专利名称：白内障、黄斑变性和其它眼科疾病的改善的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请是2003年5月19日提交的美国申请10/440,583的部分继续，还要求2003年11月20日提交的美国临时申请60/523,803的优先权，在此将每个文件全文引用作为参考。
发明领域 本发明涉及改善患者眼睛白内障发展的组合物和实现这些改进的方法。在本发明的优选实施方案中，白内障发展或生长基本停止。本发明还涉及眼睛中黄斑变性的治疗和某些其它的用途。根据优选实施方案，本发明的所述组合物能够无需注射对患者进行施用，并且能够被配制成眼药水以进行这样的施用。本发明还提供了治疗白内障和黄斑变性的方法，以作为制备本发明的实际操作中有用的新化合物和组合物的方法。
背景技术：
本发明参考了诸多专利和其它公开出版物。本文中将每个这些专利和出版物的内容都全文引用作为参考。本文还将申请日为2003年5月19日的共有未决的美国申请10/440,583全文引用作为参考。
老化相关性白内障是眼睛的晶状体逐渐浑浊化的结果。目前，该疾病是通过手术去除和替换染病的晶状体进行治疗的。通常认为，一旦开始，白内障的发展就会以一种或多种常规途径进行下去，直至对晶状体纤维造成损伤。这种疾病发展缓慢且多发于老年人。或者，白内障也可能是由于对患者进行手术、辐射或药物治疗后形成的，例如在进行了修复视网膜损伤(玻璃体切割术)或降低较高的眼内压的眼睛手术之后；肿瘤的X光辐射；或类固醇药物治疗。在这样的患者中，白内障发展速率的明显延迟免除了诸多手术摘除白内障的必要。这一需要的降低为患者个人和公共健康系统都带了了巨大的益处。
一种较不严重但更普遍存在的眼睛晶状体疾病是老花眼。晶状体被强韧的胶原夹膜所包被，认为该夹膜影响了晶状体的柔韧性，使得其通过睫状肌控制的曲率改变在不同的距离聚焦。随着晶状体的老化，其体积逐渐增大，因此逐渐丧失了弹性，从而减弱了个体对较近物体的聚焦能力。这种疾病被称为老花眼，在老龄人群中发生比率较高。
除了白内障和老花眼，眼睛还会罹患多种疾病和影响其行使正常功能的其它不利病症。大多数这些不利病症都发生于眼睛的内部、尤其是眼睛的后部，那里有视神经和视网膜，7层交替细胞以及将光信号转化成神经信号的过程。视神经和视网膜的疾病和退化病症是世界范围内失明的首要原因。
明显的视网膜退行性疾病是黄斑变性，也称为老化相关性黄斑变性(AMD)。在50岁或更年长的美国人中，AMD是视力丧失的最常见原因，且其随年龄的增加而愈加普遍。AMD可分为湿性的(新血管性的)(neovascular)或干性的(非新血管性的)。最为常见的是该疾病的干性形式。当中心视网膜变得扭曲、具色素或最常见地变薄时，该疾病发生。该疾病的湿性形式引起最严重的视力丧失。黄斑变性的湿性形式通常与年龄老化相关，但能引起湿性黄斑变性的其它疾病包括严重的近视以及某些类似组织胞浆菌病的眼内感染，其可在患有AIDS的个体中加重。包括遗传构成、年龄、营养、吸烟和暴露于阳光与否的多种因素都可能导致黄斑变性。
与糖尿病相关的视网膜病变是1型糖尿病失明的首要原因，在2型糖尿病中也很常见。视网膜病变的程度与患糖尿病的持续时间相关，通常开始于糖尿病发病之后的10年或更长时间。糖尿病的视网膜病变可分为(1)非增殖性或背景视网膜病变，其特征在于毛细管渗透性、水肿、出血、小动脉瘤、以及渗出物的增加，或(2)增殖性视网膜病变，其特征在于从视网膜向玻璃体延伸新血管、瘢痕化、纤维组织形成、以及视网膜脱落的潜在可能。一般认为，糖尿病的视网膜病变至少部分由高血糖导致的糖基化蛋白的发展引起的。糖基化蛋白产生自由基，导致了氧化性组织损伤和诸如谷胱甘肽的细胞活性氧(ROS)清除剂的耗尽。
几种其它较不常见但仍然使人衰弱的视网膜病变包括脉络膜新血管膜(CNVM)，黄斑囊样水肿(CME，也称作黄斑水肿或黄斑水肿)，视网膜外膜(ERM)(黄斑皱褶)和黄斑裂孔。在CNVM中，起源于脉络膜的异常血管滋长穿过了视网膜层。所述脆弱的新血管很容易破裂，从而引起血液或体液在视网膜层内聚集。在CME中，可作为疾病、损伤或手术的后果发生，在黄斑层内聚集体液，可以引起中心视觉的模糊、扭曲。ERM(黄斑皱褶)是在黄斑上形成的赛璐玢样膜，其通过引起混浊和扭曲影响中心视觉。随着其逐渐发展，在所述黄斑上的膜的收缩可引起肿胀。ERM在75岁以上的人群中最为常见。其病因学是未知的，但可能与糖尿病的视网膜病变、玻璃体后部脱落、视网膜脱离或创伤以及其它病症相关。
另一种眼睛内部的疾病是眼葡萄膜炎，或葡萄膜的炎症。葡萄膜(色素层)由虹膜、睫状体和脉络膜组成。葡萄膜是眼球的三层包层的中间层，位于其后部(脉络膜)部分的巩膜和视网膜之间。眼葡萄膜炎可由创伤、感染或手术引起，并可感染任意年龄的人群。眼葡萄膜炎可解剖学地分为前部的、中部的、后部的或扩散的。前部的眼葡萄膜炎感染眼睛的前部分，包括虹膜。中部的眼葡萄膜炎，也称为外周眼葡萄膜炎位于紧接睫状体区域的虹膜和晶状体后面的区域中部。后部的眼葡萄膜炎也引起某种形式的视网膜炎，或可影响脉络膜或视神经。扩散的眼葡萄膜炎涉及眼睛的所有部分。
青光眼是通过由视神经损伤引起的视觉丧失的一系列眼部疾病的组合。由于不充分的眼部导液引起的较高的眼内压(IOP)是青光眼的主要原因。青光眼可随眼睛年龄的老化而发展，或可作为眼睛损伤、炎症、肿瘤或白内障或糖尿病的老年病例的结果发生。其还可由诸如类固醇的某些药物引起。此外，青光眼在不存在IOP升高的情况下也会发展。这种形式的青光眼与日裔祖先的遗传(即正常压力青光眼的家族史)，以及诸如心律不齐的系统性心脏病有关。
眼睛每天约产生一茶匙房水。通常情况下，这样的液体通过称为小梁网的海绵状结缔组织网、以其被产生出来的相同速率从眼睛中释放出来。在一段时期之内，自由基和其它的活性氧(ROS)能够引起对于小梁网的逐渐的损伤。其结果是小梁网变得部分封阻，外流能力下降，且当更多房水形成时IOP升高。尽管一开始所述IOP并未升高至足以引起任何值得注意的症状，但当压力维持在较高水平或继续升高时，视神经中的纤维被压缩或破坏，导致了在若干年后的视觉逐渐丧失。Izzotti等人提供了在外流系统的微小但关键的组织结构中将氧化性DNA损伤和青光眼相联系的确凿证据(Izzotti A，Sacca SC，Cartiglia C，De Flora S.，青光眼患者眼睛中的氧化性脱氧核糖核酸损伤(Oxidativedeoxyribonucleic damage in the eyes of glaucoma patients).Am J Med.2003；114)。他们在青光眼患者的小梁网组织中观察到了8-氧-脱氧鸟苷(8-OH-dG)的量升高超过三倍。所述升高的氧化性DNA损伤还与诸如眼内压指数的临床参数和视野丧失相关。
青光眼中视神经病变的主要特征包括视神经乳头的特征性改变、存活视网膜神经节细胞数目的下降以及视觉丧失。一般认为级联事件将视神经乳头的变性与该疾病中可观察到的视网膜神经节细胞的慢性死亡相联系，且该级联事件可通过神经保护剂的使用而得以延缓或预防(Osborne等人，2003，Eur.J.Ophthalmol.13(Supp 3)S19-S26)，其中抗氧化剂和自由基清除剂是重要的一族(Hartwick，2001，Optometry andVision Science85-94)。
眼睛的最外层、角膜控制进入眼睛的光线并将其聚焦。角膜必须保持透明以使光线适当的折射。角膜还可帮助保护眼睛的其它部分免于细菌、灰尘和其它有害物质的伤害，特别重要的是其可作为滤镜将阳光中最有害的某些紫外线(UV)过滤掉。如果没有这样的保护，晶状体和视网膜会非常容易遭受UV辐射的伤害。
角膜和周围的结膜也可经常遭受损害视力的多种有害病症。其包括诸如由过敏反应、感染或创伤引起的炎症反应，和以多种营养不良(由于混浊物质的积累导致的角膜的一个或多个部分丧失其正常的透明度)，例如富克斯(氏)营养不良、圆锥角膜、角膜网络状营养不良和map-dot-fingerprint营养不良来命名的少数几种和其它的病症(例如，干眼综合征)。
在干眼中，眼睛表面和泪腺炎症已被证实在称为干性角结膜炎的眼睛表面上皮细胞疾病中具有病理学的作用。氧化性组织损伤和表现氧化性潜能的多型核自细胞可在患有干眼的患者的泪液膜中出现。这些反应导致了所涉及组织的严重损伤。自由基和炎症可参与所述疾病的病理学或自我蔓延(Augustin，A.J.等人，在患干眼患者泪液中的氧化反应，″Oxidative reactions in the tear fluid of patients suffering from dryeyes″Graefe′s Arch.1995，11694-698)。
睑炎是眼睑的炎症。睑结膜炎是眼睑和眼睛的结膜的炎症。尽管还存在有其它的原因，但这两种病状都与公知的眼红斑痤疮的病状相关。睑炎是一种异常的病症，其中所产生的眼泪中含有过量的脂类(自然眼泪中的油性成分)，并且在某些情况下，含有刺激性的油。正如在下文中所解释的，这样的油性成分可以防止湿润眼睛角膜上皮的房水层的蒸发，并可协助所述房水层在眨眼时能够覆盖在正常的防水性角膜上。如果存在有过量的油脂，所述脂质层会倾向于附着于角膜本身。如果眼睛不能将这样的油脂从角膜的表面清除，就会在角膜上产生“干燥”区域，因为所述房水层不能浸湿该区域。
红斑痤疮是病因未知的皮肤疾病(酒渣鼻)和眼部疾病(眼红斑痤疮)并具有多种表象。该眼睛疾病的临床和病理特征并无特异性，而且该疾病常常是不能被眼科医生诊断出来得。
视网膜光毒性是由于通过位于颞部入路眼科手术的操作显微镜或由军用激光将眼睛暴露于视网膜照度引起的。这些光源具有对小凹(fovea)造成光诱导损伤的潜能(M.A.Pavilack和R.D.Brod，在颞部入路眼科手术过程中对人视网膜的光诱导光毒性的显微镜操作的潜在位点，“Site of Potential Operating Microscope Light-induced Phototoxicityon the Human retina during Temporal Approach Eye Surgery”Ophthalmol.2001，108(2)381-385；H.F.McDonald和M.J.，在睫状环玻璃体切割术中显微镜诱导的视网膜光毒性，“microscope-induced retinalphototoxicity during pars plana vitrectomy”Arch.Ophthalmol.106521-523；Harris M.D.等人，军事岗位中的眼睛损伤“eye injuries inmilitary occupations”Aviat.Space Environ.Med.2003，74(9)947-952)。损伤还可以发生在准分子激光光疗后脱落的角膜表面的治疗后(SeijiHayashi等人，，准分子激光治疗后氧自由基对角膜的损伤，“Oxygenfree radical damage in the cornea after excimer laser therapy”J.Ophthalmol.1997，81141-144)。
某些角膜病症是不可修正的，且仅可通过角膜移植进行治愈，而其它病症则可通过光性治疗性角膜切除术(PTK)，即准分子激光手术得以修正，其过程已知会引起炎症反应，引起角膜混浊或角膜区域混浊。
眼睛周围的皮肤也经常患疾病和病症。尤其是，眼睑的红斑痤疮和睑炎都是较严重的病症。眼红斑痤疮是一种常见的、具有不确定病因的潜在致盲病症(Stone D.U.and J.Chodosh，2004 Curr.Opin.Ophthalmol.15(6)499-502)。眼部的睑炎可以是葡萄球菌性的睑炎、皮脂溢性睑炎，这些炎症的混合形式，或者是最严重的形式、溃疡性的睑炎。
在多种眼科疾病或病症的发展和加速中都涉及到了氧化胁迫，包括上述AMD和多种视网膜病变(参见，例如Ambati等人，2003，Surveyof Ophthalmology 48257-293；Berra等人，2002，Arch.Gerontol.Geriatrics 34371-377)，和眼葡萄膜炎(例如Zamir等人，1999，Free Rad.Biol.Med.277-15)，白内障(例如，M.Lou，2003，Prog.Retinal&EyeRes.657-682)，青光眼(例如，Babizhayev和Bunin，2002，Curr.Op.Ophthalmol.1361-67)，角膜和结膜炎症，多种角膜营养不良，手术后或UV相关的角膜损伤(例如，Cejkova等人，2001，Histol.Histopathol.16523-533；Kasetsuwan等人，1999，Arch.Ophthalmol.117649-652)和老花眼(Moffat等人，1999，Exp.Eye Res.69663-669)。出于这个原因，对具有抗氧化性的药剂进行了研究以作为治疗这些病症的潜在治疗剂。已有众多研究致力于对细胞中产生还原力的生化途径，例如谷胱甘肽合成和循环。已经对能还原活化氧诸如超氧化物岐化酶的酶类进行了研究，从而确定其是否能够降低细胞的氧化胁迫。通过直接的自由基清除在细胞膜中抑制脂类氧化的化合物也可被考虑成为可能的治疗介入。
硝基氧是稳定的游离自由基，其可还原为所对应的羟胺。因为他们的自由基清除性质，模拟超氧化物岐化酶的活性和在多种氧化性损伤和炎症的动物模型中具有的抗炎效用，这些化合物具有相当的研究价值。由于它们比较缺乏毒性，羟胺优于硝基氧作为治疗剂。
提供某些羟胺组合物来预防和延缓白内障是公知的。在此将其全文引作参考的、Zigler等人的美国专利6,001,853，反应出了在美国国立卫生研究院进行的工作。Zigler等人鉴定出了一类羟胺，当将其施用于实验动物时，改善了白内障的发生或发展。出于物理化学的原因，经注射的这样的施用是必要的。尽管Zigler等人公开了可通过液体眼药水临床方便地递送tempol-H，但还没有见到工作实例的报道，而Zigler的羟胺实际上是通过结膜下注射进行施用。Zigler的材料可以通过注射、全身性或其它方式与还原剂共施用。在国立卫生研究院(National Institutes of Health)进行的后续工作也旨在对可以局部施用的有效羟胺进行鉴定，然而这些努力并未成功。
因此，深入研究努力的目的在于鉴定出含有它们的化合物和组合物，其可以改善患者眼睛中自内障的形成和发展，而不会引起令人不快的、不方便的和具有潜在危险的眼内注射。尤其是，还存在着对未能实现的这些化合物和组合物的长期需要，所述化合物和组合物可通过局部施用进行施用，特别是通过眼药水。
发明概述 本发明提供了对正在发展白内障或已知或怀疑具有白内障形成危险的患者眼中的白内障进行治疗的组合物。还提供了对表现出或处于这些疾病或退行性病症发展危险中的患者眼睛的黄斑变性、多种视网膜病变、青光眼、眼葡萄膜炎、某些角膜、眼睑或结膜病症和老花眼进行治疗的组合物。根据优选的实施方案，这些组合物被配制成局部液体形式，尤其是眼药水形式。本发明所述组合物的定期应用在进行治疗的眼睛中可以延缓或阻止白内障或黄斑变性的发展。本发明提供了这样的组合物，其无需通过注射或其它不舒服或不方便的方式进行应用。
根据优选的实施方案，本发明提供了包含眼科可接受的载体或稀释剂和具有以下通式化合物的组合物，
在这样的化合物中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基且R3和R4独立地为C1-C3的烷基。还可能，根据某些实施方案，R1和R2相连，或R3和R4相连，或都可以形成环烷基部分。在本发明的化合物中，R5为H、OH或C1-C6的烷基，而R6是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基。R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基或C1-C6的环烷基或杂环。还有可能R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环。在此使用的术语“眼科的”是指对眼睛及其疾病的治疗有用。
在用于本发明组合物的化合物中，取代的烷基或烯基可被至少一个羟基、烷氧基、烷基硫基、烷基氨基，二烷基氨基，芳基氧基、芳基氨基、苄氧基，苄氨基或杂环基或YCO-Z所取代，其中Y是O、N或S，Z是烷基、环烷基或杂环基或芳基取代基。根据某些实施方案，所述杂环是环中具有至少一个氧原子、硫原子或氮原子的5、6或7元环。在一种优选的组合物中，R6和R7相连形成了环丙基，而在其它情况下，R6和R7相连形成了四氢呋喃基，而R5、R6和R7相连形成了呋喃基。
对某些优选化合物而言，每一种R1至R4都是C1-C3的烷基，最特别为乙基或甲基，最特别为甲基。对某些优选实施方案而言，本发明的化合物R6是至少具有一个C1-C6烷氧基或苯氧甲基取代的C1-C6的烷基。
在其它优选化合物中，每一种R1至R4都是甲基，R5是H或甲基，R6是苯氧甲基或C1-C6烷氧基取代的甲基且R7是甲基或其中的R6和R7相连形成了环丙基。在其它情况下，每一种R1至R4都是甲基，R5是甲基，R6是乙氧基甲基且R7是甲基。在另一种情况下，每一种R1至R4都是甲基，R5是甲基，R6是苄氧基甲基且R7是甲基，而其中每一种R1至R4都是甲基，R5是甲基，R6是羟甲基且R7是甲基的化合物也有用处。
对某些实施方案而言，优选的是如下的化合物其中每一种R1至R4都是甲基，R5、R6和R7相连形成了呋喃基或其中R5是H，且R6和R7形成了四氢呋喃基。其它的实施方案提供了这样的化合物，其中R1至R4都是甲基，R5是H，且R6和R7形成了环丙烷。
优选地，可将本发明的组合物配制成水性介质，其可以局部液体的形式对眼睛进行递送，例如通过眼药水。因此，对于接受局部施用的患者眼睛而言，本发明组合物的pH和其它特征是眼科可接受的。对某些实施方案而言，所述化合物以盐的形式存在，优选为盐酸盐或类似的盐。
本发明的组合物可包含不止一种本发明的化合物。此外，所述组合物还可以包含本领域中公知地用于治疗特定适应症的其它化合物连同本发明的所述化合物。在一些实施方案中，本发明的所述化合物可以同时施用。在其它实施方案中，本发明的所述化合物可以依次施用。类似地，本领域中公知地用于治疗本文所述疾病和病症的其它化合物可与本发明的化合物同时或依次施用。本发明还提供了采用这种组合治疗方式对疾病和病症进行治疗的方法。
由于本发明的所述化合物含有可氧化的羟胺部分，其在化学还原状态下最为有效，在某些实施方案中，所述组合物优选地还包含抗氧化剂，尤其是巯基化合物。示例性的化合物包括巯基丙酰基甘氨酸，N-乙酰半胱氨酸，β-巯基乙胺，谷胱甘肽和类似化合物，虽然也可以采用其它适于眼科施用的抗氧化剂，例如抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或偏亚硫酸氢钠。羟胺的量可从约0.1％重量体积比至约10.0％重量体积比；优选为约0.25％重量体积比至约10.0％重量体积比。
还可看到本发明提供了眼科组合物，其包括眼科可接受的载体或稀释剂以及具有与可熔性修饰部分结合的N-羟基哌啶部分的化合物。以这种方式，所述活性部分、羟胺可以“秘密的(stealth)”形式递送至需要接受治疗的眼睛晶状体中，换言之，以可从分子平衡切除羟胺部分的化合物的形式。所述化合物在眼中分解从而产生活性羟胺，进而对白内障、黄斑变性或在此涉及到的任何其它眼部病症进行有效的治疗。由此，所述化合物在25℃在水中具有至少约0.1％重量的溶解度，且在25℃，水-正辛醇的分配系数至少为约3。根据优选的实施方案，所述水溶解度按重量计大于约0.5％，优选大于约2.0％，且所述分配系数大于约5，优选大于约10。
因此，所希望的是，采用的所述化合物在对所述眼睛进行局部施用后，能够透过角膜，并被转化成所希望的羟胺，优选地，N-羟基哌啶。优选的是这样的转化通过对所述化合物进行酶解发生的。在一个优选实施方案中，所述羟胺部分含有-1，4-二羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶。
本发明包括改善-或者延缓或者完全阻止-患者晶状体中自内障发展的方法。类似地，本发明还包括改善老花眼、黄斑变性、多种视网膜病变、青光眼、眼葡萄膜炎、角膜病症(特别是那些与创伤、炎症(这两种情况都可以由准分子激光手术引起)、衰老、UV暴露和其它氧化相关的病症)，结膜病症(结膜炎)、干眼综合征、睑炎和眼红斑痤疮的发展或对其治疗的方法。本发明还提供了保护视网膜色素上皮细胞免受光氧化损伤的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给眼睛施用眼科组合物，其包括含有作为活性组分的一种或多种上述化合物的以眼药水形式存在的眼科可接受的载体或稀释剂。优选地，所述施用发生在多个时间，在某些优选实施方案中，实施了长期、定时的施用。
在本发明的另一方面，本发明的眼科组合物可用作预前治疗方案，来预防或延缓某些老化相关性眼科病症，包括白内障、老花眼、角膜变性和营养不良、青光眼、黄斑变性和光氧化性视网膜损伤。在优选实施方案中，所述组合物被配制成眼药水或洗眼液。在眼睛的老化相关性病症发展之前或起始阶段，将其对所述眼睛施用，或预防晚期疾病的发展。
本发明还提供了鉴定可通过眼药水的形式递送至患者晶状体的药物的方法。这些方法包括选择在25℃的水溶解度至少约按重量计0.1％和在25℃水/正辛醇的分配系数至少为约5的化合物，该化合物在患者眼中获得的条件下是可酶切的，从而产生最直接的药物对眼睛、优选是晶状体的病症进行治疗。优选地，所述活性药物是羟胺，尤其是具有N-羟基哌啶核的那种。
图1所示为用本发明的化合物1或tempol-H局部处理的兔眼中房水中tempol-H(1，4-二羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶)的水平。
图2所示为在治疗后选定时间点，在化合物1局部施用之后兔眼不同组织中的tempol-H的水平。
图3所示为各种浓度的tempol-H保护蓝光照射的充满A2E-的RPE细胞。
图4所示为1mM tempol-H对保护蓝光照射的充满A2E的RPE细胞的效果。
示例性实施方案的详细描述 本发明提供了这样的化合物和组合物，其可局部施用于表现出或发展或处于发展如下病症危险中的患者的眼睛白内障、老花眼、眼葡萄膜炎、黄斑变性或其它视网膜病变，包括但不限于糖尿病视网膜病变、脉络膜新血管膜(CNVM)、黄斑囊样水肿(CME)、视网膜外膜(ERM)(黄斑皱褶)和黄斑裂孔，以及角膜(和周围眼睑和结膜)病症，包括但不限于炎症、创伤、辐射损伤、角膜新血管形成和多种营养不良，例如富克斯(氏)营养不良、圆锥角膜、角膜网络状营养不良和map-dot-fingerprint营养不良，以及干眼综合征、睑炎和眼红斑痤疮。虽然可见这样的化合物中包括了作为化学片段的，之前已知的能有效延缓白内障发展的羟胺类物质，但在治疗领域中获得能够局部施用的化合物也是非常显著的进步。事实上，Zigler专利的受让人国立卫生研究院曾试图鉴定出通过局部施用来有效治疗白内障或黄斑变性的化合物，但该尝试却并未成功。在本文中，值得注意的是Zigler专利引用了通过注射进行某些组合物，例如tempol-H的施用，并且意识到了通过眼药水进行局部施用的期望，但是在实际中却发现这种所建议的施用方式并不可行。因此，本发明应被认为具有“开创性”，因为它满足了在本领域中长期感受到但却未被满足的需要。
本发明人证明本发明的所述化合物可吸收进入和穿过角膜和巩膜，透过色素层并进入晶状体和眼睛内部。在这些组织内的酶学过程可将所述化合物的N-羟基哌啶部分从其被酯化的酸上面分解下来。所述N-羟基哌啶部分，一旦被释放出来，就具有了如Zigler所证明的相同的功能和相同的效率。此外，本发明所述化合物的另一优点在于即使以其酯化形式存在，其也具有自由基清除和抗氧化剂活性，正如在tempol-H和其它非酯化的羟胺化合物中所见到的一样。
迄今为止，并不知道可将本发明的所述化合物对眼睛施用。也并不了解其可用于治疗自内障、老花眼、角膜病症、黄斑变性、视网膜病变、青光眼或眼葡萄膜炎。在将其全文引用作为参考的Paolini等人的美国专利5,98 1,548在文中多处描述了某些N-羟基哌啶酯及其作为抗氧化剂的用途。然而，Paolini并未公开针对患者眼睛的眼科制剂或局部治疗方案。而且，Paolini缺失公开某些这类分子有用的合成。
Gupta等人在美国专利4,404,302的内容中公开了某些N-羟胺用作塑性制剂(plastic formulation)的光稳定剂的应用。在将其内容引用作为参考的Mitchell等人的美国专利5,462,946中，公开了用于保护机体免受氧化胁迫的衍生自取代的噁唑烷的硝基氧。在将其内容引用作为参考的Ramey等人的美国专利3,936,456中，提供了用于稳定聚合物的取代的哌嗪二酮烃氧基和氢氧化物。在将其内容引用作为参考的Behrens等人的美国专利4,691,015中，描述了衍生自受阻胺的羟胺和其中的部分羟胺对稳定聚烯烃的用途。
在一方面，本发明提供了含有药物载体或稀释剂和具有以下通式化合物的组合物，
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基； R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且 其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或都可以是环烷基； R5为H、OH或C1-C6的烷基； R6是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基； R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基、烯基、环烷基或杂环 或其中R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环。这些化合物可以与眼科可接受的载体共同用于眼科组合物中。
在另一方面，本发明还提供了眼科可接受的载体或稀释剂以及具有与溶解度修饰部分结合的N-羟基哌啶部分的化合物，所述化合物在25℃在水中具有至少按重量计约0.25％的溶解度，且在25℃的水/正辛醇分配系数至少为约5。在所述眼中发现的条件下，所述组合物可具有来自所述化合物的可分解的N-羟基哌啶部分。可以预期这一部分可在眼睛晶状体的条件下被裂解。N-羟基哌啶部分可被酶裂解。还可以存在这样的组合物，其中所述N-羟基哌啶部分是1-氧-4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶基。
在本发明中，术语C1-Cn的烷基、烯基、炔基是指其中具有1-n个碳原子的烃基。因此该术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基和戊基、己基等的多种异构形式。类似地，该术语还包括乙烯基、乙炔基、丙烯基、丙炔基以及类似的高达n个碳原子的支链和直链不饱和烃基。正如本文所示，这些基团可被一或多个羟基、烷氧基、烷基硫基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氧基、芳基氨基、苄氧基甲基、苄氨基、杂环或YCO-Z官能化，其中Y是O、N或S，Z是烷基、环烷基、杂环或芳基取代基。
术语碳环是指环状结构或环，其中所有形成环的原子都是碳原子。这样的例子有环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等等。环丙基是优选的类型。杂环是指其中至少有一个环原子不是碳原子的环结构。这类较广泛的例子包括呋喃、二氢呋喃、四氢呋喃、吡喃、噁唑、噁唑啉、噁唑烷、咪唑和其它化合物，尤其是那些在环上具有氧原子的化合物。在环上具有至少一个氧原子或氮原子的五元环、六元环和七元环是优选的杂环。其中呋喃基和四氢呋喃基是优选的。
在某些实施方案中，每一种R1-R2优选为低级烷基，即C1-C3的烷基。优选地，为了便于合成且由于在这些位置上具有这种取代部分的公知效率，所有的这些基团都是甲基。然而，也可以使用其它的取代基。
在某些实施方案中，所采用的化合物是其中的R6是被至少一种C1-C6烷氧基或苄氧基取代的C1-C6烷基。其中优选这些化合物具有乙氧基或者苄氧基取代基。在那些优选的化合物中，其中每一种R1至R4是甲基，R5是H或甲基，R6是苄氧基或C1-C6的烷氧基取代的甲基且R7是甲基，或其中R6和R7形成了环丙基，而在另一些化合物中每一种R1至R4是甲基，R5是甲基，R6是乙氧基甲基或苄氧基甲基且R7是甲基。在其它优选的化合物中，其中每一种R1至R4是甲基，R5是甲基，R6是羟甲基且R7是甲基。
其它有用的化合物是这样的化合物，其中每一种R1至R4是甲基，且R5、R6和R7形成了呋喃基，或其中R6和R7形成了四氢呋喃基。在以下的实施例中，R1至R4是甲基，R5是H，且R6和R7形成了环丙基环的化合物是更优选的类型。
本发明的所述化合物可被配制成组合物从而应用于需要接受治疗的患者的眼睛。因此这样的组合物可适于用作眼药水或接触透镜、嵌入物等等的药物用途，如以下详细描述的那样。因此，如药物制剂领域所属技术人员公知的，可以将化合物配制入含有任何所需要的稀释剂、盐、pH调节剂等的无菌水中以便得到适合眼睛施用的溶液。其可以是眼药水、嵌入物、接触透镜、凝胶和其它需要不同制剂的局部液体剂型。在这里包括了所有适于对眼睛区域进行直接施用的这些制剂。
本发明的所述组合物还具有根据所使用抗氧化剂的不同范围的抗氧化剂。所述应用还依赖于允许所述药物组合物至少2年保存期所需的抗氧化剂量。所述制剂中可包括一种或多种抗氧化剂。某些常用的抗氧化剂具有管理部门所允许的最高水平。同样地，需要施用的抗氧化剂量也应该足够有效而不引起任何不希望的效果。这样的剂量可由内科医生根据需要进行调节，在管理部门所设定的最高水平之内，且处于本领域所属技术人员确定适当和有效的剂量范围之内。合理的范围是约0.01％-约0.15％重量体积比的EDTA，约0.01％-约2.0％重量体积的亚硫酸钠，和约0.01％-约2.0％重量体积比的偏亚硫酸氢钠。本领域所属技术人员能够对上述每种物质采用约0.1％重量体积比的浓度。N-乙酰基半胱氨酸可以约0.1％-约5.0％重量体积比的范围存在，约0.1％-约10％的羟胺浓度是优选的。抗坏血酸或盐可以约0.1％-约5.0％重量体积比的范围存在，约0.1％-约1 0％重量体积比的羟胺浓度是优选的。其它的巯基，如果包括在内的话，可以与N-乙酰基半胱氨酸具有相同的范围。其它示例性的化合物包括巯基丙酰基甘氨酸，N-乙酰基半胱氨酸，β-巯基乙胺，谷胱甘肽和类似的物质，虽然也可以采用其它适于眼科施用的抗氧化剂，例如，抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或偏亚硫酸氢钠。
可采用缓冲剂将眼药水制剂的pH保持在约4.0-约8.0的范围中；这是防止角膜发炎所必需的。因为本发明的所述化合物是酯，为了防止所述酯键的水解和确保所述产品至少2年的保藏期，所述pH优选地被保持在约3.5-约6.0，优选为约4.0-约5.5。这样的pH也确保了大多数羟胺处于其质子化形式以具有最高的水溶性。所述缓冲液可以是pKa为约4.0-约5.5的任意弱酸及其共轭碱；例如乙酸/乙酸钠；柠檬酸/柠檬酸钠。羟胺的pKa为约6.0。为了直接的玻璃体内和眼球内注射，制剂应为pH 7.2-7.5，优选为pH 7.3-7.4。
本发明的所述化合物还可包括适于眼睛施用的张力剂。其中适合的是氯化钠，其可将本发明的制剂配制成和0.9％盐水大约等渗的制剂。
在某些实施方案中，可将本发明的所述化合物与增稠剂一起进行配制。示例性的增稠剂有羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。所述化合物中的粘度剂可高至约2.0％重量体积比。优选地，所述粘度剂的存在范围从约0.2％-约0.5％重量体积比。聚乙烯吡咯烷酮的优选范围可从约0.1％-约2.0％重量体积比。本领域所属技术人员可优选根据食品药品管理局(FDA)接受的制定的任意范围。
如果需要的话，本发明所述化合物还可含有添加的共溶剂。适合的共溶剂可包括甘油，聚乙二醇(PEG)，聚山梨醇酯，丙二醇，甘露醇和聚乙烯醇。所述共溶剂可以约0.2％-约0.4％的重量体积比的范围存在。优选地，甘露醇可以约0.5％-约4.0％重量体积比的范围与本发明的所述化合物进行配制。优选地，聚乙烯醇可以约0.1％-约4.0％重量体积比的范围与本发明的所述化合物进行配制。本领域所属技术人员可优选根据食品药品管理局(FDA)接受的制定的任意范围。
在本发明中可以在特定的范围内使用防腐剂。其中，优选为高至0.013％重量体积比的苯扎氯铵，高至0.013％重量体积比的苄索氯铵，高至0.5％重量体积比的氯丁醇，高至0.004％重量体积比的乙酸苯基汞或硝酸苯基汞，高至0.01％重量体积比的硫柳汞，和约0.01％-约0.2％重量体积比的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
用于注射的制剂被优选地设计成一次性施用且不含有防腐剂。可注射的溶液应该具有相当于0.9％氯化钠溶液(摩尔渗透压浓度为290-300mOsmoles)的等渗度。这可以通过添加氯化钠或其它如上所列示的共溶剂、或如上所列示的诸如缓冲剂的赋型剂和抗氧化剂来实现。可注射的制剂是无菌的，且在一个实施方案中，是以一次性使用的小管或安瓿提供的。在其它实施方案中，为了进行再组成和随后的注射，可以无菌的、冻干的固体形式提供可注射的产品。
本发明的所述组合物还可含有不止一种本发明的所述化合物。因此本发明的所述组合物含有至少一种本发明的所述化合物。在一些实施方案中，本发明的所述化合物可以同时施用。在其它实施方案中，本发明的所述化合物可以依次施用。本发明的所述方法包括了组合治疗方案。
在本发明的一些实施方案中，本发明的所述化合物可与本领域中公知的其它化合物一起施用，所述其它化合物可有效地治疗疾病或病症，所述疾病或病症是本发明所述化合物的靶。因此，本发明的所述组合物还包括至少一种本领域中公知的治疗拟被治疗的疾病或病症的其它化合物。所述本领域中公知的其它化合物可以与本发明的所述化合物同时施用，或依次施用。类似地，本发明的方法包括使用这样的组合治疗方案。
包括晶状体在内的眼睛前房组织都浸在房水之中。因为其含有抗氧化化合物和酶，所以该液体处于高度还原性的氧化还原状态。晶状体也处于还原性的环境中，其将羟胺化合物保持为优选的还原形式。因此，在眼药水制剂中优选包含还原剂，或用还原剂分别施用来将羟胺保持为其还原性形式。
优选的还原剂可以是N-乙酰半胱氨酸，抗坏血酸或盐形式，和亚硫酸盐或偏亚硫酸氢盐，抗坏血酸和/或N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽部分适于可注射的溶液。N-乙酰半胱氨酸和抗坏血酸钠可用于多种制剂。还可以加入诸如EDTA(乙二铵四乙酸)或有可能的DTPA(二乙烯三胺五乙酸)来将眼药水制剂中的羟胺保持为还原性形式。
值得注意的是本发明的所述化合物可以两种方式发挥其抗-caractogenic和其它治疗效果。首先，将所述酯化合物原位水解形成发挥治疗活性的羟胺成分。其次，所述酯化合物本身就具有抗-caractogenic和抗氧化活性，从而证实了含有所述化合物的药物制剂的治疗有效性。
与本发明所述化合物活性的第一种基础相关，即分解以释放羟胺组分，在眼睛组织尤其是角膜中存在有多种酯酶。无需对能够分解该系列酯的特异性酯酶进行鉴定就可实施本发明。在对兔子眼睛施用所述化合物之后，迅速发生并基本完成了所述酯的分解。这是通过局部施用后在所有时间(30，60，90和120分钟)测定的房水中tempol-H的存在显示的。相比较而言，所述酯在眼房水中是较稳定的；例如，酯4的溶液在40℃，在pH 4.6的乙酸盐缓冲液中可稳定存在3个月。
本发明对改善患者眼睛白内障的发展具有最佳的用途。其它最佳的用途包括对患者视网膜的黄斑变性进行治疗。其它最佳的用途还包括对上述的糖尿病视网膜病变和多种其它视网膜病变的发展进行治疗、缓解或预防，以及对眼葡萄膜炎和青光眼进行治疗。其它最佳的用途是对角膜病症、尤其是那些与氧化胁迫相关的病症，例如炎症或创伤(其可以是也可以无需与手术相关)和多种营养不良。本发明的所述化合物和组合物也可用来减轻、预防或改善对于视网膜色素上皮细胞的光氧化性伤害，和改善眼睛激光手术过程中的刺激和炎症，包括对于青光眼的小梁切除术和对于角膜重塑的角膜切除术。所述化合物和组合物还可用来治疗结膜和眼睑的疾病和病症。此外，本发明的所述化合物和组合物还可用来治疗脱发和放疗后的直肠组织损伤。
许多在这里描述的病症和疾病，尤其是白内障、老花眼和黄斑变性都是随年龄发展的渐进性疾病。因此，作为预防或延缓这些老化相关性眼科疾病发展的预前治疗措施，可使用本发明的所述组合物。在优选实施方案中，所述组合物被配制成眼药水或洗眼液。在眼睛的老化相关性疾病的发展之前，或在其开始阶段将其对眼睛施用。
可采用一种或多种本领域公知的递送方式将含有本发明所述化合物的组合物对患者的眼睛进行施用。在优选实施方案中，可以眼药水或洗液的方式将所述组合物对眼睛进行局部递送。在其它实施方案中，可将所述组合物以局部眼用软膏的形式进行施用，其特别适于有效治疗角膜、结膜或周围皮肤的疾病，例如干眼和睑炎。在其它实施方案中，可通过定期的结膜下或眼内注射，或通过诸如BSS或BSSPLUS(Alcon USA，Fort Worth，德克萨斯州)的冲洗溶液灌注，或通过使用诸如BSS或BSS PLUS组合物的羟胺预配制溶液，将所述组合物递送至眼内的多个位置。在一个实施方案中，本发明所述化合物在玻璃体切割术中的应用可有效减轻或预防与玻璃体切割术相关的白内障的发展。
或者，可将所述组合物应用于其它本领域所述技术人员公知的眼科制剂形式，例如预形成或原位形成的凝胶或脂质体，例如在Herrero-Vanrell的美国专利5,718,922中公开的那样。已采用了向玻璃体中直接注射药物来进行疾病治疗，其中使用微球体或脂质体来缓慢地释放药物(Moritera，T.等人，作为玻璃体中药物传递系统的生物可降解聚合物的微球体，“Microspheres of biodegradable polymers as adrug-delivery system in the vitreous”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.199132(6)1785-90)。
在其它实施方案中，所述组合物可通过接触透镜(例如Lidofilcon B，Bausch&Lomb CW79或DELTACON(Deltafilcon A))或临时滞留在眼睛表面上的其它物体被递送到或透过需要治疗的眼睛的晶状体。例如，美国专利6,410,045描述了接触透镜类型的药物递送装置，其包括吸收于所述接触透镜中的浓度为按重量计0.05％-0.25％的能够递送入眼液的含有药物的多聚水凝胶接触透镜。
在其它实施方案中，可采用诸如胶原角膜防护物(例如，BIO-COR可溶解的角膜防护物，Summit Technology，Watertown，马萨诸塞州)的支持物。还可通过来自渗透泵(ALZET，Alza Copr.，Palo Alto，加利福尼亚州)插管或通过含有所述组合物的定时释放的胶囊(OCCUSENT)或生物可降解片(OCULEX，OCUSERT)的植入，将所述组合物通过灌注施用进入眼球。这些施用方法的益处在于为眼睛提供了连续的组合物供给。
许多类型的药物递送系统是本领域所公知的，并且可用于队本发明的组合物进行递送。以上对非限制性的示例进行了描述，下面将列举更多的示例。
治疗干眼综合征的优选方法采用了基于水的溶液或凝胶，其可被配制成含有一种或多种本发明的化合物。在这些人工眼泪制剂中，所述“活性”组分通常是水溶性的或可分散的聚合物，例如羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，卡波姆(carbomers)和泊洛沙姆(poloxamers)。
美国专利6,429,194描述了用于眼睛滴注的水性眼科制剂，或在其中预浸泡或储存拟插入眼睛的物体，例如接触透镜，软膏，或拟插入结膜囊的固体装置。所述眼科制剂包括粘蛋白成分，其类似于在正常人眼表面发现的物质。美国专利6,281,192还描述了粘蛋白的眼科应用。
眼科溶液必须提供对于干眼症状有效和长期持续的治疗。一种实现这些目的的方法是提供具有特定流变学性质的溶液，即在逆境条件下产生或流动的高粘度溶液。这种方法的例子在美国专利5,075,104和5,209,927中已经公开，其中所述眼科溶液的流变学性质是通过卡波姆聚合物的应用来保持的。这些卡波姆聚合物具有生物附着性，正如美国专利5,225,196；5,188,828；4,983,392和4,615,697中所描述的那样。一般认为所述卡波姆的生物附着性有助于其在眼中的驻留较长时间。事实上，美国专利5,075,104和5,209,927教导了通过保持或恢复所述上皮细胞的正常水合平衡，以类似于正常眼泪的粘蛋白成分所提供的方式保护角膜，可使所述卡波姆聚合物行使功能。
美国专利4,883,658描述了部分水解聚(乙酸乙烯酯)和完全水解的聚(乙酸乙烯酯)水溶液的协同组合，即聚(乙烯醇)，当在疏水性固体上形成完全湿润的吸收层时，其在水-气界面上表现出了较低的表面张力。所述组合物适于局部使用的眼科药物或营养剂的水性介质。
最近出现了治疗干眼综合征的基于乳液的制剂。如美国专利5,578,586；5,371,108；5,294,607；5,278,151；4,914,088中公开的一种方法，使用了多种方法和组合物来降低来自所述眼睛表面的水层的蒸发。该方法包括对眼睛施用荷电的磷脂和非极性油的混合物，优选为精细分散的油包水乳液形式。在美国专利4,818,537和4,804,539中描述了另一方法，其中报道了乳液形式的脂质体组合物能够增强在眼睛表面的驻留能力，从而缓解了干眼的症状。
还有几种其它的递送系统也是可取的，其特别适于向眼睛的内部或后部递送药物组合物。例如，Parel等人的美国专利6,154,671公开了通过离子渗入疗法向眼球进行药剂递送的装置。该装置采用了用于容纳所述活性剂的容器，其含有至少一种位于角膜周围面向眼睛组织的活性表面电极。所述容器还具有与所述患者部分关闭的眼睑相接触的返回电极。Wong等人的美国专利5,869,079公开了在生物可降解缓释眼科植入物中亲水和疏水实体的组合。此外，Guo等人的美国专利6,375,972，Chen等人的美国专利5,902,598，Wong等人的美国专利6,331,313，Ogura等人的美国专利5,707,643，Weiner等人的美国专利5,466,233和Avery等人的美国专利6,251,090的每一个都描述了可用来递送含有本发明化合物的药物组合物的眼内植入装置和系统。
美国专利4,014,335描述了放置于巩膜和下眼睑之间的凹陷中的眼科药物递送装置，其可作为容器进行药物施用。该装置包括三层薄片的聚合材料，其将所述药物容纳于所述薄片的中央储存区域之内。所述药物可从所述容器扩散透过至少一层聚合物薄片。
以眼科插入物形式存在的固体装置，已被用来缓解干眼的长期症状。这些装置被放置于眼中，且缓慢地溶解或侵蚀以提供增厚的泪液膜。这一技术的实例可见于美国专利5,518,732；4,343,787和4,287,175中。
本发明的所述化合物可用于除眼科领域之外更广泛的领域中。这些领域可包括，例如，毛囊的保护和在癌症的放疗过程中对直肠造成的辐射损伤的保护。本发明所述组合物的其它不提倡对眼睛进行递送的施用形式可包括口服药片，液体或喷雾剂；静脉内，皮下和腹膜内注射；以贴片或软膏对皮肤进行的施用；灌肠剂，栓剂或气雾剂。
为了有效地治疗此述的白内障、老花眼、黄斑变性、青光眼或任何的视网膜病变、角膜病症或眼部不适，本领域所述技术人员可推荐适用于待治疗的受试者的剂量方案和剂量。如果所述组合物被配制在持续递送的载体中或通过植入物进行递送，则所述施用频率可以稍有降低。对局部递送而言，优选的是根据需要每天剂量施用1-4次。所述剂量可以是每剂1-2滴。所述剂量方案还可随活性药物浓度的改变而进行改变，其会取决于所使用的羟胺和所述患者的需要。优选地，在所述制剂中所述活性成分量为约0.1％-约10.0％重量体积比。在一些实施方案中，优选的活性药物浓度为0.25％-约10.0％重量体积比。在所述组织和体液中，所述羟胺组分的浓度优选为约0.1μM-约10mM。在一些实施方案中，所述范围为1μM-5mM，在其它实施方案中，所述范围为约10μM-2.5mM。在其它实施方案中，所述范围为约50μM-1mM。最优选地，所述羟胺组分的浓度优选为1-100μM。在所述组织和体液中，所述还原剂的浓度为1μM-5mM，优选为约10μM-2mM。可通过普通的药代动力学和稀释计算，将所述组合物成分的浓度适当地调节成适于施用方式，以达到这样的局部浓度。或者，可采用放射性标记的羟胺对角膜的渗透和进入眼睛内部其它组织的吸收进行证明。
眼科医师和本领域所述工作人员都有多种方法监测所述剂量方案的有效性并由此对剂量进行调节。例如，可通过眼科医师用裂隙灯检查法观察晶状体在间隙的混浊程度，或其它本领域中公知的方法来确定治疗白内障的有效性。可通过提高视觉分辨力和评估立体彩色眼底照片的异常和分级来确定治疗黄斑变性或其它视网膜病变的有效性(老化相关性疾病研究小组，NEI，NIH，AREDS报告第8号，2001，Arch.Ophthalmol.1191417-1436)。可通过改善视觉分辨力和玻璃体混浊程度以及控制炎症来确定治疗眼葡萄膜炎的有效性(Foster等人，2003，Arch.Ophthalmol.121437-40)。在这些评估之后，如果需要的话，眼科医师可调节所述施用的频率和/或药剂的浓度。
本发明的另一方面描述了鉴定以眼药水形式对患者眼睛进行递送的药物的方法，包括选择在25℃的水溶解度至少为约按重量计0.25％比且在25℃的水-正辛烷的分配系数至少为约5的化合物，该化合物在患者眼睛的晶状体中所得的条件下可被酶学分解，从而产生羟胺、优选为N-羟基哌啶。优选地，所选择的化合物是羟胺的酯。
优选地，至少0.1％的溶解度是眼药水所必需的，即使对悬液制剂而言。完全的水不溶性化合物是没有效果的。在水中可溶(＞0.1％重量体积比)的酯是优选的。低于0.1％溶解度的酯可以悬液形式或软膏或其它剂型应用。通过在室温下将100mg的测试化合物与1ml水混合，再另外加入1ml量的水并混合，直到所述脂完全溶解来测定溶解度。
对兔眼体内施用所述化合物的溶液之后，通过测定房水中有效羟胺和/或脂的实际浓度(例如＞5μM)证明了角膜渗透。这是通过对兔子的房水进行电子自旋共振(ESR)，高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GS)分析测定的。尤其对化合物的筛选而言，也可以在使用体内检测方法之前采用体外角膜渗透方法。在向兔眼施用所述化合物溶液之后，通过测定在玻璃体液、色素层或视网膜中的所述化合物浓度也能够类似地证明化合物对眼睛内部或后部的渗透。
对这些检验的酯的选择是基于其计算或测定的辛醇/水分配系数(P)。诸如tempol-H的亲水化合物不能渗透角膜的亲脂上皮细胞层。能够渗透的tempol-H和酯的分配系数如下 P(计算的)* Tempol-H0.8(测量值0.5) 酯4 16.4 酯8 8.2 酯146.3 *Clog P 4.0版，Biobyte Corporation 在向兔眼施用所述化合物之后，酶学转化以大于90％的所述的酯在体内水解成醇和酸的比例基本全部完成。所述转化可通过对选定的眼组织(例如房水)进行HPLC或GC分析得以测定。或者，还可通过将化合物温育在血浆或眼睛组织匀浆中，并通过HPLC或GC定期的分析所述样品来监测所述分解率来测定所述酶学转化。半衰期低于1或2小时的酯是优选的候选化合物。该方法可以是在体内测试前的优选筛选程序。
所述酯应该在40℃的条件下，在3个月后，在pH4.0-5.0的水溶液中的水解低于约10％。由此可以推断该酯溶液的保藏期在室温时至少为18个月，其对于眼药水产品而言是优选的。
实施例 通过参照以下实施例在某些实施方案中对本发明进行了说明。所述实施例仅具有说明性目的而非以任何的方式对本发明进行限制。
实施例1在眼房水中测定酯化合物的稳定性 方法在含有DPTA或EDTA的缓冲液(pH4.5-5.0)中制备了0.1-0.5％的所述酯化合物的溶液。将所述溶液填充到棕色玻璃小管中，将其密封并放置于温度保持在40℃的控温容器中。定期取出样本小管并储存于0-5℃，直到进行HPLC，GC或GC/MS分析，发现其在这样的条件下3个月后仍然保持稳定。
为了能作为有效的抗白内障药物，所述试剂必须能够渗透入晶状体中。这可以包括在选择抗白内障化合物的方法中。对于tempol-H的方法描述如下 实施例2器官培养的大鼠晶状体的药物渗透 与之前作为抗白内障制剂所检测的药物相反，tempol-H和tempol具有显著的能够从周围液体渗透入晶状体组织的能力。在本部分中描述的试验测定了在所述器官培养条件下与大鼠晶状体孵育之后，所述晶状体中的时期，活性化合物浓度和化合物分布。
方法大鼠晶状体的培养如下大鼠晶状体得自Sprague-Dawley大鼠。将所述晶状体温育在盛有修饰的TC-199培养基的24孔培养板，并放置于含有95％空气/5％CO2气氛的37℃培养箱中。所述晶状体在2ml培养基中孵育，其被调节至300毫渗量(mOsm)。在含有4.0mMtempol-H或4.0mM氧化形式tempol的培养基中将所述晶状体温育1-24小时。在适当的时间，将所述晶状体从培养基中取出，吸干，匀浆并采用电子自旋共振方法(ESR)进行活性化合物的分析。在一个实验中，所述晶状体孵育了4小时，并在分析前被分解成上皮细胞部分，皮层部分和核部分。
结果在活性化合物孵育1、2和4小时之后，tempol-H的浓度(mM，在晶状体水中)分别达到了0.4mM、0.8mM和1.0mM。所述晶状体在与氧化形式的tempol孵育之后，发现tempol-H水平分别达到了0.6mM、1.5mM和2.8mM。在后一种情况中，在所述晶状体中仅测定到了痕量(5％或更低)的氧化形式的tempol；其几乎完全被转换成了还原形式的tempol-H。
在与tempol-H孵育4小时之后，tempol-H在晶状体上皮细胞、皮层和核之间的分布相当均匀。tempol-H在晶状体上皮细胞、皮层和核内的水平分别达到了1.5mM、0.8mM和1.0mM。在与氧化型tempol孵育后的晶状体中，tempol-H/tempol的水平分别为1.2mM、2.9mM和2.0mM。在后一种情况下，核中的所有化合物都是还原形式，仅有约5％上皮细胞中的化合物为氧化形式。
结论还原型和氧化型的所述活性制剂都可容易地从培养基浴中渗透入所培养的大鼠晶状体中，并分布于上皮细胞、皮层和核。晶状体与所述氧化型tempol的孵育可在整个晶状体内得到较高浓度的还原化合物tempol-H。
实施例31-氧基-4-(3’-乙氧基-2’，2’二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
在干燥的DMF(10mL)中，向3-乙氧基-2，2-二甲基丙酸(750mg，7.13mmol；根据J.Org.Chem.，38，2349，1975所述的方法制备，在此将其内容引用作为参考)的搅拌溶液中以较小的比例加入1，1’-羰基二咪唑(1.27g，7.84mmol)。可观察到剧烈的气体生成。将该溶液在100℃加热1小时。向该混合物中加入tempol(900mg，5.23mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-稀(DBU)(800mg，5.26mmol)并继续加热12小时。在减压的条件下对所述反应混合物进行浓缩。将残渣溶于乙酸乙酯(100mL)中并用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水依次洗涤，通过无水硫酸钠干燥，真空浓缩得到红色固体(1.48克)。使用环己烷∶乙酸乙酯(8∶1)作为洗脱剂对其进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(1.22克，70.0％)。
IR(KBr，cm-1)1360(N-O·)，1725(酯) 实施例41-羟基-4-(3’-乙氧基-2’，2’二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
将实施例2的硝基氧(1.02mg，3.34mmol)加入饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液真空干燥，并溶解于100mL乙酸乙酯中，并用饱和NaHCO3洗涤从而得到无碱的羟胺。将所述乙酸乙酯层分离并浓缩，得到红色的油状物，通过TLC分析，其大多数是硝基氧。使用环己烷∶乙酸乙酯(4∶1)作为洗脱剂对该油状物进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(700mg)。将该固体溶于饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中，真空浓缩，并从乙酸乙酯∶二异丙醚(2∶1，50mL)中重结晶，从而得到白色的晶体状固体(320mg)。溶点为140-142℃(dec.)。
1H-NMR(270MHz，D2O)ppm1.48(6H，s)；1.57(3H，t)；1.63(12H，s)；1.82(2H，s)；2.02(2H，t)；2.40(2H，d)，3.88(2H，q)；5.44(1H，m)IR(KBr，cm-1)3487(OH)，1726(酯) 质谱(EI，m/z)301(M+) 实施例5a1-氧基-4-环丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
在室温下将干燥THF(50mL)中的氢化钠(60％溶于油相，1.0g，25mmol)的悬液搅拌5分钟，然后向该混合物中加入tempol(4.0g，23mmol)。将所述混合物搅拌1小时，逐滴加入环丙烷羰酰氯(2.4g，23mmol)5分钟，然后回流1小时。减压浓缩所述反应混合物。将残渣吸收在丙烷(100mL)中，分离所述上清液并减压浓缩得到红色固体。使用环己烷∶乙酸乙酯(3∶1)作为洗脱剂对该固体进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(1.4g，5.8mmol，25.3％)。
IR(KBr，cm-1)1361(N-O·)1720(酯) 实施例5b制备1-氧基-4-环丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶的其它 方法
向干燥DMF(10mL)中的环丙烷羧酸(860mg，10mmol)的搅拌溶液中以较小的比例加入1，1’-羰基二咪唑(1.78g，11mmol)。可观察到剧烈的气体生成。将该溶液在40℃加热1小时。向该混合物中加入tempol(1.72g，10mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-稀(DBU)(1.52g，10mmol)并继续在40℃加热12小时。在减压的条件下对所述反应混合物进行浓缩。将残渣溶于乙酸乙酯(100mL)中并用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水依次洗涤。将乙酸乙酯层分离，通过无水硫酸钠干燥，真空浓缩得到红色固体。使用环己烷∶乙酸乙酯(8∶1)作为洗脱剂对其进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(720mg，30.0％)。
IR(KBr，cm-1)1360(N-O·)，1720(酯) 实施例5c制备1-氧基-4-环丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶的其它方法[DCC/DMAP酯化法]
向tempol(1.72g，0.01mmol)、环丙烷羧酸(0.946g，0.011mmol)和DMAP(0.12，0.001mmol)的二氯甲烷(25mL)的搅拌溶液中加入DCC(2.27g，0.11mmol)，并将所述混合物在室温搅拌过夜。将所述混合物经硅藻土过滤，并在减压条件下对所述溶液进行蒸发。先用己烷，然后用10％溶于己烷的乙酸乙酯通过硅胶柱层析对多数产物进行分离。产量2.26g(94.1)。IR和NMR与所指定的结构一致。
实施例61-羟基-4-环丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸(化合物1)
将实施例5a的硝基氧(2.2g，9.15mmol)加入到饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液真空浓缩，并溶解于100mL乙酸乙酯中，并用饱和NaHCO3洗涤从而得到无碱的羟胺。将所述乙酸乙酯层分离，用含醚的HCl酸化，并浓缩从而得到白色固体，其可从乙醇(10ml)中重结晶成白色晶体状固体1.15g(4.13mmol，45.1％)。溶点为224-228℃(dec)。
1H-NMR(270 MHz，D2O)ppm0.97(4H，d)；1.43(1H，m)；1.44(6H，s)，1.46(6H，s)；1.90(2H，t)；2.28(2H，t)；5.2(1H，m) IR(KBr，cm-1)3478(OH)，1720(酯) 质谱(EI，m/z)240(M+) 实施例7 1-羟基-4-环丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸(其它方法)
将实施例5a中的硝基氧(700mg，2.91mmol)加入到饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液真空干燥，并溶解于100mL乙酸乙酯，并浓缩至一半体积，从而得到白色晶体状固体，627mg(2.25mmol，77.5％)。溶点为224-227℃(dec.)。
1H-NMR(270 MHz，D2O)ppm0.97(4H，d)；1.43(1H，m)；1.44(6H，s)，1.46(6H，s)；1.90(2H，t)；2.28(2H，t)；5.2(1H，m) IR(KBr，cm-1)3476(OH)，1720(酯) 质谱(EI，m/z)240(M+) 实施例81-氧基-4-(3’-苄氧基-2’，2’-二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
向干燥DMF(5mL)中的3’-苄氧基-2，2-二甲基丙酸(1.04g，5mmol)的搅拌溶液(如J.Org.Chem.，38，2349，1975中描述的类似方法制备的)中，以较小的比例加入1，1’-羰基二咪唑。可观察到剧烈的气体生成。将该溶液在50℃加热30分钟。向该混合物中加入tempol(900mg，5.23mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-稀(DBU)(800mg，5.26mmol)。将所述混合物在50℃加热3天(通过TLC监测)，然后在减压的条件下对其进行浓缩。将残渣溶于乙酸乙酯(100mL)中，并用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水依次洗涤，并用无水硫酸钠干燥。真空浓缩所述干燥溶液从而得到红色固体(1.48g)。使用环己烷∶乙酸乙酯(3∶1)作为洗脱剂对该固体进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(1.02g，2.8mmol，56.2％)。
IR(KBr，cm-1)1359(N-O·)，1732(酯) 实施例91-羟基-4-(3’-苄氧基-2’，2’-二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
将实施例8的硝基氧(1.02mg，3.34mmol)加入到饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液真空浓缩，并将残渣溶解于乙酸乙酯(20mL)。加入己烷(20mL)，所述产物开始呈油状析出；然后将所述混合物静置12小时。通过溶剂倾析得到了油性的残留物，用异丙醚对其进行处理并进行温育。待所述混合物冷却之后，得到了腊状固体，并用乙酸乙酯进行重结晶，从而得到白色晶体状固体(0.6g，1.5mmol，45％)。
1H-NMR(270MHz，D2O)ppm1.26(6H，s)，1.51(6H，d)；1.65(6H，m)；2.01(2H，t)；2.44(2H，d)，5.40(1H，m)；3.46(2H，s)；4.55(2H，s)，7.31(5H，s) IR(KBr，cm-1)3480(OH)，1712(酯)，710(芳香族) 质谱(EI，m/z)262(M+) 实施例101-羟基-4-(3’-羟基-2’，2’-二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
向1-氧基-4-(3’-苄氧基-2’，2’-二甲基)丙烷羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶(1.0g，3.83mmol)的乙醇溶液中加入Pd/C(5％，100mg)，将所述混合物在Paar氢化装置中在45psi氢化12小时。将所述反应混合物经硅藻土过滤，真空浓缩所得到清澈的无色油状物，使用环己烷∶乙酸乙酯(3∶1)作为洗脱剂对其进行硅胶柱层析，得到无色的油。将该油溶解于饱和氯化氢的乙醇溶液(20mL)中，并进行真空浓缩。静置后可结晶产物，并用乙醇重结晶(123mg，0.4mmol，10.4％)。溶点210-215℃(dec.) 游离碱的1H-NMR(270MHz，CDCl3)ppm1.14(6H，s)，1.44(6H，s)；1.57(6H，s)；1.70(2H，m)；2.8(1H，s，br)，3.65(2H，s)5.16(1H，m) IR(KBr，cm-1)3480(OH)，1712(酯)，710(芳香族) 质谱(EI，m/z)262(M+) 实施例111-氧基-4-(1-甲基-环丙烷)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
在室温下将干燥THF(80mL)中的氢化钠(60％溶于油相，2.2g)搅拌5分钟，然后加入tempol(3.0g，17.44mmol)。将所述混合物搅拌30分钟，逐滴加入1-甲基-环丙烷羰酰氯(2.2g，18.71mmol)5分钟，然后回流12小时。减压浓缩所述反应混合物，所述残渣立即结晶。使用环己烷∶乙酸乙酯(3∶1)作为洗脱剂对该产物进行硅胶柱层析纯化，得到红色结晶状固体(2.0g，7.86mmol，45.1％)。
IR(KBr，cm-1)13 14(N-O·)，1722(酯) 实施例121-羟基-4-(1-甲基-环丙烷)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
将实施例11的硝基氧(700mg，2.91mmol)加入饱和氯化氢的乙醇溶液(10mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液真空浓缩得到白色结晶状固体，将其过滤，用乙酸乙酯洗涤并真空干燥(0.700mg，2.4mmol，82.7％)。溶点为215-220℃(dec.)。
1H-NMR(270 MHz，D2O)ppm0.80(2H，d)；1.19(2H，m)；1.21(2H，s)；1.44(15H，s)；2.03(4H，m)；5.10(1H，m) 质谱(EI，m/z)254(M+) 实施例131-氧基-4-(2-呋喃)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
将溶于苯(100mL)中的甲氧基钠(溶于甲醇的25％甲氧基纳，200mg)搅拌混合物加热回流，所述苯被逐渐蒸馏直到原来体积的一半，从而得到固体甲氧基钠的精细悬液。向该混合物中加入tempol(1.76g，10mmol)、2-糠酸甲酯(1.26g，10mmol)和苯(50mL)。继续蒸馏苯8小时，从而去除所形成的甲醇。通过加入更多的苯维持烧瓶中苯的体积。将所述苯层用1N HCl洗涤，然后用水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，蒸发至干燥，得到红色固体(1.72g)，用己烷对其进行重结晶，得到1.45g产物。进一步使用环己烷∶乙酸乙酯(3∶1)作为洗脱剂对其进行硅胶柱层析，得到红色结晶状固体(1.02g，3.82mmol，32.8％)。
IR(KBr，cm-1)1364(N-O·)，1716(酯)，706(芳香族) 实施例141-羟基-4-(2’-呋喃)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
将实施例13中的硝基氧(300mg，1.13mmol)加入到饱和氯化氢的乙醇溶液(10mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液室温保持1小时并分离出白色晶体状固体。将其过滤，用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥，从而得到羟胺(220mg，0.72mmol，64.5％，溶点209.4℃-210.4℃)。
1H-NMR(270MHz，D2O)ppm1.49(6H，s)；1.62(6H，s)；2.03(2H，t)；2.42(2H，d)；5.49(1H，m)；6.63(1H，q)；6.64(1H，d)，7.34(1H，d)；7.74(1H，s) 质谱(EI，m/z)266(M+) 实施例151-氧基-4-(3’-四氢呋喃)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶
向干燥DMF(20mL)中的3-四氢呋喃羧酸(1.5g，13mmol)的搅拌溶液中以较小的比例加入1，1’-羰基二咪唑(2.3g，14.18mmol)。可观察到剧烈的气体生成。将该溶液在70℃加热1小时。向该混合物中加入tempol(2.23g，12.97mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-稀(DBU)(2.0g，13.14mmol)并继续加热12小时。将所述反应混合物倒入250mL的水中，然后用醚(2×100mL)进行提取。将含醚的层合并，并用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水依次洗涤，在无水硫酸钠上干燥，并真空浓缩，得到红色固体(2.05g)，用乙酸乙酯∶己烷(1∶2)对其进行重结晶，从而得到纯的红色晶体状固体硝基氧(1.45g，5.36mmol，37.8％)。
IR(KBr，cm-1)1360(N-O·)，1725(酯) 实施例161-羟基-4-(3’-四氢呋喃)羰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸
将实施例15中的硝基氧(300mg，1.11mmol)加入到饱和氯化氢的乙醇溶液(10mL)中。红色迅速消失并将所得的黄色溶液加热沸腾从而得到清澈的无色溶液。将所述溶液室温保持1小时并分离出白色晶体状固体。将其过滤，用乙醇洗涤，然后真空干燥，从而得到产物(146mg，0.48mmol，42.86％，溶点221.0℃-223.2℃)。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)ppm0.84(2H，m)；0.90(2H，m)；1.35(6H，s)；1.46(6H，s)；1.65(1H，m)；2.13(2H，t)；2.44(2H，d)，5.14(1H，m) 实施例17代表性化合物穿过动物角膜的吸收
在本研究中使用每组6只新西兰白兔的组来评估tempol-H和化合物1的吸收。在浓度为3.5％重量体积比的无菌盐水中制备所述检测化合物。在进行眼药水灌注的过程中将所述动物限制于盒子中，使用微量移液器，每只眼睛50μL。施用后，轻柔地保持闭眼60秒。对所述兔子每天施用两次，连续进行4天。在第5天，对所述兔子施用1次，然后在施用后30分钟(2只)，施用后60分钟(2只)和施用后120分钟(2只)将其处死。处死后立即从每只兔子采集房水。采用电子自旋共振(ESR)法测定每个样本中的tempol-H的眼房水浓度。
在所有时间点，用tempol-H施用后的房水tempol-H水平低于所述分析的可检测限(参见图1)。用化合物1施用后的房水tempol-H水平在施用后30分钟达到最高，在施用后2小时依然存在。(参见图1和表1) 表I房水浓度兔子的吸收研究 剂量50μL的3.5％溶液，单剂量(N＝4只眼睛/时间点) 实施例18 在兔子眼中鉴定的化合物1的代谢产物 对来自实施例16中所述的体内兔子研究中的房水样本进行GC/MS，鉴定了化合物1及其代谢产物，通过眼酯酶水解化合物1形成的tempol-H及羧酸(R1COOH)的存在。两种代谢产物都被观测到，但化合物1并未观测到。这验证了化合物1被完全转化成了其代谢产物。
在含有小磁棒的10mL棕色玻璃小管中对房水样本进行冷冻干燥。向其中加入1mL二氯甲烷，将所得溶液搅拌2分钟然后静置5分钟。向GC柱中进样3μL等份的所述二氯甲烷层。用质谱仪在13.02(保留时间)用m/z＝85(GC 5989型和GC 5890型系列II(都由HP制造))对环丙烷羧酸进行测定。使用了25m长、0.2mm直径的Agilent DB-5柱子。载气He为22厘米/秒。进口温度为250℃，检测器为280℃。对每一次进样，将温度在35℃保持5分钟，然后以10℃/分钟的速度升高到240℃，并在240℃保持3分钟。使用的是不分开的进样。
实施例19化合物1在兔眼中的体内耐受 在1小时内对2只有意识的兔子的每只眼睛施用6次含有3.5％化合物1的眼药水。在这一预实验中，所述药物被良好耐受并且未注意到任何的不良发现。
实施例20兔子的眼睛生物利用度 对新西兰白兔对化合物2和3的眼睛生物利用度进行了评估。将每种化合物溶解于pH 7.0的10mM磷酸缓冲液中，直到浓度达到125mM。该浓度等于化合物2和3的约3.5％。在1小时内向每只兔子双眼的角膜灌注6次，每次50μl。对每种化合物使用两只兔子。用每种化合物处理的已知兔子在最后一次施用后30分钟处死，另一只在最后一次施用后90分钟处死。
处死后，立即将每只兔子的眼睛摘出，并从眼眶采集血样。用注射器从每只眼中采集房水，然后将所述晶状体从眼睛中分割开来。小心地从所述纤微块中分离包膜/上皮细胞，并将两个部分在干冰上冷冻，所述包膜/上皮细胞置于100μl的5mM DTPA(二乙烯三胺五乙酸)溶液只并在未加入液体的情况下将所述纤微块密封于小管中。类似地，也将所述水性样本和血样快速冷冻。将包括角膜、视网膜、巩膜和玻璃体的每只眼睛的剩余部分冻存以进行后续的解剖和分析。将所有样本在干冰上运送回实验室，并保存与-75℃直至使用。
使用电子自旋共振(ESR)法对每个样本中tempol-H的眼房水浓度进行测定。对房水的分析说明两种化合物都渗入了角膜并进入到了眼房。所述两种化合物的最高浓度出现在所述30分钟样本中，而所述90分钟样本中的浓度则显著降低。在血液中也检测到了少量的化合物(每种化合物2-3μM)。
实施例21在兔子中，化合物2和3的房水浓度 表II化合物2和3的剂量50μL的125mM溶液， 在每小时的间隔×6(N＝2眼/时间点) 实施例22 水溶液溶解度数据 表III在多种系统中在室温下测定的实施例6化合物的溶解度 类似地，测定出实施例10和16中的化合物在水中的溶解度大于3.5％重量体积比(＞35mg/ml)，而实施例12中的化合物在水中的溶解度约为0.1％。
表IV酯化合物的分配系数
表V酯化合物的溶点
酯化合物的波谱数据 1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)ppm对所有4位取代的-1-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶盐酸部分而言其质谱数据都是一致的，1.35(6H，s)；1.46(6H，s)；2.13(2H，t)；2.44(2H，d)，5.14(1H，m) 下表VI至XII描述了用于合成本发明所述酯化合物其它例子的方法。通过实施例5c的所述DCC/DMAP酯化方法，可将列示与所述表中的适当羧酸都转化成酯硝基氧。通过实施例6和7所述的方法可将所述酯硝基氧转化成对应的1-羟基哌啶。
采用美国专利4,851,436中所述的方法制备了3-酰氧基-2，2-二甲基丙酸，为了合成3-乙酰氧基-2，2-二甲基丙酸，在此将其内容引用作为参考。
表VI在DCC/DMAP酯化方法中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表VII 通过J.Org.Chem.38，2349(1975)所述的方法制备了3-烷氧基-2，2-二甲基丙酸和3-烷氧基烷基-2，2-二甲基丙酸。
在所述DCC/DMAP酯化法(实施例5c)中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表VIII 采用Talley等人的美国专利5,475,013所述的方法制备了3-N-取代的-2，2-二甲基丙酸，在此将其内容引用作为参考。在所述DCC/DMAP酯化法(实施例5c)中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表IX 采用美国专利5,475,013所述的方法制备了3-S-取代的-2，2-二甲基丙酸。在所述DCC/DMAP酯化方(实施例5c)中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表X 采用美国专利5,475,013所述的方法制备了3-取代的-2，2-二甲基丙酸。在所述DCC/DMAP酯化法(实施例5c)中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表XI 各种NSAID(含有羧酸基团的非类固醇类抗炎药物)都是可商业获得的。在DCC/DMAP酯化法中用下列化合物取代环丙烷羧酸 表XII 各种羧酸都是可商业获得的。在DCC/DMAP酯化法中用下列化合物取代环丙烷羧酸 实施例65 在兔子中化合物1的单次局部剂量施用后的药代动力学，眼组织分布和总放射性的泌尿排泄 评估了在兔子中化合物1的氚标记的盐酸在单次局部剂量施用之后的药代动力学，眼组织分布和总放射性的泌尿排泄。使用了18只3-6月龄、2.1-3.0公斤重的新西兰(Harlan)白兔。
实验设计 所述实验设计是在向双眼单次局部施用[3H]化合物1-HCl的一组兔子中进行的随机的单处理研究。所述组由6个亚组组成，每个亚组中有3只动物。在施用后的6个特定时间(0.5，1，2，4，8和24小时)分别将每个亚组的三只动物处死，并采集末端(terminal)的样本。将指定的施用后24小时亚组的动物放置于代谢笼中，在施用后0-12和12-24小时收集尿液。通过心脏穿刺技术采集末端(terminal)的血液。从每一只眼中采集以下眼组织房水、玻璃体液、晶状体和角膜。在所有样本中测定总放射活性。
所述设计和剂量可见于下表。
所述动物的每只眼睛都接受单次局部眼部施用，先左(OS)后右(OD)。尽管下眼睑会轻微地拉离眼球，还是将所述剂量准确地吸取在所述角膜上，并使其在下结膜囊汇集。在药物灌注后，将眼睑轻柔地闭合1分钟，然后小心地放开。
数据分析和统计评估 使用Beckman LS6000计数器将对所有分析样本的每分钟计数转化成每分钟的衰变数(DPM)。在适当的背景消除之后，可将DPM值转化成浓度(DPM/ml或DPM/g)。计算出平均的DPM/ml或DPM/g。计算出3H放射活性的平均浓度值，并根据所测定的比活性和通过氧化测定的检测物体制剂的额定施用浓度将其转化成每毫升或每克的等价值。测定了在血液和血浆中的总放射活性浓度，以及在眼组织和尿样中的量(剂量的％)和浓度。还计算了包括血液、血浆和组织半衰期的消除动力学。还将泌尿排泄数据制成表。统计评估由描述性的统计分析组成。通过对样本分析结果未决适合性的独立模型分析，对放射活性的药代动力学进行了评估。在所述计算中使用的是未删减(non-truncatd)的数值。
代表性结果 一滴(40μl)化合物1的3％溶液，在施用后30分钟，可分别在角膜、眼房水、玻璃体、血液和血浆中产生以下峰组织浓度(ng等价值/g) 如图2所示，在施用后24小时，在所有组织中的放射活性依然是可测的。之前已证明，用化合物1的3％溶液对兔子进行每天4次、施用1周也不会引起毒性。
实施例66在兔子模型中化合物1或Tempol-H对光化学视网膜损伤的治疗效果 光产生视网膜损伤的能力远远低于其能够产生热损伤的水平被称为光化学视网膜损伤。一般认为光化学视网膜损伤的作用机理是光诱导的自由基的产生。目前已经充分意识到了在临床眼科中所使用的常见光源能够产生的光化学视网膜损伤的能力。已证明在眼科手术中使用的操作显微镜具有产生视网膜光化学损伤的能力。这一观察结果已被用来在兔眼中构建一个模型，用来检测各种制剂对光化学视网膜损伤的防御能力。现已测定眼观察仪器(opthalmoscopically)可见的视网膜损伤在暴露于操作显微镜仅2.5分钟之后就可检测到。以下设定的操作方法可用来确定通过玻璃体内注射施用化合物1或tempol-H是否能够阻止由操作显微镜产生的眼观察仪器可见的光化学视网膜损伤的发展。
材料和方法 在处理前一周，对每只动物进行基线眼底照相和FA。在暴露于来自操作显微镜的光线前1天，每只动物的一只眼睛接受0.1cc BSS的玻璃体内注射作为对照，而另一只眼睛则接受0.1cc溶于BSS介质的化合物1或Tempol-H。通过IM注射60-40％盐酸氯胺酮(氯胺酮)100mg/ml和甲苯噻嗪20mg/ml的混合物将所述动物麻醉。将窥器插入接受所述注射的眼中，使用30g的针穿过紧邻于缘之后的巩膜，并转变角度使其不接触到晶状体，并将其尖端放置于玻璃体腔中部。注射之后，用手持Applanation眼压器监测眼内压。如果必要的话，可在所述动物返回其笼子之前，实施穿刺术将眼内压降低至正常水平。或者，可在所述过程之前，通过局部眼药水的多次灌注将化合物1或tempol-H施用于所述兔子的眼睛。
将20只有色兔子的40只眼睛暴露于Zeiss OpMi 1型操作显微镜的光不同时间段直至1小时。通过IM注射60-40％盐酸氯胺酮100mg/ml和甲苯噻嗪20mg/ml的混合物将所述动物麻醉。然后将所述兔子固定于桌上；向要暴露的眼中插入眼睑窥器。用托品酰胺HCl 1％使瞳孔扩大，用BSS冲洗角膜。将来自显微镜的光定位于离所述动物20cm位置的方式，从而将所述光集中并与所述眼睛平行。所述光束集中在所述角膜上锐聚焦中。暴露后48小时，对所述动物进行检验并重复进行眼底照相和FA。采用标准方法处死动物并收集选中的眼睛，并储存于冷的戊二醛(glutaldehyde)溶液中以进行其它分析。
实施例67玻璃体内注射之后化合物1或Tempol-H掺入兔子视网膜组织的评估 为了评价化合物1或tempol-H对预防AMD和其它视网膜病症的有效性，必须确定所述药物已掺入视网膜组织。在本实施例中设定的操作方法采用了闪烁技术来制定在向所述兔子进行玻璃体内注射之后，化合物1或tempol-H掺入视网膜组织的量和持续时间。因为兔子的大眼睛为治疗施用提供了适当的模板，所以在包括玻璃体内注射的实验中对新西兰白兔进行详细的表征(Hosseini等人，2003，Lasers Surg.Med.32265-270)。此外，在通过闪烁技术对吸收进入视网膜组织的药物进行评估的实验中也广泛的使用了新西兰白兔(Ahmed等人，1987，J.Pharm.Sci.76583-586)。
材料与方法 在本实验方法中使用的是24只2.5-3公斤重的雄性新西兰白兔。将所述兔子随即分入两个处理分组中的一组。开始对兔子进行基线眼科检查从而确保所有眼睛都没有受到刺激和感染。在随即分组和基线检测之后，通过皮下注射100mg/ml盐酸氯胺酮/20mg/ml甲苯噻嗪将所述兔子麻醉。向双眼施用1滴商业可获得的0.5％盐酸丙对卡因(proparacaine hydrochloride)。然后根据以下所示的盲随机化方案(masked randomization)通过玻璃体内注射对兔子进行双侧(bilaterally)处理。
盲处理组 1.用标记的化合物1或tempol-H进行双侧的玻璃体内注射。(N＝12) 2.用安慰剂(介质)进行双侧的玻璃体内注射。(N＝12) 在1、7、14和28天，将分别来自每一处理组的3只兔子共6只兔子，用致死剂量的戊巴比妥钠处死。处死后立即实施双侧摘出，并将所述视网膜组织取出进行闪烁分析(在摘出后可将视网膜组织冷冻以防止液体流失)。将视网膜组研磨成匀浆并溶解于碱或季铵化合物中。记录闪烁读数从而对存在于所述视网膜组织中的化合物1或tempol-H的量进行定量。
对统计分析而言，来自用实验物体施用的所有兔子的数据都认为是有价值的。初级和次级效率变量具有统计显著性。采用的是双侧非参数统计检验，p＜0.05被认为统计显著。
实施例68Tempol-H对视网膜色素上皮细胞(RPE)中的光氧化过程进行保护的效率 背景 尽管目前还不清楚萎缩性老化相关性黄斑变性(AMD)的病因学，但通常都接受AMD是开始于视网膜色素上皮细胞的死亡、光受体细胞的变性，以及由此引起的之后发生的视觉丧失。有越来越多的证据将在RPE中累积的脂褐素与这些细胞的死亡关联起来。例如，不仅黄斑下面RPE细胞中的脂褐素水平最高，通过测定眼底自动荧光监测RPE的脂褐素也证明了在先前荧光增强的位点，RPE萎缩的区域会随之扩大。对于测定RPE脂褐素和RPE细胞死亡之间关联的研究显示RPE脂褐素的组分，即双维甲酸类发光团A2E能够扰乱细胞膜，并且介导蓝光对RPE的损伤。A2E的光激活导致了单态氧的生成，且后者沿着来自A2E的维甲酸类侧链对碳-碳双键的加成由此形成了环氧化物。以这种方式，可将A2E转化成含有多种环氧化物化合物的混合物(A2E-环氧化物)。已证明这些高活性的环氧化物能够损伤细胞。最终，在RPE细胞中由A2E的激发引起的光化学事件启动了细胞死亡，该启动过程包括半胱氨酸依赖性蛋白酶(caspase)的参与来分解细胞底物，并且可通过线粒体蛋白bcl-2进行调节。
还测定了tempol-H对A2E介导的蓝光损伤的保护能力。
材料与方法 将在培养中积累了A2E的APRE-19细胞暴露于卤素源所递送来的430+/-20nm的光。这个波长的光是适当的，因为(i)A2E的激发最大值为约430nm，和(ii)这一波长的光可在体内达到所述RPE，而波长大于400nm的光则不能被角膜和晶状体所吸收。对用tempol-H预处理(24小时)和没有预处理的蓝光照射的充满A2E的RPE的细胞死亡进行了比较。细胞活力的丧失是通过以下2种方式进行定量的 1.基于健康的具有代谢活性的细胞将所述黄色四唑鎓盐MTT分解成紫色的formazan晶体进行量热计微滴定分析。在蓝光照射之后24小时测定细胞活力。在2个实验中的每一个中都分析三个重复的小孔。
2.双色荧光分析，其中通过膜-impermeant染料(Dead Red核酸染料，Molecular Probes)染色所有死细胞的细胞核都染成红色，而DAPI将所述细胞的细胞核染成蓝色。在蓝光照射后8小时测定细胞活力。通过对每个孔中照射区域中5个视野内的细胞计数进行重复分析，每个实验对3个孔进行分析。所的数据是基于3次实验的结果。
结果 如图3和图4所示，在这一黄斑变性的模型中，tempol-H提供了对于充满A2E的RPE死亡的剂量依赖性保护。这表明了对化合物1的期待，而同时tempol-H也是化合物1的活性代谢产物。
尽管参照所提供的优选实施方案对本发明进行了特别地说明和描述，但还需理解本发明并不局限于在此具体公开和示例性的实施方案。可对本发明优选实施方案进行诸多改变和修改，并且这种改变和修改不背离所附权利要求所限定的本发明的范围和精神。
权利要求
1.治疗患者黄斑变性、视网膜病变、青光眼、老花眼、结膜疾病、眼睑病症、角膜疾病或眼葡萄膜炎的方法，所述方法包括向所述患者的眼睛施用包括含有至少一种下式化合物的眼科可接受的载体或稀释剂的组合物
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；
R3和R4独立地为C1-C3的烷基；以及
其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或二者可以为环烷基；
R5为H、OH或C1-C6的烷基；
R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基；
R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基
或其中R6和R7相连，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环。
2.如权利要求1所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是C1-C3的烷基。
3.如权利要求2所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是乙基。
4.如权利要求2所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是甲基。
5.如权利要求4所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6为苄氧基或C1-C6烷氧基取代的甲基；以及
R7为甲基。
6.如权利要求4所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6和R7形成了环丙基。
7.如权利要求4所述的方法，其中
R5，R6和R7形成了呋喃基。
8.如权利要求4所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了四氢呋喃基。
9.如权利要求4所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了环丙基环。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述施用是通过眼药水，洗眼液或眼用软膏进行的。
11.如权利要求1所述的方法，还包括对所述患者施用还原剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物共施用。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物分别施用。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述还原剂是巯基化合物。
15.如权利要求14所述的方法，还包括向所述患者共施用巯基丙酰基甘氨酸，N-乙酰半胱氨酸，β-巯基乙胺或谷胱甘肽。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述还原剂是通过眼药水，洗眼液或眼用软膏施用的。
17.如权利要求1所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约0.1μM-约10mM。
18.如权利要求1所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约1μM-约5mM。
19.如权利要求1所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约25μM-约1mM。
20.如权利要求1所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约50μM-约100μM。
21.预防或延缓白内障、老花眼、青光眼、老化相关性黄斑病症或其它老化相关性眼部疾病的发展的方法，所述方法包括向眼睛施用包括含有至少一种下式化合物的眼科可接受的载体或稀释剂的眼药水，洗眼液或眼用软膏
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；
R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且
其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或二者为环烷基；
R5为H、OH或C1-C6的烷基；
R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基；
R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基
或其中R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环；
其中，所述施用是在老化相关性疾病开始之前或其开始的时候进行的。
22.如权利要求21所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是C1-C3的烷基。
23.如权利要求22所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是乙基。
24.如权利要求22所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是甲基。
25.如权利要求24所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6为苄氧基或C1-C6烷氧基取代的甲基；且
R7为甲基。
26.如权利要求24所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6和R7形成了环丙基。
27.如权利要求24所述的方法，其中
R5，R6和R7形成了呋喃基。
28.如权利要求24所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了四氢呋喃基。
29.如权利要求24所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了环丙基。
30.如权利要求21所述的方法，还包括对所述患者施用还原剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物共施用。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物分别施用。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述还原剂是巯基化合物。
34.如权利要求33所述的方法，还包括向所述患者共施用巯基丙酰基甘氨酸，N-乙酰半胱氨酸，β-巯基乙胺或谷胱甘肽。
35.如权利要求21所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约0.1μM-约10mM。
36.如权利要求21所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约1μM-约5mM。
37.如权利要求21所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约25μM-约1mM。
38.如权利要求21所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约50μM-约100μM。
39.保护视网膜色素上皮细胞免受光氧化损伤的方法，所述方法包括向眼睛施用包括含有至少一种下式化合物的眼科可接受的载体或稀释剂的眼药水，洗眼液或眼用软膏
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；
R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且
其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或二者为环烷基；
R5为H、OH或C1-C6的烷基；
R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基；
R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基
或其中R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环；
其中，所述施用是在老化相关性疾病开始之前或其开始的时候进行的。
40.如权利要求39所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是C1-C3烷基。
41.如权利要求40所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是乙基。
42.如权利要求40所述的方法，其中R1，R2，R3和R4是甲基。
43.如权利要求42所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6为苄氧基或C1-C6烷氧基取代的甲基；且
R7为甲基。
44.如权利要求42所述的方法，其中
每个R5为H或甲基，
R6和R7形成了环丙基。
45.如权利要求42所述的方法，其中
R5，R6和R7形成了呋喃基。
46.如权利要求42所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了四氢呋喃基。
47.如权利要求42所述的方法，其中
R5为H，且
R6和R7形成了环丙环。
48.如权利要求39所述的方法，还包括对所述患者施用还原剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物共施用。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述还原剂与所述组合物分别施用。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述还原剂是巯基化合物。
52.如权利要求51所述的方法，还包括向所述患者共施用巯基丙酰基甘氨酸，N-乙酰基半胱氨酸，β-巯基乙胺或谷胱甘肽。
53.如权利要求39所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约0.1μM-约10mM。
54.如权利要求39所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约1μM-约5mM。
55.如权利要求39所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约25μM-约1mM。
56.如权利要求39所述的方法，其中将所述化合物施用直至在组织和体液中的浓度达到约50μM-约100μM。
57.保护毛囊和预防进一步脱发的方法，其包括向需要的患者施用包括含有至少一种下式化合物的药物可接受的载体或稀释剂的组合物，
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；
R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且
其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或二者为环烷基；
R5为H、OH或C1-C6的烷基；
R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基；
R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基或其中R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环；
其中，所述所述组合物保护毛囊且预防进一步脱发。
58.保护或治疗直肠组织免于由于辐射治疗引起的损伤的方法，其包括向需要的患者施用包括含有至少一种下式化合物的药物可接受的载体或稀释剂的组合物
其中，R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；
R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且
其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或二者为环烷基；
R5为H、OH或C1-C6的烷基；
R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基；
R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基
或其中R6和R7，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环；
其中，所述所述组合物缓解、延缓或阻止组织损伤。
59.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是睑炎。
60.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是眼红斑痤疮。
61.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是黄斑变性。
62.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是视网膜病变。
63.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是青光眼。
64.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是老花眼。
65.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包括用于治疗所述黄斑变性、视网膜病变、青光眼、老花眼、结膜疾病、眼睑病症、角膜疾病或眼葡萄膜炎的第二化合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中同时施用所述第二化合物。
67.如权利要求65所述的方法，其中顺序施用所述第二化合物。
全文摘要
本发明公开了用于阻止白内障、老花眼、黄斑变性和其它视网膜病变、青光眼、眼葡萄膜炎以及多种角膜病症发展的眼科可接受的组合物。所述组合物也可用作预防性治疗手段来预防或延缓老化相关性眼科病症，所述病症包括白内障、老花眼、青光眼和黄斑变性。所述组合物包括药物可接受的载体或稀释剂和至少一种所述通式的化合物，其中R1和R2独立地为H或C1-C3的烷基；R3和R4独立地为C1-C3的烷基；且其中，R1和R2相连，或R3和R4相连，或都可以是环烷基；R5为H、OH或C1-C6的烷基；R6是或是C1-C6的烷基、烯基、炔基或 取代的烷基或烯基；R7是C1-C6的烷基、烯基、炔基或取代的烷基或烯基或其中R6和R7相连，或R5，R6和R7相连，形成环中含有3-7个原子的碳环或杂环。
文档编号A61K31/445GK101102770SQ200480034358
公开日2008年1月9日 申请日期2004年11月22日 优先权日2003年11月20日
发明者威廉·L·马蒂尔, 甘希亚姆·帕蒂尔 申请人:奥特拉药物公司