1％葡萄糖取代甘油与合适抗生素(氨苄西林或卡那霉素)的Terrific肉汤液体或琼脂(按照Sambrook等所述)。
用Qiagen Spin Miniprep试剂盒(Valencia，CA)纯化质粒。
用于非脂质化的2086表达的生产菌株或细胞系的制备通过聚合酶链式反应(PCR)[AmpliTaq和ABI 2400热循环仪，AppliedBiosystems，Foster City，CA]从得自脑膜炎球菌菌株8529的染色体DNA中扩增2086基因。在每次反应中，2086基因的PCR扩增使用两个化合物号为6474和5135(分别为SEQ ID NOS.316和308)的寡核苷酸引物。扩增的2086PCR产物直接克隆进TOPO-PCR2.1克隆载体并在补加了100μg/ml氨苄西林和20μg/ml X-Gal的Terrific肉汤琼脂上选出。选择白色的菌落并培养、使用Qiagen miniprep试剂盒制备质粒DNA并筛选用于PCR片段插入的质粒。对PCR插入质粒进行DNA测序(在ABI377测序仪上用Big Dye化学法进行，Applied Biosystems，Foster City，CA)。
表现出正确DNA序列的质粒用BglII限制性内切酶消化并用GeneClean II纯化试剂盒(Bio101，Carlsbad，CA)凝胶纯化BglII片段。纯化的BglII片段克隆进表达载体pET9a的BamHI位点。在补加了30μg/ml卡那霉素的Terrific肉汤平板上选择pET9a/2086克隆。培养卡那霉素耐受的克隆并少量制备质粒DNA。筛选在BamHI位点2086基因有合适取向的质粒。合适取向的质粒代表了T7-抗原与2086基因的氨基末端的融合(rP2086T7)。这些rP2086T7基因融合物转化进BLR(DE3)pLysS，在Terrific肉汤/Kan平板上选出，在Terrific肉汤中培养并用1mM IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导表达rP2086T7融合蛋白。rP2086T7融合蛋白以高水平表达。
然后这些融合质粒进行NdeI限制性消化以删除T7-抗原并将成熟的2086基因直接与载体提供的ATG起始密码子相连。这些NdeI删除的质粒转化进Top10细胞并在Terrific肉汤/Kan平板上选出。培养候选克隆并少量制备质粒DNA。对该质粒DNA进行DNA测序以确认此删除和2086基因的完整性。这些质粒见命名为pPX7328的质粒图(图6)所示。代表正确的DNA序列的质粒转化进BLR(DE3)pLysS，在Terrific肉汤/Kan平板上选出，在Terrific肉汤中培养并用IPTG诱导表达2086蛋白。当去除T7-标记时，载体pET9a不能在菌株BLR(DE3)pLysS中表达成熟的2086蛋白。
非脂质化2086蛋白的产生纯化的质粒DNA用于转化表达菌株BLR(DE3)pLysS。携带该质粒的BLR(DE3)pLysS细胞对卡那霉素耐受并可加入1mM IPTG来诱导表达高水平的PorA蛋白。
rP2086T7融合蛋白在大肠杆菌细胞系BLR(DE3)pLysS中表达为不溶性包涵体并占总蛋白的～40％。该纯化的融合蛋白用于免疫小鼠并产生显著水平的抗异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。(见表V)2086非脂质化基因突变在2086基因的5’端进行PCR引物诱变。进行表达研究以确定是否能除去T7-标记却仍能表现出成熟rP2086T7的高表达水平。
非脂质化rP2086T7的纯化表达非脂质化rP2086T7的大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞在pH7.4的10mM Hepes-NaOH/5mM EDTA/1mM Pefabloc SC中用微流化器裂解。然后以18,000xg离心细胞裂解物30分钟。包涵体沉淀用pH8、50mMTris-HCl/5mM EDTA/1％TritonX-100洗涤并以24,000xg离心30分钟，共进行3次。然后，包涵体沉淀用pH8的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％两性洗涤剂3-14洗涤并以24,000xg离心15分钟，共进行2次。然后用pH8的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/4M尿素溶解包涵体沉淀2小时，接着离心以除去不溶性物质。上清液(溶解的rP2086T7)分为4份相等的样品。使用储存溶液将一份样品调节为50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素，pH8(无洗涤剂)；一份调节为50mMTris-HCl/5mM EDTA/250mMNaCl/2M尿素/1％氢化的Triton X-100，pH8(TX-100)；一份调节为50mMTris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素/1％两性洗涤剂3-12，pH8(Z3-12)；还有一份调节为50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素/1％两性洗涤剂3-14，pH8(Z3-14)。为除去尿素，样品用不含尿素的各自缓冲液透析至完成。然后样品用不含尿素、含有60mM NaCl的各自缓冲液透析至完成来降低NaCl浓度。2,000xg离心15分钟以除去不溶性物质，得到的上清液(重折叠的rP2086T7)用于进一步的实验。使用考马斯染色的SDS-PAGE和激光光密度测定法确定rP2086T7的均一性为91-95％。
如实施例2所示的免疫原性过程该纯化的融合蛋白用于免疫小鼠并产生了显著水平的抗异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体(见下表V)。
表V产生的针对rP2086T7的小鼠抗体的杀菌滴度

(*用rLP2086免疫小鼠产生的阳性对照血清)实施例4ORF2086嵌合克隆的开发来自菌株CDC-1573的2086基因的N-末端区域含有菌株8529和2996基因2086中不存在的重复区段(见图8)。看来重复区段负责提高两个基于大肠杆菌的表达系统(pET和pBAD)表达重组2086蛋白的水平。CDC-1573的2086基因在pET和pBAD表达系统中的重组蛋白表达水平显著高于用相同系统的菌株8529和2996中2086基因的重组表达水平。所有3种菌株的2086基因的N-末端区域除了这种重复区段外是相对同源性的。因此，可以合理地假定通过将CDC-1573的N-末端融合于菌株8529和2996的2086基因，当使用pET和pBAD系统时，从这些基因表达的重组2086蛋白的水平会增加。
材料和方法纯化菌株8529和2996的染色体DNA，并用作PCR扩增嵌合2086基因的模板。含有化合物号6721和5135(分别是SEQ.ID.NOS.321和308)的PCR引物用于扩增来自菌株8529的嵌合2086基因和含有化合物号6721和6605(分别是SEQ.ID.NOS.321和320)的PCR引物用于扩增来自菌株2996的嵌合2086基因。PCR产物直接克隆进Invitrogen的PCR2.1 TOPO载体，然后通过DNA序列分析来筛选以鉴定完整的嵌合2086基因。然后用BglII从PCR2.1载体上切下该基因并将BglII片段插入pET9a质粒的BamHI位点。筛选合适取向的质粒，然后经NdeI消化。使线形NdeI片段自身连接以删除含有pET9a载体提供的T7-标记序列的小NdeI片段。该删除使T7启动子直接与嵌合2086基因的5’端相连。删除NdeI的质粒转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)并筛选卡那霉素抗性的菌落用于IPTG诱导表达嵌合2086蛋白。
最初的研究表明当在pET9a中表达时，菌株2996的嵌合2086基因表达的重组蛋白约是天然2996/2086基因表达的两倍。PBAD系统还未测试。
虽然仅进行了一次实验，但数据显示提高了嵌合2086基因的利用。CDC-1573 N-末端与来自菌株8529和2996的2086基因融合的产物提高了重组2086蛋白的表达。
实施例5
脑膜炎奈瑟球菌菌株的2086基因PCR筛选为确定临床分离物中2086基因的保守性，对88种脑膜炎奈瑟球菌菌株进行了PCR扩增。
ORF2086的初步PCR鉴定使用了列于表IV(见以上实施例2)具有以下化合物号的引物4623、4624和4625(分别是SEQ.ID.NOS.303、304和305)。这些引物以Sanger的脑膜炎奈瑟球菌血清群A序列为基础设计。为有助于筛选大量的菌株，设计了2086基因的内部引物。使用新设计的化合物号为5005和5007(SEQ.ID.NOS.306和307)的内部2086引物对总共88种脑膜炎奈瑟球菌菌株进行PCR筛选。使用这些引物，申请者从88种脑膜炎奈瑟球菌菌株中的63种(～70％)鉴定出了2086基因，(见表VI-A)。
检测并比对了围绕Sanger脑膜炎奈瑟球菌血清群A序列和TIGR的脑膜炎奈瑟球菌血清群B序列的扩展区域。对应2086基因的上游和下游区域设计引物。其目的是为使用这些引物从各种脑膜炎奈瑟球菌菌株中扩增大于全长的2086基因用于序列比较。使用化合物号6470和6472(分别是SEQ.ID.NOS313和314)PCR扩增菌株(6557)得到低产量的产物。克隆菌株6557的扩增产物并提交质粒DNA作序列分析。结果显示一种新型的2086基因比以往见到的基因具有更大的序列变异性。菌株6557的2086基因在氨基酸水平上与其它测序的菌株相同性为～75％。有趣的是，菌株6557是上述2086PCR筛选中测试为阴性的～30％菌株中的一株。
设计了对菌株6557中C-末端可变区域特异性的内部引物。这些引物用于在以前2086PCR筛选中测试为阴性的～30％菌株中筛选有更多变异的2086基因。所有可用的脑膜炎奈瑟球菌菌株(n＝88)用这些新鉴定的内部2086引物(分别以化合物号6495和6496；SEQ.ID.NOS.159和160表示)进行PCR筛选。在本此筛选中，以前2086PCR筛选中测试为阴性的只有～30％菌株为PCR阳性。扩增自以前在2086PCR筛选中测试为阴性(～30％)菌株的一组基因代表了2086基因的一种新类型或第二家族2086基因，文中命名为2086亚科A。使用8529衍生引物从～70％菌株中扩增的一组2086基因文中命名为亚科B。
2086基因的亚科A的例子(不限于)见奇数编号序列SEQ.ID.NOS1-173。2086基因的亚科B(不限于)见奇数编号序列SEQ.ID.NOS175-251。
用于PCR扩增研究的脑膜炎奈瑟球菌菌株选自表VI-A和表VI-B。列于表中的菌株是脑膜炎奈瑟球菌菌株的非限制性例子。列于表VI-A中的菌株分类为2086蛋白亚科A，列于表VI-B中的菌株分类为2086蛋白亚科B。列于各表中的菌株分成血清亚型群。这些菌株可得自示于表中的以下4个来源MPHL-曼彻斯特公众健康研究所(Manchester Public HealthLaboratory)，曼彻斯特，UK；RIVM，Bilthoven，荷兰；衣阿华州立大学，医学院，微生物系，衣阿华市，IA和Walter Reed Army Institute ofResearch，华盛顿。
表VI-A

表VI-B品，并在贮存1个月和3个月后将其接受方法部分描述的溶解性(稳定性)实验；“％溶解”表示45分钟后溶解的非诺贝特的百分比

分别在下列条件下贮存实施例7中的本发明的片剂制剂A的样品，并使其接受贝特测定，结果如下

分别在下列条件下贮存实施例7中的本发明的片剂制剂A的样品，并将其接受按照Ph.Eur.(降解产品A、B、G和未知产物累积成总降解产物；HPLC方法)的降解产品检验，结果如下

实施例10在狗中的体内研究如上面方法部分所描述的，在小猎犬中使用160mg实施例7中的制剂A进行相对于160mg Tricot(批号098212E21)的制剂A的体内研究，结果如下
实施例6抗脑膜炎球菌菌株的rLP2086抗血清的反应性下表(表VII)显示了上述rLP2086的交叉反应性和交叉保护能力。如该表中所示，使用各种技术(包括全细胞ELISA(WCE)滴度、杀菌实验(BCA)和幼龄大鼠(IR)实验)处理和分析rLP2086来测定产生的抗2086蛋白多克隆抗体的细菌细胞表面反应性。
表VII抗多种脑膜炎球菌菌株的rLP2086-8529抗血清的反应性<p>表15

由表14和表15可清楚地确认本发明的紫外线防护制剂可以不损害化妆品的功能和保存稳定性地配合，而且可以赋予适当的SPF值。
亚细胞分级、差异性洗涤剂抽提、等电点聚焦和离子交换层析联合免疫接种和抗多种菌株的杀菌实验来鉴定感兴趣的小群蛋白质。对主要成分的直接测序表明N-末端是封闭的。对得自化学或蛋白酶水解消化的多肽的直接测序得到了内部蛋白序列。脑膜炎球菌菌株A群的基因组序列从Sanger中心下载并由我们的生物信息学小组使用现有的专有算法分析建立了可检索的数据库。该多肽序列数据表明ORF2086是感兴趣的。基于这种ORG的引物用于对菌株8529的2086基因进行PCR。基因序列分析、N-末端封闭的事实和其亚细胞定位说明P2086是脂质化的外膜蛋白质(LP2086)。rLP2086-8529和其它脑膜炎球菌菌株的变体使用流感嗜血杆菌的P4信号序列在大肠杆菌中重组表达为脂蛋白。这些重组蛋白用差异性洗涤剂抽提从大肠杆菌膜中分离，用离子交换层析纯化并用于免疫小鼠。小鼠抗-LP2086血清能增强对脑膜炎奈瑟球菌几种不同的血清亚型菌株的杀菌活性。对许多脑膜炎奈瑟球菌菌株的2086基因的进一步分析表明这些序列可分成命名为亚科A和亚科B的两组。(见图12)产生的针对亚科B蛋白质的抗血清对9种表达亚科B蛋白质的菌株和一种表达亚科A蛋白质的菌株有杀菌活性。亚科A抗血清对对亚科A菌株有杀菌活性。一种rPorA和一种rLP2086的混合物引发的互补性抗体增加了疫苗的覆盖面，超过了单独一种蛋白诱导的范围。
这些观察结果导致以下结论。RLP2086抗原能引发针对表达异源性PorA和异源性P2086蛋白的脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。P2086的抗原家族单独使用或与其它奈瑟球菌抗原组合使用可能是有用的疫苗或免疫原性组合物。
以下详细描述了前述的研究。发现可溶性外膜蛋白(sOMPs)的复合混合物能引发PorA不依赖的抗多种表达异源性PorA蛋白的菌株的杀菌抗体。对免疫活性组分进行差异性洗涤剂抽提、等电点聚焦和离子交换层析和接着的小鼠免疫接种。
每一步都测试血清针对含有血清亚型抗原的几株细菌的表面反应性和杀菌活性，这几株细菌是世界范围的脑膜炎球菌性疾病的流行病学的代表菌株。
这种分离和免疫的方法用于鉴定B群脑膜炎奈瑟球菌的新颖的交叉反应免疫原性候选对象。
PorA缺陷菌株的产生。将-PorA染色体基因克隆进菌株2996的质粒pPX7016。删除质粒中的PorA启动子、S/D盒与前面38个N-末端密码子并用自身含有的KanR表达盒代替。用限制性内切酶使该质粒线性化并自然转化进血清亚型菌株PI5，2；PI9；PI7，16；PI15；PI4；PI3和PI10。选择卡那霉素抗性转化子并在ELISA中通过血清亚型特异性的单克隆抗体筛选丢失PorA的转化子。
杀菌实验见Mountzourous.K.T.和Howell.A.P.，基于荧光的脑膜炎奈瑟球菌B群血清杀菌实验中补体介导的抗体依赖性杀菌活性的测定(Detection of Complement-Mediated Antibody-Dependent BactericidalActivity in a Flourescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group BNeisseria meningitidis.)，J.Clin.Microbiol.，2000，382878-2884。
全细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)脑膜炎奈瑟球菌的全细胞悬浮液用0.01M磷酸盐、0.137M NaCl、0.002M KCl(PBS)液稀释至620nm处光密度为0.1。0.1ml这种悬浮液加入Nunc Bac T 96孔板(Cat#2-69620)的每孔中。细胞在板上于37℃干燥过夜，然后覆盖、翻转并于4℃保存。板用洗涤缓冲液(0.01M Tris-HCl、0.139M NaCl/KCl、0.1％Brij-35，pH7.0-7.4)洗涤3次。抗血清稀释液用PBS、0.05％吐温-20/叠氮化物制备，取0.1ml转移至包被的板上并将板于37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次。山羊-抗-小鼠IgG AP(Southern Biotech)用PBS/0.05％吐温-20作1∶1500稀释，向每孔加入0.1ml并于37℃孵育板2小时。洗涤板(如上所述)。用二乙醇胺稀释对-硝基苯基磷酸酯(Sigma)至1mg/ml来制备底物溶液。底物以每孔0.1ml加到板上并于室温孵育1小时。用50μl/孔的3N NaOH终止反应并以690nm作参考在405nm处读板。
诱导重组PorABLR(DE3)/pET9a菌株于37℃在补加了Kan-30和2％葡萄糖的Hysoy肉汤(Sheffield Products)中培养过夜。在早上，O/N培养物用含有Kan-30和1％甘油的HySoy肉汤Broth作1/20稀释并于37℃培养1小时。加入终浓度1mM的IPTG来诱导这些培养物。培养物再培养2-3小时，然后收获。
重组PorA纯化大肠杆菌包涵体的rPorA溶解于8M尿素，并用不含尿素的缓冲液透析使其重折叠。然后渗滤浓缩重折叠的rPorA并用G25柱将缓冲液交换为NaPO4，pH6。透析后的rPorA过阳离子交换柱(S Fractogel)并用1M NaCl洗脱。
来自菌株8529(P1.7-2.3)的sOMPs在小鼠中引发针对表达异源性血清亚型的菌株的PorA不依赖性杀菌活性。下表(表IX)显示了在所研究菌株中的杀菌活性。
表IX


制备sOMPs脑膜炎奈瑟球菌膜用TX-100、两性洗涤剂3-14和两性洗涤剂3-14+0.5M NaCl抽提。上述sOMPs溶解于两性洗涤剂3-14/0.5MNaCI抽提液中。抽提操作用本领域技术人员熟知的技术进行，例如，见美国专利号6,355,253，该专利纳入文中作为参考。
免疫原性雌性Swiss-Webster小鼠在0周和4周用添加了20μg QS-21佐剂的25μg总蛋白免疫。在6周时进行放血和数据分析。
1杀菌(BC50)滴度表示为能减少存活细胞计数达50％的抗血清稀释度的倒数。0周时正常小鼠血清的BC50滴度＜25。
2 NST＝非血清亚型分类。
下表(表X)是亚科A和亚科B的重组脂质化P2086(rLP2086)蛋白质的纯化和性质的总结。
亚科A rLP2086的纯化表X

亚科B rLP2086的纯化表XI

纯化方法所有来自大肠杆菌膜的变体蛋白用TX-100溶解(除LP2086-8529是用十二烷基肌氨酸钠或尿素溶解外)。以Tris-HCl或aPO4缓冲液联用阴离子交换(TMAE)、体积排它和/或阳离子交换(S Fractogel)层析实现进一步的纯化。
1与来自菌株8529的P2086比较的氨基酸同源性。
2对胶质考马斯染色条带(简单的蓝染料)进行SDS-PAGE和激光光密度测定法所确定的纯度。
测试的亚科B成员rLP2086-8529对同源和异源菌株的免疫原性。
下表XII是测试的亚科B成员rLP2086-8529对同源和异源菌株的免疫原性。
表XII

疫苗接种程序6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠在0周和4周时用10μgrLP2086-8529+20μg QS-21免疫。6周时放血进行数据分析。
a P2086与rLP2086-8529比较的氨基酸同源性。
b以吸光度＝0.1时稀释度的倒数表示的端点滴度。
c BC50滴度以能减少存活细胞计数达50％的抗血清稀释度的倒数表示。0周时正常小鼠血清的BC50滴度＜10。
表XIII是测试的亚科B成员rLP2086-2996对同源和异源菌株的免疫原性。
表XIII

疫苗接种程序6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠在0周和4周时用10μgrLP2086-2996+20μg QS-21免疫。6周时放血进行数据分析。
a P2086与rLP2086-8529比较的氨基酸同源性。
b吸光度＝0.1时的稀释度的倒数表示的端点滴度。
c杀菌(BC50)滴度以能减少存活细胞计数达50％的抗血清稀释度的倒数表示。0周时正常小鼠血清的BC50滴度＜10。
下表XIV显示了当将抗rLP2086和rPorA的抗血清混合并测试杀菌活性时，二者是互补的。
表XIV

疫苗接种程序6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠在0周和4周时用10μgrLP2086-8529/20μg QS-21或15μg rPorA/100μgMPL免疫。6周时放血进行数据分析。
a杀菌(BC50)滴度以能减少存活细胞计数达50％的抗血清稀释度的倒数表示。0周时正常小鼠血清的BC50滴度＜10。
下表XV显示了rLP2086亚族和两种rPorA的混合物在小鼠中引发了杀菌抗体。
表XV

疫苗接种程序6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠在0周和4周时用10μg的每种蛋白+20μgQS-21免疫。6周时放血进行数据分析。
a杀菌(BC50)滴度以能减少存活细胞计数达50％的抗血清稀释度的倒数表示。0周时正常小鼠血清的BC50滴度＜10。
b SfA-亚科A，SfB-亚科B
c相关的单价对照(Relevant monovalent control)rLP2086-8529、rLP2086-2996、rP1.5-1、2-2或rP1.22-1、14-1抗血清。
以下总结了上述研究的结果。抗-rPL2086抗血清13/16测试菌株是杀菌剂。表达不同异源性血清亚型的11株细菌被抗-P2086血清杀死。抗-rLP2086血清的杀菌活性与抗-rPorA血清相互补。P2086和PorA的混合物在小鼠中引发了互补性杀菌抗体。差异性洗涤剂抽提、纯化和免疫接种结合抗许多菌株的功能性抗体实验可用于鉴定新的的候选疫苗。P2086鉴定为能引发针对P2086和rPorA异源菌株杀菌抗体的候选疫苗。所以，2086蛋白家族无论单独使用或与其它奈瑟球菌抗原合用均是有用的疫苗。
实施例9按照以前的实施例，通过PCR筛选了其它不同血清群的脑膜炎球菌菌株中是否存在ORF2086基因。最终，筛选了100株脑膜炎球菌。以下描述了该项研究和所有的结果。这些结果补充了以前实施例的数据。
两组针对C-末端可变区域的特异性内部PCR引物用于区分亚科A和B的基因序列。存在约350bp的PCR扩增产物说明2086基因序列存在于染色体中。所有菌株均产生了具有预期大小的一种PCR产物。55种全长ORF2086基因的核苷酸序列得到确定、进行比对(DNAStar MegAlign)并用于产生系统发生树。(见图12)这些2086基因中的9种在pBAD阿拉伯糖可诱导启动子系统中重组表达为rLP2086脂蛋白，3种在IPTG诱导的pET系统中重组表达为rP2086非脂质化蛋白。这些重组蛋白在大肠杆菌B中表达。纯化的重组蛋白用于免疫小鼠并测试小鼠抗血清的血清IgG滴度和其对各种异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。
用PCR扩增脑膜炎球菌全细胞、纯化的染色体DNA或质粒DNA模板之一的ORF2086。
将9种ORF2086基因克隆进载体pLP339使嗜血杆菌P4前导序列与ORF2086基因5’端融合。大肠杆菌菌株BLR用作从pBAD/ORF 2086克隆重组表达脂质化形式的rP2086的宿主菌株。(见图10)pBAD阿拉伯糖可诱导的启动子驱动表达P4信号/ORF 2086融合蛋白来表达脂质化形式的rP2086。将三种缺乏信号序列的P2086基因克隆到pET9a载体中的高度活性T7噬菌体启动子之前。大肠杆菌菌株BL21(DE3)用作从pET9a/ORF 2086克隆重组表达非脂质化形式的rP2086的宿主菌株。(见图10B)大肠杆菌BL21中的DE3溶原菌可通过加入IPTG诱导在lacUV5启动子的控制下的T7 RNA聚合酶的表达。见，WCE；FEMS Micro.Lett.，48(1987)367-371和BCA；J.Clin.Microbiol.，38(2000)2878-2884。
克隆55种不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株的ORF2086基因从并测序。比对(DNAStar MegAlign)了核苷酸序列并将其用于产生系统发生树。(见图12)。该树揭示了ORF2086基因核苷酸序列的两种不同的亚科。这两种亚科的基因在其5’端相似，但在其3’端附近含有相当量的变化。虽然表现出显著的变异，但不同菌株之间的该基因的某些关键区域是高度同源的。这些保守区域可能为此蛋白质提供功能连续性并可能意味着这些区域含有可作为疫苗靶位的交叉保护性表位。
克隆了几个血清群B脑膜炎球菌菌株的2086基因并用和不用脂质化信号序列表达。参考图11A和11B，凝胶照片显示了表达r2086蛋白的大肠杆菌B的全细胞裂解物。融合有T7-标记的非脂质化形式蛋白以高水平表达。T7-标记序列使得对mRNA稳定并显著提高多肽的翻译水平。这种融合蛋白看上去沉积在包涵体内并可用已知的方法纯化和不难重折叠。脂质化或非脂质化形式的P2086的表达量占细胞总蛋白约5-8％(T7-标记融合物除外，其表达的rP2086占总蛋白的约50％)。非脂质化形式的蛋白表现为可溶性位于细胞质中。脂质化形式的蛋白表现为与膜组分结合并可用洗涤剂溶解。
来自脑膜炎奈瑟球菌B菌株8529的重组脂质化2086蛋白引发的血清IgG滴度比非脂质化形式高(见下表XVI)，这很好地与对同源和异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌活性水平提高相关联(见下表XVII)。
表XVI在6周时使用8529 rP2086(非脂质化)或8529rLP2086(脂质化)引发的免疫应答(用WCE法测定)

表XVII8529 rP2086引发的杀菌活性比8529 rLP2086弱

以下是该项研究的总结。所有测试的脑膜炎奈瑟球菌B菌株表现出具有一个2086样基因。至少代表了2086基因的两个家族亚科A-约30％的菌株和亚科B-约70％的菌株。已克隆了55种脑膜炎奈瑟球菌菌株的2086基因中并测序。亚科A中的序列在DNA水平上～86-100％相同。亚科B中的序列在DNA水平上～89.5-100％相同。亚科A与亚科B中的序列在DNA水平有～60.9％-74％相同。通过PCR在以下菌株中鉴定2086的同类物脑膜炎奈瑟球菌A、B、C、W135、Y；乳糖奈瑟球菌；淋病奈瑟球菌FA1090。
已克隆并重组表达了几种ORF 2086基因。
P2086的脂质化形式从9种脑膜炎奈瑟球菌菌株中表达纯化这些重组蛋白并用于给小鼠接种疫苗。
得到的抗血清是杀菌剂。
P2086的非脂质化形式从上述9种菌株中的3种表达。
rLP2086总能比rP2086引发更强的免疫应答。
rLP2086对同源和异源脑膜炎球菌菌株也表现出提高的杀菌活性。
实施例10
下表XVIII和XIX显示了两种亚科成员的变体的性质。
表XVIII亚科A rLP2086变体的性质

表XIX亚科B rLP2086变体的性质

下表XX提供了2086亚科A的荧光血清杀菌实验的结果表XX

注意*百分率是在1∶800稀释度时的％BC活性。
**未得到阳性对照。
-未测试血清。
实施例11以下进一步说明了P2086可在奈瑟球菌菌株中表达并提供了在几株细菌中表达P2086的其它具体例子。
平板培养的细胞悬浮于SDS样品缓冲液并于98℃加热4分钟来制备细胞裂解物。样品以每孔～30-50μg总蛋白加入到10-20％预制凝胶(ICN)上以175V跑电泳。凝胶转移至硝酸纤维素膜上，接着用含5％奶粉的Tris-缓冲盐水(Blotto)中封闭该膜30分钟。使用的第一级抗体是在小鼠中产生的针对各rLP2086变体的混合多克隆抗血清。
参考图17和18，Western印迹显示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚科A和B全细胞裂解物有反应性。就亚科A细胞裂解物印迹而言，使用的抗血清是针对用Blotto盐水1/500稀释的rLP2086-2996、-870446、-250771以及rLP2086-250771与其它用Blotto盐水1/1000稀释的蛋白质而产生的。就亚科B细胞裂解物印迹而言，使用的抗血清是针对rLP2086-8529(用Blotto盐水1/1000稀释)、-CDC1573.-M982和-880049(这三种用Blotto盐水1/500稀释)。将第一抗血清和印迹于4℃孵育过夜。洗涤印迹，加入用Blotto盐水1/500稀释的山羊-抗-小鼠AP二抗，并于室温孵育印迹30分钟。洗涤后，使用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL)显色印迹。
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本发明现已得到完全描述，本领域的普通技术人员可在不脱离上述发明的精神或范围的条件下做出许多变化和修改。前面描述了本发明优选的实施方案和大量可能的替代选择。然而，这些实施方案仅是例子，本发明不受其限制。
权利要求
1.一种组合物，其包含有(a)至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一氨基酸序列的蛋白质；(b)至少一种含有由能在严谨条件下与编码SEQ ID NOS444-452之一的任一多核苷酸杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白质；(c)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质或(c)中所述免疫原性部分的至少一种生物等价物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质含有SEQ ID NOS444-449之一的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质含有SEQ ID NOS450-452中任一序列。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种由在严谨条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质是由在严谨条件下与编码SEQ ID NOS444-449之一的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种由在严谨条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质是由在严谨条件下与编码SEQ ID NOS450-452之一的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有至少一种PorA、PorB、运铁蛋白结合蛋白或混浊蛋白(Opc)。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有奈瑟球菌种的至少一种其它表面抗原，所述的其它表面抗原是非-ORF2086蛋白。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白经质谱测量分子量约为26,000-30,000。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白在10％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶上测量的分子量约为28-35kDa。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有药学上可接受的缓冲液、稀释剂、佐剂或运载体。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有运载体。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有佐剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述的佐剂含有一种液体。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的蛋白质是非脂质化的。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的蛋白质是重组蛋白质。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的蛋白质分离自天然奈瑟球菌种。
17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的蛋白质是脂蛋白。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有多糖。
19.如权利要求60所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有其它的肽、多肽或蛋白质，所述组合物形成一种能在哺乳动物中诱导对两种或多种细菌的免疫应答反应的偶联物。
20.一种组合物，其包含有(a)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一氨基酸序列的蛋白质；(b)至少一种含有由能在严谨条件下与编码偶数编号序列SEQ IDNOS330-442之一核酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质；(c)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质或(c)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白含有奇数编号序列SEQ ID NOS433-443之一的氨基酸序列。
23.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白质含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-431中任一序列。
24.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述至少一种由在严谨条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质是由在严谨条件下与编码偶数编号序列SEQ ID NOS432-442之一的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。
25.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述至少一种由在严谨条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质是由在严谨条件下与编码偶数编号序列SEQ ID NOS330-430之一的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码。
26.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有至少一种PorA、PorB、运铁蛋白结合蛋白或混浊蛋白(Opc)。
27.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有奈瑟球菌种的至少一种其它表面抗原，所述的其它表面抗原是非-ORF2086蛋白。
28.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白经质谱测量分子量约为26,000-30,000。
29.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白在10％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶上测量的分子量约为28-35kDa。
30.一种组合物，其包含奈瑟球菌种第一种细菌菌株的至少一种抗原，该抗原提供受试者抗奈瑟球菌种第二种细菌菌株感染的免疫原性；其中所述第一种菌株是脑膜炎奈瑟球菌血清群B的菌株M98250716，所述的第二种菌株是脑膜炎奈瑟球菌血清群B的另一菌株。
31.一种组合物，其包含有奈瑟球菌种第一种细菌菌株的至少一种抗原，该抗原提供受试者抗奈瑟球菌种第二种细菌菌株感染的免疫原性；其中所述第一种菌株是选自下组的任一菌株脑膜炎奈瑟球菌血清群B的CDC-5315、B40、M97250571、CDC-2367、CDC-1343、CDC-983和CDC-852，所述第二种菌株是脑膜炎奈瑟球菌血清群B的另一菌株。
32.一种组合物，其包含有至少一种含有SEQ ID NO301的氨基酸序列的分离的蛋白质；其中x是任何氨基酸；其中从氨基酸位置5到氨基酸位置8的区域可有0-4个氨基酸；其中从氨基酸位置66到氨基酸位置68的区域可有0-3个氨基酸；并且其中所述的至少一种分离的蛋白质还含有SEQ ID NOS444-449之一的氨基酸序列。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述的从氨基酸位置5到氨基酸位置8的区域含有0或4个氨基酸。
34.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述的从氨基酸位置66到氨基酸位置68的区域含有0或3个氨基酸。
35.一种组合物，其包含有至少一种含有SEQ ID NO302的氨基酸序列的分离的蛋白质；其中x是任何氨基酸；其中从氨基酸位置8到氨基酸位置12的区域可有0-5个氨基酸；并且其中所述的至少一种分离的蛋白质还含有SEQ ID NOS450-452之一的氨基酸序列。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述的从氨基酸位置8到氨基酸位置12的区域含有0或5个氨基酸。
37.一种组合物，其包含有至少一种能与以下任一物质免疫特异性结合的抗体(a)至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一的氨基酸序列的蛋白质；(b)至少一种含有由能在严谨条件下与编码SEQ ID NOS444-452之一的任一多核苷酸杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白质；或(c)至少一种(a)或(b)中所述的蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(d)至少一种如(a)或(b)中所述蛋白质或(c)中所述免疫原性部分的至少一种生物等价物。
38.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体。
39.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，还含有药学上可接受的运载体。
40.一种组合物，其包含有至少一种能与以下任一物质免疫特异性结合的抗体(a)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一的蛋白质；或(b)至少一种(a)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述蛋白质或(b)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
41.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种蛋白质、其免疫原性部分或生物等价物含有SEQ ID NOS444-452中任一序列。
42.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述的至少一种抗体是单克隆抗体。
43.一种组合物，其包含有(a)编码至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一的分离的蛋白质，或(b)能在严谨条件下与(a)中所述的多核苷酸之一杂交的至少一种多核苷酸。
44.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，还含有P4前导序列(SEQID NO.322)。
45.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有载体。
46.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述的严谨条件是高度严谨的southern杂交条件。
47.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述的多核苷酸是重组多核苷酸。
48.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述的多核苷酸分离自天然来源。
49.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有编码其它肽、多肽或蛋白质的核酸序列。
50.一种组合物，其包含有含有以下物质之一的载体(a)至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一的氨基酸序列的蛋白质；或(b)至少一种(a)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述蛋白质或(b)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
51.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述的载体是质粒。
52.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述的载体是噬菌体。
53.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述的载体是细菌噬菌体。
54.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述的载体是中等噬菌体。
55.一种组合物，其包含有含有至少一条编码含有SEQ ID NO300的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的载体；其中x是任一氨基酸；其中从氨基酸位置5到氨基酸位置9的区域可有0-5个氨基酸；其中从氨基酸位置67到氨基酸位置69的区域可有0-3个氨基酸；其中氨基酸位置156可有0-1个氨基酸；并且其中所述的蛋白质还含有SEQ ID NOS444-449中任一序列。
56.一种组合物，其包含有含有以下物质之一的载体(a)至少一条编码奇数编号序列SEQ ID NOS331-443中至少一条多肽的多核苷酸；或(b)至少一条能在严谨条件下与(a)中至少一条多核苷酸杂交的多核苷酸。
57.如权利要求56所述的组合物，其特征在于，所述的载体含有偶数编号序列SEQ ID NOS330-442之一的核酸序列。
58.一种组合物，其包含有用一载体转化/转染或感染的宿主细胞，所述载体含有以下物质之一(a)至少一种由奈瑟球菌的开放读框(ORF2086)编码的蛋白质，所述的开放读框编码交叉反应性免疫原性抗原，而所述的交叉反应性免疫原性抗原在受试者中可提供抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染的免疫原性；或(b)至少一种(a)中所述蛋白的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一个如(a)所述蛋白或如(b)所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
59.一种含有以下物质的组合物用载体转化/转染或感染的一种宿主细胞，所述载体含有以下任一种物质(a)至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一的蛋白质；或(b)至少一种(a)中所述蛋白的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一个如(a)所述蛋白或如(b)所述免疫原性部分的至少一种生物等价物。
60.由以下方法制备的组合物，该方法包括从奈瑟球菌种分离和纯化以下任一种物质(a)至少一种由奈瑟球菌种的开放读框编码的蛋白(ORF2086)，所述的开放读框编码交叉反应免疫原性抗原，而所述的交叉反应的免疫原性的抗原在受试者中可提供抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染的免疫原性；或(b)至少一种(a)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述蛋白质或(b)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物；和其中所述的至少一条多核苷酸含有偶数编号序列SEQ ID NOS330-442之一的核酸序列。
61.如权利要求60所述的组合物，其特征在于，所述的方法还包括将一种非天然前导序列引入所述的至少一条分离的多核苷酸。
62.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述的非天然前导序列是P4前导序列(SEQID NO.322)。
63.用以下方法制备的组合物，该方法包括从奈瑟球菌种分离和纯化以下任一物质(a)至少一种含有SEQ ID NOS444-452之一序列的蛋白质；或(b)至少一种(a)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述蛋白质或(b)中所述免疫原性部分的至少一种生物等价物。
64.用以下方法制备的组合物，该方法包括从奈瑟球菌种分离和纯化以下任一物质(a)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一氨基酸序列的蛋白质；(b)至少一种由能在严谨条件下与含有偶数编号序列SEQ IDNOS330-442之一核酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质；(c)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质或(c)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
65.一种组合物，其包含有至少一种免疫原性非菌株特异性的脑膜炎奈瑟球菌抗原，所述的抗原是非致病性的并且基本上不含有任何感染性杂质；其中所述抗原含有的氨基酸序列与奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一具有至少约70％的氨基酸序列相同性。
66.如权利要求1-65中任一项所述的组合物在制备用于诱导哺乳动物免疫应答的药物中的应用。
67.如权利要求66所述的应用，其特征在于，所述的组合物经胃肠道外给药。
68.如权利要求66所述的应用，其特征在于，所述的组合物经粘膜给药。
69.如权利要求1-65中任一项所述的组合物在制备有效防御哺乳动物细菌性脑膜炎的药物中的应用。
70.如权利要求69所述的组合物的应用，其特征在于，所述的组合物经胃肠道外给药。
71.如权利要求69所述的组合物的应用，其特征在于，所述的组合物经粘膜给药。
72.如权利要求69所述的组合物的应用，其特征在于，所述的组合物经皮下或肌肉内注射给药。
73.一种制备组合物的方法，包括在宿主细胞中表达编码以下物质的核酸序列(a)至少一种由奈瑟球菌的开放读框(ORF2086)编码的蛋白，所述的开放读框编码交叉反应性免疫原性抗原，而所述的交叉反应性免疫原性抗原可在患者中提供抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染的免疫原性；或(b)至少一种(a)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述蛋白质或(b)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。和其中所述的至少一种蛋白含有SEQ ID NOS444-452之一的序列。
74.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述的核酸序列在体内表达。
75.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述的核酸序列在体外表达。
76.如权利要求73所述的方法，其特征在于，还包括连接P4前导序列(SEQ ID NO.322)。
77.一种制备组合物的方法，包括从脑膜炎奈瑟球菌分离和纯化至少一种符合以下条件的多核苷酸(a)编码至少一种由奈瑟球菌的开放读框(ORF2086)编码的至少一种蛋白质或所述至少一种蛋白质的至少一种免疫原性部分或生物等价物，所述的开放读框编码交叉反应性免疫原性抗原，而所述的交叉反应性免疫原性抗原可在患者中提供抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染的免疫原性；或(b)能在严谨条件下与(a)中所述的多核苷酸之一杂交。
78.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述的严谨条件是高度严谨的southern杂交条件。
79.一种制备组合物的方法，该方法包括从奈瑟球菌种分离和纯化本文所述的任何蛋白质、其免疫原性部分或生物等价物。
80.一种制备抗体组合物的方法，该方法包括；将含有本文所述的任何蛋白质、其免疫原性部分或生物等价物的组合物引入动物后，从该动物中回收抗体。
81.一种在哺乳动物中诱导免疫应答反应的方法，该方法包括给予哺乳动物有效剂量的如权利要求1-65所述的一种或多种组合物。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述组合物经胃肠道外给药。
83.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述组合物经粘膜给药。
84.一种预防或治疗哺乳动物细菌性脑膜炎的方法，该方法包括给予哺乳动物有效剂量的如权利要求1-65所述的一种或多种组合物。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述组合物经胃肠道外给药。
86.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述组合物经粘膜给药。
87.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述组合物经皮下或肌肉内注射给药。
88.一种预防或治疗哺乳动物细菌性脑膜炎的方法，该方法包括给予哺乳动物有效剂量的含有抗体的抗体组合物，所述抗体能免疫特异地与含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一或SEQ IDNOS444-452之一氨基酸序列的蛋白质、其免疫原性部分或生物等价物结合。
89.如权利要求88所述的方法，其特征在于，所述的抗体组合物经胃肠道外给药。
90.如权利要求88所述的方法，其特征在于，所述的抗体组合物经粘膜给药。
91.如权利要求88所述的方法，其特征在于，所述的抗体组合物经皮下或肌肉内注射给药。
92.一种制备组合物的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码以下任一物质的核酸序列(a)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443或SEQ IDNOS254-299之一氨基酸序列的蛋白质；(b)至少一种由能在严谨条件下与含有偶数编号序列SEQ IDNOS330-442之一核酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质；(c)至少一种(a)和(b)中所述蛋白质的至少一个免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述蛋白质或(c)中所述免疫原性片段的至少一种生物等价物。
93.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述核酸序列在体内表达。
94.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述核酸序列在体外表达。
95.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述载体是质粒。
96.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述载体是噬菌体。
97.如权利要求92所述的方法，其特征在于，还包括将非天然前导序列与所述至少一种分离的多核苷酸相连接。
98.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述非天然前导序列是P4前导序列(SEQ ID NO.267)。
99.一种制备抗体组合物的方法，该方法包括将一种组合物引入动物后从该动物中回收抗体，所述组合物包含(a)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443或SEQ IDNOS444-452之一氨基酸序列的蛋白质；或(b)至少一种由能在严谨条件下与偶数编号序列SEQ ID NOS330-442中的任一多核苷酸杂交的多核苷酸编码的蛋白质。
100.如权利要求99所述的方法，其特征在于，所述的严谨条件是高度严谨性southern杂交条件。
101.一种转化/转染或感染的细胞系，其含有表达核酸序列的重组细胞，所述核酸序列(a)编码至少一种含有SEQ IDNOS444-452之一氨基酸序列的分离的蛋白质，或(b)能在严谨条件下与(a)中所述多核苷酸之一杂交。
102.一种转化/转染或感染的细胞系，其含有表达一种核酸序列的重组细胞，该核酸序列(a)编码至少一种由奈瑟球菌种的开放读框(ORF2086)编码的至少一种蛋白质或所述至少一种蛋白的至少一种免疫原性部分或生物等价物，所述开放读框编码交叉反应性免疫原性抗原，而所述交叉反应性免疫原性抗原可在受试者中提供抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染的免疫原性；或(b)在严谨条件下与(a)中所述的多核苷酸之一杂交；或表达一种核酸序列的重组细胞，该核酸序列编码(c)至少一种由(a)或(b)中任一多核苷酸编码的多肽；或(d)至少一种含有奇数编号序列SEQ IDNOS331-443之一氨基酸序列的多肽。
103.如权利要求102所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述多肽是单克隆抗体。
104.如权利要求102所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述重组细胞是杂交瘤。
105.如权利要求102所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述的重组细胞是三源杂交瘤。
106.一种转化/转染或感染的细胞系，其含有表达一种核酸序列的重组细胞，该核酸序列含有(a)至少一种编码含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一的蛋白质的多核苷酸；(b)至少一种含有偶数编号序列SEQ ID NOS330-442之一的核酸序列的多核苷酸；(c)至少一种能在严谨条件下与(a)或(b)中之一序列杂交的多核苷酸；或表达一种核酸序列的重组细胞，该核酸序列编码(d)至少一种由(a)、(b)或(c)中任一序列编码的多肽；或(e)至少一种含有奇数编号序列SEQ ID NOS331-443之一的氨基酸序列的多肽。
107.如权利要求106所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述多肽是单克隆抗体。
108.如权利要求106所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述重组细胞是杂交瘤。
109.如权利要求106所述的转化/转染或感染的细胞系，其特征在于，所述重组细胞是三源杂交瘤。
110.一种基本如上所描述的组合物。
111.一种基本如上所描述的应用。
全文摘要
本发明涉及奈瑟球菌的ORF2086蛋白、其可分离自奈瑟球菌菌株或可重组制备的交叉反应性免疫原性蛋白(包括其免疫原性部分和生物等价物)；能免疫特异地与上述物质结合的抗体；和编码上述各物质的核酸序列以及它们在免疫原性组合物中的用途，该组合物能有效地抵御血清群B脑膜炎奈瑟球菌引起的感染。
文档编号A61K39/00GK1867354SQ200480016353
公开日2006年11月22日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者G·W·泽洛特尼克, L·D·弗莱切, J·法利, L·A·伯恩非尔德, R·J·扎古斯基, B·J·梅特卡夫 申请人:惠氏控股有限公司