增加的神经胚素分泌的制作方法

专利名称：增加的神经胚素分泌的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备神经胚素肽以及例如通过基因治疗将神经胚素局部递送至神经系统特定区域的方法和组合物，所述神经系统包括中枢神经系统和眼。本发明包括自被包封入半透大胶囊(macrocapsule)的经转导或转染的细胞递送神经胚素。本发明进一步还涉及可制备增加量的神经胚素的哺乳动物细胞。
背景技术：
细胞具有多种方式将从头合成的蛋白质导向至所述细胞的各个区室及细胞外间隙。将信号肽引入染色体DNA编码部分并通过核醣体作为蛋白质的一部分合成。信号肽构成了N-末端，可以将新合成的多肽导入粗面内质网。在这里，所述信号肽被从多肽切除，成熟蛋白质分泌入周围环境。因此，所述信号肽仍然留在了细胞内。
蛋白质的原(pro)-部分被从蛋白质的成熟部分切割出来终止于细胞外。对于一些神经营养因子例如NGF而言，所述的蛋白质原-部分作为神经肽具有生物活性。
在插入的基因编码分泌型蛋白质的基因治疗中，需要将信号序列置于成熟蛋白质之前以确保其通过粗面内质网和高尔基氏体的正确加工。几乎恒定不变的首选是所述蛋白质的天然信号肽，因为通常期望的是所述蛋白质以与天然细胞分泌和加工的相同方式分泌和/或加工。对于一些应用情况，还期望蛋白质的表达量与天然细胞中的相等。另外，本领域技术人员不能排除切割出的信号序列在细胞新陈代谢中发挥作用的可能性。最终，本领域技术人员可以选用蛋白前-原-部分确保成熟蛋白的正确加工和折叠。
多数情况下，预期分泌治疗因子的经体内转导及转染的细胞不能分泌治疗足够量的治疗因子并且不能分泌足够的时间。当细胞在体外被转染或转导并在基因修饰后插入患者的情况下，这在离体基因治疗中同样也是一个问题。
现有技术没有提供关于在哺乳动物中将信号肽与异源蛋白偶联的很多信息。对于在真菌或酵母中异源表达哺乳动物蛋白质而言，通常的做法是用在生产者物种中功能性的信号肽取代哺乳动物信号肽。
发明概述本发明涉及一种用于制备生物学活性神经胚素多肽的方法，该方法包括培养其中含有表达载体的细胞，该表达载体中包含可操作地连接于编码信号肽和神经胚素多肽的核苷酸序列的启动子序列，其中所述的核苷酸序列不编码神经胚素原-区。
所述天然的人前原神经胚素多肽长220个氨基酸(

图17A)(SEQ IDNO10)。所述神经胚素信号肽由39个氨基酸组成，起始于第一位甲硫氨酸，终止于第39位丙氨酸(图17B)。神经胚素的最长的全长前-结构域由69个氨基酸组成，起始于第40位丝氨酸，终止于第107位精氨酸(图17C)。一种成熟的神经胚素多肽由C末端113个氨基酸组成，起始于第108位的丙氨酸，终止于第220位的甘氨酸。前-原-神经胚素含有几个可能的前-肽切割位点，原-前-神经胚素在哺乳动物细胞中表达可以引起多种成熟肽的分泌，所述成熟肽可能为由C末端的140，113，107，和104个氨基酸组成的形式。对于所有这些成熟形式中的每一种来说，存在一个相应的原-结构域，其由从成熟肽的第40位到首位残基前一位的氨基酸组成。
本发明为在用病毒载体在体内及体外转导哺乳动物细胞时常出现的下述问题提供了解决方案几乎根本没有神经营养性因子包括神经胚素的分泌。这种现象还出现于基于质粒的表达载体中。由于某些未知的原因，哺乳动物细胞经常被阻遏而无法分泌出所述载体编码的神经营养性因子。一种可能的解释是分泌型蛋白质的正确加工是细胞特异性的。这是病毒载体基因治疗应用中的重要问题。目前，病毒载体基因治疗是体内或离体基因治疗的最优选(如果不是唯一相关的话)的方法，这是由于病毒载体能确保稳定地整合入被转导细胞的基因组内。
本发明提供了成熟人神经胚素或成熟人神经胚素生物活性截短形式即分泌的神经胚素多肽作为前-蛋白而非前-原蛋白有效表达。本发明所述神经胚素前蛋白通常包括两组分分泌的神经胚素多肽(如上所述)，和异源的信号序列。
另外，本发明人发现用来自其他蛋白质诸如来自免疫球蛋白重链可变区的另一种信号肽替换取代神经胚素的天然信号肽，可以更进一步提高神经胚素的分泌，尤其是自经转导的细胞的分泌。
另外，本发明人还发现通过去除编码信号肽及神经胚素多肽的核苷酸序列中的编码原-区的核苷酸序列，能够表达并且获得比包括原区在内时更多量的分泌型神经胚素。
现已发现尽管原-区是许多蛋白质正确折叠所必需的，但是确实可以制备出无原-区的生物活性神经胚素多肽。
另一方面本发明涉及编码所述信号肽和所述神经胚素多肽的核苷酸序列，含该核苷酸序列的表达载体，包含本发明所述载体以及一种或多种药物学可接受的佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂的药物组合物。所述药物组合物可以用于体内和离体的基因治疗。
另一方面，本发明涉及经本发明所述载体转导或转染的分离的宿主细胞。
与经编码带有其天然信号肽的神经胚素的载体转导或转染的细胞相比，这类经过基因修饰的宿主细胞能够产出出人意料的大量神经胚素。因此，这些经过转导或转染的宿主细胞可以作为工业化大规模制备神经胚素的生产细胞的有希望的来源。所述神经胚素-分泌细胞还可以移植入哺乳动物受试者充当神经胚素的来源。一种具体的应用为离体基因治疗。
另一方面本发明涉及一种能够产生感染性载体粒子的包装细胞系，该载体颗粒含有源自反转录病毒的基因组，该基因组包含5’反转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接于编码融合蛋白的多核苷酸序列、第二链DNA合成起点以及3’反转录病毒LTR，所述融合蛋白包括神经胚素和免疫球蛋白信号肽。
这些包装细胞系还可以用于制备本发明所述病毒载体。当包封并移植至CNS时候，它们还可以用于体内基因治疗。
另一方面，本发明涉及转基因非人哺乳动物，其中含有至少一种在被本发明所述载体转导或转染的细胞。所述过表达神经胚素的动物可用于基因绘图以及筛选和开发药物。
优选地，所述经转导或转染的细胞具有个体动物的基因型，即，并非是同种异体的(allogenic)或异种的(xenogenic)移植体。
另一方面，本发明涉及可植入细胞培养装置，所述装置其中含有允许神经营养性因子扩散通过的半透薄膜；和至少一种本发明所述的分离的宿主细胞。
这些胶囊可用于神经胚素移植入中枢神经系统时的局部递送。生长因子局部及延长的递送是治疗多种CNS疾病的优选施用方法，包括但不限于帕金森氏疾病，阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease)，亨延顿舞蹈病(Huntington′s disease)，中风(stroke)，和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。同样，所述胶囊可用于为了外周疾病包括但不限于神经病和神经病性疼痛的神经胚素的局部及延长的递送。其他的适应症还包括眼部疾病。
本发明所述的胶囊剂提供了使用胶囊方式将病毒颗粒递送至患者所需部位的方法。与单次输注相反，载体-制备型细胞系的胶囊化能够使得将病毒颗粒持续地递送至目标部位。此外，还可以重复治疗，减小免疫攻击的可能性。所述胶囊具有足够大的孔，允许释放自包装细胞的病毒颗粒通过，但阻止宿主细胞进入胶囊。
这种胶囊方式提高了所述治疗的安全性和可控性，因为该装置能很容易地被撤除(终止转导治疗)或外植(explanted)及再植入(reimplanted)(修饰治疗)。另外，由于胶囊装置为非开放性的或者非外部化的(externalised)，所以减少了感染的几率。
最后，由于胶囊化作用能够阻止包装细胞在患者体内的迁移，从而延长了植入的包装细胞的存活能力，所以这种治疗方法需要的细胞很少。这有助于进一步降低所述患者体内的免疫反应。
另一方面本发明涉及本发明所述载体作为药物的用途。
另一方面，本发明涉及本发明所述载体用于制备在治疗神经系统疾病的药物的用途。
另一方面，本发明涉及本发明所述载体在制备用于治疗CNS疾病的药物的用途。
另外，本发明涉及一种治疗神经系统疾病的方法，该方法包括向需要的个体施用治疗有效量的本发明所述载体；或者其中治疗有效量的药物组合物，其含有所述载体。
依据本发明的这个方面提供了改进后的基因治疗方法，用于治疗神经系统疾病。正如所附实施例证明的那样，用本发明所述病毒载体转导导致所编码神经胚素的前所未有的分泌水平，以及由此而带来的增强的治疗效果。
另一方面本发明涉及一种治疗神经系统疾病的方法，该方法包括向需要的个体移植-治疗有效量的本发明所述的转导细胞；或者-本发明所述的可植入装置或者这个方面提供了另一种治疗神经系统疾病的方法，该方法基于离体基因治疗和能分泌增量神经胚素的治疗用细胞的植入。
大规模生产神经胚素目前优选的方法为在大肠杆菌中异源表达，然后是蛋白质的溶解、提取、纯化、重折叠以及任选的切割。用于制备研究规模量的另一种方法包括培养哺乳动物生产者细胞例如CHO细胞，该细胞可将经正确加工及折叠的神经胚素分泌入培养基，因而能够相对容易地从培养基分离出所述神经胚素。本发明所述的哺乳动物细胞能够制备得到比此前的哺乳动物细胞更多的神经胚素，因而是用于制备生物活性神经胚素的改进的细胞来源，该神经胚素是经过正确加工及折叠的神经胚素。
附图简述图1各种哺乳动物的IgSP序列的比对结果。
图2实施例2的转导试验中使用的慢病毒载体构建体pHsC.IgSP.hNBN.W的载体图谱。
图3pNSln.IgSP.hNBN的载体图谱。与实施例1使用的位于BamHI和XhoI限制酶切位点之间的pHsC.IgSP.hNBN.W相同的IgSP-NBN序列。
图4RetL3ELISA测定的NBN活性(双份样品)。(a)使用大肠杆菌中制备的重组小鼠Artemin(mART)作为标准测定的细胞上清中的NBN活性，(b)经转染的细胞的上清的分析结果，(c)经转导的细胞的上清的分析。
图5用抗-NBN抗体#_378进行Western印迹分析。(a)来自CHO-NBN16细胞的GFR[alpha]3亲和纯化的NBN(CHO-NBN)和20ng大鼠重组NBN(rNBN)的分析结果(b)经IgSP-NBN表达构建体转染或转导的ARPE-19以及稳定过表达来自野生型构建体的NBN的两种CHO细胞克隆(CHO-NBN25c和CHO-NBN16)的上清的分析。箭头标示的是经抗体#_378还原后神经胚素的糖基化及非-糖基化单体的位置。
图6预测利用SignalP对信号肽的切割。解释参见实施例4。
图7图7A图示的是质粒pHs C.hNBN.W，图7B图示的是质粒pHsCXW。解释参见实施例6。
图8图8A图示的是条件培养基中的相对NBN释放，图8B和8C图示的是不同细胞系中的NBN，还参见实施例7。
图9图示的是天然人神经胚素多肽的104个羧基(C)末端氨基酸序列(SEQ ID NO19)，以及编码所述天然人神经胚素104个C末端氨基酸的相应DNA序列(SEQ ID NO58)与为CHO细胞表达而优化的编码天然人神经胚素104个C末端氨基酸的合成基因(SEQ ID NO59)之间的比对。(*)标示的是合成基因中相对于天然序列发生了改变的核苷酸。
图10图示的是质粒pNBN026-35内的神经胚素序列(SEQ ID NO60)。该序列的上游紧邻“CT”二联核苷酸，其参与构成XhoI限制酶切位点。下游紧邻BamHI限制酶切位点。
图11图示的是融合于合成信号序列的神经胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列。下划线标出的为信号序列。
图12图示的是融合于神经胚素信号序列的神经胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列。下划线标出的为信号序列。
图13A图示的是融合于白蛋白信号序列的神经胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。下划线标出的为信号序列。
图13B图示的是融合于经修饰白蛋白信号序列的神经胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO69)和氨基酸(SEQ ID NO70)序列。下划线标出的为信号序列。
图14图示的是融合于人生长激素信号序列的神经胚素C末端104氨基酸的DNA序列(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ ID NO68)序列。下划线标出的为信号序列，其含有内含子。
图15图示的是使用白蛋白信号肽序列(15A)或人生长激素信号肽序列(15B)(15C)时，自CHO细胞分泌的神经胚素的质谱分析结果。11,156和11,157道尔顿处的峰对应于104个氨基酸的神经胚素C末端片段。11,084和11,085道尔顿处的峰对应于103个氨基酸的神经胚素C末端片段。图15A图示的是白蛋白-指导分泌的去糖基化神经胚素。图15B图示的是人生长激素-指导分泌的去糖基化神经胚素。图15C图示的是人生长激素-指导分泌的神经胚素。具有较大质量(mass)的峰对应的是各种糖基化存在形式。
图16图示的是KIRA测定结果，显示了CHO细胞中产生重组制备的神经胚素的活性。
图17A图示的是包括成熟蛋白质、原-结构域和信号肽的全长神经胚素的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。图17B图示的是全长天然神经胚素信号肽的氨基酸序列。图17C图示的是全长神经胚素原-结构域的氨基酸序列。
定义“C末端氨基酸”在本申请中是指多肽链中位于多肽链氨基(N)末端最远端的一连串连续的氨基酸。
“神经胚素原-区”是指这样的区域，其中含有至少对应于SEQ IDNO10，11，12中第41至-11位氨基酸的氨基酸。
“前原神经胚素多肽”(SEQ ID NO10)在本申请中是指由下列序列组成的多肽成熟的人神经胚素，即，神经胚素C末端的113个氨基酸(SEQID NO10的第108-220位a.a.)，全长人神经胚素原-结构域，即，成熟神经胚素N末端近端的68个氨基酸(SEQ ID NO10的第40-107位a.a.)，以及人神经胚素信号肽，即，神经胚素原-结构域N末端近端的39个氨基酸(SEQ ID NO10的第1-39位a.a.)，信号肽-真核生物信号肽。真核生物的信号肽是存在于待分泌或将成为膜成分的蛋白质上的肽。通常位于蛋白质的N-末端。本申请中，SignalP(版本2.0或者优选版本3.0)中鉴定的所有信号肽都被认为是信号肽。
“功能性神经胚素信号肽”在本申请中是指SEQ ID NO10的前39个氨基酸或者或者其中任一能实现成熟神经胚素从细胞分泌的部分。
“功能性神经胚素信号序列”是指编码功能性的神经胚素信号肽的核酸序列。
哺乳动物信号肽是指源自分泌自ER的哺乳动物蛋白质的信号肽。
成熟的人神经胚素多肽在本申请中是指天然人神经胚素C-末端的113个氨基酸，即SEQ ID NO.10中的第108-220位氨基酸。
成熟的小鼠神经胚素多肽在本申请中是指天然小鼠神经胚素C-末端的113个氨基酸，即SEQ ID NO.11中的第112-224位氨基酸。
成熟的大鼠神经胚素多肽在本申请中是指天然大鼠神经胚素C-末端的113个氨基酸，即SEQ ID NO.12中的第112-224位氨基酸。
神经胚素多肽在本申请中是指一种多肽，其中含有天然人神经胚素C-末端第99-140位氨基酸，大鼠或小鼠神经胚素C-末端第99-144位氨基酸。更优选地，神经胚素多肽含有天然人神经胚素C-末端的99-113位氨基酸，天然大鼠神经胚素C-末端99-113位氨基酸，或者小鼠神经胚素C-末端的99-113位氨基酸，其中的每一种都具有天然序列中的达15个氨基酸的取代。一些情况下，应理解“分泌的神经胚素多肽”是指待分泌的多肽而不是已分泌的多肽。所述分泌的神经胚素多肽不含神经胚素原-区。
功能性的神经胚素原结构域是位于信号肽和成熟肽之间的肽，所述原肽可在切割信号肽后用弗林蛋白酶从成熟肽切割。
生物活性二聚化时与GFRα3一起结合RET并诱导RET二聚化及自身磷酸化的能力。用Kira Elisa或RET L3 Elisa试验测量。
“异源的”当用于核酸序列或氨基酸序列时，是指来源于与特定宿主细胞不同来源的序列，或者，如果来自同样的宿主细胞，则是对其原始形式修饰得到的。
异源的信号肽 非天然地可操作地连接于神经胚素多肽的信号肽。
发明详述本发明涉及一种用于制备神经胚素多肽的方法，其中编码神经胚素多肽的核苷酸序列不编码原-区。本申请中原-区至少包括SEQ ID NO.10，11或12中的第-41至-11位氨基酸。更优选地，所述原-区包括至少SEQ IDNO.10，11或12中任一序列中的第-41至-1位氨基酸。更优选地，所述原-区包括至少SEQ ID NO.10，11或12中任一序列中的第-41至10位氨基酸。最优选地，其含有所述序列的原-结构域，相当于SEQ ID NO10中的-41至27位氨基酸，或者SEQ ID NO11或SEQ ID NO12中的-41至31位氨基酸。
信号肽本发明所述的表达载体包含含有启动子序列的核酸，该启动子序列能够指导编码可操作地连接有信号肽的神经胚素多肽的的核苷酸序列的表达，其中所述的核苷酸序列不编码神经胚素多肽的原-区。
在分泌过程中，所述神经胚素前-蛋白的信号肽被产生神经胚素多肽的宿主细胞所切割。尽管所述切割位点通常是确定的，但是本领域技术人员应该知道信号肽切割位点是可以变动的。因此，有关确切切割位点不确定的实施方案也在本发明的范围之内。
所述信号肽可以是任一功能性的信号肽，例如异源的信号肽，例如哺乳动物信号肽。所述信号肽可以来自任一合适物种的，例如人，小鼠，大鼠，猴子，猪，狗，猫，牛或马。
所述信号肽连接于神经胚素多肽，并且优选直接地融合于所述神经胚素多肽，例如所述信号肽的C-末端与神经胚素多肽的N-末端融合。
正如所附实施例证实的那样，该信号肽的使用通常可使体外和体内神经胚素的分泌增加。该结果利用慢病毒-转导的细胞(体内和体外)和质粒转染的细胞(体外)都能再现。当所述信号肽基因被直接融合于成熟蛋白质的编码基因时，所述细胞能够制备出具有生物学活性的成熟蛋白质(即，不含有原-区部分)。
本发明人发现不仅天然的神经胚素信号肽可用作信号肽，而且异源的信号肽也可以使用，并且往往提供比天然信号肽更高的产量。所述异源的信号肽可以选自生长因子信号肽、激素信号肽、细胞因子信号肽和免疫球蛋白信号肽组成的组。
因此，信号肽的实例是选自以下信号肽组成的组的信号肽TGFβ信号肽、GDF信号肽、IGF信号肽、BMP信号肽、神经营养因子信号肽、PDGF信号肽和EGF信号肽的信号肽，选自激素信号肽的信号肽，所述激素选自生长激素、胰岛素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH、T3、T4、和DHEA组成的组，或者白细胞介素信号肽。
一个实施方案中，所述信号肽选自neurturin信号肽、GDNF信号肽、persephin信号肽和NGF信号肽组成的组。
另一个实施方案中，所述信号肽选自白蛋白信号肽、经修饰的白蛋白信号肽和生长激素信号肽组成的组，诸如选自大鼠白蛋白信号肽、经修饰的大鼠白蛋白信号肽和人生长激素信号肽的信号肽组成的组，例如大鼠白蛋白信号肽和人生长激素信号肽。
因此，一些实施方案中，所述分泌的神经胚素多肽融合于天然的大鼠白蛋白信号肽。这种融合蛋白的实例为SEQ ID NO66。其他实施方案中，所述分泌的神经胚素多肽连接于经修饰的大鼠白蛋白信号序列。这种融合蛋白的实例为SEQ ID NO70。其他实施方案中，所述分泌的神经胚素多肽融合于人生长激素的信号序列。这种融合蛋白的实例为SEQ IDNO68。
还有另一个实施方案中，所述信号肽是免疫球蛋白信号肽，诸如免疫球蛋白重链信号肽。具体而言，免疫球蛋白信号肽可以是选自小鼠IgSP(SEQ ID NO 4)、大鼠IgSP(SEQ ID NO 6)、猪IgSP(SEQ ID NO 5)、猿IgSP(SEQ ID NO 2 or 3)、人IgSP(SEQ ID NO 1)组成的组的信号肽，诸如小鼠IgSP(SEQ ID NO 4)或人IgSP(SEQ ID NO 1)。
免疫球蛋白信号肽(IgSP)是已知见于许多哺乳动物的19个氨基酸的小肽。源自人、猕猴、狨(marmoset)、大鼠、小鼠和猪的该序列的比对结果图示于图1。与人IgSP相比的序列同一性百分比差别很大，从21％(猪)-68％(狨)。这种相当大的差别表明该特异性序列可以在很大程度上变动而基本上并不改变所述信号肽的生物学功能。另外还发现了种间存在的交叉反应性，如所附实施例所证实的那样。用在大鼠(体内试验)和人细胞(ARPE-19细胞)中具有功能的小鼠IgSP进行了这些试验。
优选地，所述IgSP是小鼠或人来源的，因为已知小鼠IgSP能够在小鼠、大鼠和人体内发挥作用。就应用于人类而言，所述IgSP优选来源于人类，这是为了减少任何种间交叉副作用的风险。
另一个实施方案中，所述信号肽是天然的神经胚素信号肽，例如天然的人神经胚素信号肽。在本申请中，将天然神经胚素信号肽和神经胚素多肽的后一种构建体称为delta-原(pro)神经胚素。
还有另一个实施方案中，所述信号肽是一种合成的信号肽，例如所述信号肽具有SEQ ID NO 62的氨基酸序列AA1-AA38位。(MetSerTrpAlaTrpAlaAlaCysProProCysProThrAlaLeuGlyLeuGlyGlySerAlaLeuTrpProThr-LeuAlaAlaLeuAlaLeuLeuSerSerValAlaGluAla)
神经胚素神经胚素多肽是具有下列功效的蛋白质促进神经元细胞及组织的存活，维持神经元细胞及组织的表型分化，阻止神经元细胞及组织的变性，促进神经元细胞及组织的再生，以及恢复神经元细胞及组织的活性。神经胚素(最早的描述，例如，见WO00/01815)另外还被称为″artemin″(参见，例如，WO00/18799)和″enovin″(参见，例如，WO00/04050)。
神经胚素已经分类为TGF-β超家族的关系胶原的成员(Massague，et al，.1994，Trends in Cell Biology，4172-178)，是胶质细胞系-来源的神经营养性因子配体家族(“GDNF”；WO93/06116)的成员，在该家族中包括GDNF、persephin(“PSP”；Milbrandt et al.，1998，Neuron 20245253)和neurturin(″NTN″；WO 97/08196)。GDNF亚家族的配体都能通过RET受体酪氨酸激酶诱导信号传导。GDNF亚家族的这3种配体与神经营养性受体-GFR[α]受体家族的相对亲和力不同。优选地，神经胚素通过GFR[α]3-RET复合体发挥作用。Baudet et al.，Development，127，pp.4335-44(2000)；Baloh et al.，Neuron，21，pp.1291-1302(1998)；Airaksinen et al.，Mol.Cell.Neuroscience，13，pp.313-325(1999)。
神经胚素(SEQ ID NO10)与GDNF亚家族成员Neurturin、Persephin和GDNF之间氨基酸序列比较结果显示于表1。可用于本发明的神经胚素多肽优选具有GDNF亚家族指纹(fingerprint)，即表1中下划线部分的氨基酸残基。
表1神经胚素与Persephin、Neurturin和GDNF之间的氨基酸序列比较————————————Neurturin-全长 --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA神经胚素MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-全长---------------------------GDNF_人-全长-----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-全长LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR神经胚素VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-全长-MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPLGDNF_人-全长NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-全长RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLRR神经胚素SRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLASPersephin-全长ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF_人-全长RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN** :* ****::.*:**:*:*:* * ::*Neurturin-全长LRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDE+VSFLDAHSRYHTVHELSARECACV-
神经胚素LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGPersephin-全长LQGQGRAHGG--------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF_人-全长LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI-* .****: ::*:*.:::.** *.*——————————*代表具有单个完全保守的残基的位置。表示下列“强的”基团之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW.
.表示下列“较弱的”基团之一是完全保守的-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY.
从表1显示的氨基酸序列比对方式可以看出，神经胚素具有7个在TGF-[β]超家族中保守的半胱氨酸残基。基于该序列的比对，神经胚素被证明是神经营养性因子的GDNF亚家族的成员(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，GDNF亚家族指纹，表1中的下划线部分)。
本申请中使用的神经胚素多肽可以任一生物活性形式提供，包括前-蛋白形式、成熟的蛋白质、糖基化的蛋白质、磷酸化蛋白质、截短的形式或者任一其他翻译修饰的蛋白质。已知对于每一NBN变体而言生物活性的神经胚素都是二聚形式的，这是因为二聚体的形成是活性需要的。单体NBN多肽几乎甚至根本没有活性。生物活性的神经胚素多肽包括二聚多肽，该多肽在辅助因子(例如GFR[α]3或RET)存在情况下能够与GFR[α]3或者与GFR[α]3和RET的复合体结合，诱导RET二聚化及RET的自身磷酸化。因此，在本申请中，“神经胚素多肽”是一种具有神经营养活性的多肽(例如，描述见WO 00/01815)。
用本发明所述方法制备的神经胚素多肽具有天然神经胚素的至少一种生物活性。为本发明目的的生物活性可以用任一合适的方法测定。生物学活性的神经胚素多肽是具有下述特征的多肽其二聚化时，能够与GFRα3一起结合至RET并诱导RET二聚化及自身磷酸化。(参见，例如，Sanicola et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，946238)。测定受体结合及受体自身磷酸化的任一方法都可用于测评用本发明所述方法制备的神经胚素多肽的生物活性。例如，实施例17中描述的KIRA测定(ELISA)可用于测评神经胚素的生物活性。(还参见，Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，235(2)207)。
神经胚素的生物活性形式还可以使用实施例1描述的RetL3 ELISA试验进行检测。无生物学功能的神经胚素不能用RetL3 ELISA试验检测。
下列全长的序列表示带有野生型信号肽的野生型前-原-神经胚素。当在哺乳动物细胞内进行转导或转染时，得到的成熟神经胚素只有极少量是分泌型的。人、小鼠和大鼠神经胚素的天然信号肽由开头的39个氨基酸表示。
SEQ ID NO10中的--AA-80-AA140(″野生型″人前原形式)，SEQ ID NO11中的--AA-80-AA144(小鼠前原形式)，SEQ ID NO12中的--AA-80-AA144(大鼠前原形式)，本发明所述的分泌的神经胚素多肽可以长度各不相同。尽管成熟的人神经胚素多肽通常由前原神经胚素的C末端113个氨基酸组成，但是这113个氨基酸并非都是获得有用的神经胚素生物活性所必需的。氨基末端的截短是可允许的。因此，所述分泌的神经胚素多肽对应于天然人神经胚素C末端的99-113个氨基酸，即，它的长度可以是99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112或113个氨基酸。分泌的神经胚素多肽的确切长度的选定是一种设计选择，这是本领域技术人员能够操作的。分泌的人神经胚素多肽由人神经胚素C末端104个氨基酸组成，举例说明于下文提供的工作(working)实施例中。除了长度的变化之外，所述分泌的人神经胚素多肽还可以在序列上有所不同。
下列″野生型″神经胚素氨基酸(″aa″或″AA″)序列是那些可用于本发明所述方法和组合物序列的范例--SEQ ID NO10中的AA1-AA140(成熟的140AA；下文称为″140NBN″)，--SEQ ID NO10中的AA25-AA140(成熟的116AA；下文称为″116NBN″)，--SEQ ID NO10中的AA28-AA140of SEQ ID NO10(成熟的113AA(SEQ ID No.14)；下文称为″113NBN″)，--SEQ ID NO11中的AA1-AA144(小鼠成熟144AA)，--SEQ ID NO12中的AA1-AA144of SEQ ID NO12(大鼠成熟--144AA)，--肽，其具有SEQ ID No.10中AA107-AA140所示C-末端序列，更优选具有SEQ ID No.10中AA76-AA140所示序列的肽，并保留了GDNF家族和TGF-β超家族的7个特征性Cys残基。
一个实施方案中，优选的神经胚素多肽含有(7个)保守的半胱氨酸，如SEQ ID NO.10中第43，70，74，107，108，136和138位所示。已知TGF-超家族中的这7个保守半胱氨酸残基形成了3个单体内二硫键(例如，SEQID NO.10中43-108，70-136和74-138位半胱氨酸残基之间形成的二硫键)和1个单体间二硫键(例如，SEQ ID NO.10中107-107位半胱氨酸残基之间形成的二硫键)，它们与延伸的β链区域一起形成了TGF-[β]超家族的保守结构基序。参见，例如，Daopin et al.，Proteins 1993，17176-192。
优选地，所述神经胚素多肽是野生型蛋白质的一种成熟形式。目前认为对于经基因修饰的哺乳动物细胞中的高水平分泌来说，原-区的缺失是很重要的。
可用于本发明的神经胚素多肽还包括全长神经胚素分子的截短形式。在所述截短的分子中，从N-末端或C-末端优选从N-末端缺失一个或多个氨基酸。所述截短的神经胚素多肽可以通过下述方式获得提供成熟的神经胚素多肽，在足以能制备截短型神经胚素多肽的条件下让该成熟神经胚素多肽与至少一种蛋白酶接触。优选地，至少一种蛋白酶是外切蛋白酶(exoprotease)，接触成熟神经胚素多肽能形成外切肽酶(exopeptidase)神经胚素多肽消化产物，该产物可以被二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)进一步消化。更优选地，根据本发明，表达载体编码的蛋白质是截短的形式，无需再进一步加工。
本申请所述的截短的神经胚素多肽包括包含在成熟神经胚素序列中保守的7个半胱氨酸残基的多肽序列。一些优选的实施方案中，所述截短的神经胚素多肽包括成熟113NBN神经胚素多肽中的至少85个羧基末端氨基酸。更优选的实施方案中，所述截短的神经胚素多肽包括成熟人113NBN中的至少98个羧基末端氨基酸。
一种截短的形式包括成熟神经胚素的7个半胱氨酸残基中从第一个到最后一个的97个氨基酸。其对应于SEQ ID No 20的氨基酸2-97。
神经胚素的其他变体包括截短的NBN形式。这些截短形式的实例包括(i)本申请中命名为NBN 112的112AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的112个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的29-140位氨基酸。
(ii)本申请中命名为NBN111的111AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的111个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的30-140位氨基酸。
(iii)本申请中命名为NBN110的110AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的110个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的31-140位氨基酸。
(iv)本申请中命名为NBN109的109AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的109个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的32-140位氨基酸。
(v)本申请中命名为NBN108的108AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的108个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的33-140位氨基酸。
(vi)本申请中命名为NBN107AA的107AAAA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的107个氨基酸，例如SEQ ID NO.10中的34-140位氨基酸。
(vi)本申请中命名为NBN106的106AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的106个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的35-140位氨基酸。
(viii)本申请中命名为NBN105的105AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的105个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的36-140位氨基酸。
(ix)本申请中命名为NBN104的104AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的104个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的37-140位氨基酸。(也如SEQ ID No.19所示)。
(x)本申请中命名为NBN103的103AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的103个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的38-140位氨基酸。
(xi)本申请中命名为NBN 102的102AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的102个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的39-140位氨基酸。
(xii)本申请中命名为NBN101的101AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的101个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的40-140位氨基酸。
(xiii)本申请中命名为NBN100的100AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的100个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的41-140位氨基酸。
(xiv)本申请中命名为NBN99的99AA多肽序列，其具有成熟神经胚素多肽羧基末端的99个氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的42-140位氨基酸(也如SEQ ID No.20所示)。
很显然本申请中公开的神经胚素截短形式(例如，从99AA到112AA的形式)具有神经营养活性。
在最优选的实施方案中，所述截短的神经胚素多肽是成熟113AA神经胚素多肽的99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa羧基末端氨基酸(即，分别相应命名为NBN99，NBN100，NBN101，NBN102，NBN103，NBN104，NBN105，NBN106，NBN107，NBN108，NBN109，NBN110，NBN111或NBN112)。所述序列还可以发现于小鼠和大鼠神经胚素多肽中，分别为SEQ ID No.11和12中羧基末端的99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa or 112aa。这些截短的NBN形式的最优选实例具有生物活性(称为″生物活性的截短神经胚素多肽″)，因为已经证实其具有神经营养活性。如上所述，NBN二聚化是生物活性所必需的，这是因为对于NBN单体多肽，几乎甚至根本没有观察到活性。
小鼠和大鼠神经胚素的截短形式也在本发明范围之内。这些截短形式可以由SEQ ID No 16(小鼠)C-末端的99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，或116个氨基酸组成，或者它们可以由SEQ ID No 18(大鼠)C-末端的99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111或112个氨基酸组成。
因此，本发明包括选自成熟的NBN、N-末端截短的NBN、突变的NBN或者突变且N-截短的NBN的神经胚素多肽，所述成熟NBN选自具有SEQID No 10的1-140位氨基酸或SEQ ID No 11或12的1-144位氨基酸，SEQID NO 13、14、15、16、17或18所示序列的神经胚素组成的组，例如，选自具有SEQ ID NO 13、14、15、16、17或18所示序列的神经胚素的成熟NBN，更具体而言为选自具有SEQ ID NO 10的106、104，102或99个C-末端氨基酸的N-末端截短神经胚素的神经胚素多肽或者选自人神经胚素的116个C-末端氨基酸、人神经胚素的113个C-末端氨基酸、人神经胚素的104个C-末端氨基酸和人神经胚素的116个C-末端氨基酸组成的组的神经胚素多肽，具有SEQ ID NO 19所示氨基酸序列的神经胚素多肽，或者含有SEQ ID NO 20所示99个氨基酸的神经胚素多肽。
可用于本发明的NBN还包括那些具有与上述各种前原-、前-、成熟的和截短的″神经胚素″多肽基本上类似或相同的氨基酸序列的NBN多肽。优选地，使用的神经胚素多肽与SEQ ID NO.10-23所示神经胚素多肽的成熟肽具有至少70％，更优选85％，甚至更优选90％，或者甚至进一步优选95％的同一性或相似性。最优选，使用的神经胚素多肽与SEQ ID NO.10-23所示神经胚素多肽的成熟肽之间具有至少99％相似性或同一性。
候选多肽与本发明神经胚素多肽之间的同源性程度可以确定为这两氨基酸序列之间的相似性或同一性程度。
高水平的序列同一性表明第一序列可能源自于第二序列。氨基酸序列同一要求两个被比对的序列之间具有相同的氨基酸序列。因此，与参考序列之间具有70％氨基酸同一性的候选序列要求，在比对后该候选序列中70％的氨基酸等同于该参考序列中的相应氨基酸。同一性可以用电脑分析测定，例如，但不限于，ClustalX电脑比对程序(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，& Higgins DG″The ClustalX windows interfaceflexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysistools″；Nucleic Acids Res.1997，25(24)4876-82)，和本申请中推荐的缺省参数(default parameters)。使用该程序，本发明的类似DNA序列编码的多肽的成熟部分显示与本申请中SEQ ID NO10(人NBN)、SEQ ID NOS11和12(啮齿动物NBN)所示氨基酸序列之间具有至少70％，更优选85％，更优选90％，或者更优选95％，最优选至少99％的同一性程度。
其他的比对工具也已知，例如Needleman et al.，J.Mol.Biol.48443(1970)中描述的动态编程算法(dynamic programming algorithm)，和DNAstar，Inc.制作的商品化的软件包Align Program，其中的教导在本申请中引入作为参考。候选序列和参考序列之间的比对一旦进行并改进，就可以计算出同源性百分比的得分。每一序列的各个氨基酸根据它们彼此间的相似性依次进行比较。
相似性因子包括相似的大小、形状及电荷。一种特别优选的测定氨基酸相似性的方法是PAM250矩阵法，描述见Dayhoff et al.，Atlas of proteinsequence and structure 345-352(1978 &上述)，在此引入作为参考。首先，计算相似性得分，其为比对的成对氨基酸相似性得分的和。为了同源性和同一性百分比的目的，可以把插入及缺失忽略不计。因此，缺口罚分(gap penalties)不能用于这种计算。
然后，用原始得分除以候选化合物和神经胚素多肽的7个半胱氨酸骨架的得分的几何平均数，使原始得分标准化。该几何平均数是这些得分的乘积的平方根。标准化的原始得分即为同源性百分比。
如上所述，本发明所述神经胚素多肽包括变体多肽。在本申请中，术语″变体多肽″包括具有下述氨基酸序列的多肽(或者蛋白质)其在一个或多个氨基酸位置上不同于部分SEQ ID NO.10，13，14，19，20，21，22或23(人NBN)，或者SEQ ID No.11，12，15-18(啮齿类NBN)中所示的成熟肽。所述变体多肽包括上述的经修饰的多肽，以及保守取代、拼接变体、同种型、来自其他物种的同系物，和多态性。
如本申请中定义的那样，术语″保守取代″表示一个氨基酸残基被另一个生物学上类似的残基所取代。通常，生物学相似性，如上所述，反映了具有保守氨基酸的野生型序列上的取代。
对神经胚素多肽序列中的氨基酸的取代可以选自该氨基酸所属类别的其他成员(参见表1)。另外，各种氨基酸通常可以被中性氨基酸取代，所述中性氨基酸例如，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。(参见，例如，MacLennan et al.，1998，ActaPhysiol.Scand.Suppl.，64355-67；Sasaki et al.，1998，Adv.Biophys.，351-24)。多重取代也在本发明的范围之内；但是，本发明的神经胚素多肽都必须具有如下文C部分所述的天然神经胚素的至少一种活性，参见下表
例如，本领域技术人员期望保守的氨基酸取代对生物活性几乎或根本没有任何影响，特别是当保守性取代少于多肽或蛋白质残基总数的10％时。优选地，保守的氨基酸取代是少于多肽或蛋白质5％，最优选少于多肽或蛋白质的2％中发生变化。
一个实施方案中，所述神经胚素多肽含有至多15个氨基酸的取代，例如至多12个氨基酸的取代，例如至多10个氨基酸的取代，例如至多8个氨基酸的取代，例如至多5个氨基酸的取代。例如当用例如人113NBN计算时，最优选的保守取代表示在野生型成熟氨基酸序列中少于3个氨基酸的取代。一个特别优选的实施方案中，成熟序列中只有单个氨基酸取代，其中被取代的和取代氨基酸都是非-环状的。具体而言，保守取代的其他实例包括一个疏水残基对另一个疏水残基的取代，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或者一个极性残基对另一个极性残基的取代，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或者谷氨酰胺取代天冬酰胺，等。
术语保守取代还包括用取代的氨基酸残基代替未-取代的亲代氨基酸残基，只要用取代的多肽激发的抗体与未-取代的多肽之间也发生免疫反应即可。
对该初始氨基酸序列的修饰可得到这样的蛋白质，其具有与未经修饰的相多肽基本等同的活性，因而可以认为其为亲代蛋白质的功能性类似物。所述修饰可以是有意实现的，例如，通过定点诱变，或者它们可以是天然生成的，包括拼接变体、同种型、其他物种的同系物，和多态性。所述功能性类似物也在本发明范围之内。
来自人、小鼠和大鼠的99个C-末端氨基酸的比对显示如下
CLUSTAL W(1.82)多序列比对％ ％小鼠GCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRFRFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSR大鼠GCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLDAGALRSPPGSR人GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSR*********************:************************.*****.*****％小鼠PISQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG大鼠 PISQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG人 PVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG*:**************************:**********取代优选在标记为“无星号”、“.”或者“”的非-保守位置进行。
其他优选的取代位置用“％”标示。
此外，初始氨基酸序列的修饰还可得到这样的蛋白质，其不再保留亲代蛋白质的生物活性，包括占主导地位的阴性形式等。占主导地位的阴性蛋白质可以通过下述方式干扰野生型蛋白质结合或者鳌合通常与该多肽在功能上相互作用的调节剂，诸如上游或下游组分。这类占主导地位的阴性形式也在本发明的范围之内。
截短的神经胚素的生物学活性形式公开于WO02/072826(NsGene和Biogen)。截短的及突变的神经胚素分子还可见于WO02/060929(Biogen)，特别是其中含有源自SEQ ID No14中8-113位氨基酸的氨基酸序列的突变的神经胚素，其中所述的变体神经胚素多肽包含一个或多个选自下组的氨基酸取代位于该变体多肽氨基酸序列中第14位的除精氨酸以外的氨基酸，位于该变体多肽氨基酸序列中第39位的除精氨酸以外的氨基酸，位于该变体多肽氨基酸序列中第68位的除精氨酸以外的氨基酸，和位于该变体多肽氨基酸序列中第95位的除天冬酰胺以外的氨基酸，例如为赖氨酸残基，其中所述的氨基酸位置根据SEQ ID NO10多肽序列进行编号。所述突变形式可以是如上所述的截短的形式，或者包含全长的成熟蛋白质(SEQID NO 14中1-113位氨基酸)。优选地，第14、39或68位的氨基酸为赖氨酸。
信号肽的切割在确定将被掺入表达构建体的特定神经胚素形式之前，可以使用现有技术中的预测工具验证切割信号肽诸如Igsp的可能性。一种优选的这类预测工具是SignalP软件，该软件可获自SignalP WWW服务站点(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)，或者优选从相同服务站点获得的新的3.0版本(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/).
SignalP WWW server为你的序列的每一个位置反馈3个得分C-得分(未加工的切割位点得分)受训以识别切割位点相对于其他序列位置网络(networks trained)的输出得分。其经训练为
高 在+1位(即紧接于切割位点之后)低 在所有其他位置。
S-得分(信号肽得分)受训以识别切割位点相对于其他序列位置网络(networks trained)的输出得分。其经训练为高 切割位点之前的所有位置在切割位点后第30位和非-分泌的低蛋白质的N-末端中。
Y-得分(联合的切割位点得分)切割位点定位的预测可以通过下述方式进行优化观察在何处C-得分高且S-得分从高到低值变化。通过将C-得分与S-得分的斜率合并，用Y-得分将其格式化。
具体而言，Y-得分是C-得分和S-得分的平稳导数(smoothed derivative)的几何平均数(即，当前位置之前的d位和之后的d位上的S-得分平均值之间的差，其中d随所选择网络整体不同而不同)。
所有这3个得分都是用不同部分数据训练的5个网络的平均值。
对每一序列而言，SignalP报告最大的C-得分、S-得分和Y-得分，以及N-末端与预定切割位点的平均S-得分。这些数值可用于区分信号肽和非-信号肽。如果你的序列预先确定具有信号肽，那么所述切割位点可以推测为最大Y-得分位置的前一位。
对于常见的信号肽而言，所述C-和Y-得分在+1位最高，尽管S-得分在切割位点之前较高而在切割位点之后较低。
为了进行比较，可以将推测结果与野生型神经胚素信号肽预定切割位置(在前-原-NBN的39位和40位氨基酸之间切割)进行比较。
优选地，在SignalP-NN或SignalP-HMM程序中，所述神经胚素在信号肽和神经胚素之间都具有预定切割位点。这样的神经胚素包括但不限于NBN113，NBN106，NBN104，NBN102和NBN99。特别优选这样的神经胚素，其在SignalP-NN和SignalP-HMM在这两个程序中，该位置上都有推定的信号肽。这样的神经胚素包括NBN113和NBN99。
新的版本(3.0)还包含新的用于描述“signal peptidedness”的得分D或Dmax(区别得分(signal peptidedness))，″signal peptidedness″与使用所述信号肽时所查询蛋白质的分泌水平相关。
利用所选神经胚素多肽，本发明使用的信号肽优选显示至少0.5的Dmax值，例如至少0.6，例如至少0.7，例如至少0.8。
参考文献Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Sren Brunak and Gunnarvon HeijneIdentification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites.Protein Engineering，10，1-6(1997)。关于SignalP-HMM输出模型Henrik Nielsen and Anders KroghPrediction ofsignal peptides and signal anchors by a hidden Markov model.In Proceedings ofthe Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB 6)，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122-130(1998)。改进的信号肽预测-SignalP 3.0.Jannick Dyrlv Bendtsen，Henrik Nielsen，Gunnar vonHeijne and Sren Brunak.JMB(2004)。Prediction of signal peptides and signalanchors by a hidden Markov model.Henrik Nielsen and Anders Krogh.Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology(ISMB 6)，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122-130，1998.
医学用途和治疗方法在一个方面，本发明涉及本发明所述载体用于制备用于治疗神经系统疾病的药物的用途。所述神经系统疾病可以是一种周围神经系或中枢神经系统的疾病。
神经胚素可用于治疗神经元缺陷，包括但不限于病变神经元和受损伤的神经元。受到创伤的外周神经包括，但不限于，延髓(medulla)或脊髓(spinal cord)的神经。神经胚素可用于治疗CNS疾病，例如神经变性疾病，例如，大脑缺血性神经损伤(cerebral ischaemic neuronal damage)；神经病，例如周围神经病变，阿耳茨海默病，亨延顿舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。神经胚素进一步还可用于治疗记忆减弱，例如与痴呆有关的记忆减弱。
神经胚素还可作为治疗外周神经疾病的治疗候选物，例如哺乳动物的神经病性疼痛(神经病性疼痛)。所述神经病性疼痛可能与下列状况相关毒素-诱导的神经损伤，病原体-诱导的神经损伤，创伤-诱导的神经损伤，药物-诱导的神经损伤，特发神经病，糖尿病性神经病，炎症-诱导的神经损伤，或神经变性(neurodegeneration)。神经胚素还可以用于治疗哺乳动物中的外周神经病。所述外周神经病包括创伤-诱导的神经损伤，病毒-诱导的神经损伤，化疗-诱导的神经损伤，毒素-诱导的神经损伤药物-诱导的神经损伤，维生素缺乏-诱导的神经损伤；特发神经病；和糖尿病性神经病。使用神经胚素治疗神经病性疼痛的方法和组合物公开于WO 02/078730(Biogen)。
优选地，神经胚素用于治疗选自下组的疾病外周神经病包括神经病性疼痛，脊髓损伤，脊神经根性撕脱伤(spinal root avulsion)，三叉神经痛(ticdoloreaux)，灼痛(causalgia)，角膜损伤和视网膜病变。
根据本发明的一个优选实施方案，所治疗的神经变性疾病是帕金森氏病。现已知神经胚素可提高多巴胺能神经元的存活(WO 00/01815 NsGene；Baloh et al 1998 Neuron 211291-1302).
本发明所述的载体、胶囊和组合物还可以用于治疗眼部疾病，例如色素性视网膜炎、黄斑病变，青光眼，和糖尿病性视网膜病变。神经胚素还可用于治疗角膜创口和溃疡(EP 1223 966 Biopharm).
可以通过下述方式治疗神经系统疾病向需要其的个体施用治疗有效量的本发明所述载体或者治疗有效量的本发明所述药物组合物。
另外，本发明还为将要裸露或包封的移植细胞转导至或移植入其中的脑部分提供了立体定位坐标(表II)
表II
在上表中所述中央-外侧维数相对于脑的中线；前-后维数相对于前连合和后连合之间的中点，负数代表向后方向；背-腹维数相对于前联合与后联合中点之间的连线，负数为这条连线的腹侧；所有尺寸都以厘米表示；Gpe是指苍白球的外节段；Gpi代表苍白球的内节段；Snr代表黑质网状部；STN代表底丘脑核；NBM代表迈耐特(meynert)基底核；以及尾代表尾状核。
神经系统疾病可以通过将以下物质移植到需要的个体而不是体内转导来治疗i.治疗有效量的本发明所述经转导或转染的细胞；或ii.其中含有经转导或转染的细胞的可植入装置。
优选地所述移植包括细胞或可植入装置。
所述移植可以包括自体移植、同种异体移植或异种移植。
治疗中枢神经系统中神经变性疾病的靶组织重要的参数是选择合适的靶组织。根据其对神经营养性因子的反应来选择脑部区域。可以通过递送单位剂量的本申请所述基因治疗载体或者通过植入本发明所述的裸露或包封的细胞，实现区域的靶向。
在人类当中，能够保持对神经营养性因子的应答性直到成年的CNS神经元包括胆碱能基底前脑神经元，内嗅皮质神经元(the entorhinal corticalneurons)，丘脑神经，蓝斑核神经元，脊髓感觉神经元和脊髓运动神经元。
可以对患者进行初步初始扫描，例如MRI扫描，测定治疗位点的准确位置。例如，在帕金森氏病治疗中，基底神经节，包括黑质，是治疗位点。脑部受影响区的大小使得选择5个或更少的递送位点就足以恢复临床上显著数目的多巴胺能神经元。相同数目的递送位点可用于脑外部。
对于体内基因治疗而言，递送可以是全身的或局部的。对于全身递送，通过肌内、皮下或腹腔内施用基因治疗载体，从而使得神经胚素能够连续释放至循环系统。
对于体内基因治疗而言，特异性的体内基因递送位点被选择为适当能够在神经元或终端损失区域聚集。这类区域可以使用大量临床巳知技术确定，包括磁共振成象(MRI)和活组织检查。对于人而言，优选非侵入性的体内成象方法，例如MRI。一旦确定神经元终端损失的区域，选择立体分布的递送位点，使得每一单位剂量的神经胚素都被递送入脑或脊髓中的其靶细胞处或距靶细胞500μm或500μm以内，且与另一递送位点的距离不超过10mm。对于脑内，基因治疗载体可以施用至脑实质和脑室。
在眼内，基因治疗载体可以施用至玻璃体，视网膜下隙和支持包囊(sub-tenar capsule)。
对于周围神经病包括神经病性疼痛的治疗而言，所述基因治疗载体可以施用至参与痛觉传输的身体区域。该区域可以包括脊髓和经鞘内施用。
一个实施方案中，所述载体通过肌内、皮下、或腹腔内注射施用。另一个实施方案中，将所述载体或组合物施用至参与痛觉传输的身体区域。第三个实施方案中，将所述载体或组合物鞘内施用或者施用至脊髓。第四种实施方案，所述载体施用至脑，包括实质和脑室。第五种实施方案，所述载体施用入眼，包括玻璃体，视网膜下隙，和支持包囊。
体内基因治疗用的剂量要求和递送方式另外一个重要的参数是被递送入靶组织的神经胚素的剂量。在这点上，″单位剂量″通常是指每毫升神经胚素组合物中的神经胚素浓度。对于病毒载体而言，神经胚素浓度定义为每毫升神经营养组合物中的病毒颗粒数目。最佳地，对于使用病毒表达载体递送神经胚素而言，每单位剂量的神经胚素包含2.5-25μl的神经胚素组合物，其中所述的组合物含有置于药物学可接受液体中的病毒表达载体，每毫升神经胚素组合物可提供1010-1015个含神经胚素的病毒颗粒。这样高的滴度尤其可使用腺伴随病毒。对慢病毒而言，所述滴度通常较低，例如108-1010转导单位每毫升(TU/ml)，见实施例2所述测定。
所述神经胚素组合物通过下列方式递送至靶组织中每一递送细胞位点微注射、输注、划痕加载(scrape loading)、电穿孔或适合通过外科切口将所述组合物直接递送入递送位点组织的其他方式。所述递送要慢慢地完成，例如在约5-10分钟的时段内(取决于被递送神经胚素组合物的总体积)。
本领域技术人员应该清楚本发明使用的直接递送方法消除了与体内基因治疗有关的限制性危险因素；即，携带编码神经胚素的转基因的载体转导非-靶细胞的可能性。本发明中，递送是直接进行的，递送位点是经过选择的，使得分泌的神经胚素的扩散只发生于对照的和预定的脑部区域以使得与靶神经元的接触最优化，同时最小化与非-靶细胞的接触。
基因治疗载体广义地说，基因治疗就是设法将新的遗传物质传递至患者的细胞从而获得对该患者有益的治疗效果。这种有益效果包括治疗或预防多种疾病、疾病及其他状况。
体外基因疗法包括对分离的细胞进行修饰，然后将其注入、嫁接(graft)或移植入患者体内。参见，例如，美国专利Nos.4,868,116，5,399,346和5,460,959。体内基因疗法意图在体内直接靶向宿主患者的靶组织。
可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒(papovavirus)、腺病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和反转录病毒。合适的反转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV组成的组。
用于治疗神经系统疾病的病毒优选为慢病毒和腺伴随病毒。这两种类型的病毒都能整合入基因组而无细胞分裂的，而且在临床前动物试验中已经检测了这两种类型病毒引起的神经系统症状，特别是中枢神经系统症状。
现有技术中已经公开了制备AAV的方法，例如，US 5,677,158.US6,309,634和US 6,683,058公开了将AAV递送至中枢神经系统的实例。
特定及优选的反转录病毒类型包括能够转导细胞并且在不导致细胞分裂情况下整合入其基因组的慢病毒。因此，优选地所述载体是复制-缺陷慢病毒颗粒。所述慢病毒颗粒可以由含下列元件的慢病毒载体制备5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接于编码融合蛋白多核苷酸信号的启动子、第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR。在体内制备慢病毒及施用至神经细胞的方法公开于US20020037281(使用慢病毒载体转导神经细胞的方法)。
反转录病毒载体是人临床试验最常用的载体，因为它们可携带7-8kb，大于许多其他病毒载体，而且因为它们能够侵染细胞，并能将其遗传物质高效稳定地整合入宿主细胞。参见，例如，，WO 95/30761；WO 95/24929。致肿瘤病毒亚科病毒(oncovirinae)需要至少一个靶细胞增殖循环，才能将外源核酸序列传递并整合入患者。反转录病毒载体随机整合入患者基因组。
现已经公开了两种类型的反转录病毒颗粒能有效侵染小鼠细胞的亲嗜性(ecotropic)反转录病毒和能有效侵染多种细胞的兼嗜性(amphotrophic)反转录病毒。第三类包括能侵染除产生该病毒的物种之外的另一物种的异嗜性反转录病毒。它们只能整合入正在分裂细胞的基因组，它们的这种能力使得反转录病毒对于标记发育试验用的标记细胞系以及递送治疗或自杀基因至癌或肿瘤而言很有吸引力。这些载体特别适合用于中枢神经系统，因为成年患者的中枢神经系统相对缺少细胞分裂。
对于人类患者中的应用而言，所述反转录病毒载体必须是复制缺陷性的。这就阻止了侵染性反转录病毒颗粒在靶组织中的继续生成，相反所述复制缺陷性载体成为可稳定地掺入靶细胞基因组的“俘获”转基因。通常，在复制缺陷性载体中，gag、env和pol基因已经被缺失(随病毒基因组其余的大部分一起)。异源DNA插入取代缺失病毒基因。可以将所述异源基因置于内源的异源启动子(另一种异源启动子在靶细胞中有活性)调控之下，或者反转录病毒5′LTR(所述病毒LTR在各种组织中都是有活性的)的控制下。通常，反转录病毒载体的转基因容量约7-8kb。
复制缺陷型反转录病毒载体需要提供从例如改造的包装细胞系反式复制及组装所需的病毒蛋白质。重要的是所述包装细胞不释放有复制能力的病毒和/或辅助病毒。这一点通过下述操作已经实现由缺乏ψ信号的RNAs表达病毒蛋白，并且从单独的转录单元表达gag/pol基因和env基因。此外，在一些包装细胞系中，5’LTR已经被调控这些基因表达的非-病毒启动子所取代并且添加了聚腺苷酸化信号。这些设计将最小化可复制型载体或辅助病毒产生的重组的可能性。参见，例如，美国专利No.4,861,719在此引入作为参考。
另外，本发明还涉及一种核酸构建体，其中含有编码神经胚素多肽的核酸序列和信号序列。所述信号肽和神经胚素多肽如上所述。因此，一些实施方案中，所述核酸构建体编码由前-原-神经胚素多肽C末端113个密码子组成的序列。一些实施方案中，所述核酸编码由前-原-神经胚素多肽C末端104个密码子组成的序列。
所述核酸序列可以包含异源的信号肽，例如白蛋白信号序列，例如，大鼠白蛋白信号序列，并且含有SEQ ID NO65所示核酸序列。一些实施方案中，所述核酸构建体编码经修饰的白蛋白信号序列，例如，大鼠白蛋白信号序列。一个示范性的实施方案是其中含有SEQ ID NO69的核酸构建体。其他实施方案中，所述核酸构建体编码人生长激素信号序列。一个示范性的实施方案是其中含有SEQ ID NO67的核酸构建体。所述人生长激素信号序列可以包含内含子。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述核酸构建体含有为了在转染的宿主细胞中表达而经过优化的核酸序列。通过提供增加的多肽产量或提高的转录或转染效率，密码子使用的优化可为有益的。本发明经优化核酸构建体的示范性的实施方案如SEQ ID NO59所示。
由于巳知的遗传密码子简并性，编码同一种氨基酸的密码子不止一种，因此DNA序列可以不同于SEQ ID NOS65、67或69所示序列，且分别仍编码SEQ ID NOS66、68或70所示的相应氨基酸序列。这类DNA序列变体可以源自沉默突变(例如发生于PCR扩增过程中)，或者可以是天然序列故意诱变(deliberate mutagenesis)例如密码子优化的产物。
所述核酸构建体可以是载体。合适的质粒载体的实例包括但不限于pFRT/lac Zeo，pFRT/dhfr-1，(Invitrogen，Carlsbad，CA)pUC，pGEM和pGEX(Pharmacia，Peapack，NJ)。其他合适的载体包括发挥同样功能的病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)。
表达载体表达载体可以包括可操作地连接于要表达的核酸序列的一个或多个调控序列。调控序列的实例包括启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。所述调控序列的描述见，例如，Goeddel，1990 Methods Enzymol.，1853。调控序列包括在多种类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的序列，以及仅在特定宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列(例如，组织-特异性调控序列)。本领域技术人员应该理解的是表达载体的设计取决于所转化宿主细胞的选择，目的蛋白表达水平等因素。可以将本发明所述表达载体导入宿主细胞从而制备蛋白质或肽。
用于重组表达本发明所用的神经胚素的载体的构建可以使用对于本领域普通技术人员来说无需详细说明的常规技术完成。但是，如需查看综述，本领域普通技术人员可以参阅Maniatis et al.，in Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(NY 1982)。
简而言之，重组表达载体的构建使用常规的连接技术。为了测试验证构建载体中的序列正确，可以使用连接混合物来转染/转导宿主细胞，然后通过合适的抗生素抗性筛选出成功地经基因改变的细胞。
从转染/转导后的细胞制备载体，通过限制性酶切分析，和/或通过例如，Messing，et al.(Nucleic Acids Res.，9309-，1981)中描述的方法，Maxam，et al.(Methods in Enzymology，65499，1980)中描述的方法，Sanger双脱氧法，或者本领域技术人员已知的其他合适方法进行测序。
使用常规的凝胶电泳方法实现切割片段的大小分离的描述参见，例如，Maniatis，et al.(Molecular Cloning，pp.133-134，1982).
本发明使用的表达元件在强度和特异性上各不相同。可以根据使用的宿主/载体系统，将任何多种合适的转录及翻译元件，包括组成型和可诱导型启动子，用于表达载体。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或者哺乳动物病毒(例如CMV启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的启动子；当制备含多拷贝表达产物的细胞系时，可以使用带有合适可筛选标记物的基于SV40-、BPV-及EBV-的载体。
在转录、翻译或者翻译后水平上控制基因的表达。转录启动是基因表达的早期且关键的事件。这取决于启动子及增强子序列，并受与这些序列相互作用的特异性细胞因子的影响。许多原核基因的转录单元由启动子以及在一些情况下还有增强子或调控元件组成(Banerji et al.，Cell 27299(1981)；Corden et al.，Science 2091406(1980)；and Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50349(1981))。对于反转录病毒而言，参与反转录病毒基因组复制的调控元件位于长末端重复序列(LTR)中(Weiss et al.，eds.，The molecular biology of tumor virusesRNA tumor viruses，Cold SpringHarbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼(Moloney)鼠白血病毒(MLV)及Rous肉瘤病毒(RSV)LTRs包含启动子及增强子序列(Jolly et al.，NucleicAcids Res.111855(1983)；Capecchi et al.，InEnhancer and eukaryotic geneexpression，Gulzman and Shenk，eds.，pp.101-102，Cold Spring HarborLaboratories(NY 1991)。其他的强效启动子包括源自巨细胞病毒(CMV)及其他野生型病毒启动子的启动子。
另外现在还已公开了许多非-病毒启动子的启动子及增强子区域(Schmidt et al.，Nature 314285(1985)；Rossi and deCrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845590-5594(1987)).维持并提高休眠细胞(quiescent cells)中转基因表达的方法包括使用启动子，包括I型胶原蛋白(1和2)(Prockopand Kivirikko，N.Eng.J.Med.311376(1984)；Smith and Niles，Biochem.191820(1980)；de Wet et al.，J.Biol.Chem.，25814385(1983))、SV40和LTR启动子。
哺乳动物宿主细胞中，可以使用基于多种病毒的表达系统。当使用腺病毒作为表达载体时，可以将编码序列连接至腺病毒转录/翻译调控复合体，例如，晚期启动子和三分(tripartite)前导序列。然后，通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组非必需区(例如E1或E3区)可以得到可存活的并能在感染的宿主中表达肽的重组病毒(参见，例如，Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813655)。可替代地，可以使用痘苗病毒7.5K启动子(参见，例如，Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797415；Mackett et al.，1984，J.Virol.，49857；Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，794927)。
根据本发明的一个实施方案，所述启动子是选自下组的组成型启动子泛醌(ubiquitin)启动子，CMV启动子，JeT启动子，SV40启动子，以及延伸因子1α启动子(EF1-α)。
可诱导/可抑制型启动子的实例包括Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素-可诱导的启动子、Mx1。
除使用病毒和非-病毒启动子驱动转基因表达之外，还可以使用增强子序列提高转基因表达水平。增强子不仅能提高其天然基因的转录活性而且还能提高一些外源基因的转录活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702(1973))。例如，本发明中使用带有胶原蛋白启动子2(I)的胶原蛋白增强子序列提高转基因的表达。此外，还可以使用SV40病毒中的增强子元件来提高转基因表达。这种增强子序列由72个碱基对的重复序列组成，描述见Gruss et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78943(1981)；Benoist andChambon，Nature 290304(1981)，and Fromm and Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1457(1982)，所有这些文献在此引入作为参考。当其存在于带有不同启动子的种系中时，该重复序列能提高许多不同的病毒基因和细胞基因的转录(Moreau et al.，Nucleic Acids Res.96047(1981)。
为了增加转基因表达使其长期稳定表达，还可以使用调控启动子活性的细胞因子。已经报道了几种细胞因子，其可调节胶原蛋白2(I)和LTR启动子的转基因的表达(Chua et al.，connective Tissue Res.，25161-170(1990)；Elias et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.，580233-244(1990))；Seliger et al.，J.Immunol.1412138-2144(1988)and Seliger et al.，J.Virology 62619-621(1988))。例如转化生长因子(TOF)，白细胞介素(IL)-1，和干扰素(INF)下调由各种启动子例如LTR驱动的转基因的表达。肿瘤坏死因子(TNF)和TGF1上调，可用于调控由启动子驱动的转基因表达。证明有用的其他细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。
带有胶原蛋白增强子序列(Coll(E))的胶原蛋白启动子还可用于提高转基因表达，其通过抑制对载体的进一步的任何免疫应答，其中所述载体可在经处理的脑中产生，而无论其免疫保护的状态。此外，还可以在递送载体组合物后立即向经处理的宿主施用抗炎药，包括类固醇，例如地塞米松，优选直至任一细胞因子-介导的炎性反应都平息。另外还可以施用免疫抑制药剂如环孢菌素来减少干扰素的产量，这可以下调LTR启动子和Coll(E)启动子-增强子并减少转基因表达。
所述载体可以包含其他序列例如编码Cre-重组酶蛋白质的序列和LoxP序列。确保神经胚素暂时表达的另一种方式是使用Cre-LoxP系统，当施用Cre重组酶至细胞时(Daewoong et al，Nature Biotechnology 19929-933)或者通过将编码重组酶的基因掺入病毒构建体时(Plück，Int J Exp Path，77269-278)，该系统将插入的DNA序列中的一部分切除。将重组酶的基因与LoxP位点和结构基因(本发明中为神经胚素)一起掺入病毒构建体常常使得结构基因的表达持续大约5天的时间。
本发明的方法中使用的载体还可以包括编码可用于鉴定成功转化的宿主细胞的可筛选标记物的核酸序列。哺乳动物细胞培养中使用的适宜可筛选标记物包括能赋予药物抗性的基因，所述药物例如新霉素，潮霉素和氨甲蝶呤。所述可筛选标记物可以是可扩增的可筛选标记物。一种可扩增的可筛选标记物是DHFR基因。另一合适的可扩增标记物是DHFRr cDNA(Simonsen and Levinson，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)802495)。其他可筛选标记物已由Thilly作了综述(Mammalian Cell Technology，ButterworthPublishers，Stoneham，MA)。任一本领域技术人员都能选择出合适的可筛选标记物。可以将可筛选标记物在同一载体中作为神经胚素前序列或者作为单独载体的一部分导入宿主细胞。所述可筛选标记物和所述神经胚素序列可以置于不同的或者相同的启动子的调控之下，后一种方式产生双顺反子(dicistronic)信息。这种构建体已为本领域所知(参见，例如 美国专利No.4,713,339)。
本发明的方法中使用的表达载体还可以编码有助于重组制备神经胚素多肽纯化的标签。实例包括，但不限于，载体pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.，21791)，其中可以将本申请所述的神经胚素多肽的编码序列与lacz编码区一起连接入载体框架从而制备得到杂合蛋白；此外还可使用pGEX载体表达带有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的神经胚素多肽。这些蛋白质通常是可溶性的，通过下述操作可以很容易地从细胞纯化吸附到谷胱甘肽-琼脂糖微珠然后在游离谷胱甘肽存在情况下洗脱。为了在纯化后能很容易地去除标签，所述载体包括切割位点(凝血酶或者Xa因子蛋白酶或者PreScission蛋白酶(Pharmacia，Peapack N.J.))。其他融合标签已为本领域所知，例如，组氨酸标签，麦芽糖结合蛋白标签。
基因治疗用的药物制剂为了生成本发明使用的神经胚素组合物，可以将编码神经胚素的表达病毒载体置于药物学可接受的悬液、溶液或乳液中。合适的介质包括盐水和脂质体制剂。
更具体地说，药物学可接受的载体可以包括灭菌的含水或非水溶剂、悬浮剂和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液、乳液或悬浮剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外用药的载体包括氯化钠溶液，Ringer′s葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化的Ringer′s或固定的(fixed)油类。
静脉内载体包括液体和营养补充物，电解液补充物(例如基于Ringer′s葡萄糖的)等。
防腐剂及其他添加物也可以存在，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等。此外，神经胚素转基因的组合物可以使用本领域熟知技术冻干，用于根据本发明所述进行随后的重配和使用。
另外还可以使用胶体分散系统进行靶向的基因递送。
胶态分散系统包括大分子复合体，纳米微囊剂(nanocapsules)，微球体，珠子，以及基于脂类的系统，包括水包油乳化剂，微胞团(micelles)，混合微胞团，和脂质体。脂质体是用作体内和体外递送工具的人工膜载体。现已证实直径大小为0.2-4.0μm的大单层载体(LUV)能够包封实质百分比(substantial percentage)的含大分子的含水缓冲液。RNA，DNA和完整病毒颗粒可以在含水内部包囊化，以生物学活性形式递送至细胞(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.，677，1981)。除哺乳动物细胞之外，脂质体可用于递送植物、酵母和细菌细胞中的可操作编码转基因。为了使脂质体成为一种有效的基因转移载体，应该具有下列特征(1)将编码神经胚素的基因高效包封但不破坏其生物活性；(2)与无靶标细胞相比，优先且实质上都结合至靶细胞；(3)将载体的含水内容物高效递送至靶细胞胞质；以及(4)精确且有效地表达遗传信息(Mannino，et al.，Biotechniques，6682，1988)。
所述脂质体组合物通常是磷脂，特别是high-phase-transitiontemperature磷脂，通常与固醇类物质特别是胆固醇结合。其它磷脂或其他脂类也可使用。脂质体的物理特性取决于pH，离子强度，和二价阳离子的存在。
可用于脂质体制备的脂类的实例包括磷脂酰基化合物，例如磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷酯酰乙醇胺，鞘脂类，脑苷脂类，和神经节苷脂。特别有用的为二酰基磷脂酰甘油，其中的脂质部分含有14-18个碳原子，优选为16-18个碳原子，并且是饱和的。举例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱以及二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine)。
脂质体的靶向可以根据构造上的和机理上的因素进行分类。构造上的分类以选择性水平为基础，例如器官特异性，细胞-特异性，和细胞器-特异性。机理学上的靶向可以根据其是被动的还是主动的进行划分。被动靶向利用了脂质体向含窦状毛细血管的器官中的内质网-内皮系统(RES)的细胞分布的自然趋势。
另一方面，主动靶向涉及改变脂质体，其通过将脂质体偶联至特异性配体例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质，或者通过改变脂质体的组成或大小，以实现对天然生成的定位位点之外的器官和细胞类型的靶向。
靶基因递送系统的表面可以通过多种方式进行修饰。就脂质体靶向的递送系统的情况而言，可以将脂类基团掺入脂质体的脂双层，以保持靶向配体与脂质体双层的稳定结合。可以使用各种连接基团将脂质链连接到靶向配体。
递送系统的另一个实例包括移将能产生本发明所述载体颗粒的包装细胞的组合物移植入治疗区域。包封以及移植所述细胞的方法已为本领域所知，具体可得自WO 97/44065(细胞治疗)。通过筛选能产生慢病毒颗粒的包装细胞系，从而实现将未-分裂细胞在治疗区域中的转导。通过使用只转导正在分裂细胞的反转录病毒颗粒，从而将转导限制于在治疗区域中从头分化的细胞。
递送基因治疗载体组合物的方法在本发明定义方法之后，可以通过本领域技术人员熟知的方法实现神经胚素组合物的直接递送，包括通过外科切割的显微注射(参见，例如，Capecchi，Cell，22479-488(1980)}；电穿孔(参见，例如，Andreason andEvans，Biotechniques，6650-660(1988)}；输注，与靶向型分子或共-沉淀剂(例如，脂质体，钙)的化学复合，以及靶向组织的微粒轰击(Tang，et al.，Nature，356152-154(1992))。
细胞的包封细胞包封疗法建立在下述概念基础之上在植入宿主之前用半透性的生物相容性物质包围细胞，从而将细胞与受体宿主的免疫系统分离开来。本发明包括其中细胞被包封入免疫隔离的胶囊的装置。″免疫隔离的胶囊″指的是这样的胶囊，当其植入在受体宿主时，能将宿主免疫系统对所述装置核心的细胞的有害影响最小化。通过将细胞封装入由带微孔薄膜形成的可植入聚合物胶囊实现细胞与宿主的免疫隔离。该方法能阻止宿主与植入组织之间的细胞-细胞接触，消除直接提呈引起的抗原识别。另外，所述膜还适于根据其分子量控制分子例如抗体和补体的扩散(Lysaght et al.，56J.Cell Biochem.196(1996)，Colton，14 Trends Biotechnol.158(1996))。使用包封技术，可以将细胞移植入宿主而无免疫排斥，而无论是否使用免疫抑制药物。有用的生物相容性聚合物胶囊通常包括内核和选择性通透基质或膜形成的外周或周围区域(″外壳″)，所述内核含有悬浮于液态介质或固定于固态基质中的细胞，所述外周或周围区域不含有分离的细胞，是生物相容性的且足以保护核内细胞不受有害性的免疫攻击。包封能阻止免疫系统的元件进入胶囊剂，从而保护包封细胞免受免疫破坏。胶囊膜的半透特性还可以允许目的生物活性分子很容易地从胶囊中扩散入周围的宿主组织。
所述胶囊可以用生物相容性物质制成。″生物相容性物质″是指植入宿主后不会激发足以导致排斥所述胶囊剂或者例如由于降解而使其无法发挥作用的有害的宿主反应。所述生物相容物质相对于大分子诸如宿主免疫系统的组分而言是不透性的，但是相对于大分子诸如胰岛素、生长因子和营养物而言是通透性的，同时允许新陈代谢的废物能够被除去。很多种生物相容的材料都适合于通过本发明的组合物递送生长因子。许多生物相容性材料都是已知的，具有不同的外表面形态以及其他机械及结构特性。优选的胶囊剂类似于PCT国际专利申请WO 92/19195或WO 95/05452描述的胶囊剂，其在此引入作为参考；或美国专利Nos.5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美国专利No.5,550,050，在此引入作为参考。所述胶囊剂允许代谢产物、营养物和治疗物质通过，同时将对宿主免疫系统的不利影响最小化。生物相容性物质的组成包括围绕周围的半透膜和细胞内支持支架。优选地，将基因改变的细胞种植在被选择透性膜包封的支架之上。纤维状的细胞-支持用支架可以用选自下列的任一种生物相容性材料制成丙烯酸，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚乙腈，聚乙烯teraphthalate，尼龙，聚酰胺，聚氨基甲酸酯，聚丁酯，丝，棉，几丁质，碳，或生物相容的金属。另外，键合的纤维结构也可用于细胞植入(美国专利No.5,512,600，在此引入作为参考}。生物可降解聚合物包括由聚(乳酸)PLA，聚(lactic-coglycolic acid)PLGA，和聚(羟基乙酸)PGA及其等效物组成的物质。现已用泡沫体支架提供用于粘附移植细胞的表面(PCT国际专利申请Ser.No.98/05304，在此引入作为参考}。织物网孔管用作血管移植物(PCT国际专利申请WO99/52573，在此引入作为参考)。另外，所述内核可以由水凝胶形成的固定基质组成，用来稳定细胞的位置。水凝胶是一种3维网状交联的亲水聚合物，形式为基本由水组成的凝胶。
各种聚合物和聚合物混合物可用于制备围绕外周的半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚乙二烯，聚氯乙烯共聚物，聚氨基甲酸酯，聚苯乙烯，聚酰胺，醋酸纤维素，硝酸纤维素，聚砜(包括聚醚砜)，聚磷腈，聚丙烯腈，聚(丙烯腈/covinyl氯化物)，及其衍生物，共聚物和混合物。优选地，所述外周半透膜是一种生物相容的半透性的空心纤维膜。所述膜及其制备方法公开于美国专利Nos.5,284,761和5,158,881，在此引入作为参考。所述外周半透膜由一种聚醚砜空心纤维制成，例如美国专利No.4,976,859或美国专利No.4,968,733中描述的，在此引入作为参考。一种替代的外周半透膜材料是聚(丙烯腈/covinyl氯化物)。
所述胶囊可以是适于维持生物活性并提供递送产物或功能途径的任一结构，包括例如，柱状的，矩形的，圆盘形的，补片-形状的，卵形的，星形的，或者球状的。另外，所述胶囊剂还可以盘绕或缠绕入网孔-样或嵌套状结构。如果所述胶囊剂在植入后还要回收，那么则不优选该倾向于使得胶囊从植入位点的结构，例如小到足以能在受体宿主血管中移动的球状胶囊。某些形状，例如矩形，补片，圆盘，柱体和平板状片层，能提供更好的结构完整性，优选可以用于需要回收的情况。
当使用大胶囊(macrocapsules)时，优选每一粒中包封103-108个细胞，最优选优选105-107个细胞。可以通过植入较少或较多数量的胶囊来控制剂量，优选为每位患者1-10粒胶囊。
所述支架可以用细胞外基质(ECM)分子包被。合适的细胞外基质分子的实例包括，例如，胶原蛋白，层粘连蛋白，和粘连蛋白。还可以通过下述操作修饰支架表面用等离子体辐射处理赋予电荷以提高细胞附着力。
可以使用任一合适的方法密封胶囊，包括使用聚合物粘合剂或压接、纽结(knotting)和热封。此外，也可使用任一合适的″干燥″密封方法，描述参见，例如，美国专利No.5,653,687，在此引入作为参考。
所述包封的细胞装置可以用本领域已知技术植入。许多植入位置都能使用本发明所述的装置和方法。这些植入位置包括，但不限于，中枢神经系统，包括脑，脊髓(参见，美国专利Nos.5,106,627，5,156,844，和5,554,148，在此引入作为参考)，鞘内植入，以及眼睛的含水及玻璃液(参见，PCT国际专利申请WO97/34586，在此引入作为参考)，视网膜下隙，以及支持包囊。对于脑内而言，所述装置可以植入实质和脑室。对于全身递送而言，植入可以采用经肌肉内、皮下、或腹腔内的途径。
ARPE-19细胞系是一种高级的平台细胞系，可用于基于包封细胞的递送技术，也可用于基于非包封细胞的递送技术。所述ARPE-19细胞系是耐受的(hardy)(即，所述细胞系在严谨状况下能够存活，例如植入中枢神经系统或者眼内环境)。ARPE-19细胞可以进行基因修饰以分泌具有治疗功效的物质。ARPE-19细胞具有相对长的寿命周期。ARPE-19细胞是人源性的。另外，包封的ARPE-19细胞在体内装置中的存活性良好。ARPE-19细胞可以递送有效量的生长因子。ARPE-19细胞激发的宿主免疫反应极为微弱可以忽略。而且，ARPE-19细胞是非-致瘤性的。
用于将胶囊植入CNS的方法和仪器的描述见US5,487,739。
在一个方面，本发明涉及一种生物相容的胶囊，其中含有包含着生存的包装细胞的内核，该细胞能分泌能感染靶细胞的病毒载体，其中所述病毒载体是本发明所述的载体；和包裹在所述内核外周的外壳，所述的外壳包含通透性的生物相容性材料，所述材料为多孔性，选择为允许100nm直径的反转录病毒载体通过，允许所述病毒载体从胶囊释放出去。
优选地，所述内核另外还含有基质，所述包装细胞被所述基质固定。根据一个实施方案，所述外壳其中含有水凝胶或热塑性材料。
适合于包装细胞系的细胞的实例包括HEK293，NIH3T3，PG13，和ARPE-19细胞。优选地，所述细胞包括PG13和3T3细胞。
用于包封包装细胞的方法和装置公开于US6,027,721，在此引入作为参考。
宿主细胞本发明所述核酸构建体可用于制备神经胚素多肽。真核细胞可以用编码可操作地连接于异源信号序列的重组神经胚素多肽的核酸构建体转染。制备核酸构建体以及用构建体转染细胞的方法已为本领域所知。(参见，例如，Ausubel et al.，eds.，1988，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates & Wiley-InterscienceNew York；Sambrook et al.1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2 ed.，Cold Spring HarborLaboratory PressCold Spring Harbor，NY)。例如，细胞转染可以使用电穿孔，磷酸钙沉淀，或病毒载体感染。一些实施方案中，所述转化宿主细胞是哺乳动物细胞，例如，CHO细胞，COS细胞，HeLa细胞，或NIH 3T3细胞。
在能使分泌型神经胚素多肽从所述细胞表达并分泌的表达条件下，将所述转化宿主细胞培养于合适的生长培养基。一种合适生长培养基含有足以满足细胞生长所需的营养物。细胞生长需要的营养物包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。选择性地，所述培养基可以含有牛血清或胎牛血清。所述生长培养基可以设计为能够筛选含有核酸构建体的细胞。例如，这可以通过下述操作实现药物筛选或者通过核酸构建体上的可筛选标记物或者用核酸构建体共-转染补充的必需营养物的缺乏。培养的哺乳动物细胞有时培养在商品化的含血清或无血清培养基(例如MEM，DMEM}(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。为特定细胞系选择适合的培养基要考虑的因素已为本领域所知。
因此，在一个方面，本发明涉及经本发明所述载体转导或转染的分离的宿主细胞。这些细胞优选是哺乳动物宿主细胞，因为这些细胞能分泌和正确加工所编码的神经胚素。
优选的物种包括啮齿类动物(小鼠，大鼠)，兔子，狗，猫，猪，猴子，人。
由本发明所述载体转导的良好侯选原代培养物和细胞系的实例包括CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胚胎细胞，RPE细胞系，ARPE-19，人类永生化的成纤维细胞，C2C12，HeLa，HepG2，纹状体细胞，神经元，星形细胞，中间神经元。
对于包封和裸细胞治疗，优选的细胞系类型是视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)。RPE的来源是分离自哺乳动物视网膜的原代细胞。收获RPE细胞的方法已有详细描述(Li and Turner，1988，Exp.Eye Res.47911-917；Lopezet al.，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30586-588)，其被认为是一种常规方法。在RPE细胞共移植的大部分公开报告中，细胞源自于大鼠(Li andTurner，1988；Lopez et al.，1989)。优选地，RPE细胞源自于人。除分离的原代细胞之外，培养的人类RPE细胞系可以用于实施本发明。
对于体内转导而言，优选的宿主细胞包括纹状体细胞，神经元，星形细胞和中间神经元。对于离体基因治疗而言，优选的细胞包括神经元细胞，神经元前体细胞，神经元祖细胞，干细胞和胚胎细胞。干细胞和神经元前体细胞具有下列好处可以整合入所述组织并迁移。对于包封和对于裸细胞的植入而言，优选的细胞包括视网膜色素上皮细胞，包括ARPE-19细胞；人类永生化的成纤维细胞；和人类永生化的星形细胞。特别优选的是ARPE-19。
另一个实施方案中，所述治疗细胞系选自人类成纤维细胞系，人类星形细胞细胞系，人类中脑细胞系，和人类内皮细胞系，优选用TERT、SV40T或vmyc永生化。
用于制备人类星形细胞系的方法此前已有描述(Price TN，Burke JF，Mayne LV.A novel human astrocyte cell line(A735)with astrocyte-specificneurotransmitter function.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5)279-88.)。该方法也可用于制备星形细胞系。
为了制备其他的人类星形细胞系，优选下列3种该方法的改良方式。
可以使用取自5-12周龄胎儿的人类胎儿脑组织，而不是12-16周龄的组织。
可以永生化的基因v-myc，或TERT(端粒酶)，而不是SV40T抗原。
可以使用反转录病毒基因转移代替用质粒转染。
所述神经胚素多肽还可以表达于转基因动物，例如啮齿类动物，母牛，猪，绵羊或山羊中。转基因动物是已将外源基因合并入其基因组从而使得该外源基因能够从亲代传递给后代的非人类动物。外源基因可以导入单细胞的胚胎(Brinster et al，.1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824438)。制备转基因动物的方法是本领域已知的(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786376；McKnight et al.，1983，Cell 34335；Brinster et al.，1983，Nature 306332；Ritchie et al.，1984，Nature 312517；Baldassarre et al.，2003，Theriogenology 59831；Robl et al.，2003，Theriogenology 59107；Malassagneet al.，2003，Xenotransplantation 10(3)267)。
体外制备神经胚素一个单独的方面本发明涉及哺乳动物细胞，例如上文定义的细胞，能够分泌总量超过500ng/106个细胞/24小时的神经胚素多肽，更优选超过600ng/106个细胞/24小时，更优选超过700ng/106个细胞/24小时，更优选超过800ng/106个细胞/24小时，更优选超过900ng/106个细胞/24小时，例如超过1000ng/106个细胞/24小时。
优选地所述分泌的神经胚素是生物学活性的，正如实施例1描述的RetL3 ELISA试验测定的那样。这样就省去了对糖基化，切割和再折叠的需要。
优选的宿主细胞选自CHO，HEK293 COS，PC12，HiB5，RN33b，C2C12，HeLa，HepG2，和ARPE-19细胞组成的组。更优选选自CHO，HEK293，COS，和ARPE-19组成的组。
通过下述操作能够制备得到神经胚素或其功能等价物培养这些细胞，然后从所述培养基回收神经胚素，但不必对该蛋白质重折叠或糖基化。
此外通过加入增强子元件例如WPRE可以进一步提高表达(US6,136,597)。
产神经胚素细胞的支持基质本发明进一步还包括在植入哺乳动物神经系统之前，将产神经胚素细胞在体外培养于支持基质上。在植入之前将细胞预吸附至微载体，这样的设计能够提高移植细胞的长期存活能力，并提供长期功能性的效益。
为了提高所述移植的细胞，即移植的神经胚素分泌型细胞的长期存活能力，可以将在移植之前，在体外将待移植的细胞结合到支持基质。可以用于制备支持基质的物质包括符合下列要求的物质在体外保温后细胞可吸附于其上，并能在其上生长，并且该材料能植入哺乳动物体内且不引发毒性反应或者破坏移植细胞或干扰其生物或治疗活性的炎性反应。所述材料可以是合成的或天然的化学物质，或者具有生物学起源的物质。所述基质材料包括，但不限于，玻璃及其他氧化硅，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨基甲酸酯，聚藻酸盐，聚砜，聚乙烯醇，丙烯腈聚合物，聚丙烯酰胺，聚碳酸酯，polypentent，尼龙，淀粉酶，天然的和经修饰的明胶以及天然的及经整理的(codified)胶原蛋白，天然的及经修饰的多糖，包括葡聚糖和纤维素(例如，硝化纤维}，琼脂，和磁石(magnetite)。可吸收性或非-可吸收性材料都可以使用。另外还可使用本领域熟知的细胞外基质材料。细胞外基质材料可以商业途径获得或者通过下述方式制备得到培养分泌所述基质的细胞，回收分泌型细胞，然后使要移植的细胞与所述基质相互作用或者吸附于其上。用于培养被植入细胞的基质材料，或者与所述细胞混合的基质材料，可以是RPE细胞的内生产物。因此，例如，所述基质可以是待植入的RPE细胞产生和分泌的细胞外基质或基底膜物质。
为了提高细胞吸附、存活和功能，可以任选地用本领域已知的因子包被所述固体基质的外表面，以促进细胞吸附、生长或存活。所述因子包括细胞粘着分子，细胞外基质，例如，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白，氨基多糖(glycosaminoglycan)，或者蛋白多糖或生长因子。
可替代地，如果所述供植入细胞吸附的固体物质是由多孔材料构成的，可以向所述基质材料中掺入一种或多种促生长或促存活的因子，植入体内之后所述因子再从基质材料中慢慢地释放出来。
当附着于本发明所述支持物时，所述用于移植的细胞通常位于该支持物的″外表面″上。所述支持物可以是固态的或多孔样的。但是，即使是多孔载体，所述细胞也是与外周环境直接接触的，并没有膜或其他屏障的插入。因此，根据本发明，所述细胞被认为是位于所述支持物的″外表面″，即使细胞所粘附的表面是以多孔支持物载体的内部折叠面或盘旋面(convolutions)的形式存在而并不是所述颗粒或珠体本身的外部。
所述支持物的结构优选为球状，例如珠粒，但是也可以是圆柱状的，椭圆的，扁片或条形的，针状或销形(pin shape)等。支持基质的优选形式为玻璃纤维珠。另一种优选的珠粒为聚苯乙烯珠粒。
珠粒直径大小为10μm-1mm，优选约90μm-约150μm。各种微载体珠粒的描述，参见，例如，isher Biotech Source 87-88，Fisher Scientific Co.，1987，pp.72-75；Sigma Cell Culture Catalog，Sigma Chemical Co.，St，Louis，1991，pp.162-163；Ventrex Product Catalog，Ventrex Laboratories，1989；这些参考文献在此引入作为参考。所述珠粒大小的上限可以根据所述珠粒刺激宿主不良反应确定，所述宿主不良反应会妨碍移植的细胞的功能或者引起对外周组织的损害。所述珠粒大小的上限还由施用方法决定。所述的限度是本领域技术人员很容易测定的。
神经胚素多肽本发明进一步还涉及神经胚素多肽，其中含有信号肽和神经胚素多肽，其中所述多肽不含神经胚素原-区，例如融合于信号肽的神经胚素多肽。具体而言，所述信号肽的C-末端通过肽键与所述神经胚素多肽的N-末端连接。所述的信号肽和神经胚素多肽如上所述。
实施例实施例1用IgSP-NBN构建体体外转染构建IgSP-NBN构建体IgSP.NBN通过重叠PCR制备。在第一扩增步骤中，通过PCR从pUbilz.NBN.BamHI载体扩增NBN的成熟片段，使用引物NBNs-IgSP.Flap(5’-GGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCC-3’)和NBNas+XhoI(5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’)。在第二步PCR反应中，所述IgSP序列扩增自pNUT-IgSP-CNTF载体(参见US6,361,741)，使用引物IgSPKozakls+BamHI(5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’)和IgSPas-NBN.Flap(5’-GGCCCCCAGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3’)。在第三步中，将步骤1和2中的产物合并入最后的PCR反应制备IgSP-NBN，使用等量的这两种产物作为模板并使用引物IgSPKozakls+BamHI和NBN-as+XhoI。
为了制备基于质粒的表达载体，将得到的片段克隆入用BamHI/XhoI消化后的pNSln中。在该载体中，所述IgSP-NBN序列置于CMV启动子转录调控之下(参见图3)。另外，当表达于哺乳动物细胞中时，所述载体含有能赋予G418抗性的Neo基因。
瞬时转染试验ARPE-19是一种人视网膜色素上皮细胞系(Dunn et al.1996)，37℃和5％CO2条件下生长于添加了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，Denmark)的含有Glutamax(Invitrogen，Denmark)的DMEM/Nutrient Mix F-12中。通过胰酶消化和再接种(1∶5分裂比)对细胞进行传代，大约每周两次。将细胞以105个细胞/孔的密度接种于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)用于转染试验。次日，按照厂商提供的说明书，使用Fugene6(Roche，Germany)用3μg质粒/孔转染细胞，每孔均设一式两份。转染后3天收集细胞上清，用RetL3 ELISA测定其中的NBN活性。
RetL3 ELISA所述RetL3 ELISA检测Ret-AP偶联物与结合于NBN-特异性GFRα3受体的NBN的复合体之间的结合。该试验只能检测功能活性的NBN分子。简而言之，96-孔平板(B & W Isoplate HB，Perkin Elmer，Denmark)用100μl以溶于50mM NaHCO3(pH＝9.6)的1μg/ml山羊抗人Fc(JacksonImmunoresearch Laboratories，TriChem，Denmark)在4℃包被16小时。用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗涤后，将这些孔用含0.2％I-Block(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)的PBST溶液在室温封闭1小时，然后在PBST中作简单洗涤。细胞上清或重组小鼠Artemin(R&D systems，UK)用DMEM/10％FCS稀释，然后在孔内与以1μg/ml溶于RET-AP条件培养基(Biogen，USA)的GFRα3/Fc融合蛋白(R&D Systems，UK)在室温保温1.5小时。然后首先用PBST洗涤孔接着用AP-缓冲液(200mM Tris(pH＝9.8)，10mM MgCl2)洗涤，然后与以10％溶于AP-缓冲液的Sapphire Enhancer(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)和以2％溶于AP-缓冲液的CSPD(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)保温30分钟。通过使用MicrobetaTrilux Counter(Perkin Elmer，Denmark)测定发光情况。
结果(图4(b))使用RetL3ELISA对从经pNSln-IgSP.NBN构建体瞬时转染的ARPE-19细胞收集的上清进行检测，其中的NBN活性为25.3-33.8ng/ml。相反，对于包括在同一试验中的经野生型(前原)NBN表达构建体(pUbilz.hNBN)转染的ARPE-19细胞，检测到大约低5倍的NBN活性(4.4-6.4ng/ml)。经EGFP表达构建体(pNSlz-EGFP)瞬时转染的ARPE-19的细胞上清中，则仅有极低或者甚至检测不到NBN活性，证实了该测定法的特异性。
这些结果表明与使用野生型(前原)NBN构建体时的NBN释放相比，嵌合的IgSP-NBN构建体能够使得从哺乳动物细胞释放的能结合并活化特异性NBN受体复合体的成熟NBN的量更高。
实施例2用IgSP-NBN构建体体外转导制备慢病毒IgSP-NBN构建体和病毒原液为了制备慢病毒构建体，将pNSln-IgSP-NBN用BamHI-XhoI消化，将IgSP-hNBN PCR片段(如实施例1所述)连接入BamHI/XhoI-消化的pHsCXW得到pHsCXW.IgSP.NBNw(图3)。pHsCXW是自身-灭活型慢病毒传递构建体pHR’-SIN-18的衍生物，其中包括通过用pUC19骨架取代该转移构建体中较大的非病毒部分制备得到的WPRE元件(Dull et al.，J.Virol.，72(11)8463-71(1998)；Zufferey et al.，J.Virol.，72(12)9873-80(1998)Zuffereyet al.J.virol.，73(4)2886-92(1999))。pHsCXW的序列可以从GenGank IDAY468486获取。
通过下述操作制备复制缺陷型LV-sC.IgSP.NBN.W病毒颗粒将pHsC.IgSP.NBN.W与pMD.G(VSV-G假分型载体(pseudo-typing vector))和pBR8.91(包装载体)(Zufferey et al.，Nat.Biotech.，15871-75(1997))共转染入293T细胞，反向提供所需的病毒蛋白。简而言之，在转染的前一天，将在含4.5g/l葡萄糖和glutamax(Life Technologies，32430-027)并补充10％FCS(Life Technologies，10099-141)的DMEM中培养的293T细胞接种于T75转瓶(2×106个细胞/瓶)。对于每一个T75转瓶而言，使用Lipofectamine，按照厂商提供的说明书，用5μg pMD.G，15μg pBR8.91和20μg转移载体转染细胞。转染后2-3天收集含病毒的细胞上清，用0.45μm醋酸纤维素或polysulphonic滤膜过滤除菌，通过在4℃、50,000xg超离90分钟浓缩。第二轮超速离心后，将浓缩后的病毒沉淀重悬于DMEM，分装，然后保存于-80℃。为了测定病毒滴度，测定反转录酶(RT)活性(Cepko and Pear，Current Protocols in Molecular Biology，9.13.5-6，supplement 36)，然后使用转导活性已知的EGFP慢病毒作为参照，从测得的RT活性中计算出转导单位(TU)/ml。
转导试验用NBN表达载体转导ARPE-19细胞。简而言之，将细胞以105个细胞/孔的密度接种于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)。第二天，向每个孔(一式双份)中加入2×105TU病毒和5μg/ml聚凝胺4小时。更换培养基，将培养物再保温3天。然后，按照实施例2所述收集细胞上清用于RetL3 ELISA。
结果(图4(c))使用RetL3 ELISA对从经LV-sC.IgSP.NBN.W病毒转导的ARPE-19细胞收集的上清进行检测，其中的NBN活性为39ng/ml。相反，经含野生型(前原)NBN cDNA的慢病毒(LV-sC-NBN.W)转导或者用对照EGFP慢病毒(LV-sCEW)转导的ARPE-19的细胞上清中，则仅检测到极低的或者甚至检测不到NBN活性。
这些结果表明，与使用含野生型(前原)NBN cDNA的病毒构建体相比，嵌合的IgSP-NBN构建体能够允许更多的能结合并活化特异性NBN受体复合体的成熟NBN从哺乳动物细胞释放。
实施例3自IgSP-NBN构建体表达的NBN蛋白质的分析细胞上清的Western印迹分析在Western印迹分析之前，来自转染或转导的细胞培养物细胞上清中的NBN通过与GFRa3-Ig的亲合结合而得以浓缩。简而言之，将NuncMaxiSorp平板的4个孔用300μl山羊抗人FNaHCO3(pH＝9.6)溶液在4℃包被16小时。所述孔用400μl含1％BSA的PBS溶液在室温封闭1小时，然后用PBST洗涤三遍。然后添加300μl/孔GFRo3/Fc融合蛋白1μg/ml(R&D Systems，UK)，将平板在室温保温1小时以实现最大程度的结合。然后，将孔内倒空，再用PBST洗涤3次。然后向4孔中的每一孔添加收集自转染或转导的细胞培养物的上清300μl，在室温保温至少3小时并同时轻微振摇。然后用PBST洗涤所述孔两次。然后向第一孔中添加20μl非还原性样品缓冲液(2％SDS，0.4M Tris(ph＝8.0))，将所述平板快速振摇5分钟洗脱出结合的蛋白。将这些内容物转移到下一个孔内，重复该过程一洗脱出结合于其余孔的蛋白质。添加DTT至10mM后，将所述样本在96℃加热5分钟，然后通过SDS PAGE在15％聚丙烯酰胺凝胶上用MultiPhor II系统遵照厂商的推荐(Amersham Pharmacia，Denmark)进行分析。将所述蛋白质转印到PVDF膜上(BioRad，Denmark)，所述膜使用多克隆兔抗-NBN抗体(#378)作为检测抗体进行免疫染色。使用ECL+系统(Amersham Pharmacia，Denmark)使膜显色然后进行胶片曝光。
结果#_378是抗NBN-衍生肽的兔多克隆抗体(ALRPPPGSRPVSQPC)。如图59(a)所示，单个分子量为7.2-18.5kDa的条带在含下述NBN的还原(+DTT)样本中识别出在大肠杆菌中产生的对应于单体非糖基化NBN113的纯化的大鼠重组NBN。来自经野生型(前原)NBN转染的稳定的CHO-NBN克隆的还原样本中，除几个其他条带之外也识别到了相同分子量的条带。此前的试验中已经使用去糖基化和N-末端测序方法测定了许多这样条带的性质。分子量略低的条带是成熟NBN的较小且非糖基化形式(NBN104)。此外，表观MW约21kDa的非常宽的带是NBN113和NBN104的糖基化形式。较大分子量的(糖基化的)条带为偶见于GFRa3-亲合纯化样本中的原-NBN。
如图5b所示，在CHO-NBN细胞的两个的稳定克隆中检测到MW位于6.4-21.3kDa之间的、与非糖基化NBN113和NBN104对应的双条带。在用IgSP-NBN表达构建体转导或转染的ARPE-19中也检测到了同样的双条带。另外，与糖基化NBN113和NBN104对应的、MW接近于21kDa的双条带出现于所有检测样本中。这些结果表明用野生型(前原)NBN和IgSP-NBN构建体表达时，加工和翻译后修饰是相似的。
实施例4嵌合IgSP-NBN病毒构建体的测序和信号肽的预测。
存在于构建体中的IgSP-NBN-核苷酸序列ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGTAAGGGGCTCCCAAGTCCCAAACTTGAGGGTCCATAAACTCTGTGACAGTGGCAATCACTTTGCCTTTCTTTCTACAGGGGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGCGGGGCTGCCGCCTGCGCTCGCAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGCCTGGGCCACCGCTCCGACGAGCTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCCTGCCGCCGCGCGCGCTCTCCACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGGCTGCCTGGGCTGA(SEQID NO 7)
IgSP-NBN是融合构建体，带有直接融合于成熟NBN(113)的、来自免疫球蛋白基因的信号肽。
所述IgSP-NBN含有内含子通过NetGene(CBS-DTU服务器)预测的内含子-外显子长度478个核苷酸。
13.4％A，36.2％C，32.2％G，18.2％T，0.0％X，68.4％G+C供体拼接位点，指导链---------------------------------位置5′-＞3′ 阶段 链 可信度5′ 外显子内含子 3′47 2 + 0.00 GTGGTTACAG^GTAAGGGGCT2480 + 0.60 CGACGAGCTG^GTGCGTTTCC供体拼接位点，互补链-------------------------------------无供体位点预测超过阈值。
受体拼接位点，指导链------------------------------------pos 5′-＞3′ 阶段链可信度 5′内含子外显子 3′1251 + 0.83 CTTTCTACAG^GGGTGAATTC1532 + 0.18 GCCCGGGCAG^CCGCGCTCGG1671 + 0.20 GCTCGGGCAG^CGGGGGCGCG1990 + 0.42 GCGCTCGCAG^CTGGTGCCGG
经拼接的转录本的核苷酸序列ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGCGGGGCTGCCGCCTGCGCTCGCAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGCCTGGGCCACCGCTCCGACGAGCTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCCTGCCGCCGCGCGCGCTCTCCACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGGCTGCCTGGGCTGA(SEQ ID NO 8)经拼接的转录本的翻译MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO 9)翻译出的融合蛋白质经预测含有19个氨基酸的信号肽，该信号肽可以使用Signal P(可获自www.cbs.dtu.dk的CBS DTU服务器)从成熟NBN(113)序列切割。(原核和真核生物肽的鉴定及其切割位点的预测。H.Nielsen，J.Engelbrecht，S.Brunak，G.Von Hejne，Protein Engineering 10，1-6，1997.)SignalP-NN结果(参见图6a)
#最可能的切割位点位于第19-20位之间VNS-AG
SignalP-HMM结果(参见图6b)预测信号肽信号肽概率0.999信号锚定概率0.000最大切割位点概率0.660，位于第19-20位之间使用神经网络(NN)和在真核细胞上受训得到的隐藏(hidden)马尔可夫模型(Markov models)(HMM)实施例5信号肽位置的预测。
Igsp融合于各种长度神经胚素多肽时，切割位点的预测使用上述鉴定的信号P程序2.0显示如下。
切割位点
IgSP(19)MKCSVVVIFFLMAVVTGVNS成熟形式的NBN(113)AGGPGSR(106)AR(104)AA(102)GAR(99)GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTVVRTVDRLSATACGCLG实施例6将delta原-NBN克隆入pHsCXW通过重叠PCR三步扩增制备delta原-NBN(SEQ.ID.NO82)1)相对长度为117bp的前原NBN前导序列(即，39个氨基酸的信号肽)，5′端带有BamHI/Kozak突出端，3′端带有与成熟NBN(143bp)的10个重叠碱基；2)成熟NBN，5′端带有与NBN前导序列重叠10个的碱基，3′端为XhoI(362bp)；3)将步骤1和2的产物合并入最后的PCR反应，制备delta原-NBN(492bp)。
第一步PCR反应(NBN前导)
所用引物BamHI+Kozak+hNBNsp，5’-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTG-GACTTGGAGG-3’hNBNsp3′-matNBN FLAP as，5’-GGCCCCCAGCGGCCTCTGCGACGCTGCTCA-3’使用质粒pHsC.hNBN.W(参看图7a中的质粒图谱)作为PCR反应的模板，所述反应使用Pfu-turbo聚合酶进行。
PCR反应条件94℃3min94℃30s55℃30s35个循环72℃1min72℃5min第二步PCR反应(成熟NBN)所用引物hNBNsp3′ FLAP-matNBN s，5’-CGCAGAGGCCGCTGGGGGCCCGGGCAGC-3’NBNas+XhoI，5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’使用质粒pHsC.hNBN.W(参看图7a中的质粒图谱)作为PCR反应的模板，所述反应使用Pfu-turbo聚合酶进行。
PCR反应条件94℃3min94℃30s65℃30s35个循环72℃1min72℃5min
第三步PCR反应(delta原-NBN)所用引物BamHI+Kozak+hNBNsp，5’-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTGGACTTGGAGG-3’NBNas+XhoI，5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’将前两步PCR反应的PCR片段(NBN前导序列和成熟NBN，二者都作1∶10稀释)作为第三步PCR反应的模板，所述反应使用Pfu-turbo聚合酶进行，采用与第一步PCR相同的PCR方案。
将第三步PCR反应得到的PCR片段用BamHI和XhoI切割后克隆入pHsCXW中BamHI和XhoI位点之间(参见图7b中的质粒图谱)。
实施例7用IgSP-NBN构建体和delta原NBN构建体体外转染不同的细胞系用不同的NBN构建体瞬时转染后，对NBN(包括野生型前-原NBN，Δ-前NBN和IgSP-NBN)的分泌情况进行比较。瞬时转染在ARPE-19，HEK293，CHO和HiB5细胞中进行。
细胞系按照实施例1的描述培养ARPE-19细胞。将HiB5(Renfranz et al.1991)，HEK293和CHO细胞培养于含10％胎牛血清(Invitrogen，Denmark)的DMEM(Invitrogen，Denmark)，然后另外向CHO用培养基中补充20mg/l L-脯氨酸。ARPE-19，HEK293和CHO细胞的培养条件为37℃和5％CO2，HiB5细胞的培养条件为33℃和5％CO2。通过胰蛋白酶消化和再接种(reseeding)(1∶5分裂比)的方法进行细胞传代，约每周两次。
瞬时转染的NBN分泌将细胞以大约105个细胞/孔的密度接种于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)。第二天，分别用pHsC.hNBN.W，pHsC.IgSP.hNBN.W和pHsC.delta原-hNBN.W转染细胞。ARPE-19细胞按实施例1的描述使用Fugene6转染，设置一式三份的平行孔，而其余三种细胞系按照厂商提供的说明书使用Lipofectamine Plus(Invitrogen，Denmark)转染，2μg质粒/孔，设置一式三份的平行孔。第二天，向孔中添加新鲜生长培养基，细胞继续保温24小时，然后收集调节的培养基(conditioned medium)。通过评估用pHsC.EGFP.W.平行转染的孔中的EGFP表达水平保证足够的转染效率。使用RetL3 ELISA测定经调节的培养基中的NBN结合活性。RetL3 ELISA检测Ret-AP偶联物与NBN同NBN-特异性GFRα3受体的结合复合体之间的结合。数值计算为ng NBN/ml/24h和ng NBN/105个细胞/24h，然后以得自野生型NBN构建体转染的细胞的值设定为1，将以上数值调整为相对NBN释放。图8中的数据代表这三种计算，表示为平均值±SEM(n＝3)。在图8A中，*表示与用野生型NBN构建体转染的细胞之间差异显著(P＜0.05，单向ANOVA，Fisher LSD Method)结果如下表和图8A所示，与使用野生型NBN构建体时相比，使用delta原-NBN构建体时所述这四种受试细胞系都表现出NBN释放量的增加(NBN释放量高出9-17倍，取决于具体的细胞系)。当用pHsC.IgSP，hNBN构建体转染所述四种细胞系时，NBN的分泌量进一步升高(与野生型NBN相比，NBN释放量高出29-91倍)。经EGFP表达构建体(pNSlz-EGFP)瞬时转染过的ARPE-19的细胞上清中，则仅有极低或者甚至检测不到NBN活性，证实了该测定的特异性。
图8B中图示的是瞬时转染的细胞系的条件培养基(24h)中的NBN浓度。来自经IgSP-NBN构建体转染的HEK293细胞的条件培养基中，测得的浓度最高(1240±54ng NBN/ml)。图8C中图示的是NBN释放/105个细胞/24小时。IgSP-NBN转染的ARPE-19细胞表现出最大的NBN释放量(133±35ng/105个细胞/24h)。
本发明的结果表明为了提高成熟NBN自哺乳动物细胞的分泌量，使用嵌合IgSP-NBN构建体和delta原NBN构建体适用于不同的细胞类型。
实施例8使用SignalP 3.0的预测使用版本3.0预测信号肽的位置。所述预测在具有下列序列的delta原NBN和IgSP-NBN上进行。
含NBN-SP的嵌合NBN分子(delta原NBNs)NBN-SP(SEQ ID NO24)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAdelta原NBN140(SEQ ID NO25)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN113(SEQ ID NO26)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN106(SEQ ID NO27)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN104(SEQ ID NO28)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN102(SEQ ID NO29)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN99(SEQ ID NO30)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含IgSP的嵌合NBN分子(IgSP-NBNs)IgSP(SEQ ID NO4)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSIgSP-NBN140(SEQ ID NO31)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN113(SEQ ID NO32)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN106(SEQ ID NO33)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN 104(SEQ ID NO34)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN102(SEQ ID NO35)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN99(SEQ ID NO36)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含大鼠白蛋白SP的嵌合NBN分子(AlbSP-NBNs)
AlbSP(SEQ ID NO37)MKWVTFLLLLFISGSAFSAlbSP-NBN140(SEQ ID NO38)MKWVTFLLLLFISGSAFSPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN113(SEQ ID NO39)MKWVTFLLLLFISGSAFSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN106(SEQ ID NO40)MKWVTFLLLLFISGSAFSARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN104(SEQ ID NO41)MKWVTFLLLLFISGSAFSAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN102(SEQ ID NO42)MKWVTFLLLLFISGSAFSGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN99(SEQ ID NO43)
MKWVTFLLLLFISGSAFSGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含经修饰的大鼠白蛋白SP的嵌合NBN分子(ModAlbSP-NBNs)ModAlbSP(SEQ ID NO44)MKWVTFLLFLLFISGDAFAModAlbSP-NBN140(SEQ ID NO45)MKWVTFLLFLLFISGDAFAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN113(SEQ ID NO46)MKWVTFLLFLLFISGDAFAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN 106(SEQ ID NO47)MKWVTFLLFLLFISGDAFAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN 104(SEQ ID NO48)MKWVTFLLFLLFISGDAFAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG
ModAlbSP-NBN 102(SEQ ID NO49)MKWVTFLLFLLFISGDAFAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN99(SEQ ID NO50)MKWVTFLLFLLFISGDAFAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含人生长激素SP的嵌合NBN分子(GHSP-NBNs)GHSP(SEQ ID NO51)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGHSP-NBN 140(SEQ ID NO52)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN113(SEQ ID NO53)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN 106(SEQ ID NO54)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG
GHSP-NBN104(SEQ ID NO55)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN102(SEQ ID NO56)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN99(SEQ ID NO57)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG信号肽的预测显示于下表
含NBN信号肽1(delta原)蛋白质的信号肽预测
1MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEA-39个氨基酸*低于截止值含IgSP2的蛋白质的信号肽预测
2MKCSWVIFFLMAVVTGVNS-19个氨基酸**低于截止值含ModAlbSP4的蛋白质的信号肽预测
4MKWVTFLLFLLFISGDAFA-19个氨基酸*低于截止值含AlbSP3的蛋白质的信号肽预测
3MKWVTFLLLLFISGSAFS-18个氨基酸-*低于截止值含GHSP5的蛋白质的信号肽预测
5MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSA-26个氨基酸*低于截止值实施例9神经胚素基因序列的优化根据目前至2002年间的数据，对CHO细胞中最常用的密码子进行了分析，使用本领域巳知的方法(Nakamura et al.，1999，Nucleic Acids Res.，27(1)292)。中国仓鼠(Cricetulus griseus)依赖的密码子使用列于下表。
表.仓鼠中对于每1,000个密码子标准化的密码子使用频率。
编码C末端104个氨基酸片段的天然人核苷酸序列(Roseblad et al.，2000，Mol.Cell Neurosci.15(2)199；Baloh et al.，Neuron 211291)和合成基因的核苷酸序列的比对见图9，对其中变化了核苷酸作了标示。这两种序列具有83.33％的序列同一性。
实施例10神经胚素基因的克隆为了有助于连接至神经胚素5′端密码子的各种信号肽序列的插入，合成100个密码子(300个核苷酸)的神经胚素基因3′形式，并将其克隆入表达质粒。通过下述操作组配所述的100密码子-形式的神经胚素基因将40pmol的寡核苷酸KD3-464至KD3-469(表2)合并入200μL含Deep Vent聚合酶(New England BioLabs，Beverly，MA)的缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-Cl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.8)中。将内容物在95℃加热4分钟，然后进行20个下列循环95℃1分钟，60℃30秒，以及72℃1分钟，然后72℃延伸4分钟。用SalI和NheI连续消化制备所述末端。包含位于神经胚素两侧30个碱基的非-编码区的330个碱基片段通过凝胶纯化，然后连接入经凝胶纯化并经NheI和XhoI消化的质粒pFRT/dhfr-1(pcDNA/FRT的衍生物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其中的潮霉素基因被二氢叶酸还原酶基因所取代)。得到的质粒命名为pNBN026-35。pNBN026-35内的神经胚素序列显示于图10。
下表中给出了PCR中使用的寡核苷酸，以及为制备信号肽-神经胚素融合基因而进行组配的合成序列。所有序列都按照从5’至3’的方向。
表
实施例11信号肽-神经胚素融合体的构建对四种不同信号肽的编码序列进行了测试。这些序列中都包含来自神经胚素、大鼠白蛋白和人生长激素的信号序列。此外，合成信号序列得自在用于制备神经胚素信号肽的PCR扩增过程中的两个移码突变。使用寡核苷酸组配或者PCR方法合成所述融合体。将所述DNA片段连接入pNBN026。通过DNA序列分析，对所述四种分子中每一种的相关DNA序列进行验证。
通过PCR扩增合成信号序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-479，KD3-480，KD3-481，和KD3-482(表)以及puReTaq聚合酶(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反应条件包括将反应物95℃加热4分钟，然后进行20个下列循环95℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，然后72℃延伸4分钟。用PstI和XhoI消化制备末端。对所述330个碱基的片段进行凝胶纯化，然后连接入也经过凝胶纯化并用PstI-和XhoI消化的质粒pNBN026。得到的质粒命名为pNBN030。有两个自发的移码突变，它们未被预测到或者由互补且保持翻译蛋白质读框的寡核苷酸编码。所述DNA和蛋白质序列如图11所示。
通过PCR扩增合成神经胚素信号序列，使用寡核苷酸KD3-513和KD3-514(表)。使用的聚合酶为puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反应条件包括95℃加热4分钟，然后进行3个下列循环95℃ 1分钟，60℃30秒，72℃ 1分钟，然后72℃延伸4分钟。用NheI和XhoI消化制备末端。对所述330个碱基的片段进行凝胶纯化，然后连接入也经过凝胶纯化并用NheI和XhoI消化的质粒pNBN030。得到的质粒命名为pNBN038。所述DNA和蛋白质序列如图12所示。
通过PCR扩增合成白蛋白信号序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-471，和KD3-472(表)。使用的聚合酶为puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ)。PCR反应条件包括95℃加热4分钟，然后进行20个下列循环95℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，然后72℃延伸4分钟。用PstI和XhoI消化制备末端。将所述330个碱基的片段做凝胶纯化，然后连接入也已经过凝胶纯化并用PstI-和XhoI消化后的质粒pNBN026。得到的质粒命名为pNBN029。所述DNA和蛋白质序列如图13所示。
通过PCR扩增从质粒pV30(基于pUC的质粒，其中含有人生长激素基因5’末端的基因组拷贝)合成人生长激素信号序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-477和KD3-485(表2)。使用的聚合酶为puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反应条件包括95℃加热4分钟，然后进行20个下列循环95℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，然后72℃延伸4分钟。用PstI和XhoI消化制备末端。对所述330个碱基的片段进行凝胶纯化，然后连接入经过凝胶纯化并用PstI-和XhoI消化后的质粒pNBN026。得到的质粒命名为pNBN031。所述DNA和蛋白质序列如图14所示。
实施例12CHO细胞转染提前用含Flp Recombination Target(frt)的DNA序列转化CHO-DG44细胞(A1细胞)。这种A1宿主细胞系不含二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，因此是DHFR-阴性的。上述的每一种质粒都能编码DHFR基因，神经胚素融合基因，外加frt位点。质粒pOG44编码所述Flp重组酶基因。用这些质粒共转染A1细胞的结果是将单一拷贝的信号-肽-神经胚素融合基因和DHFR插入染色体。在与厂商描述一样的条件下(即0.4毫米透明小容器，280伏特，950微法)(BioRad，Hercules，California)，用目的质粒外加质粒pOG44A1对细胞进行电穿孔。根据能在补充了10％透析过的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的不含核苷的α-阴性培养基极限必需培养基Alpha(Minimal Essential Medium-Alpha)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长的能力，筛选出表达DHFR的转化细胞。大约两周后，分离集落，转移到盛装有相同培养基的较大容器中扩大培养。将细胞培养物转移到无血清培养基中进行分析。
实施例13转染的细胞系的分析筛选出能够表达神经胚素的侯选细胞系。为了从经调节的培养基分离细胞，对等份细胞培养物悬液离心。从细胞沉淀中取出经调节的培养基，然后将该培养基和该细胞沉淀进行处理，在16％聚丙烯酰胺凝胶上如通常所述那样进行还原型变性电泳(Ausubel et al.同上)。电泳完成时，将所述蛋白质电印迹到PVDF膜上，用抗神经胚素的兔多克隆抗血清进行检测。通过使用与辣根-过氧化物酶偶联的山羊抗-兔多克隆抗血清(BioRad，Hercules，California)，对所述抗体-神经胚素复合体进行检测蛋白质从编码神经胚素的、合成的、白蛋白的和人生长激素的信号肽的质粒表达，每一种质粒都表达细胞沉淀级分中的免疫-反应性神经胚素。但是，只有白蛋白和人生长激素信号肽表达在经调节的培养基中的可检测水平的神经胚素。所有表达的神经胚素多肽的电泳迁移率都与11kD，104-氨基酸形式的神经胚素一致。
实施例14CHO细胞中制备的神经胚素的序列使用免疫亲和柱从经调节的培养基纯化出神经胚素，如通常描述的那样(Ausubel et al.，同上)。测定从细胞系纯化的含白蛋白和生长激素信号肽的蛋白质的氨基-末端序列。将神经胚素加载到TFA微过滤物(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上，进行自动的Edman化学降解。氨基末端测序在ABI Procise 494测序仪上完成。得到的PTH氨基酸使用装有PTH C18反-相柱的ABI 140C Microgradient系统分离，使用ABI 7785A吸光度检测器进行分析。对于这两种构建体而言，原始蛋白质序列从全长神经胚素的104个C末端氨基酸片段的第一位残基(即丙氨酸)开始。另外，利用生长激素信号肽表达的神经胚素制剂还包含不含氨基-末端丙氨酸残基的103个氨基酸神经胚素C末端片段。所述103个氨基酸形式的神经胚素从丙氨酸开始。这两种情况下，信号肽发挥预期作用，即神经胚素多肽从细胞中分泌，信号肽被该细胞切除。
实施例15重组神经胚素的质谱分析从含有编码白蛋白和生长激素信号肽的构建体的细胞系的经调节的培养基纯化的神经胚素，利用完整光谱学在ZMD质谱仪(Waters，Milford，MA)如生产商通常描述的那样进行分析。对于两种构建体，去糖基化样本的第一个峰对应104个氨基酸的神经胚素多肽(图15)。这两种信号肽发挥预期作用，即神经胚素多肽从细胞中分泌，信号肽被该细胞切除。此外，从用编码神经胚素和生长激素信号肽的构建体转染的细胞分离的糖基化神经胚素包含各种的糖基化形式。
实施例16对来自用编码神经胚素和异源信号序列的构建体转染的CHO细胞的培养基中的神经胚素活性进行检测生物活性使用激酶受体活化ELISA(KIRA)测定。该方法此前已有描述(Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，1996.235(2)207。简而言之，NB41A3-mRL3细胞是表达Ret和GFRα3的附着性(adherent)鼠神经母细胞瘤细胞系，将该细胞以2×105个细胞/孔的密度接种于24-孔平板中补充了10％胎牛血清的Dulbecco′s改良eagle培养基(DMEM)内，然后在37℃和5％CO2条件下继续培养18小时。
用PBS洗涤细胞，然后用0.25mL含连续稀释的神经胚素的DMEM在37℃和5％CO2条件下处理10分钟。每一样本均以一式两份的方式进行分析。细胞用1mL PBS洗涤，然后在4℃用0.30mL 10mM Tris HCl，pH 8.0，0.5％Nonidet P40，0.2％去氧胆酸钠，50mM NaF，0.1mM Na3VO4，1mM苯甲磺酰氟裂解1小时，同时轻微振摇该平板。再通过反复吹打混匀裂解物，然后取0.25mL样本转移至96-孔ELISA板，该板已经用含5μg/mL抗-RetmAb(AA.GE7.3)(Upstate Biotechnology，Waltham，MA)的50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6 4℃包被了18小时，然后室温用封闭缓冲液(20mM Tris HClpH 7.5，150mM NaCl，0.1％Tween-20(TBST)，含1％普通小鼠血清和3％牛血清白蛋白)封闭1小时。
在室温保温2小时后，用TBST洗涤孔6次。再洗涤一次后向所述平板中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸。显色反应后，对仅用裂解物或裂解缓冲液处理过的孔读取450nm处的吸光度数值，背景-矫正信号绘制为用于刺激的配体浓度的函数。
对连续稀释的经调节的培养基进行测试，用与此前描述的一批从大肠杆菌表达、纯化及再折叠的神经胚素类似的方式对功能性神经胚素进行检测(图16)。
实施例17用异源的信号肽表达成熟神经胚素合适的寡核苷酸可按照实施例9描述的方法制备，以克隆编码成熟神经胚素的DNA序列(即，全长神经胚素的113C末端片段)。按照实施例10中的描述，可将编码大鼠白蛋白或人生长激素信号肽的DNA序列融合于编码成熟神经胚素多肽的DNA序列。可以将所述DNA序列转染入真核细胞，例如CHO细胞，以制备分泌的成熟神经胚素。
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在本脱离本发明实质和范围的前提下可以对本发明进行多种改进和变动，这一点对于本领域技术人员来说是显而易见的。本申请描述的具体实施方案，提供的目的仅仅是为了举例而决不应构成任何限制。说明书和实施例应当理解为只是举例，本发明真正的范围和实质由权利要求来限定。
序列SEQ ID NO类型 描述1 PIgSP人2 PIgSP猴3 PIgSP狨4 PIgSP小鼠5 PIgSP猪6 PIgSP大鼠7 N嵌合小鼠IgSP-人113NBN构建体的核苷酸序列8 NSEQ ID No 7的拼接转录本9 PSEQ ID NO 8和7编码的嵌合蛋白质10P人前原神经胚素11P小鼠前原神经胚素12P大鼠前原神经胚素13P成熟的人116氨基酸(aa)神经胚素14P成熟的人113aa神经胚素15P成熟的小鼠119aa神经胚素16P成熟的小鼠116aa神经胚素17P成熟的大鼠116aa神经胚素18P成熟的大鼠113aa神经胚素19PN-末端截短的人104aa神经胚素20PN-末端截短的人99aa神经胚素21PN-末端截短的人140aa神经胚素22PN-末端截短的人106aa神经胚素23PN-末端截短的人102aa神经胚素24P人NBN-SP25Pdelta原NBN14026Pdelta原NBN113
27Pdelta原NBN10628Pdelta原NBN10429Pdelta原NBN10230Pdelta原NBN9931P小鼠IgSP-人140NBN嵌合蛋白32P小鼠IgSP-人113NBN嵌合蛋白33P小鼠IgSP-人106NBN嵌合蛋白34P小鼠IgSP-人104NBN嵌合蛋白35P小鼠IgSP-人102NBN嵌合蛋白36P小鼠IgSP-人99NBN嵌合蛋白37P大鼠白蛋白信号肽38P大鼠AlbSP-人140NBN嵌合蛋白39P大鼠AlbSP-人113NBN嵌合蛋白40P大鼠AlbSP-人106NBN嵌合蛋白41P大鼠AlbSP-人104NBN嵌合蛋白42P大鼠AlbSP-人102NBN嵌合蛋白43P大鼠AlbSP-人99NBN嵌合蛋白44P经修饰的大鼠白蛋白信号肽45PModAlbSP-人140NBN嵌合蛋白46PModAlbSP-人113NBN嵌合蛋白47PModAlbSP-人106NBN嵌合蛋白48PModAlbSP-人104NBN嵌合蛋白49PModAlbSP-人102NBN嵌合蛋白50PModAlbSP-人99NBN嵌合蛋白51P人生长激素信号肽52PGHSP-人140NBN嵌合蛋白53PGHSP-人113NBN嵌合蛋白54PGHSP-人106NBN嵌合蛋白55PGHSP-人104NBN嵌合蛋白56PGHSP-人102NBN嵌合蛋白57PGHSP-人99NBN嵌合蛋白
58N人104NBN核苷酸序列59N合成的104NBN的核苷酸序列60N质粒pNBN026-35中的神经胚素序列61N合成SP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列62P合成SP-合成104NBN的嵌合蛋白63NNBNSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列64PNBNSP-合成104NBN的嵌合蛋白65NAlbSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列66PAlbSP-合成104NBN的嵌合蛋白67N含内含子GHSP-合成104NBN嵌合核苷酸序列68PGHSP-合成104NBN的嵌合蛋白69NModAlbSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列70PModAlbSP-合成104NBN的嵌合蛋白71N引物KD3-46472N引物KD3-46573N引物KD3-46674N引物KD3-46775N引物KD3-46876N引物KD3-46977N引物KD3-47178N引物KD3-47279N引物KD3-47780N引物KD3-47981N引物KD3-48082Ndelta原NBN113核苷酸序列序列表<110>NsGene公司(NsGene A/S)比奥根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.)Groborg，MetteWahlberg，LarsTorno，JensKusk，PhilipPederson，Nels E.
Sisk，William P.
<120>增加的神经胚素分泌<130>P 951 PC00<160>82<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15Thr His Ala<210>2<211>19<212>PRT<213>猕猴(Macaca mulatta)<400>2Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15Val Leu Ser<210>3<211>19<212>PRT<213>狨(Callithrix jacchus)<400>3Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15Ala His Ser<210>4<211>19<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>4Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser<210>5<211>19<212>PRT<213>野猪(Sus scrofa)<400>5Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly1 5 10 15Val Gln Gly<210>6<211>19<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>6Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser<210>7<211>478<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
<221>内含子<222>(47)..(125)<220>
<221>外显子<222>(1)..(46)<220>
<221>外显子<222>(126)..(478)<400>7atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca g 46Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr1 5 10 15gtaaggggct cccaagtccc aaacttgagg gtccataaac tctgtgacag tggcaatcac106tttgcctttc tttctacag gg gtg aat tcg gct ggg ggc ccg ggc agc cgc 157Gly Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg20 25gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg 205Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val30 35 40ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt 253Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg45 50 55ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca cac gac 301Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp60 65 70ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg 349Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro75 80 85 90ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa 397Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu95 100 105gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc 445Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg110 115 120ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tga 478Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly125 130<210>8<211>399
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
<221>CDS<222>(1)..(399)<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>鼠IgSP<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(396)<223>人113神经胚素<400>8atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15gtg aat tcg gct ggg ggc ccg ggc agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg 96Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala20 25 30cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc144Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly35 40 45ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc192Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly50 55 60tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca cac gac ctc agc ctg gcc agc cta240Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu65 70 75 80ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc288Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser85 90 95cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac336Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp100 105 110gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc384Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys115 120 125ggc tgc ctg ggc tga399Gly Cys Leu Gly130
<220>
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(396)<223>人113神经胚素<400>9Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala20 25 30Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly35 40 45Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly50 55 60Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu65 70 75 80Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser85 90 95Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp100 105 110Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys115 120 125Gly Cys Leu Gly130<210>10<211>220<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<223>全长人神经胚素<220>
<221>信号
<222>(1)..(39)<220>
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>10Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80 -75 -70 -65Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg-15 -10 -5 -1Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1 5 10 15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20 25 30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35 40 45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50 55 60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65 70 75 80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85 90 95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>11<211>224<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>11Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg-80 -75 -70 -65Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg-15 -10 -5 -1Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala1 5 10 15Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala20 25 30
Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg35 40 45Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser50 55 60Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg65 70 75 80Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly85 90 95Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys100 105 110Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr115 120 125Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>12<211>224<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>12Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg-80 -75 -70 -65Pro Arg Trp Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Ser Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
-45 -40 -35Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Ala Leu Arg-15 -10 -5 -1Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala1 5 10 15Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala20 25 30Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg35 40 45Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser50 55 60Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg65 70 75 80Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ala Gly85 90 95Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys100 105 110Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr115 120 125Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>13<211>116<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala1 5 10 15
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly20 25 30Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35 40 45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50 55 60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65 70 75 80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp85 90 95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>14<211>113<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leul00 105 110Gly<210>15<211>119<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>15Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr1 5 10 15Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser20 25 30Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe35 40 45Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu50 55 60Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg65 70 75 80Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser85 90 95Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala100 105 110Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly115<210>16<211>116<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>16Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala1 5 10 15
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly20 25 30Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35 40 45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50 55 60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser65 70 75 80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp85 90 95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>17<211>116<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>17Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala1 5 10 15Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly20 25 30Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35 40 45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50 55 60Leu Asp Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser65 70 75 80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
85 90 95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>18<211>113<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>18Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>19<211>104<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
1 5 10 15Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg20 25 30Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser35 40 45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50 55 60Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val65 70 75 80Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser85 90 95Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100<210>20<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu1 5 10 15Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser20 25 30Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu35 40 45Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln50 55 60Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val65 70 75 80Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly85 90 95
Cys Leu Gly<210>21<211>140<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1 5 10 15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20 25 30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35 40 45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50 55 60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65 70 75 80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85 90 95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>22<211>106<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val1 5 10 15
Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg20 25 30Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp35 40 45Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro50 55 60Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu65 70 75 80Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg85 90 95Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>23<211>102<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala1 5 10 15Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys20 25 30Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala35 40 45Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro50 55 60Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe65 70 75 80Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr85 90 95Ala Cys Gly Cys Leu Gly100
<210>24<211>39<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp1 5 10 15Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20 25 30Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala35<210>25<211>179<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>delta原人NBN140<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>25Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala-5 -1 1 5Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala10 15 20 25Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg30 35 40
Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu45 50 55Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser60 65 70Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu75 80 85Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln90 95 100 105Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val110 115 120Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly125 130 135Cys Leu Gly140<210>26<211>152<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>delta原人NBN113<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>26Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg
-5 -1 1 5Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val10 15 20 25Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg30 35 40Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser45 50 55Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser60 65 70Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val75 80 85Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser90 95 100 105Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly110<210>27<211>145<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>delta原人NBN106<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
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Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg45 50 55Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr60 65 70Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr75 80 85Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90 95 100<210>30<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>delta原人NBN99<220>
<221>信号<222>(1)..(39)<220>
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45 50 55Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu60 65 70Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg75 80 85Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90 95<210>31<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>信号<222>(1)..(19)<220>
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<223>鼠IgSP-人NBN102<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
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<223>鼠IgSP-人NBN99
<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
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<223>大鼠白蛋白信号肽-NBN140<220>
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<223>大鼠白蛋白信号肽-NBN106<220>
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<223>大鼠白蛋白信号肽-NBN104
<220>
<221>信号<222>(1)..(18)<220>
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>41Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val-1 1 5 10Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg15 20 25 30Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp35 40 45Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro50 55 60Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu65 70 75Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg80 85 90Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95 100<210>42<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大鼠白蛋白信号肽-NBN102<220>
<221>信号<222>(1)..(18)<220>
<221>mat_肽
<222>(19)..()<400>42Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val-1 1 5 10Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg15 20 25 30Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser35 40 45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50 55 60Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val65 70 75Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser80 85 90Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95 100<210>43<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大鼠白蛋白信号肽-NBN99<220>
<221>信号<222>(1)..(18)<220>
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>43Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5
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<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN140<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)<220>
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>45Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro-1 1 5 10Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly15 20 25Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu30 35 40 45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50 55 60Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65 70 75Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala80 85 90Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg95 100 105Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp110 115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>46<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN113<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>46Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala-1 1 5 10Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly15 20 25Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly30 35 40 45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50 55 60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65 70 75Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp80 85 90Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys95 100 105Gly Cys Leu Gly110<210>47<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN106<220>
<221>信号<222>(1)..(19)
<220>
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>47Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser-1 1 5 10Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu15 20 25Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser30 35 40 45Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg50 55 60Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr65 70 75Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr80 85 90Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95 100 105<210>48<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN104<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>48Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp
-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu-1 1 5 10Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val15 20 25Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His30 35 40 45Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro50 55 60Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr65 70 75Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp80 85 90Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95 100<210>49<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN102<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
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<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN99<220>
<221>信号<222>(1)..(19)<220>
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>50Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala-1 1 5 10Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys15 20 25Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala30 35 40 45
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<223>人生长激素SP-NBN140<220>
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<223>人生长激素SP-NBN113<220>
<221>信号<222>(1)..(26)<220>
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<223>人生长激素SP-NBN106<220>
<221>信号<222>(1)..(26)<220>
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>54Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala
-10 -5 -1 1 5Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly10 15 20Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly25 30 35Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu40 45 50Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser55 60 65 70Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp75 80 85Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys90 95 100Gly Cys Leu Gly105<210>55<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长激素SP-NBN104<220>
<221>信号<222>(1)..(26)<220>
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>55Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly-10 -5 -1 1 5
Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly10 15 20His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys25 30 35Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly40 45 50Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro55 60 65 70Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn75 80 85Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys90 95 100Leu Gly<210>56<211>128<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长激素SP-NBN102<220>
<221>信号<222>(1)..(26)<220>
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>56Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg-10 -5 -1 1 5Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg10 15 20
Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg25 30 35Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly40 45 50Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys55 60 65 70Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr75 80 85Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90 95 100<210>57<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生长激素SP-NBN99<220>
<221>信号<222>(1)..(26)<220>
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>57Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser-10 -5 -1 1 5Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu10 15 20Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser25 30 35Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg40 45 50
Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr55 60 65 70Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr75 80 85Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90 95<210>58<211>312<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<223>NBN104核苷酸序列<400>58gcagcggggg cgcggggctg ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc 60ctgggccacc gctccgacga gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc120gcgcgctctc cacacgacct cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg180cccccgggct cccggcccgt cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc240tccttcatgg acgtcaacag cacctggaga accgtggacc gcctctccgc caccgcctgc300ggctgcctgg gc312<210>59<211>312<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成NBN104核苷酸序列<400>59gccgccggcg ctcgaggctg ccggctgcgg tcccagctgg tgcctgtgcg ggccctgggc 60ctgggccacc ggtccgacga gctggtgcgg ttccggttct gctccggctc ctgccggcgg120gcccggtccc ctcacgacct gtccctggcc tccctgctgg gcgccggcgc cctgcggcct180cctcctggct cccggcctgt gtcccagcct tgctgccggc ctacccggta cgaggccgtg240tccttcatgg acgtgaactc cacctggegg accgtggacc ggctgtccgc caccgcctgc300ggctgcctgg gc312
<210>60<211>303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pNBN026-35中编码NBN99的序列<400>60cgaggctgcc ggctgcggtc ccagctggtg cctgtgcggg ccctgggcct gggccaccgg 60tccgacgagc tggtgcggtt ccggttctgc tccggctcct gccggcgggc ccggtcccct120cacgacctgt ccctggcctc cctgctgggc gccggcgccc tgcggcctcc tcctggctcc180cggcctgtgt cccagccttg ctgccggcct acccggtacg aggccgtgtc cttcatggac240gtgaactcca cctggcggac cgtggaccgg ctgtccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc300tga 303<210>61<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成SP-NBN104合成<400>61atgagctggg cctgggcggc ctgtccaccc tgtcccactg cccttggcct cggcggcagt 60gccctgtggc ctaccctggc cgccctggcc ctgctgtcct ccgtggccga ggccgccgcc120ggcgctcgag gctgccggct gcggtcccag ctggtgcctg tgcgggccct gggcctgggc180caccggtccg acgagctggt gcggttccgg ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg240tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg ctgggcgccg gcgccctgcg gcctcctcct300ggctcccggc ctgtgtccca gccttgctgc cggcctaccc ggtacgaggc cgtgtccttc360atggacgtga actccacctg gcggaccgtg gaccggctgt ccgccaccgc ctgcggctgc420ctgggc 426<210>62<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成SP-NBN104合成氨基酸序列
<400>62Met Ser Trp Ala Trp Ala Ala Cys Pro Pro Cys Pro Thr Ala Leu Gly1 5 10 15Leu Gly Gly Ser Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu20 25 30Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg35 40 45Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp50 55 60Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg65 70 75 80Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu85 90 95Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro100 105 110Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg115 120 125Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>63<211>432<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NBN信号肽-合成NBN104<400>63atggagctgg gcctgggcgg cctgtccacc ctgtcccact gcccttggcc tcggcggcag 60cctgccctgt ggcctaccct ggccgccctg gccctgctgt cctccgtggc cgaggccgcc120gccggcgctc gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg180ggccaccggt ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc240cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct300
cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc360ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc420tgcctgggct ga432<210>64<211>143<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>NBN信号肽-NBN104合成序列<400>64Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp1 5 10 15Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20 25 30Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu35 40 45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50 55 60Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65 70 75 80Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala85 90 95Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg100 105 110Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>65<211>369<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>白蛋白信号肽-NBN104合成<400>65atgaagtggg tgaccttcct gctgctgctg ttcatctccg gctccgcctt ctccgccgcc 60ggcgctcgag gctgccggct gcggtcccag ctggtgcctg tgcgggccct gggcctgggc120caccggtccg acgagctggt gcggttccgg ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg180tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg ctgggcgccg gcgccctgcg gcctcctcct240ggctcccggc ctgtgtccca gccttgctgc cggcctaccc ggtacgaggc cgtgtccttc300atggacgtga actccacctg gcggaccgtg gaccggctgt ccgccaccgc ctgcggctgc360ctgggctga369<210>66<211>122<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>白蛋白信号肽-NBN104合成序列<400>66Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala1 5 10 15Phe Ser Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val20 25 30Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg35 40 45Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp50 55 60Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro65 70 75 80Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu85 90 95Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg100 105 110Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
115 120<210>67<211>662<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>具有内含子的GHSP-NBN104合成序列<400>67atggctacag taagcgcccc taaaatccct ttgggcacaa tgtgtcctga ggggagaggc 60ggcgtcctgt agatgggacg ggggcactaa ccctcaggtt tggggcttat gaatgttagt120atcgccatct aagcccagta tttggccaat ctccgaatgt tcctggtccc tggagggagg180cagagagaga gagaaaaaaa aaaacccagc tcctggaaca gggagagcgc tggcctcttg240ctctccagct ccctctgttg ccctccggtt tctccccagg ctcccggacg tccctgctcc300tggcttttgg cctgctctgc ctgtcctggc ttcaagaggg cagtgccgcc gccggcgctc360gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg ggccaccggt420ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc cggtcccctc480acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct cctggctccc540ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc ttcatggacg600tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc tgcctgggct660ga 662<210>68<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GHSP-NBN104合成序列<400>68Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly20 25 30Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly35 40 45
His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys50 55 60Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly65 70 75 80Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro85 90 95Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn100 105 110Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys115 120 125Leu Gly130<210>69<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的白蛋白信号肽序列-NBN104合成序列<400>69atgaagtggg tgaccttcct gctgttcctg ctgttcatct ccggcgatgc cttcgctgcc 60gccggcgctc gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg120ggccaccggt ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc180cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct240cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc300ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc360tgcctgggct ga372<210>70<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修饰的大鼠白蛋白信号肽-NBN104合成序列
<400>70Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp15 10 15Ala Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu20 25 30Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val35 40 45Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His50 55 60Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro65 70 75 80Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr85 90 95Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp100 105 110Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly115 120<210>71<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>71aagcttgcta gcatgaattc atctcgaggc tgccggctgc ggtcccagct ggtgcctgtg60cgggccctgg gcctgggcca c 81<210>72<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>72
ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg60ctgggcgccg gcgccctgcg g 81<210>73<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>73cagccttgct gccggcctac ccggtacgag gccgtgtcct tcatggacgt gaactccacc60tggcggaccg tggaccggct g 81<210>74<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>74ggcccgccgg caggagccgg agcagaaccg gaaccgcacc agctcgtcgg accggtggcc60caggcccagg gcccgcacag g 81<210>75<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>75gtaccgggta ggccggcagc aaggctggga cacaggccgg gagccaggag gaggccgcag60ggcgccggcg cccagcaggg a 81<210>76<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>76cttggaattg tcgacggatc ctcagcccag gcagccgcag gcggtggcgg acagccggtc60
cacggtccgc caggtgga 78<210>77<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>77aagcttagct agcggatcca tgaagtgggt gaccttcctg ctgctgctgt tcatc 55<210>78<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>78ggcagcctcg agcgccggcg gcggagaagg cggagccgga gatgaacagc agcagcagga60a61<210>79<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>79aagcttagct agcggatcca tggctacagg taagc 35<210>80<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>80aagcttagct agcggatcca tggagctggg cctgggcggc ctgtccaccc tgtc 54<210>81<211>55<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>81ggcggcagcc tgccctgtgg cctaccctgg ccgccctggc cctgctgtcc tccgt 55<210>82<211>492<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>delta原人113核酸序列<400>82tataggatcc gccaccatgg aacttggact tggaggcctc tccacgctgt cccactgccc 60ctggcctagg cggcagcctg ccctgtggcc caccctggcc gctctggctc tgctgagcag120cgtcgcagag gccgctgggg gcccgggcag ccgcgctcgg gcagcggggg cgcggggctg180ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc ctgggccacc gctccgacga240gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc gcgcgctctc cacacgacct300cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg cccccgggct cccggcccgt360cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc tccttcatgg acgtcaacag420cacctggaga accgtggacc gcctctccgc caccgcctgc ggctgcctgg gctgagggct480cgctcgagta ta49权利要求
1.用于制备生物学活性神经胚素多肽的方法，该方法包括培养含有表达载体的细胞，该表达载体包含启动子序列，所述启动子序列可操作地连接于编码信号肽和神经胚素多肽的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列不编码神经胚素原-区。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的信号肽是异源的信号肽。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的信号肽是哺乳动物信号肽。
4.权利要求3所述的方法，其中所述信号肽为人信号肽、大鼠信号肽、小鼠信号肽、猪信号肽、猿信号肽、犬信号肽、猫信号肽、牛信号肽或者马信号肽。
5.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述信号肽选自生长因子信号肽、激素信号肽、细胞因子信号肽和免疫球蛋白信号肽组成的组。
6.权利要求5所述的方法，其中所述信号肽选自TGFβ信号肽、GDF信号肽、IGF信号肽、BMP信号肽、神经营养因子信号肽、PDGF信号肽和EGF信号肽组成的组。
7.权利要求5所述的方法，其中所述信号肽选自激素信号肽，所述激素选自生长激素、胰岛素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH、T3、T4、和DHEA组成的组。
8.权利要求5所述的方法，其中所述信号肽为白细胞介素信号肽。
9.权利要求5所述的方法，其中所述信号肽选自neurturin信号肽、GDNF信号肽、persephin信号肽和NGF信号肽组成的组。
10.权利要求1所述的方法，其中所述信号肽选自白蛋白信号肽、经修饰的白蛋白信号肽和生长激素信号肽组成的组。
11.权利要求10所述的方法，其中所述信号肽选自大鼠白蛋白信号肽、经修饰的大鼠白蛋白信号肽和人生长激素信号肽组成的组，诸如大鼠白蛋白信号肽和人生长激素信号肽。
12.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述信号肽是合成的信号肽，诸如包含SEQ ID NO70的信号肽。
13.权利要求1所述的方法，其中所述信号肽为免疫球蛋白信号肽。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的信号肽选自小鼠IgSP(SEQID NO 4)、大鼠IgSP(SEQ ID NO 6)、猪IgSP(SEQ ID NO 5)、猿IgSP(SEQ ID NO 2或3)、人IgSP(SEQ ID NO 1)组成的组。
15.权利要求13所述的方法，其中所述的IgSP是小鼠IgSP(SEQ IDNO 4)。
16.权利要求13所述的方法，其中所述的IgSP是人IgSP(SEQ ID NO1)。
17.权利要求1所述的方法，其中所述的信号肽是天然的神经胚素信号肽。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的信号肽是天然的人神经胚素信号肽。
19.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述的神经胚素多肽选自成熟的NBN、N-末端截短的NBN、突变的NBN或者突变且N-截短的NBN，所述成熟NBN选自具有以下序列的神经胚素SEQ ID No 10的1-140位氨基酸，或SEQ ID No 11或12的1-144位氨基酸，SEQ ID NO 13、14、15、16、17或18所示序列。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的神经胚素多肽为成熟的NBN，所述成熟NBN选自具有SEQ ID No 13，14，15，16，16，17或18所示序列的神经胚素组成的组。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的神经胚素多肽为人成熟113NBN(SEQ ID No 14)。
22.上述权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述的神经胚素多肽选自以下序列组成的组人神经胚素的116个C-末端氨基酸、人神经胚素的115个C-末端氨基酸、人神经胚素的114个C-末端氨基酸、人神经胚素的113个C-末端氨基酸、人神经胚素的112个C-末端氨基酸、人神经胚素的111个C-末端氨基酸、人神经胚素的109个C-末端氨基酸、人神经胚素的108个C-末端氨基酸、人神经胚素的107个C-末端氨基酸、人神经胚素的106个C-末端氨基酸、人神经胚素的105个C-末端氨基酸、人神经胚素的104个C-末端氨基酸、人神经胚素的103个C-末端氨基酸、人神经胚素的102个C-末端氨基酸、人神经胚素的101个C-末端氨基酸、人神经胚素的100个C-末端氨基酸和人神经胚素的99个C-末端氨基酸。
23.权利要求1所述的方法，其中所述的神经胚素多肽选自含SEQ IDNO 10的106、104、102或99个C-末端氨基酸的N-末端截短的神经胚素组成的组。
24.权利要求1所述的方法，其中所述的神经胚素多肽选自人神经胚素的116个C-末端氨基酸、人神经胚素的113个C-末端氨基酸、人神经胚素的104个C-末端氨基酸、人神经胚素的116个C-末端氨基酸组成的组。
25.权利要求1所述的方法，其中所述N-末端截短的神经胚素具有SEQ ID No 19所示的氨基酸序列。
26.权利要求1所述的方法，其中所述N-末端截短的神经胚素包含SEQ ID NO 20所示的99个氨基酸。
27.权利要求1所述的方法，其中所述的神经胚素多肽包含源自SEQID No14的8-113位氨基酸的氨基酸序列，其中所述的变体神经胚素多肽包含一个或多个选自下组的氨基酸取代位于该变体多肽氨基酸序列中第14位的除精氨酸以外的氨基酸，位于该变体多肽氨基酸序列中第39位的除精氨酸以外的氨基酸，位于该变体多肽氨基酸序列中第68位的除精氨酸以外的氨基酸，和位于该变体多肽氨基酸序列中第95位的除天冬酰胺以外的氨基酸，其中所述的氨基酸位置根据多肽序列SEQ ID NO14进行编号。
28.权利要求27所述的方法，其中在第14、39或68位上的取代为赖氨酸。
29.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体是质粒。
30.上述权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
31.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体是哺乳动物表达载体。
32.权利要求30所述的方法，其中所述的载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。
33.权利要求32所述的方法，其中所述载体颗粒由慢病毒载体产生，所述慢病毒载体含有5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接于编码所述信号肽和所述神经胚素肽的多核苷酸信号的启动子、第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR。
34.权利要求30所述的方法，其中所述载体选自反转录病毒，诸如HIV，SIV，FIV，EIAV，AAV，腺病毒，疱疹病毒，和MoMLV组成的组。
35.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述的启动子选自泛醌启动子，CMV启动子，JeT启动子，SV40启动子，和延伸因子1α启动子(EF1-α)，小鸡β-肌动蛋白，PGK，和MT-1组成的组。
36.权利要求34所述的方法，其中所述的启动子为可诱导/可抑制型启动子，诸如Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素-可诱导型启动子、Mx1和RU486。
37.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物宿主细胞。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的哺乳动物选自啮齿类动物、兔、犬、猫、猪、猴、人组成的组。
39.权利要求37所述的方法，其中所述的细胞选自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胚胎细胞，ARPE-19，永生化的成纤维细胞，C2C12，HeLa，HepG2，视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞，纹状体细胞，神经元，星形细胞，中间神经元组成的组。
40.权利要求39所述的方法，其中所述的细胞为CHO细胞。
41.包含编码信号肽和神经胚素多肽的多核苷酸序列的核酸，其中所述的多核苷酸序列不编码神经胚素原-区，其中所述信号肽和所述神经胚素肽如权利要求1-40中任一项所限定。
42.权利要求41所述的核酸，其中包含a)SEQ ID NO64，66，或68所示的核苷酸序列，或者b)编码SEQ ID NO65，67，或69所示多肽的核苷酸序列。
43.权利要求41或42所述的核酸，其中所述的核苷酸序列已经被优化用以在哺乳动物中表达。
44.含有权利要求41-43中任一项所述核酸的表达载体。
45.药物组合物，其中含有权利要求44所述载体以及一种或多种药物学可接受的佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
46.由权利要求44所述载体转导或转染的分离的宿主细胞。
47.权利要求46所述的细胞，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
48.权利要求47所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够分泌超过500ng/106个细胞/24小时的量的神经胚素或其功能对等物。
49.权利要求47所述的哺乳动物细胞，其选自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，永生化的成纤维细胞，C2C12，HeLa，HepG2，RPE细胞系，和ARPE-19细胞组成的组。
50.权利要求48所述的哺乳动物细胞，选自CHO，HEK293，COS，和ARPE-19组成的组。
51.权利要求47所述的哺乳动物细胞，选自RPE细胞，神经元细胞，神经元前体细胞，干细胞，和胚胎细胞组成的组。
52.权利要求47所述的细胞，其能结合于支持基质。
53.能够产生感染性载体颗粒的包装细胞系，其中所述的载体颗粒含有源自反转录病毒的基因组，该基因组包含5’反转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接于编码信号肽和神经胚素多肽的多核苷酸序列的启动子、第二链DNA合成起点以及3’反转录病毒LTR，其中所述的核苷酸序列不编码神经胚素原-区，且所述信号肽和神经胚素肽如权利要求1-40中任一项所限定。
54.权利要求53所述的包装细胞系，其中所述的载体颗粒是复制缺陷型的。
55.权利要求53所述的包装细胞系，其中所述的基因组是慢病毒来源的，所述的LTR是慢病毒LTR。
56.转基因非人哺乳动物，其中含有至少一个由权利要求44所述载体转导或转染的细胞。
57.权利要求56所述的哺乳动物，其中所述的至少一个经转导或者转染的细胞含有所述哺乳动物的基因组。
58.可植入的细胞培养装置，该装置包括i.容许生长因子扩散通过的半透膜；和ii.至少一个权利要求46所述的分离的宿主细胞。
59.权利要求56所述的装置，其中所述半透膜是免疫隔离的。
60.权利要求56所述的装置，其中所述半透膜是多微孔的。
61.权利要求56所述的装置，其中所述装置进一步还包括置于所述半透膜内的基质。
62.权利要求56所述的装置，其中所述装置进一步还包括束缚性锚定物(tether anchor)。
63.权利要求44所述载体或权利要求56-60中任一项所述装置作为药物的用途。
64.权利要求44所述载体在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途。
65.权利要求64所述的用途，其中所述神经系统疾病选自周围神经病，包括神经病性疼痛，脊髓损伤，脊神经根性撕脱伤，三叉神经痛和灼痛组成的组。
66.权利要求63所述的用途，其中所述的药物用于治疗眼部疾病，所述眼部疾病，诸如角膜损伤和溃疡，以及视网膜病变。
67.权利要求44所述载体在制备用于治疗CNS疾病的药物中的用途。
68.权利要求67所述的用途，其中所述的CNS疾病是神经变性疾病。
69.权利要求64所述的用途，其中所述神经变性疾病是外周神经病，包括神经病性疼痛。
70.一种治疗神经系统疾病的方法，该方法包括向需要的个体施用i.治疗有效量的权利要求44所述的载体；或者ii.治疗有效量的权利要求45所述的药物组合物。
71.权利要求70所述的方法，其中所述载体经肌内、皮下、或腹腔内施用。
72.权利要求70所述的方法，其中所述载体或组合物施用至参与痛觉传输的身体区域。
73.权利要求70所述的方法，其中所述载体或组合物经鞘内施用或者施用至脊髓。
74.权利要求70所述的方法，其中所述载体施用至脑，包括实质和脑室。
75.权利要求70所述的方法，其中所述载体施用入眼，包括玻璃体，视网膜下隙，和支持包囊(sub-tenar capsule)。
76.权利要求70所述的方法，其中所述神经系统疾病选自外周神经病，包括神经病性疼痛，脊髓损伤，脊神经根性撕脱伤，三叉神经痛，灼痛，角膜损伤，和视网膜病变组成的组。
77.治疗神经系统疾病的方法，该方法包括向需要的个体移植治疗有效量的权利要求46所述细胞。
78.权利要求77所述的方法，其中所述移植包括自体移植、同种异体移植或异种移植。
79.权利要求77所述的方法，其中所述细胞经鞘内施用或者施用至脊髓。
80.权利要求77所述的方法，其中所述细胞施用至脑，包括实质和脑室。
81.权利要求77所述的方法，其中将所述细胞施用至眼内，包括玻璃体，视网膜下隙，和支持包囊。
82.权利要求77所述的方法，其中所述神经系统疾病选自外周神经病，包括神经病性疼痛，脊髓损伤，脊神经根性撕脱伤，三叉神经痛，灼痛，角膜损伤，和视网膜病变组成的组。
83.一种治疗神经系统疾病的方法，该方法包括向需要的个体移植权利要求56所述的可植入装置。
84.权利要求77所述的方法，其中所述移植包括自体移植、同种异体移植或异种移植。
85.权利要求83所述的方法，其中所述装置经鞘内植入或者植入至脊髓。
86.权利要求83所述的方法，其中所述装置经植入施用于脑，包括实质和脑室。
87.权利要求83所述的方法，其中所述装置经植入施用于眼，包括玻璃体，视网膜下隙，和支持包囊。
88.权利要求83所述的方法，其中所述神经系统疾病选自外周神经病，包括神经病性疼痛，脊髓损伤，脊神经根性撕脱伤，三叉神经痛，灼痛，角膜损伤，和视网膜病变组成的组。
89.上述权利要求72-80中任一项所述的方法，用于治疗神经病性疼痛，该方法包括向需要的个体给予治疗有效量的权利要求44所述的载体，或权利要求46-50中任一项所述的细胞的组合物，或权利要求56所述的细胞装置。
90.神经胚素肽，包含信号肽和神经胚素肽，其中所述多肽缺乏神经胚素原-区。
91.权利要求90所述的多肽，其中所述神经胚素肽融合于所述信号肽。
92.权利要求91所述的多肽，所述信号肽的C-末端通过肽键与所述神经胚素肽的N-末端相连接。
93.上述权利要求90-92中任一项所述的多肽，其中所述的信号肽是异源信号肽。
94.上述权利要求90-93中任一项所述的多肽，其中所述的信号肽如权利要求1-40之一所定义。
95.权利要求94所述的多肽，其中所述信号肽选自以下信号肽组成的组天然大鼠白蛋白信号肽，经修饰的大鼠白蛋白信号肽，和人生长激素信号肽。
96.上述权利要求90-94中任一项所述的多肽，其中所述的信号肽是神经胚素信号肽。
97.上述权利要求90-94中任一项所述的多肽，其中所述的信号肽是IgSP。
全文摘要
本发明涉及用于制备神经胚素多肽以及通过基因治疗将神经胚素局部递送至神经系统特定区域的方法和组合物，所述神经系统包括例如中枢神经系统和眼。所述的生物活性神经胚素多肽是由不编码天然神经胚素原－区的构建体制备的，所述构建体包含一种核酸，该核酸含有可操作连接于编码信号肽和神经胚素多肽的核苷酸序列的启动子，其中所述核苷酸序列不编码神经胚素原－区。
文档编号A61P25/28GK1835971SQ200480022946
公开日2006年9月20日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者拉斯·U·沃尔伯格, 梅特·格朗伯格, 菲利普·库斯克, 詹斯·托诺埃, 内尔斯·E·佩德森, 威廉·P·西斯克 申请人:Ns基因公司, 比奥根艾迪克Ma公司