专利名称：用于减轻雌激素替代疗法副作用的药物组合物和方法
技术领域：
本发明涉及在绝经后妇女中减轻雌激素替代疗法副作用的药物组合物和方法，具体地说涉及心血管和肿瘤疾病。
发明概述本发明提供在绝经后妇女中减轻病理状况的药物组合物，其包含赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜、锰，其中组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。本发明还提供使用所述药物组合物的治疗方法。
背景技术：
绝经后综合症侵害着已进入绝经期的妇女。常见的综合症包括骨质疏松、恶心、便秘、腹泻、关节痛、肌痛、潮热、发汗、心理和情绪上的疲劳症状、失眠、烦躁和神经质。参见The Merck Manual，1793(16thEd.1992)。在美国和许多国家，雌激素替代疗法已成为用于绝经后综合症的标准临床治疗法。激素疗法表现出某些优势。例如，数据支持雌激素限制骨质疏松性骨丢失演进的能力。某些研究支持雌激素的心脏保护作用，该作用表现为绝经后雌激素替代疗法既降低了冠心病的发病率，又降低了心血管疾病的死亡率(Stampfer，M.J.et al.，N.Engl.J.Med.325，756-762(1991))。尽管这些文献报告了有益的作用，但雌激素替代疗法也存在不需要的副作用。例如，雌激素替代疗法的有益的心血管作用还没有在更近一些的研究中得到证实。最近临床实验的海量分析表明，激素替代疗法没有提供曾经认为的有益作用，而是发现其具有潜在的有害作用(Waters et al.JAMA，288卷，2432-2440页，2002)。
在指出的众多病状中，雌激素替代疗法的两种主要副作用引起长期医学关切a)心血管异常，例如高血压和动脉粥样硬化；和b)雌激素依赖性癌症，具体地说是乳癌。
已知雌激素替代疗法与心血管疾病(包括血栓栓塞性疾病、缺血性疾病和高血压病)的发生率增加相关。心血管疾病的这种增加可能与雌激素有效诱导平滑肌细胞增殖而导致高血压的能力有关。另外，其可能加速动脉粥样硬化演进。对于血栓栓塞性疾病和缺血性疾病、高血压增加的情况，雌激素替代疗法应立即被终止(Pschyrembel，Klinisches Worterbuch，259 Edition)。
雌激素替代疗法还与肿瘤疾病(具体地说是乳癌)的发病率增加有关。例如，接受雌激素疗法的妇女的乳癌风险大约为7％，相比之下，未接受雌激素疗法的妇女的乳癌风险为2％。长期使用雌激素和相关激素可能导致癌细胞增殖，以及促进癌细胞扩散。
目前，在绝经后妇女中减轻雌激素疗法副作用的方法包括给予1)化疗化合物，例如他莫昔芬，2)抗雌激素化合物，例如弱雄激素，或3)黄体酮。这样的联合治疗并不理想。例如，雄激素在子宫中仍可以对某些癌细胞群发挥刺激作用，并且其具有反向生长作用(contraproductive effect)。持续给予黄体酮可诱发闭经，并引起子宫内膜生长退化。长期使用黄体酮可引起不适宜的中枢神经系统副作用，并可导致不孕。
几个美国专利公开了通常可用于绝经后妇女的膳食补充物。例如，美国专利5,514,382公开了每日补充维生素C、锰、镁、生物类黄酮和硒。美国专利5,569,459公开了补充植物雌激素、镁、钙、维生素E、人参粉和泛酸盐。美国专利5,654,011公开了补充植物雌激素和维生素。美国专利5,998,401公开了一类取代的萘化合物。美国专利6,359,017公开了补充植物雌激素和植物雄激素。美国专利6,476,012公开了雌二醇类似物，可选地还有维生素C。美国专利6,479,545公开了补充脂肪酸化合物、钙、维生素C和叶酸。所有这些公开的补充方案都可以进行改进，以减轻雌激素替代疗法的特异性副作用及其效力。
欧洲专利申请00115643.9公开了一种通常用于退行性疾病(与胞外基质降解有关，例如动脉粥样硬化)、癌症和其它相关疾病的药物组合物。组合物包含抗坏血酸盐、纤维蛋白溶解抑制剂和其它微量元素。
长久以来迫切需要提供安全有效的药物组合物和方法，用于减轻与使用合成雌激素和黄体酮药物的激素替代疗法相关的副作用，主要是心血管和肿瘤异常的副作用。
发明目的和概述本发明的一个目的是提供药物组合物，用于在接受雌激素疗法的妇女中减轻绝经后综合症的病理状况。病理状况包括在这些妇女中由于雌激素疗法引起的有害心血管作用(例如高血压和动脉粥样硬化)和有害肿瘤作用(例如乳癌)产生的症状。
因此，本发明提供用于在绝经后妇女中减轻病理状况的药物组合物，其包含赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜、锰和一种选自以下的组分药物可接受的载体、稀释剂和赋形剂，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
可选地，药物组合物还含有选自以下的雌激素化合物乙炔基雌激素、美雌醇、雌二醇、炔雌醇、雌三醇、炔诺酮、利奈孕酮、炔诺醇、己二烯雌酚、双丙拉嗪硫酸雌酮(biperazine estrone sulfate)和植物雌激素。
可选地，药物组合物还含有选自以下的黄体酮化合物甲羟孕酮、异炔诺酮和炔诺酮。
本发明提供含以下物质的药物组合物750mg-15g赖氨酸、500mg-10g脯氨酸、400mg-8g精氨酸、500mg-10g抗坏血酸、40mg-750mg镁、750mg-15g绿茶提取物、150mg-2g N-乙酰基-半胱氨酸、20-700μg硒、1.5mg-20mg铜和0.8mg-15mg锰，其中组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
优选地，本发明提供含以下物质的药物组合物1g-5.5g赖氨酸、750mg-4g脯氨酸、500mg-3g精氨酸、710mg-4g抗坏血酸、50mg-300mg镁、1g-5g绿茶提取物、200mg-1g N-乙酰基-半胱氨酸、30-400μg硒、2mg-10mg铜和1mg-8mg锰，其中组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
更优选地，本发明提供含以下物质的药物组合物1g赖氨酸、750mg脯氨酸、500mg精氨酸、710mg抗坏血酸、50mg镁、1g绿茶提取物、200mg N-乙酰基-半胱氨酸、30μg硒、2mg铜和1mg锰，其中组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
优选地，药物组合物为口服或胃肠外形式。更优选地，口服形式为片剂或胶囊。
本发明提供在绝经后妇女中减轻病理状况的方法，其包括以下步骤给予需要治疗的妇女有效量的药物组合物，其包含赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜、锰和一种选自以下的组分药物可接受的载体、稀释剂和赋形剂，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。可选地，所述组合物含雌激素化合物和/或黄体酮化合物。
本发明提供在绝经后妇女中减轻病理状况的方法，其包括以下步骤给予需要治疗的妇女有效量的药物组合物。通常，推荐的日剂量为10-208mg/kg赖氨酸、7-139mg/kg脯氨酸、5-111mg/kg精氨酸、7-139mg/kg抗坏血酸、0.5-10mg/kg镁、10-208mg/kg绿茶提取物、2-28mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0003-0.01mg/kg硒、0.02-0.3mg/kg铜、0.01-0.2mg/kg锰，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
优选地，药物组合物的日剂量包含13-70mg/kg赖氨酸、10-56mg/kg脯氨酸、7-42mg/kg精氨酸、9.8-4mg/kg抗坏血酸、0.7-4.2mg/kg镁、13-70mg/kg绿茶提取物、3-14mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0004-0.006mg/kg硒、0.03-0.15mg/kg铜、0.01-0.1mg/kg锰，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
更优选地，日剂量为13mg/kg赖氨酸、10mg/kg脯氨酸、7mg/kg精氨酸、9.8mg/kg抗坏血酸、0.7mg/kg镁、13mg/kg绿茶提取物、3mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0004mg/kg硒、0.03mg/kg铜、0.01mg/kg锰，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
优选地，药物组合物可口服、静脉内或胃肠外给予。
附图简述
图1图示了本发明组合物(20μg/ml)对人平滑肌细胞中[3H]胸苷掺入的作用。以相对于对照组值(100％)的百分率表示胸苷掺入。
图2图示了组合物(20μg/ml)阻断雌激素(100nM)介导的平滑肌细胞侵袭的作用。
图3图示了组合物(20μg/ml)在人平滑肌细胞中阻断雌激素(100nM)介导的白介素-6释放的作用。
图4图示了组合物(100μg/ml)阻断人乳癌细胞(MCF-7细胞)中雌激素(20-500nM)介导的[3H]胸苷掺入的作用。
图5图示了组合物(30μg/ml)阻断植物雌激素(25μM)介导的人乳癌细胞(MCF-7)增殖的作用，这可由这些细胞中的[3H]胸苷掺入反映出来。
图6图示了组合物(100μg/ml)阻断人乳癌细胞(MCF-7细胞)中雌激素(10-100nM)介导的VEGF释放的作用。
发明详述本文使用的术语“减轻”用于指减少、抑制、减弱或治疗接受雌激素疗法的绝经后妇女常见的症状。“雌激素疗法综合症”是公认的术语，在本文主要指接受雌激素替代疗法的妇女中的心血管和肿瘤问题，包括高血压、动脉粥样硬化和乳癌。术语“有效量”指能够减轻本文所述各种病理状况的症状的本发明化合物量。修饰载体、稀释剂和赋形剂的术语“药物可接受的”指其必须与配方中的其它成分相容，并对其受者无害。“％(重量)”指成分占组合物总重的百分比；例如，25％(重量)的赖氨酸表示组合物总重的25％由赖氨酸组成。
用于激素疗法的雌二醇和黄体酮的量可大范围变化。雌二醇典型剂量为0.2-0.5mg。黄体酮的示例性剂量为50-100mg。
本发明提供用于在绝经后妇女中治疗与雌激素替代疗法相关的病理状况的组合物，其包含赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地包含雌激素或黄体酮。
尽管不希望受到理论束缚，但本发明的组合物有效抑制雌激素诱导的平滑肌细胞增殖和侵袭。因平滑肌细胞增殖和侵袭对小动脉狭窄起主要作用，所以组合物调节血压以及动脉粥样斑块的发生。赖氨酸和脯氨酸之类成分的联合作用似乎可防止严重的结缔组织退化，这又可以减弱增殖和侵袭进程。另外，绿茶提取物和维生素C也可以利用其抗氧化特性减弱结缔组织退化。尽管确切的作用机制尚未完全明了，但其有可能是通过组合物中存在成分的协同作用抵消雌激素的心血管退化和癌症发生作用来实现。
治疗绝经后雌激素和黄体酮缺乏的方法多种多样。一般包括给予雌激素的口服活性制剂、注射剂或经皮制剂，以及口服或注射形式的黄体酮。临床研究表明，本发明制剂的最佳剂量是每天3粒胶囊，每粒胶囊含0.3-0.4mg雌二醇和50或100g微粉化黄体酮。
按照本发明，所述药物组合物用于在接受雌激素疗法的妇女中减轻绝经后综合症的症状。
各种形式的雌激素都可购买商品。雌激素包括例如乙炔基雌激素(0.01-0.03mg/天)、美雌醇(0.05-0.15mg/天)和结合雌激素，例如Premarin RTM.(Wyeth-Ayerst；0.3-2.5mg/天)。代表性的雌激素是倍美力(Premarin)。
雌激素一被人体吸收，就转变为雌激素的生物活性代谢物雌二醇(17β雌二醇)。雌激素的日剂量为约375μg-1.25mg/天，等于0.05mg-1mg的雌二醇日剂量。雌激素的其它功能等同物包括炔雌醇、炔诺醇、己二烯雌酚、雌二醇和双丙拉嗪硫酸雌酮。
绝经综合症与机体中的雌激素分布随年龄增长而产生的变化有关。在这方面的证据是植物雌激素高的食品是合成激素的合适替代品，对不利的临床症状产生减轻作用。植物雌激素被认为起恢复雌激素代谢平衡的作用。
植物雌激素是植物来源的雌激素化合物。有3类主要的植物雌激素即异黄酮类、木脂素类和香豆素类。代表性的植物雌激素包括染料木黄酮(5，7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮)和白藜芦醇(5-[(1E)-2-(4-羟苯基)乙烯基]-1，3-苯二醇)。已经表明，植物雌激素结合雌激素受体，但亲和力较低，并模拟雌激素的生物作用。植物雌激素替代疗法还没有已确定的剂量，采用染料木黄酮的一些临床研究提示日剂量为20mg-600mg。
按照本发明植物雌激素可得自多种不同来源。优选地植物雌激素由三叶草提取，例如红三叶草或地三叶，或由含高水平植物雌激素的大豆提取。但是，如果需要的话，可替代性地使用任何富含植物雌激素的来源。
各种形式的黄体酮也可以购买商品。黄体酮包括例如甲羟孕酮，如Provera RTM.(Upjohn；2.5-10mg/天)、异炔诺酮(1.0-10.0mg/天)和炔诺酮(0.5-2.0mg/天)。代表性的黄体酮是异炔诺酮和炔诺酮。
当在本文中提及雌激素化合物时，其可包括雌激素、雌二醇、炔雌醇、雌三醇、炔诺酮和利奈孕酮。
赖氨酸可包括赖氨酸盐，例如羟基赖氨酸和羟基赖氨酸盐。通常，L-赖氨酸的给予日剂量为10-208mg/kg，优选为13-70mg/kg，更优选为13mg/kg。L-赖氨酸可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的赖氨酸总量为750mg-15g，优选为1g-5.5g，更优选为1,000mg。
脯氨酸可包括脯氨酸、脯氨酸盐、羟基脯氨酸和羟基脯氨酸盐。通常，L-脯氨酸的给予日剂量为7-139mg/kg，优选为10-56mg/kg，更优选为10mg/kg。L-脯氨酸可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的脯氨酸总量为500mg-10g，优选为750mg-4g，更优选为750mg。
精氨酸可包括精氨酸及其精氨酸盐。通常，L-精氨酸的给予日剂量为5-111mg/kg，优选为7-42mg/kg，更优选为7mg/kg。L-精氨酸可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的精氨酸总量为400mg-8g，优选为500mg-3g，更优选为500mg。
抗坏血酸可包括抗坏血酸、抗坏血酸盐及其衍生物。本文使用的抗坏血酸和维生素C可交互使用，包括抗坏血酸钙、抗坏血酸镁或棕榈酸抗坏血酸酯。通常，抗坏血酸的给予日剂量为7-139mg/kg，优选为9.8-4mg/kg，更优选为9.8mg/kg。抗坏血酸可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的抗坏血酸总量为500mg-10g，优选为710mg-4g，更优选为710mg。
在本申请中要求保护的不同化合物可以共价结合化合物的形式或作为物理混合物或以任意其它组合一起使用。
尽管不希望受任何理论束缚，但相信本发明的组合物可借助其抑制胞外细胞基质降解的能力发挥其有益的作用。与雌激素替代疗法有关的心血管疾病可归因于胞外基质的降解。而且，癌症转移可归因于雌激素通过活化降解结缔组织的酶(包括纤溶酶和胶原酶)弱化胞外基质的能力。
本发明提供含雌激素、抗坏血酸化合物、脯氨酸、赖氨酸或其任意组合的药物组合物。因此，本发明不限于雌激素、抗坏血酸、脯氨酸或赖氨酸，而是包括可按照本发明的优选用途使用的任意等价构成。
本文使用的绿茶提取物指存在于绿茶中的多酚化合物。绿茶中存在的多酚化合物最多可达30％干重。多酚化合物包括黄烷醇、黄烷双醇、黄酮类似物和酚酸。黄烷醇代表绿茶中最丰富的多元酚，通常称为儿茶素。绿茶提取物中主要的儿茶素包括1)(-)-表儿茶酸、2)(-)-表儿茶酸-3-没食子酸、3)(-)-表焙儿茶素和4)(-)-表焙儿茶素-3-没食子酸(EGCG)。在这些儿茶素中，EGCG是绿茶中存在的主要多元酚成分。本文使用的绿茶提取物含约80％(重量)的多元酚，并且不含咖啡因。
绿茶提取物的给予日剂量可为10-208mg/kg，优选为13-70mg/kg，更优选为13mg/kg。绿茶提取物可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的绿茶提取物总量为750mg-15g，优选为1g-5g，更优选为1g。
N-乙酰基-半胱氨酸可包括半胱氨酸或胱氨酸(半胱氨酸二聚体)及其半胱氨酸盐。N-乙酰基-半胱氨酸的给予日剂量可为2-28mg/kg，优选为3-14mg/kg，更优选为3mg/kg。N-乙酰基-半胱氨酸可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的N-乙酰基-半胱氨酸总量为150mg-2g，优选为200mg-1g，更优选为200mg。
本发明进一步提供矿物质和/或微量元素。微量元素可有助于催化结缔组织需要的这些大分子的生产。
镁的给予日剂量可为0.5-10mg/kg，优选为0.7-4.2mg/kg，更优选为0.7mg/kg。镁可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的镁总量为40mg-750g，优选为50mg-300g，更优选为50mg。
硒的给予日剂量可为0.0003-0.01mg/kg，优选为0.0004-0.006mg/kg，更优选为0.0004mg/kg。硒可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的硒总量为20μg-700μg，优选为30μg-400μg，更优选为30μg。
铜的给予日剂量可为0.02-0.3mg/kg，优选为0.03-0.15mg/kg，更优选为0.03mg/kg。铜可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的铜总量为1.5mg-20mg，优选为2mg-10mg，更优选为2mg。
锰的给予日剂量可为0.01-0.2mg/kg，优选为0.01-0.1mg/kg，更优选为0.01mg/kg。锰可以一日一次、两次或三次的剂量形式口服给予。对于平均体重72kg的个体，每日推荐给予的锰总量为0.8mg-15mg，优选为1mg-8mg，更优选为1mg。
按照本发明，组合物中的某些成分以较高的量存在。赖氨酸占24-25％(重量)(与总组合物相比)，优选为24％(重量)。维生素C占16-25％(重量)(与总组合物相比)，优选为17％(重量)。绿茶提取物占22-25％(重量)(与总组合物相比)，优选为22-24％(重量)，更优选为24％(重量)。
尽管不希望受理论束缚，但相信高比例的这些成分(即24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的维生素C和22-25％(重量)的绿茶提取物)，或独立或协同，起对抗雌激素替代疗法副作用的作用。
本发明的组合物可用于治疗或抑制特征为过量平滑肌细胞增殖(平滑肌细胞高增殖)的心血管疾病。所述组合物尤其可用于治疗接受雌激素替代疗法的妇女中由于平滑肌细胞高增殖而经常发生的高血压和动脉粥样硬化。
本发明的组合物还可用于治疗或抑制特征为癌细胞增殖和转移的肿瘤疾病，例如乳癌。
本发明还提供在妇女中治疗绝经后综合症的方法，其包含给予妇女有效量的本发明组合物的步骤。所述疗法尤其可用于治疗心血管异常(例如高血压和动脉粥样硬化)和肿瘤(例如乳癌)，因为患者可接受雌激素疗法的益处，同时本发明组合物抑制雌激素不利的副作用。所述治疗还可能对联合激素疗法(即雌激素和黄体酮)有益。
需要的剂量随给予途径、出现症状的严重性和要治疗的具体患者而变。组合物的推荐日剂量为口服给予的mg/kg。推荐日剂量为10-208mg/kg赖氨酸、7-139mg/kg脯氨酸、5-111mg/kg精氨酸、7-139mg/kg抗坏血酸、0.5-10mg/kg镁、10-208mg/kg绿茶提取物、2-28mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0003-0.01mg/kg硒、0.02-0.3mg/kg铜、0.01-0.2mg/kg锰。日剂量优选为13-70mg/kg赖氨酸、10-56mg/kg脯氨酸、7-42mg/kg精氨酸、9.8-4mg/kg抗坏血酸、0.7-4.2mg/kg镁、13-70mg/kg绿茶提取物、3-14mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0004-0.006mg/kg硒、0.03-0.15mg/kg铜、0.01-0.1mg/kg锰。日剂量更优选为13mg/kg赖氨酸、10mg/kg脯氨酸、7mg/kg精氨酸、56mg/kg抗坏血酸、0.7mg/kg镁、13mg/kg绿茶提取物、3mg/kg N-乙酰基-半胱氨酸、0.0004mg/kg硒、0.03mg/kg铜、0.01mg/kg锰。
本发明的组合物可通过各种途径给予，所述给予途径包括但不限于口服、静脉内或胃肠外给予。用于口服、静脉内或胃肠外给予的精确剂量可有所变化，可基于要治疗的个体患者的体验确定。药物组合物优选为单位剂型，例如为片剂或胶囊。在这种形式时，将组合物再分为含合适量活性成分的单位剂量；单位剂型可为包装的组合物，例如封装的粉剂、小瓶或安瓿。单位剂型可为例如胶囊、自身的丸剂或片剂，或者其可为封装形式的、合适量的任意这种组合物。
本发明的另一方面提供有效量的组合物和药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一方面提供药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地包含有效量的雌激素或黄体酮。
本发明的药用制剂可使用众所周知并简单易得的成分，通过本领域已知的方法制备。例如，在有或没有雌激素或黄体酮化合物的情况下，本发明组合物的成分可与普通的赋形剂、稀释剂或载体配制，形成片剂、胶囊、悬浮剂、粉剂等。适于这些制剂的赋形剂、稀释剂或载体的实例包括以下物质填充剂和增量剂，例如淀粉、糖、甘露醇和硅酸衍生物；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；增湿剂，例如甘油；崩解剂，例如碳酸钙和碳酸氢钠；分解阻滞剂，例如石蜡；吸收促进剂，例如季铵盐化合物；表面活性剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；吸附载体，例如高岭土和膨润土；以及润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇。
本发明的治疗性化合物可配制成药物组合物，其可优化或促进治疗性化合物的应用。具体地说，药物组合物含治疗与雌激素替代疗法有关的胞外基质疾病的有效量。这样的药物组合物经常含有药物可接受的载体或稀释剂，如果适宜的话还含有赋形剂。
组合物还可以配制成常规口服给予的酏剂或溶液，或配制成适于胃肠外(例如通过肌内、皮下或静脉内途径)给予的溶液。理想地，制剂为丸剂、片剂、胶囊、锭剂、液体或类似的剂型。组合物可适当地配制成缓释剂型等。制剂的组成可使其有可能在一段时间内仅在或优选地在特定的生理部位释放活性成分。可由例如聚合物或蜡制备包衣、包膜和保护基质。
本发明的药用制剂可使用众所周知并简单易得的成分，通过本领域已知的方法制备。例如，在有或没有雌激素或黄体酮化合物的情况下，可将式I化合物与普通的赋形剂、稀释剂或载体配制，形成片剂、胶囊、悬浮剂、粉剂等。适于这些制剂的赋形剂、稀释剂或载体的实例包括以下物质填充剂和增量剂，例如淀粉、糖、甘露醇和硅酸衍生物；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；增湿剂，例如甘油；崩解剂，例如碳酸钙和碳酸氢钠；分解阻滞剂，例如石蜡；吸收促进剂，例如季铵盐化合物；表面活性剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；吸附载体，例如高岭土和膨润土；以及润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇。
化合物还可以配制成常规口服给予的酏剂或溶液，或配制成适于胃肠外(例如通过肌内、皮下或静脉内途径)给予的溶液。此外，化合物可适当地配制成缓释剂型等。制剂的组成可使其有可能在一段时间内仅在或优选地在特定的生理部位释放活性成分。可由例如聚合物或蜡制备包衣、包膜和保护基质。
除非另有说明，否则本文使用的所有科学术语都和本领域一般技术人员通常理解的含义一致。下文描述了示例方法和材料，可以使用其等同物。本文提及的所有出版物和其它参考文献都通过引用整体结合到本文中。
提供以下的实施例是为了进一步阐述本发明。以下实施例无意以任何理由限制本发明的范围。
实施例实验的基本原理和方案平滑肌细胞的生长速率实验基本原理正如所述，平滑肌细胞和癌细胞的过量生长速率分别与动脉粥样硬化进程和恶性肿瘤生长的加速直接相关。根据温育过程中掺入到细胞DNA中的氚标记代谢前体的量评价DNA从头合成(即[3H]胸苷掺入)，由此估测培养细胞的生长速率。胸苷掺入以每孔40,000细胞/ml(0.5ml)的细胞浓度，将人平滑肌细胞(Aortic-Cambrex Corporation，San Diego，CA，目录号CC-2571)接种在含适宜生长培养基(DMEM+10％FBS)的24孔板中。温育3小时后，漂洗细胞，加入含指定量测试组合物的新鲜培养基。将细胞再培养3-4天。在培养结束时，以1μCi/mL(1μCi＝37kBq)的终浓度加入等份的[3H]胸苷(DuPont-NEN，Boston，Mass.)。24小时后，用冰冷的DulbeccoPBS漂洗细胞，在冷的10％TCA(三氯乙酸)中固定至少0.5小时，并与0.5mL的0.1 N NaOH于37℃温育2小时。用0.1 N NaOH提取结合[3H]胸苷的细胞，并用液体闪烁计数器(LS 8000，Beckman Coulter)检测。
平滑肌细胞生长和侵袭为心血管疾病演进的指标基本原理在病理刺激作用下，平滑肌细胞首先由血管壁的中层迁移至血管壁内层，然后在内层中增殖。这些事件在动脉粥样斑决的初期发生过程中是至关重要的。在内层中动脉粥样硬化病变的形成发生在许多心血管疾病中，包括高血压、动脉硬化、心肌缺血、梗塞和中风。(R.Ross，Cellular Mechanisms of Atherosclerosis，Atherosclerosis Review，103，25卷，195-200页)。本发明组合物设计用来抑制平滑肌细胞的侵袭和增殖，相信本发明组合物是在绝经后妇女中减轻雌激素替代疗法副作用的药物。
在以下实施例中使用的“组合物”是指含以下特定量的特定成分的组合物1g赖氨酸、750mg脯氨酸、500mg精氨酸、710mg抗坏血酸、50mg镁、1g绿茶提取物、200mg N-乙酰基-半胱氨酸、30μg硒、2mg铜和1mg锰。首先将含以上提及的组合物的胶囊溶解在培养基中，并在使用前稀释至合适的浓度。
图1呈现的数据显示了使用单独的雌激素以及雌激素和组合物(含1g赖氨酸、750mg脯氨酸、500mg精氨酸、710mg抗坏血酸、50mg镁、1g绿茶提取物、200mg N-乙酰基-半胱氨酸、30μg硒、2mg铜和1mg锰)对平滑肌细胞增殖作用的体外实验。显示了代表性实验的结果，值以平均值±SEM表示。进行ANOVA对比，接着进行Fisher的最小显著差异检验。可接受的显著性为P＜0.05。“％”指对照值的％；例如％[3H]胸苷掺入是指参比于对照细胞的％。
如图1所示，观察到50-450nM剂量的雌激素诱导人平滑肌细胞中的[3H]胸苷掺入增加，这与雌激素和抗高血压作用的相关性相符。20μg/ml浓度的组合物有效消除了雌激素介导的平滑肌细胞增殖。还发现组合物有效阻断黄体酮(50-45nM)和硫酸脱氢表雄甾酮(25-100nM)介导的[3H]胸苷掺入。因此，所述组合物可有效阻断雌激素诱导的平滑肌细胞增殖。
平滑肌细胞侵袭实验平滑肌细胞和癌细胞侵袭胞外基质的能力提升分别与动脉粥样斑块形成和转移形成的开始直接相关。根据穿过天然胞外基质(Matigel，Beckton-Dickinson)包被的多孔塑料膜的细胞数估测培养细胞的侵袭力。在75cm2培养瓶中的含10％胎牛血清(FBS)的培养基中于37℃使培养细胞生长至接近完全汇合。在温育的最后48小时，通过加入1μCi/mL[3H]胸苷代谢标记从头合成的细胞DNA。通过用0.025％胰蛋白酶的PBS溶液处理细胞层，将标记细胞与塑料表面分离。以40,000细胞/mL的浓度将培养细胞接种在衬垫(insert)塑料底膜的上表面，将衬垫置于24孔塑料板的孔中，孔中为0.5mL含10％胎牛血清(FBS)的培养基。衬垫底膜具有直径尺寸控制为8μm的孔，并以Matrigel层覆盖。通过于37℃温育使细胞与Matrigel表面附着3小时。用不含FBS的新鲜培养基和指定量的测试化合物更换细胞培养基。将细胞于37℃温育24小时。在温育期结束时，将衬垫由孔中取出，并用PBS彻底清洗。用棉花擦擦拭衬垫底膜的上表面，以去除附着的细胞。然后切下膜，并转移至充满闪烁液的闪烁瓶。用冰冷的10％TCA处理细胞层30分钟。用闪烁计数器(LS 8000，Beckman-Coulter)检测膜下表面结合的放射性的量，根据该量评价穿透到多孔膜另一侧的细胞数。
如图2所示，发现100nM的雌激素诱导人平滑肌细胞侵袭增加。20μg/ml浓度的组合物有效消除雌激素介导的平滑肌细胞侵袭。
平滑肌细胞表达白介素-6是自分泌炎症反应的指标基本原理细胞因子表达及其与炎症反应有关是已知。近来已认识到心血管疾病中出现的血管和平滑肌病变是动脉粥样硬化和高血压过程中的一种炎症反应。白介素-6是触发该炎症进程的一种关键细胞因子。在病理刺激下白介素-6在平滑肌细胞中过表达可能进一步放大了炎症损害。本发明的组合物设计用来抑制平滑肌细胞中产生的细胞因子(具体地说是白介素-6)的过表达。通过抑制白介素-6在平滑肌细胞中的表达，相信本发明的组合物是在绝经后妇女中减轻雌激素替代疗法副作用的药物。
如图3所示，发现100nM的雌激素诱导人平滑肌细胞释放的白介素-6增加。我们发现，20μg/ml浓度的组合物有效消除平滑肌细胞中雌激素介导的白介素-6释放。
乳癌细胞增殖是肿瘤疾病演进的指标如图4所示，观察到20-500nM剂量的雌激素诱导人乳癌细胞(MCF-7细胞；ATCC No.HTB-22)中的[3H]胸苷掺入增加。该观察结果与在绝经后妇女中雌激素疗法与乳癌发病率增加相关的观察结果一致。100μg/ml浓度的组合物有效消除雌激素介导的MCF-7细胞增殖。使用另一种乳癌细胞系(即MDA-MB-MB-231；ATCC No.HTB-26)也观察到相似的抑制。还发现所述组合物有效封闭黄体酮(100nM)介导的[3H]胸苷掺入。因此，所述组合物可有效阻断雌激素诱导的乳癌细胞增殖。
如图5所示，30μg/ml的组合物有效阻断植物雌激素(25μM)介导的人乳癌细胞(MCF-7细胞)增殖，这可由这些细胞中的[3H]胸苷掺入情况反映出来。
检测癌细胞中的VEGF(血管内皮生长因子)基本原理肿瘤床中的新血管形成(即新血管化)是肿瘤生长必需的。在没有新血管形成的情况下，大部分肿瘤仅可生长至约1mm直径，因为营养和氧向生长中肿瘤细胞的供应给依赖于肿瘤周围的血管。肿瘤能够通过释放被称为血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白引起新血管形成(新血管化)。理想地是抑制癌细胞中的VEGF表达，以防止新血管化，并抑制肿瘤生长。(参见Vascular Endothelial Cell GrowthFactor(VEGF)，an Emerging Target for Cancer Chemotherapy，Shinkaruk，et al.，Current Medicinal Chemistry and Anti-Cancer Agents，2003，第3卷，95-117页)。
细胞因子表达实验细胞血管内皮生长因子(VEGF)的生产水平是刺激新血管化进程的指标。用市售可得的免疫化学实验试剂盒检测培养细胞合成并分泌细胞因子进入培养基的速率。以40,000细胞/mL的浓度将培养细胞接种在48孔板中的0.5mL含10％FBS的培养基中。通过于37℃温育2-5天，使孔中的细胞生长成汇合层。用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗细胞层，将含测试化合物的无血清新鲜培养基置于孔中，保持37℃达24小时。按照生产商的说明(R&D Systems)，使用ELISA试剂盒检测分泌入细胞培养基的细胞因子水平。
如图6所示，观察到雌激素(10-100nM)诱导人乳癌细胞(MCF-7细胞)中释放的VEGF增加。我们发现100μg/ml浓度的所述组合物有效消除人乳癌细胞中由雌激素介导的VEGF释放。还发现所述组合物有效阻断乳癌细胞中黄体酮(10nM)介导的VEGF释放。因此，所述组合物可有效阻断人乳癌细胞中的雌激素诱导的细胞因子表达。
临床应用本发明的组合物可用于对抗雌激素的作用，以防止胞外基质降解。本发明可用于病理状况，其中通过组合使用本文公开的组合物可抵消有益的激素疗法的副作用。加强绝经过程中和绝经后的结缔组织的天然机制可由本发明的联合治疗应用取代。其可用于最小化或防止长期激素疗法的副作用，包括癌症和其它严重健康状况，同时允许雌激素和相关激素的需要的药物或治疗作用。
高血压由于雌激素替代疗法与动脉内膜中脂肪物质沉积和纤维化之类的因素有关，所以其可通过侵袭、增厚动脉壁，恶化动脉粥样硬化进程。动脉增厚伴随着侵袭入斑块或病灶的内膜平滑肌细胞增加。如果容许发展，动脉壁增厚可引起动脉腔的严重狭窄和阻塞，减小或阻塞血流，从而发生高血压，最终导致主要受影响器官或解剖部分(例如脑、心脏、肠或肢体)的缺血或梗塞。
一旦疾病发展到显著的持久性症状和功能受损的阶段，必须进行动脉旁路移植来代替受损伤的动脉。在美国，动脉旁路方法存在显著的风险。外科手术仍然是最后选择的解决方法，并且发病率高。本发明提供了减轻和显著减慢平滑肌细胞增殖和迁移的药物组合物，由此减慢了雌激素替代疗法过程中的动脉粥样硬化和高血压进程。
动脉粥样硬化动脉粥样硬化与胆固醇代谢有关，胆固醇代谢又与雌激素代谢紧密相关。其在绝经后妇女中的发病率升高，而在接受雌激素替代疗法的绝经后妇女中的发病率较低，所有这些都指出，雌激素对许多方面(包括平滑肌细胞迁移和胆固醇代谢)都有适度的影响。已表明雌激素是有效的促细胞分裂剂，可诱导平滑肌细胞迁移和增殖。雌激素的另一种主要作用是刺激肝脏将胆固醇(尤其是将高度致动脉粥样硬化的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白)加工为胆汁盐。
推测当雌激素和抗坏血酸、赖氨酸、脯氨酸和其它物质联合给予时，存在于组合物中的各种成分的作用应相互抵偿。雌激素治疗导致胞外基质降解，而已知抗坏血酸组合物，特别是与赖氨酸和脯氨酸组合的抗坏血酸组合物，降低或抑制这种降解，雌激素治疗将由此失效。但是，令人惊奇地是，至少部分程度上不是这种情况，原因是这种抗坏血酸组合物的协同作用，特别是和赖氨酸和脯氨酸(以及大量的赖氨酸)组合时，其一方面防止或抑制胞外基质降解，另一方面增强胶原蛋白合成，尤其是抗坏血酸可产生并支持胞外基质。
已知雌激素和相关激素可弱化结缔组织。因此，在优选实施方案中，本发明提供化合物的联用或治疗应用，其抵消雌激素化合物的弱化作用。因此，本发明提供增强结缔组织的有效量的抗坏血酸化合物、赖氨酸和脯氨酸，以平衡雌激素化合物的弱化作用。已知抗坏血酸刺激成纤维细胞和相关细胞合成胶原蛋白、弹性蛋白和其它结缔组织大分子。氨基酸赖氨酸和脯氨酸是合成结缔组织分子需要的主要氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物显示出有效抑制平滑肌细胞增殖。所述组合物在例如抗高血压药物的应用中具有临床相关性。通过降低平滑肌细胞增殖，所述组合物增加血管孔径，降低总外周血管阻力。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物显示出抑制平滑肌细胞增殖，而平滑肌细胞增殖已被证明是动脉粥样硬化发生和发展所必须的。我们的体外数据表明了所述组合物作为增殖抑制剂的有效作用(通过3H-胸苷掺入检测)。预期所述组合物可由此减弱动脉粥样硬化。
本发明的药物组合物还抑制平滑肌细胞迁移，由此降低动脉粥样硬化的发生和演进。中层平滑肌细胞趋化迁移至内膜在动脉粥样硬化过程中的新内膜形成发病机理中是重要的第一步。Russel R.(1986)N.Engl.J.Med.314 488-500)。不受任何机制解释或操作理论限制，本文公开的组合物体内抑制体内肌肉内膜形成的能力可能部分地与直接抑制血管平滑肌由中膜向内膜物理迁移有关。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地含有雌激素和黄体酮，或者含有其药物可接受的赋形剂，用于抑制哺乳动物(优选人)中的平滑肌细胞增殖，具体地说是用于抑制绝经后妇女血管中的增殖；用于抑制动脉粥样硬化发生；用于抑制与高血压相关的血管肥厚的演进。
在另一个实施方案中，本发明还提供抑制哺乳动物(优选人)中的平滑肌细胞增殖和迁移的治疗方法，具体地说是防止绝经后妇女血管中的增殖的治疗方法，用于抑制动脉粥样硬化发生的治疗方法；或用于抑制与高血压相关的血管肥厚的演进的治疗方法，所述方法包括给予需要其的患者有效剂量的本文公开的药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地含有雌激素和黄体酮，以及其药物可接受的赋形剂。本发明的组合物显示出有效抑制由各种不同促细胞分裂剂介导的血管平滑肌细胞增殖和迁移。
肿瘤疾病处于月经周期某些阶段的妇女和乳癌存在强烈相关，这提示雌激素在其发病机理中起主要作用。乳癌仍然是一种普遍的癌症，临床研究表明大约有三分之一的乳房肿瘤是雌激素依赖性的。这说明雌激素在绝经前和绝经后患者中都是乳房肿瘤生长所必需的。在最常发生乳癌的绝经后妇女中，乳房肿瘤的雌激素和雌二醇浓度显著高于血液雌激素水平。此观察结果与乳房肿瘤中存在雌激素受体相关。乳癌的增殖和增殖可具有良好的雌激素依赖性。据信，如果用雌激素阻断剂如他莫昔芬(一种非甾族雌激素拮抗剂)治疗乳癌细胞含雌激素受体的妇女，则其生存机会将极大增加。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物表现出抑制癌细胞增殖和迁移，而癌细胞增殖和迁移是乳癌发生和演进所必需的。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地含有雌激素和黄体酮，或者含有其药物可接受的赋形剂，用于抑制哺乳动物(优选人)中的乳癌细胞增殖，具体地说是用于抑制乳癌发生。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制哺乳动物(优选人)中的乳癌细胞增殖和迁移的治疗方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜和锰，可选地含有雌激素和黄体酮，或者含有其药物可接受的赋形剂。
应当理解地是，所公开的优选实施方案对本发明没有限制意义，而是要涵盖属于本发明精神和范围的所有修改和替代方案。
权利要求
1.一种用于在绝经后妇女中减轻病理状况的药物组合物，所述组合物包含赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N-乙酰基-半胱氨酸、硒、铜、锰和一种选自以下的药物可接受的组分载体、稀释剂和赋形剂，其中所述组合物含24-25％(重量)的赖氨酸、16-25％(重量)的抗坏血酸和22-25％(重量)的绿茶提取物。
2.权利要求1的药物组合物，所述组合物还含有选自以下的雌激素化合物乙炔基雌激素、美雌醇、雌二醇、炔雌醇、雌三醇、炔诺酮、利奈孕酮、炔诺醇、己二烯雌酚、双丙拉嗪硫酸雌酮和植物雌激素。
3.权利要求2的药物组合物，所述组合物还含有选自以下的黄体酮化合物甲羟孕酮、异炔诺酮和炔诺酮。
4.权利要求1的药物组合物，其中存在750mg-15g赖氨酸、500mg-10g脯氨酸、400mg-8g精氨酸、500mg-10g抗坏血酸、40mg-750mg镁、750mg-15g绿茶提取物、150mg-2gN-乙酰基-半胱氨酸、20-700μg硒、1.5mg-20mg铜和0.8mg-15mg锰。
5.权利要求1的组合物，其中存在1g-5.5g赖氨酸、750mg-4g脯氨酸、500mg-3g精氨酸、710mg-4g抗坏血酸、50mg-300mg镁、1g-5g绿茶提取物、200mg-1gN-乙酰基-半胱氨酸、30-400μg硒、2mg-10mg铜和1mg-8mg锰。
6.权利要求1的组合物，其中存在1g赖氨酸、750mg脯氨酸、500mg精氨酸、710mg抗坏血酸、50mg镁、1g绿茶提取物、200mgN-乙酰基-半胱氨酸、30μg硒、2mg铜和1mg锰。
7.权利要求1的药物组合物，其中所述病理状况为选自以下的至少一种疾病高血压、动脉粥样硬化和乳癌。
8.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物为口服形式或胃肠外形式。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述口服形式为片剂、丸剂或胶囊。
10.一种用于在绝经后妇女中减轻病理状况的方法，所述方法包括给予需要治疗的妇女有效量的权利要求1、2或3的药物组合物的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述组合物的有效量为以下的日剂量10-208mg/kg赖氨酸、7-139mG/kg脯氨酸、5-111mg/kg精氨酸、7-139mg/kg抗坏血酸、0.5-10mg/kg镁、10-208mg/kg绿茶提取物、2-28mg/kgN-乙酰基-半胱氨酸、0.0003-0.01mg/kg硒、0.02-0.3mg/kg铜、0.01-0.2mg/kg锰。
12.权利要求10的方法，其中所述组合物的有效量为以下的日剂量13-70mg/kg赖氨酸、10-56mg/kg脯氨酸、7-42mg/kg精氨酸、9.8-4mg/kg抗坏血酸、0.7-4.2mg/kg镁、13-70mg/kg绿茶提取物、3-14mg/kgN-乙酰基-半胱氨酸、0.0004-0.006mg/kg硒、0.03-0.15 mg/kg铜、0.01-0.1mg/kg锰。
13.权利要求10的方法，其中所述组合物的有效量为以下的日剂量13mg/kg赖氨酸、10mg/kg脯氨酸、7mg/kg精氨酸、56mg/kg抗坏血酸、0.7mg/kg镁、13mg/kg绿茶提取物、3mg/kgN-乙酰基-半胱氨酸、0.0004mg/kg硒、0.03mg/kg铜、0.01mg/kg锰。
14.权利要求10的方法，其中所述药物组合物口服、静脉内或胃肠外给予。
全文摘要
本发明提供用于在绝经后妇女中减轻病理状况的药物组合物，其含有赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、抗坏血酸、镁、绿茶提取物、N－乙酰基－半胱氨酸、硒、铜、锰和一种选自以下的药物可接受的组分载体、稀释剂和赋形剂，其中所述组合物含24－25％(重量)的赖氨酸、16－25％(重量)的抗坏血酸和22－25％(重量)的绿茶提取物。还公开了一种使用所述药物组合物的治疗方法。
文档编号A61K9/20GK1997353SQ200480022589
公开日2007年7月11日 申请日期2004年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者S·内特科, A·尼德维基, 马蒂亚斯·拉思, V·伊瓦诺夫 申请人:马蒂亚斯·拉思