因子vii多肽的稳定化固体组合物的制作方法

专利名称：因子vii多肽的稳定化固体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药盒，所述药盒包含含有因子VII或因子VII相关多肽的化学和物理上稳定的组合物，使得这些组合物能够在室温进行贮藏、操作和使用。
背景技术：
含有多肽的药物是复杂的组合物。开发这类药物时需要考虑一系列参数。例如，药物必须是有效的、安全的、且具有良好患者顺应性。此外，可以使用药物上可接受赋形剂配制成非胃肠道施用的药物，这必须获得各种全世界医学管理机构的批准。为了非胃肠道施用的目的，非常希望制剂是大致等渗的，而且制剂的pH能使得在注射/灌输后处于生理学合适范围内，否则它可能导致患者疼痛和不适。关于蛋白质制剂的一般综述参阅例如Cleland等人，稳定蛋白质制剂的开发对蛋白质聚集、脱酰胺、和氧化的密切关注，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1993，10(4)307-377；和Wang等人，蛋白质和肽的肠胃外制剂稳定性和稳定剂，Journal of Parenteral Science and Technology，1988(增刊)，42(2S)。
然而，对于包含多肽的药物而言，安全性可能与多肽的物理和化学稳定性直接相关。多肽易受物理降解的影响，包括变性和聚集，诸如形成可溶性或不溶性的二聚体、寡聚物和多聚物形式的聚集体；或者易受化学降解的影响，包括例如水解、脱酰胺、和氧化。因此，所述物理和化学不稳定性可能导致多肽活性的损失、有毒且免疫原性降解产物的形成、在注射降解的多肽后诱发血栓症的严重风险、堵塞用于注射的针头和非均质的风险等。
因此，包含多肽的组合物需要稳定化，从而能够在环境温度进行贮藏和操作。将多肽稳定化的一种方法涉及将多肽脱水，例如诸如以冻干饼的形式提供多肽，即在冻干处理后获得的最终物质。然而，冻干处理自身对多肽有害；在冻干过程中，首先冷却多肽溶液直至充分冻结，多肽溶液中大量的水将在此阶段形成冰。因此，多肽易受由冷冻诱导的压力，导致变形和沉淀。在下一步中，即所谓的第一干燥阶段，冰升华；而在第二干燥阶段，在较高温度下除去吸附或结合水。在此脱水过程中，多肽可能松开主要由氢键提供的正确构象。
因此，为了在冻干过程中保持多肽的构象、活性、和稳定性，需要为多肽溶液补充足够量的具有防冻剂和/或防溶剂特性的适当赋形剂，从而分别保护蛋白质免于由冷冻诱导的压力和/或脱水过程中的压力。
US 20010031721 A1(American Home Products)关注高度浓缩、冻干且液态的因子IX制剂。
WO 97/26909(Genetics Instute)关注适于贮藏和施用的因子IX冻干制剂。这些制剂可以包含蔗糖或甘露醇作为防冻剂。
WO 95/28954(Genetics Institute)关注适于贮藏和施用的因子IX制剂。这些制剂可以包含蔗糖作为防冻剂。
另外，在提供冻干产品时，关键的特征涉及冻干饼的特性。它需要具有在形式和结构方面的优良特性，即它应当不会崩塌，因为这些崩塌块难以或甚至不可能在使用前溶解(重构)。相反，冻干饼的物理结构最好不要太松太软。因此，在冻干前向蛋白质溶液中加入一种或多种所谓的膨胀剂(bulking agent)。
除了选择正确的膨胀剂，关键是避免赋形剂，其使饼的物理性质不稳定。所述物质的浓度应当尽可能的低。此外，重要的是，重构溶液不能过于低渗或高渗，因为那样会引起注射不便，或者在注射时甚至引起患者疼痛。因此，通常需要向组合物中加入渗透性。其它赋形剂可为缓冲物质，用于在贮藏期间保持重构溶液的pH稳定。
维生素K-依赖性多肽是一组参与凝血过程的多肽，包括因子VII，因子IX，因子X，因子II，蛋白C，蛋白S，gas6，和骨基质Gla多肽，或可以是选自如下的蛋白酶因子VIIa，因子IXa，因子Xa，因子IIa，和活化的蛋白C。因子VIIa，IXa和Xa是特别有用的蛋白酶。因子VIII是参与凝血的多肽。可通过重组技术获得或者从血浆中制备，且广泛用于血友病患者出血事件的治疗。
因子VII是参与凝血过程的多肽。目前，因子VIIa可通过重组技术制备(rFVIIa)且广泛用作促止血物质。因子VII(人野生型)在美国专利4,784,950中有描述。rFVIIa为目前提供了快速且高效的经历出血之血友病个体中的促止血应答。有利地，rFVIIa可被用于治疗由于抗体形成而不能用其它凝固因子产品治疗的血友病个体。患有因子VII缺乏的个体或具有正常凝血系统但是仍经历过量流血的个体可用rFVIIa成功治疗。
现在以冻干产品形式提供的重组生产的FVII多肽意欲贮藏于约2℃-约8℃。对冷却条件的要求造成了对制造商或供应商以及终端用户(患者)的负担和不便。
目前，重组生产的FVII产品有NovoSeven_(Novo Nordisk A/S，丹麦)，它由1.2mg重组人因子VIIa、5.84mg NaCl、2.94mgCaCl2·2H2O、2.64mg甘氨酰甘氨酸、0.14mg聚山梨酸酯80、和60.0mg甘露醇组成。加入2.0ml注射用水(WFI)重构后，pH是5.5，而且由此配制的含FVII溶液足以在室温稳定24小时。
本发明的研究人员发现，将冻干的NovoSeven_产品于25℃贮藏6个月后，占初始含量约6-7％w/w的rFVIIa以聚集体的形式存在。
因此，含有因子VII多肽的组合物需要被稳定从而允许在室温贮藏和操作。
本发明的一个目的是提供改进的组合物、药盒和制备它们的方法，其中所述含有多肽的干组合物对化学和物理降解是稳定的(诸如，例如形成较少的二聚体/寡聚物降解形式)；由于其形式和结构具有冻干饼的良好性质，即它不应当崩塌；具有冻干饼的良好和稳定的物理结构；且该干组合物摒弃了使饼的物理性质不稳定的赋形剂，例如通过降低最低可融化的熔点并因此增加了饼崩塌的风险；其中通过将含干多肽的组合物在施用载体中溶解重建的组合物是等渗的，或接近等渗的，具有确定的pH(pH-稳定的)。特别的，一个目的是提供含有因子VII多肽而基本上不存在降解产物且不降低因子VII多肽的活性(优选的在室温条件下长期贮藏后，例如至少6个月)的改进组合物。此外，一个目的是适于非胃肠道施用的稳定组合物，以不引起患者的任何不便。
发明概述本发明人发现，含有多肽的药物可以药盒的部分的形式提供，所述药盒的部分包含第一单元形式，所述第一单元形式由含有多肽和至少一种稳定剂的干(例如冻干)组合物和用于容纳所述第一单元形式的容器组成，其中所述组合物具有不超过约3％的含湿量；以及在用于容纳所述单元的容器中，由施用载体组成的第二单元形式，所述施用载体包含溶解(重建)所述组合物的溶剂和至少一种选自如下的成分(i)当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂，其中所述试剂以约0.1mM-100mM的量存在，和(ii)以足以使得自溶解第一单元形式的组合物于第二单元形式之施用载体的溶液基本上等渗的张力调节剂。
通常存在于制剂中的物质如缓冲物质和张力调节剂非常容易降低最低可融化的熔点，因此增加饼的崩塌风险。如果在冻干过程中存在这些物质，在初步干燥过程中冰的温度必须被降低，以避免崩塌，因此，用于冻干的时间延长了。这些冻干饼中的物质浓度应当尽可能的低，或者它们应当完全避免。相反，它们可有利的加入重建液体。
通过降低这些赋形剂的浓度或者完全除去它们，重建溶液有时候会变得低渗，其需要加入张力调节剂到溶剂中，以获得具有需要的张力之溶液，如等渗的，或接近等渗的(“基本上等渗的″)。溶剂中另一需要的赋形剂是缓冲物质，以保持重建的溶液之pH在贮藏过程中稳定。
药盒的部分足够稳定，以允许在室温下贮藏约至少8个月。
此外，发现可以在足够稳定的组合物中提供因子VII多肽，从而能够在室温贮藏约至少8个月。研究人员发现，稳定化作用涉及一些药物上可接受赋形剂的适当组合。
因此，本发明第一方面，涉及一种药盒(含有药物/治疗)，所述药盒包含a)在第一单元形式中，含有多肽和至少一种稳定剂的组合物，其中所述组合物具有不超过约3％的含湿量，以及用于容纳所述第一单元形式的容器装置；和b)在第二单元形式中，含有用于重构(溶解)所述组合物的溶剂和至少一种选自如下的成分之施用载体(i)当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂，其中所述试剂以约0.1mM-100mM的量存在，(ii)以足以使得自溶解第一单元形式的组合物于第二单元形式之施用载体的溶液基本上等渗的量的张力调节剂；和用于容纳所述第二单元形式的容器装置。
第二方面，本发明涉及一种制备多肽的液体制剂的方法，所述方法包括步骤a)提供上述的第一单元形式和第二单元形式；b)将所述第一和第二单元形式混合以提供施用载体中的溶解的组合物液体溶液。
在第三和第四方面，本发明涉及一种治疗凝固因子应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的根据上述方法制备的所述凝固因子之液体制剂，以及涉及所述制剂用于制备呈如上述药盒形式的用于治疗因子VII-应答性综合征的药物的用途。
在第五方面，本发明涉及一种组合物，其中包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂
a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；d)甲硫氨酸；以及约0.06-0.08mg/mL量的聚山梨酸表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
在第六方面，本发明涉及一种制备如上述定义的组合物的方法，包括步骤i)提供溶液中的因子VII多肽，所述溶液包含至少一种选自如下的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；以及聚山梨酸酯表面活性剂，其量为约0.06-0.08mg/mL；ii)加工所述溶液以获得具有含湿量不超过约3％w/w的固体组合物。
在第七和第八方面，本发明涉及一种治疗FVII-应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的如上述定义的组合物，以及涉及因子VII多肽用于制备治疗因子VII-应答性综合征的药物的用途，所述药物包含上述定义的组合物。
发明详述本发明涉及包含因子FVIII、维生素K依赖性多肽和因子VII多肽之多肽的贮藏稳定的药盒和组合物。这些组合物可以在室温贮藏较长时间而不会引起多肽的显著降解。室温指室内环境温度；它通常的范围是约5℃-约40℃，诸如约10℃-30℃、或15℃-25℃。
通过特定药物上可接受赋形剂的适当预定组合，本发明的研究人员提供了包含多肽，特别是因子VII多肽的稳定化组合物，从而能够将组合物于室温贮藏较长时间，诸如至少约8个月。有利的是，稳定化组合物不必贮藏于冷却条件，诸如2℃-8℃。
本发明还关注于在约30℃贮藏至少约8个月时仍稳定的贮藏稳定的组合物。这些组合物优选贮藏于黑暗中。因此，本发明使之有可能将这些组合物贮藏于室温而不会增加对施用这些组合物的患者的不利事件。有利的是，改进的贮藏稳定性还将使花费降低，因为贮藏不需要特殊的冷却条件，还使用户处理组合物更加方便。
待根据本发明配制的多肽包括，但不限于，凝血因子包括维生素K-依赖性多肽，如例如，不限于，因子VIII、因子V、因子XI、因子VII、因子IX、因子X、因子II、蛋白C、蛋白S、gas6、和骨基质Gla多肽；活化的FVIII、因子Va、因子XIa、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa、和活化的蛋白C。
术语″维生素K依赖性多肽″包括选自如下的多肽因子VII、因子IX、因子X、因子II、蛋白C、蛋白S、gas6、和骨基质Gla多肽或可为选自如下的蛋白酶因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa和活化的蛋白C。因子VIIa、IXa和Xa为特别有用的蛋白酶。
术语″因子VII多肽″意指任何在防止或治疗出血中有效的因子VII多肽。包括来自血液或血浆的，或由重组方法产生的因子VII多肽。
在用于本文时，″因子VII多肽″涵盖但不限于因子VII以及因子VII相关多肽。术语″因子VII″意欲涵盖但不限于具有野生型人因子VII氨基酸序列第1-406位(公开于美国专利号4,784,950)的多肽，以及由其它物种衍生的野生型因子VII，诸如牛、猪、犬、鼠、和鲑鱼，所述因子VII是由血液或血浆衍生的，或者是通过重组技术生产的。它还涵盖个体之间可能存在或发生的因子VII天然等位基因变异。同样，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可能随所选宿主细胞和宿主细胞环境的性质而变化。术语″因子VII″还意欲涵盖处于未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及经过蛋白水解加工而生成的相应生物活性形式，这可以称为因子VIIa。通常，因子VII在第152位与第153位之间得到切割而生成因子VIIa。
术语“因子VII衍生物″如此处所用，意在指显示与野生型因子VII基本上相同或改善的生物学活性的FVII多肽，其中亲本肽的一个或多个氨基酸被基因工程和/或化学和/或酶学修饰，例如通过烷基化、糖基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等。这包括但不限于PEG化的人因子VIIa，半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa及其变异体。因子VII衍生物的非限定性实例包括GlycoPeg化的FVII衍生物，如WO 03/31464和美国申请 US20040043446，US 20040063911，US20040142856，US 20040137557以及US20040132640中所述NeoseTechnologies，Inc.)；FVII偶联物如WO 01/04287，US专利申请20030165996，WO 01/58935，WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO02/02764，美国专利申请20030211094(University of Minnesota)中所述。
术语“改善的生物活性″是指具有如下性质的FVII多肽i)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的多肽，或ii)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增加的TF结合活性的FVII多肽，或iii)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增加的血浆半寿期的FVII多肽。术语″PEG化人因子VIIa″是指人因子VIIa，具有与人因子VIIa多肽偶联的PEG分子。应当知晓，PEG分子可以与因子VIIa多肽的任一部分相连，包括因子VIIa多肽的任一氨基酸残基或糖基。术语″半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa″是指具有偶联于导入人因子VIIa的巯基的PEG分子之因子VIIa。
如上所述，术语″因子VII多肽″还意指″因子VII相关多肽″。术语″因子VII相关多肽″意欲涵盖处于未切割(酶原)形式的这些多肽，以及经过蛋白水解加工而生成的相应生物活性形式。在用于本文时，″因子VII相关多肽″涵盖但不限于与野生型人因子VII相比展示基本上相同或改进的生物学活性的多肽，其中相对于野生型人因子VIIa，其生物学活性大大降低(如美国专利4,784,950中所公开)。这些多肽包括但不限于因子VII或因子VIIa已被化学修饰，例如通过使因子VII与不可逆抑制剂如有机磷化合物、磺酰氟、肽卤甲基酮或氮杂肽反应，或者非限制性实例被酰化，以及导入了略微改变或改进多肽生物学活性的特定氨基酸序列改变的因子VII变体，诸如例如其中因子VIIa的催化活性通过催化位点或三联体的化学衍生化被抑制术语″催化位点″或“活性位点″，当此处用于指FVIIa时，是指催化和酶原底物结合位点，包括FVIIa的“S1″位点，该术语如Schecter，I.和Berger，A.所述，(1967)Biochem.Biophys.Res.Commun.7157-162。人和牛因子VII蛋白质的催化位点包括氨基酸Ser344、Asp242和His193(下标表示在序列中的位置编号)，形成所谓的催化“三联体″。其它哺乳动物的因子VII中的催化位点可以利用现有的技术确定，尤其是包括蛋白质分离和氨基酸序列分析。催化位点也可通过序列与其它丝氨酸蛋白酶的序列比对确定，特别是胰凝乳蛋白酶，其活性位点此前业已确定(Sigler等人，J.Mol.Biol.，35143-164(1968))，由比对确定类似的活性位点残基。
因子VII相关多肽(包括与野生型因子VIIa相比具有基本上相同或改进的生物学活性的变异体)涵盖那些在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时，与在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa相比展示至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、更优选至少约100％、更优选至少约110％、更优选至少约120％、且最优选至少约130％的比活的多肽。
因子VII相关多肽包括变异体，相对于野生型人因子VIIa的活性，其所述生物学活性被大大降低，包括显示低于约25％，更优选低于约10％，或5％，或3％，或2％，且最优选低于约1％的野生型因子人因子VIIa的比活性的那些多肽，如本说明书中所述在一种或多种凝结测定法、FIXa或FXa产生测定法、氨解或蛋白解测定法中测定。
在有些实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽，特别是变异体，其中在″体外水解测定法″(见下文实施例，一般方法)中进行测试时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比是至少约1.25；在其它实施方案中，该比是至少约2.0；在还有一些实施方案中，该比是至少约4.0。在本发明的有些实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽，特别是变异体，其中在″体外蛋白水解测定法″(见下文实施例，一般方法)中进行测试时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比是至少约1.25；在其它实施方案中，该比是至少约2.0；在还有一些实施方案中，该比是至少约4.0；在还有一些实施方案中，该比是至少约8.0。
与野生型因子VII相比具有基本上相同或改进的生物学活性的因子VII变异体的非限制性实例包括S52A-FVII、S60A-FVII(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352182-192、1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、和S336G-FVII；美国专利号5,580,560中公开的展示蛋白水解稳定性增加的FVIIa变异体；在第290位与第291位残基之间或第315位与第316位残基之间受到蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；氧化形式的因子VIIa(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.，36343-54，1999)；PCT/DK02/00189中公开的FVII变异体；WO02/38162(Scripps研究院)中公开的展示蛋白水解稳定性增加的FVII变异体；WO 99/20767，美国专利US6017882和US6747003、美国专利申请20030100506(明尼苏达大学)和WO00/66753、美国专利申请US2001 0018 414，US2004220106和US200131005，US专利US6762286和US6693075(明尼苏达大学)中公开的具有经修饰的Gla结构域且展示膜结合增强的FVII变异体；WO 01/58935、美国专利US68060063、美国专利申请20030096338(Maxygen Aps)、WO03/93465(Maxygen，Aps)和WO 04/029091(Maxygen ApS)中公开的FVII变异体；WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635、丹麦专利申请PA2002 01423、丹麦专利申请PA 2001 01627；WO 02/38162(Scripps研究院)中公开的与野生型FVIIa相比生物学活性增加的FVII变异体；以及JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic研究院)中公开的具有增强活性的FVIIa变异体。
具有相对于野生型因子VII明显降低的生物学活性之因子VII多肽的非限制性实例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem 293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，FFR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，和缺乏Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等人，FEBS Letts.317245-249，1993)。非限制性实例也包括人FVIIa，其在位置341的赖氨酸残基被另一氨基酸残基替代；人FVIIa，其在位置344的丝氨酸残基被另一氨基酸残基替代；人FVIIa，其在位置242的天冬氨酸残基被另一氨基酸残基替代；人FVIIa，其在位置193的组氨酸残基被另一氨基酸残基替代；FVII-(K341A)；FVII-(S344A)；FVII-(D242A)；FVII-(H193A)；Phe-Phe-Arg-FVII(FFR-FVII)，D-Phe-Phe-Arg-FVII(D-FFR-FVII)，Phe-Pro-Arg-FVII(FPR-FVII)，D-Phe-Pro-Arg-FVII(D-FPR-FVII)，L-Glu-Gly-Arg-FVII(EGR-FVII)和D-Glu-Gly-Arg-FVII(D-EGR-FVII)，Dansyl-Phe-Phe-Arg-FVII，Dansyl-D-Phe-Phe-Arg-FVII，Dansyl-Phe-Pro-Arg-FVII，Dansyl-D-Phe-Pro-Arg-FVII，Dansyl-L-Glu-Gly-Arg-FVII和Dansyl-D-Glu-Gly-Arg-FVII。化学修饰的因子VII多肽的非限制性实例和序列变异体描述于例如美国专利5,997,864。因子VII或因子VII相关多肽的实例包括但不限于野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，和S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E 96V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-因子VII，S60A-因子VII；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；从233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII，从304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII，以及从Ile153至Arg223的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII。
为了本发明的目的，可以使用缺乏因子VII的血浆和促凝血酶原激酶通过测量制剂促进血液凝结的能力而将因子VII多肽的生物学活性(″因子VII生物学活性″)定量，例如美国专利号5,997,864中所述。在这种测定法中，生物学活性表述成凝结时间相对于对照样品的缩短，并且通过与含1U/ml因子VII活性的合并人血清标准品进行比较而转变成″因子VII单位″。或者，可以通过下列方法而将因子VIIa生物学活性定量(i)在包含TF(包埋在脂膜中)和因子X的系统中测量因子VIIa或因子VIIa相关多肽生成激活的因子X(因子Xa)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.，27219919-19924，1997)；(ii)在水性系统中测量因子X水解(″体外蛋白水解测定法″，见下文实施例，一般方法)；(iii)使用基于表面激元共振(surface plasmon resonance)的仪器测量因子VIIa或因子VIIa相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.，413359-363，1997)；(iv)测量因子VIIa和/或因子VIIa相关多肽对合成性底物的水解(″体外水解测定法″，见下文实施例，一般方法)；和(v)在不依赖TF的体外系统中测量凝血酶的生成。
术语″因子VII生物学活性″或″因子VII活性″意在包括生成凝血酶的能力；该术语还包括在缺乏组织因子时在激活的血小板的表面上生成凝血酶的能力。
本说明书详细描述了可用于测定FVII生物学活性的测定法。
此外，贯穿本说明书，下列术语具有以下含义术语“药盒″或“部分的药盒″是指在第一单元中的干产品(含有多肽和一种或多种稳定剂)；和在第二单元中，由适于溶解第一单元的干产品之溶剂，结合至少一种缓冲剂(量为约0.1mM-100mM)和/或至少一种张力调节剂组成的施用载体的组合。药盒含有药物治疗，特别是出血事件。在使用前，第一单元的干组合物与包含在第二单元的施用载体混合并溶于其中，由此提供了一种可以使用的药物。
可以使用的药物是基本上等渗的。
术语“施用载体″意在包括药物上可接受的，优选适于通过注射单元施用的无菌液体，诸如通过例如静脉内、皮下或肌肉内注射的输注或注射。施用载体优选为水性的。施用载体包括适于多肽组合物重构(溶解)的溶剂或溶剂混合物(例如，注射用水/WFI)，和一种或多种当溶于水性溶剂中适于使所述组合物的pH范围保持在3-9的试剂，其量为0.1mM-100mM；和/或一种或多种张力调节剂，其量足以使通过将第一单元形式的组合物溶于第二单元形式的载体中所得的重构溶液基本上等渗。
施用载体可含有其他物质，诸如盐例如，钙盐和/或镁盐，氨基酸，例如甘氨酰甘氨酸。
重构组合物意在用于预防和/或治疗的非胃肠道施用。
“有效量″的多肽是指如下多肽的量，当根据本发明施用时，产生本领域普通技术人员知晓的至少一种止血临床参数中的可测量的改善。
应当知晓多肽的有效量可根据受试者的凝血状况变化，其反过来可在一种或多种临床参数中反应，包括例如循环凝固因子的相对水平；失血量；出血速度；红细胞压积等等。还应理解单一剂量有效量可根据常规实验，通过构建数值矩阵和测定矩阵中的不同点，由本领域普通技术人员确定。
术语″稳定化″意欲涵盖使组合物的贮藏或生产过程中(不溶性的和/或可溶性的)聚集体形成和/或化学降解降至最低，以及维持pH和蛋白质的正确构象，从而实现生物学活性的实质性保持并维持蛋白质稳定性。此外，稳定化还意指在冻干条件下生产组合物时对蛋白质提供防溶保护(lyoprotection)和防冻保护。
术语″稳定剂″意在包括能够在贮藏或生产含有所述多肽的组合物的过程中稳定多肽的物质，或物质的混合物。
术语″结构性稳定化″或″结构稳定性″意欲涵盖形成具有优良特性和外观的冻干块或饼的能力，例如使得它不崩塌且使用前易于溶解。
术语″贮藏稳定的″意欲定义在5℃-40℃贮藏后稳定且在合适时间(常常是几个月)内保持预定产品规格的产品。
术语因子VII多肽的″物理稳定性″涉及不溶性和/或可溶性的二聚体、寡聚物和多聚物形式的因子VII多肽聚集体的形成，以及该分子的任何结构性变形和变性。
术语″化学稳定性″意指在加速条件下以溶解或固体状态贮藏后因子VII多肽中任何化学变化的形成，例如水解、脱酰胺、和氧化。具体而言，含硫氨基酸易于氧化而形成相应的亚砜。
术语″防冻剂″在用于本文时通常包括针对由冷冻诱导的压力为蛋白质提供稳定性的试剂。防冻剂的范例包括多元醇，诸如例如甘露醇，包括糖，诸如例如蔗糖，还包括表面活性剂，诸如例如聚山梨酸酯、泊洛沙姆、或聚乙二醇等。防冻剂也有助于制剂的张力。
术语″防溶剂″(Lyoprotectant)在用于本文时包括在冻干工艺的干燥过程后的脱水过程中为蛋白质提供稳定性的试剂，例如维持蛋白质的正确构象。防溶剂的范例包括糖，特别是二糖或三糖。防冻剂也可具有防溶剂的效果。
术语″适于将pH维持在范围3-9的试剂″涵盖那些将溶液pH维持在可接受范围3.0-9.0之间的试剂。能够将pH维持在3-9范围内的试剂的典型范例是柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、PIPES、咪唑、TRIS、乳酸、戊二酸、和甘氨酰甘氨酸的酸形式或盐。应当理解的是，在本发明中还可以使用试剂组合，其中试剂组合适于将pH维持在上文所述范围内。
术语″冻干饼″在用于本文时意欲涵盖在一定条件下加工溶解的或至少部分溶解的组合物后得到的固体组合物，所述条件涉及至少一个将所述溶解的/部分溶解的组合物冷却至结冰的步骤，和随后至少一个真空干燥的步骤。
术语″冻干″和“冷冻干燥″涵盖在一定条件下由溶解或至少部分溶解的组合物除去液体的过程，所述条件涉及至少一个将所述溶解的/部分溶解的溶液冷却至结冰、随后真空干燥的步骤。冻干是用于制备固体多肽药物的最常用方法。该方法由两个主要步骤组成将多肽溶液冷冻和在真空条件下将冷冻的固体干燥。干燥步骤还可分成两个阶段初步和次级干燥。初部干燥除去冻结水(冰的升华)，次级干燥除去非冻结的″结合″水(水的解吸附)。对每个冻干步骤的更详细分析提供于例如Wang等人，2000，International Journal ofPharmaceutics，2031-60(见第4部分，第16页及以下)。
通常，通过将组合物装到瓶中、在冻干机的架子上冷冻、然后建立真空并加热架子以执行初步干燥(或冰的升华)，实现对组合物的冻干。此后，在较高温度进行次级干燥(或吸附水的解吸附)直至完成加工，即组合物的含湿(水)量足够低。冻干的方法在本领域是普遍知道的，参阅例如Wang等人，2000，International Journal ofPharmaceutics，2031-60。从业人员凭借普通技术就能够在特定组合物的加工过程中将要使用的温度、每个温度下的时间、还有压力方面优化冻干条件。
术语″含湿量″意欲涵盖与产品相关的水，包括但不限于吸附形式的水，诸如冻结溶质相捕获或吸附的非冻结水和/或与无定形相相关的非冻结水或结晶固体吸附的非冻结水。术语″含水量″与″含湿量″可互换使用。期望的残余湿气水平(含湿量)是次级干燥步骤的持续时间和温度的函数。本领域知道用于在冻干过程中测定残余含湿量的几种方法；例如可以使用电子湿度计或残余气体分析仪。可以通过本领域知道的几种方法来测定冻干制剂的含湿量，诸如例如干燥损失、Karl Fischer滴定、热比重分析(TGA)、气相层析(GC)、或近IR(参阅例如Wang等人，2000，International Journal ofPharmaceutics，2031-60)。用于测定含水量(含湿量)的方法还描述于欧洲和美国药典。例如，可以如美国药典(USP<921，Ic>)或欧洲药典(EP<2.5.32>)中所述通过Karl Fischer电量滴定来进行含水量测定。
简而言之，该方法如下通过电量滴定测定含水量水的电量测定利用Karl Fischer反应，其依据的是无水介质中水与二氧化硫和碘的定量反应。在反应池中以电化学方式即通过碘化物的氧化生成碘。在阳极生成的碘立即与反应池中所含的水和二氧化硫反应。物质中水的量与电量成正比，直至滴定终点。当池中的水都耗尽时，达到终点，由此出现过量的碘，这可以通过量电法检测，由此指示终点。然后计算物质中存在的含水量百分比。
可以根据分析时小瓶中的样品重量(即固体加上存在的水-称为湿重基数)来定义含湿量，或者可以根据校正样品中测量到的水(即干重基数)来进行定义。在具有低含湿量的冻干产品的情况中，两种测量方法(湿重基数对干重基数)产生非常相似的结果。在用于本文时，含湿量是根据固体加上存在的水(即湿重基数)来定义的。
术语″膨胀剂″(bulking agent)通常包括提供优良冻干饼特性、形成药物上精致产品、帮助多肽克服多种压力(例如与冻干加工有关的剪切/冻结)、和有助于在冻干过程及后续贮藏过程中维持多肽活性水平的试剂。膨胀剂的典型范例包括甘露醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖。这些试剂可能对制剂的张力也有贡献。
等渗溶液具有血液、腹水或其它相关体液的生理范围内的张力。等渗性是指具有相应于0.9％NaCl溶液的渗透压(＝286mOsM)之渗透压的溶液。术语″基本上等渗的″意在表示相应于含有约0.7-约1.5％NaCl，诸如例如约0.8-约1.3％，约0.8-约1.1％，约0.8-约1.0％，或约0.9％NaCl的盐水溶液之渗透压的张力。
术语″张力调节剂″意指能够调节组合物的张力、使得在使用时将组合物溶解(或重构)后组合物。显然，重构的溶液之张力可取决于干组合物中和重构溶剂中张力调节剂的含量。
张力调节剂包括但不限于选自如下的组分醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、甘露醇、甘油、丙二醇，或这些化合物中两种或多种的混合物。
适于提供具有上述张力的组合物之张力调节剂的量为例如从0-约9mg/ml氯化钠，从0-约17mg/ml二水合氯化钙，从0-约51mg/ml甘露醇，从0-约26mg/ml甘油，从0-约21mg/ml丙二醇，取决于是否各个张力调节剂单独或与一种或多种张力调节剂组合使用。
术语″表面活性剂″通常包括那些保护蛋白质免于由空气/溶液界面诱导的压力和由溶液/表面诱导的压力的影响的试剂。例如，表面活性剂可以保护蛋白质免于聚集。合适的表面活性剂可以包括例如聚山梨酸酯、聚氧乙烯烷基醚诸如Brij35_、或泊洛沙姆诸如吐温20、吐温80、或泊洛沙姆188。优选的表面活性剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407；聚氧乙烯烷基醚，例如Brij35_、Cremophor A25、Sympatens ALM/230；和聚山梨酸酯/吐温，例如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80。更优选的是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188，和吐温，例如吐温20和吐温80。一般地，所加表面活性剂的量为0.005-5mg/ml。优选的量为0.01-3mg/mol，更优选的0.01～3mg/ml(对于吐温20和/或吐温80)和0.05-3.0mg/ml(对于泊洛沙姆188)。
术语″初始含量″指配制时加到组合物中的因子VII多肽的量。本文给出的浓度(mg/ml)指除湿前(例如冻干前)的因子VII多肽溶液或重构组合物中因子VII多肽的浓度，或者在涉及固体组合物例如冻干饼中的浓度时表述成％w/w。
在用于本文时，所述量理解为±约10％，因此约50mM包括50mM±5mM，4％包括4％±0.4％，等等。
如上所述，本发明的研究人员对本领域的主要贡献是将因子VII多肽稳定化从而能够长时间贮藏而不会引起用户的风险增加和不便。
本发明的研究人员发现，在将因子VII多肽稳定化时需要调整许多关键的参数。一个重要的参数至少部分涉及含湿量，例如水。含湿量应当受到限制。作为另一个重要参数，组合物应当至少包含一种稳定剂。
稳定剂包括但不限于，抗氧化剂、糖、多元醇、表面活性剂和适于在预定范围内维持pH的试剂。
在一个实施方案中，适当的稳定剂包括选自下组的至少两组药物上可接受赋形剂的组合抗氧化剂、糖、和多元醇。糖和多元醇具有防溶剂和/或防冻剂特性，这在将组合物进行冻干的情况中可能是重要的，至少部分重要。一般而言，可以通过至少两组赋形剂的适当组合而部分实现稳定性的改进。然而，更具体的说，发现当所述组合包含糖(蔗糖)或抗氧化剂(甲硫氨酸)时，稳定效果可能甚至更加显著。此外，还令人惊讶的发现甲硫氨酸可预防因子VII多肽的氧化性降解。
如所述，在本发明的一个实施方案中，稳定剂包括组合至少两组药物上可接受的赋形剂。
依照本发明，因子VII多肽意欲涵盖上文所述多肽。在本发明的合适实施方案中，因子VII多肽选自下组人因子VIIa、重组人因子VIIa、和因子VII序列变体。优选的是，因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa或因子VII相关多肽，其中在本说明书所述“体外蛋白水解测定法″和″体外水解测定法″中的一种或多种方法中进行测试时，所述因子VII相关多肽与野生型因子VII的活性比是至少1.25。
如上所述，含湿量应当受到限制。为了本发明的目的，在大量提供因子VII多肽时，它可以是固体或液体的形式。然而，在大量提供因子VII多肽时，它通常是液体的形式。因此，将大量蛋白质进一步加工以制备组合物时需要添加合适赋形剂并由混合物除去液体的步骤，所述添加赋形剂可以在除去液体之前或之后进行。用于从多肽除去液体的这样一种方法涉及冻干。因此，在本发明的一个优选实施方案中，组合物是冻干饼的形式。然而，本发明不排除适于由大量多肽除去液体以获得含湿量不超过约3％w/w的固体组合物的其它方法。
此外，依照本发明，含湿量优选不超过约2.5％w/w，更优选不超过约2％w/w，最优选不超过约1.5％w/w。
可以理解，本发明部分涉及在制备过程中(例如在混合赋形剂和除去液体以获得含湿量最高3％w/w的固体组合物的过程中)限制因子VII多肽的降解，以及由制造至使用(例如直至将组合物施用于患者之时)该固体组合物这段时间里限制所述降解。
因此，将包含因子VII多肽的组合物稳定化时还有另一个参数，即在溶于水性溶剂，诸如纯水或水性缓冲液后，应当将pH维持在pH范围3-9内。也就是说，除去含湿量之前，例如冻干前，多肽溶液的pH应当维持在约3-约9内。有利的是，该pH范围也处于期望的生理范围内，从而不会在通过肠胃外手段进行施用后对使用者造成伤害。优选的是，溶液的pH是约4.0-约9.0，诸如4.0-8.0，4.0-7.5，4.0-7.0，4.5-7.0，4.5-6.8，4.5-6.5，5.0-7.0，5.0-6.5，5.0-6.0，5.5-6.0，或约5.5-约6.5，诸如约5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，或6.5。
在合适实施方案中，适于将pH维持在3-9范围的试剂选自下组柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、戊二酸、PIPES、和甘氨酰甘氨酸的酸或盐，或至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能提供所示范围的pH值。
此外，用于将pH保持在3-9的适当试剂也可以是至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能提供所示范围的pH值。所述适当试剂的浓度范围为约0.1mM-100mM；约0.1mM-约50mM；诸如约0.1mM-约40mM；约0.1mM-约35mM；约0.1mm-约30mM；约0.5mM-约25mM；约1mM-约20mM；约1mM-约15mM；约5mM-约20mM；或约5mM-约15mM。
在本发明的一个实施方案中，适于将pH保持在3-9的适当试剂为组氨酸，优选为L-组氨酸。
通过氧化途径以及通过聚集途径的因子VII多肽的降解是稳定性的敏感参数。
通常，在终止冻干后，组合物得到稳定化，使得少于初始含量5％w/w、诸如少于4、3、或2％w/w的因子VII多肽转变成其氧化形式。因子VII多肽的初始含量即配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的量。此外，根据常规分析方法(诸如例如本申请实施例中所述方法)的测定，少于初始含量5％w/w、诸如少于4.0％、3.0％、2.5％、2％、1.5％、或少于1％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
本发明的研究人员发现，因子VII多肽在贮藏于环境温度后的进一步降解(即计算由终止制造过程时直至于30℃贮藏8个月)很少。发现包含抗氧化剂(甲硫氨酸)的组合物针对因子VII多肽的氧化性降解更加稳定。
因此，依照本发明，合适组合物在于环境温度贮藏至少8个月后氧化形式的含量增加有限。也就是说，在还有一些实施方案中，组合物是稳定的，从而在终止制造过程(例如冻干加工)后将组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约6％w/w的因子VII多肽被额外降解成氧化形式。在其它合适实施方案中，由终止制造过程时直至于30℃贮藏8个月后计算，不超过约5、4、3、2、或1.5％w/w的因子VII多肽额外转变成氧化形式。在本发明的这些实施方案中，组合物是稳定的，从而所述组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约5％(4、3、2、或1.5％)w/w的因子VII多肽转变成氧化形式。如上所述，初始含量指配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的因子VII多肽的量。
如上所述，聚集途径对因子VII多肽的降解也可看作基本的稳定性指示参数。
因此，本发明的实施方案涉及稳定的组合物，使得将所述组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约5％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。如上所述，所述因子VII多肽的初始含量指配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的量。通过糖、多元醇、和抗氧化剂含量的适当优化，至少是部分优化，组合物是稳定的，从而所述组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约4.0％、3.0％w/w、诸如2.5、2.0、1.5、或1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
因此，有利的是，终止制造过程之后(即终止冻干加工后)，本发明的组合物具有低含量的氧化形式和聚集体，因此，依照本发明的组合物的特征是在进行贮藏前其中氧化形式和聚集体初始含量较低，例如在终止制造过程后不超过初始含量约5％w/w、诸如4％、3％、或2％w/w的因子VII多肽转变成氧化形式，而且少于5％w/w、诸如不超过约4.0％、3.0％、2.5％、2％、1.5％、或不超过约1％w/w转变成二聚体或高级聚合体形式。
此外，有利的是，本发明的组合物是贮藏稳定的，例如在黑暗中于30℃贮藏至少8个月后少于初始含量10％w/w、诸如6％、5％、4％、3％、2％、或1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化形式，而且少于5％w/w、诸如4％、3％、2.5％、2％、1.5％、或1％w/w转变成二聚体或高级聚合体形式。
如上所述，所述改进的稳定性涉及特定赋形剂的适当组合。依照本发明，赋形剂应当选自下组糖、多元醇、和抗氧化剂。在合适实施方案中，感兴趣的糖是二糖、三糖、和多糖，而且糖可以选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。此外，在有些实施方案中，多元醇选自甘露醇、山梨醇、和木糖醇。在还有一些实施方案中，抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任意一种的肽。
可以理解，糖和多元醇赋形剂分别还可以是至少两种所列试剂的混合物。在本发明的一系列实施方案中，所用糖赋形剂是至少两种二糖、三糖、和/或多糖的组合，诸如例如蔗糖与环糊精的组合、海藻糖与环糊精的组合、蔗糖与葡聚糖的组合、或蔗糖与乳糖的组合。在本发明的一系列实施方案中，所用多元醇赋形剂是至少两种多元醇的组合，诸如例如甘露醇与山梨醇的组合、甘露醇与木糖醇的组合、或山梨醇与木糖醇的组合。在本发明的一系列实施方案中，所用抗氧化剂赋形剂是至少两种抗氧化剂的组合，诸如例如甲硫氨酸与同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、谷胱甘肽以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任意一种的肽中一种或多种的组合。
在特别感兴趣的实施方案中，抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽以及含有同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任一种的肽。在优选的实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。
在更加有趣的实施方案中，多元醇存在的量是约5％w/w-约90％w/w。优选的，多元醇存在的量是约18％w/w-约88％w/w，诸如约18％w/w-约83％w/w、25％-80％、30％-65％、30％-80％、40％-80％、50％-80％、30％-75％、40％-75％、50％-75％、或约50％-约70％w/w。
多元醇存在的量是约0.5-75mg/ml，诸如约2-60mg/ml、5mg/ml-55mg/ml、8-45mg/ml、10-40mg/ml、10-30mg/ml、或约2-45mg/ml、5mg/ml-45mg/ml、5-35mg/ml、5-25mg/ml、5-20mg/ml、20-40mg/ml、或诸如约20-30mg/ml。
在其有趣实施方案中以及在本发明的其它一些有趣实施方案中，组合物中糖存在的量是约0-约85％w/w。在其它有趣实施方案中，其存在量是约3％w/w-约80％w/w，诸如约7％w/w-约75％w/w、10％-70％、10％-50％、20％-50％、10％-40％、或约10％w/w-约35％w/w。
糖存在的量应当是约0.5-75mg/ml，诸如约2-60mg/ml、约5mg/ml-55mg/ml、约8-45mg/ml、约10-40mg/ml、约10-30mg/ml、约2-45mg/ml、约5mg/ml-45mg/ml、约5-35mg/ml、约5-25mg/ml、诸如约5-20mg/ml。
应当提供的抗氧化剂的量是约0.05-10mg/ml，优选约0.1-5mg/ml，更优选约0.1mg/ml-2.5mg/ml、甚至更优选约0.1-2mg/ml，最优选约0.1-1mg/ml。
需要适当调节多元醇与糖之间的比率。在本发明的合适实施方案中，所述多元醇相对于所述糖的重量比的范围是约100∶1-1∶50。在甚至更合适实施方案中，所述重量比是约50∶1-1∶10，更优选约20∶1-1∶5。在其它合适实施方案中，重量比涉及范围约10∶1-1∶2和约6∶1-1∶2。在非常合适的实施方案中，所述糖醇相对于所述糖的重量比的范围是约4∶1-1∶1，诸如约4∶1-3∶2或约1∶1-3∶2。
本发明的有些实施方案中，多元醇是甘露醇；在还有一些实施方案中，糖是蔗糖。此外，在还有一些实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。
在本发明又一优选的实施方案中，组合物还包含其它用作膨胀剂的药物赋形剂。即甘露醇之外的膨胀剂包括在组合物中。特别的，膨胀剂包括在通过冻干制备的组合物中。
在组合物中因子VII多肽的初始浓度优选为约0.6mg/mL-约10.0mg/mL，诸如约0.6mg/mL-约8mg/mL，约0.6mg/mL-约6mg/mL，约0.6mg/mL-约5mg/mL，约0.6mg/mL-约4mg/mL，约0.6mg/mL-约3mg/mL，约1.0mg/mL-约5mg/mL，约1.0mg/mL-约4mg/mL，或约1.0mg/mL-约3mg/mL，例如约1.0mg/mL，约2.0mg/mL，约3.0mg/mL，约4.0mg/mL，或约5.0mg/mL。
在一个实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、和聚山梨酸酯，优选聚山梨酸酯20或80，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸，和聚山梨酸酯，优选聚山梨酸酯20或80，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸和聚山梨酸酯，优选聚山梨酸酯20或80，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸、组氨酸和聚山梨酸酯，优选聚山梨酸酯20或80，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖和泊洛沙姆188，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸和泊洛沙姆188，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸和泊洛沙姆188，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。
在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，包含在药盒的第一单元形式中的组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸、甲硫氨酸和泊洛沙姆188，具有不超过约3％的含湿量，而且组合物当溶于水时具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在一个实施方案中，包含在药盒的第二单元形式中的施用载体包括水和组氨酸。在一个实施方案中，载体还包含一种或多种选自下组的成分CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，载体包含选自如下的一种或多种成分CaCl2，浓度为约5-15mM；NaCl，浓度为约30-60mM，诸如例如约40mM或约50mM。
在一个优选实施方案中，制备稳定因子VII多肽的方法包括冻干。冻干涉及一种方法，其中含有所述因子VII多肽的溶液注入冷冻干燥管等中。所述因子VII多肽可任选的在开始冻干前经过无菌过滤。为冻干小管，对冻干机的托架降温，使溶液低于临界产物温度。通过导入真空除去水份，水蒸汽在冻干机的冰冷凝器上冷凝。当产品干时，通常少于3％的残留含湿量(例如，通过上述Karl Fischer电量滴定测定)，封闭小管并加帽。制备完成且组合物现在呈冻干饼的形式。
重构组合物意在用于预防和/或治疗性处理的非胃肠道施用。优选的，药物组合物通过非胃肠道，即静脉内、皮下或肌肉内施用，或其通过例如连续或脉冲输注的方式施用。
因此，本发明的一个方面涉及所述固体稳定的组合物用于制备治疗凝固因子应答性综合征的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及因子VII多肽用于制备治疗因子VII应答性综合征的药物的用途。
在不同的实施方案中，所述因子VII应答性综合征为血友病A、血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术或创伤。此外因子VII应答性综合征可与抗凝剂疗法相关。
如所述，本发明的组合物为固体形式。因此，在适合的实施方案中，药物应当适于被溶解，因此，允许非胃肠道施用所述药物。当所述组合物施用于患者时，包括在施用步骤前溶解所述组合物于适当液体中的步骤。
此处使用的缩写FVII凝固因子VII，以其单链形式FVIIa凝固因子VII，以其切割的活化的双链形式rFVII(rFVIIa)重组因子VII(重组因子VIIa)实施方案在本发明的一系列实施方案中，药盒的第一单元形式包括赋型剂，和其量，且具有如制剂1-48所示的pH(表1)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
(表1，续)
在本发明的另一系列实施方案中，药盒的第一单元形式包括赋形剂，和其量，且具有如制剂100-124所示的pH
(表2)
(表2，续)
(表2，续)
(表2，续)
(表2，续)
(表2，续)
在一系列实施方案中，在任一组合物1-48和100-124中FVII多肽的浓度为约0.6mg/mL-约10.0mg/mL，诸如约0.6mg/mL-约8mg/mL，约0.6mg/mL-约5mg/mL，约0.6mg/mL-约3mg/mL，约1.0mg/mL-约5mg/mL，或约1.0mg/mL-约3mg/mL。
在另一系列实施方案中，在任一组合物1-48和100-124中FVII多肽的浓度选自约0.6mg/mL，约0.7mg/mL，约0.8mg/mL，约0.9mg/mL，约1.0mg/mL，约1.1mg/mL，约1.2mg/mL，约1.3mg/mL，约1.4mg/mL，约1.5mg/mL，约1.6mg/mL，约1.7mg/mL，约1.8mg/mL，约1.9mg/mL，约2.0mg/mL，约2.1mg/mL，约2.2mg/mL，约2.3mg/mL，约2.4mg/mL，约2.5mg/mL，约2.6mg/mL，约2.7mg/mL，约2.8mg/mL，约2.9mg/mL，约3.0mg/mL，约3.1mg/mL，约3.2mg/mL，约3.3mg/mL，约3.4mg/mL，约3.5mg/mL，约3.6mg/mL，约3.7mg/mL，约3.8mg/mL，约3.9mg/mL，和约4.0mg/mL。
在一系列实施方案中，制剂1-48和100-124中聚山梨酸酯的浓度为约0.05-0.08mg/mL，诸如约0.06-0.08mg/mL，或约0.07mg/mL。
在另一系列实施方案中，第一单元形式含有在任一组合物1-48和100-124中所述的组合物，第二单元形式含有如下量的L-组氨酸约0.5mg/mL-3mg/mL，例如约1.0-约2.0mg/mL，或约1.55mg/ML。
在另一系列实施方案中，第一单元形式含有在任一组合物1-48和100-124中所述的组合物，第二单元形式含有约30-约60mM NaCl，诸如约40mM，约45mM，或约50mM NaCl。
在另一系列实施方案中，第一单元形式含有在任一组合物1-48和100-124中所述的组合物，第二单元形式含有约30-约60mM NaCl，诸如约40mM，约45mM，或约50mM NaCl，以及如下量的L-组氨酸约0.5mg/mL-3mg/mL，例如约1.0-约2.0mg/mL，或约1.55mg/ML。
本发明的另一方面，提供了一种组合物，其中包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂
a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；以及约0.06-0.08mg/mL量的聚山梨酸表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
在一个实施方案中，抗氧化剂与甘露醇的组合(a)还包含糖。在另一实施方案中，甲硫氨酸和多元醇的组合(b)还包含糖。在另一实施方案中，糖和甘露醇的组合(c)还包含抗氧化剂。在另一实施方案中，其中蔗糖和多元醇的组合(d)还包含抗氧化剂。
在一个有趣的实施方案中，抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽之任意一种的肽，或其混合物；优选甲硫氨酸，或含有甲硫氨酸的混合物。在另一有趣的实施方案中，所述糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖，或其混合物；优选蔗糖，或含有蔗糖的混合物。在另一有趣的实施方案中，所述多元醇选自甘露醇、山梨醇、和木糖醇，或其混合物；优选甘露醇或含有甘露醇的混合物。
组合物可还含有一种当溶于水性溶剂中适于保持所述组合物的pH范围为3-9的试剂。所述试剂的非限制性实例以及优选的pH范围如上述。
组合物还可以包含张力调节剂。所述张力调节剂的非限制性实例如上述。
聚山梨酸酯表面活性剂选自聚山梨酸酯20或80，优选聚山梨酸酯80。
在发明的一个实施方案中，新组合物选自
(表3)
在发明的一个实施方案中，组合物选自(表4)
在发明的一个实施方案中，组合物选自(表5)
在一系列实施方案中，制剂I-XVI中的聚山梨酸酯浓度是约0.05-0.08mg/mL，诸如约0.06-0.08mg/mL，或约0.07mg/mL。
在一系列实施方案中，制剂I-XVI中的聚山梨酸酯是聚山梨酸酯20，例如吐温20TM。在一系列实施方案中，制剂I-XVI中的聚山梨酸酯是聚山梨酸酯80，例如吐温80TM。
在发明的一个实施方案中，组合物选自(表6)
(表6，续)
(表6，续)
在一系列实施方案中，制剂I-XXVIII还包含一种或多种选自如下的成分Ca2+，优选的量为约5-约15mM，诸如约10mM，和优选的为CaCl2 x2H2O；NaCl，优选的量为约50mM，或约40mM，例如39mM；组氨酸，优选的L-组氨酸，优选的量为约10mM；和甘氨酰甘氨酸，例如，量为约10mM在一系列实施方案中，组合物含有赋形剂，且其量如任一制剂I-XXVIII中所述，但是具有的pH为pH5.5，或5.6，或5.7，或5.8，或5.9，或6.1，或6.2，或6.3，或6.4，或6.5.
在一系列实施方案中，制剂I-XVI中FVII多肽的浓度为约1.0mg/mL。
在一系列实施方案中，制剂I-XXVIII中FVII多肽为野生型人因子VIIa。
在一系列实施方案中，制剂I-XXVIII中FVII多肽为FVII变异体。
在不同系列的实施方案中，制剂I-XXVIII中FVII多肽选自L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FYII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FYII，V158D/E296V-FYII，V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；在不同系列实施方案中，任一组合物1-48和100-124中的因子VII多肽选自约0.6mg/mL-约10.0mg/mL，诸如约0.6mg/mL-约8mg/mL，约0.6mg/mL-约6mg/mL，约0.6mg/mL-约5mg/mL，约0.6mg/mL-约4mg/mL，约0.6mg/mL-约3mg/mL，约1.0mg/mL-约5mg/mL，约1.0mg/mL-约4mg/mL，约1.0mg/mL-约3mg/mL，约0.6mg/mL，约0.7mg/mL，约0.8mg/mL，约0.9mg/mL，约1.0mg/mL，约1.1mg/mL，约1.2mg/mL，约1.3mg/mL，约1.4mg/mL，约1.5mg/mL，约1.6mg/mL，约1.7mg/mL，约1.8mg/mL，约1.9mg/mL，约2.0mg/mL，约2.1mg/mL，约2.2mg/mL，约2.3mg/mL，约2.4mg/mL，约2.5mg/mL，约2.6mg/mL，约2.7mg/mL，约2.8mg/mL，约2.9mg/mL，约3.0mg/mL，约3.1mg/mL，约3.2mg/mL，约3.3mg/mL，约3.4mg/mL，约3.5mg/mL，约3.6mg/mL，约3.7mg/mL，约3.8mg/mL，约3.9mg/mL，和约4.0mg/mL.
另一方面，本发明提供了一种制备如下表3-6所定义的新组合物的方法，包括步骤i)提供溶液中的因子VII多肽，所述溶液包含至少一种选自如下的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；以及ii)加工所述溶液以获得具有含湿量不超过约3％w/w的固体组合物。
在一个实施方案中，多元醇存在的量的范围为约0.5-约75mg/ml，优选约2-45mg/ml，诸如约5mg/ml-45mg/ml，约5-35mg/ml，约5-25mg/ml，5-20mg/ml，20-40mg/ml，或约20-约30mg/ml，在一个实施方案中，糖存在的量的范围为约0.5-75mg/ml，优选约2-45mg/ml，诸如约5mg/ml-45mg/ml，约5-35mg/ml，约5-25mg/ml，或约5-20mg/ml。
在一个实施方案中，抗氧化剂存在的量的范围为约0.05-10mg/ml，优选约0.1-5mg/ml，更优选约0.1mg/ml-2.5mg/ml，甚至更优选约0.1-2mg/ml，最优选约0.1-1mg/ml。
在一个实施方案中，糖为蔗糖。在一个实施方案中，抗氧化剂为甲硫氨酸。在一个实施方案中，多元醇为甘露醇。在一个实施方案中，加工包括冻干。
本发明的新组合物用可接受的，优选地无菌的稀释剂或载体优选为水性载体重构。水性载体的非限制性实例包括注射用水(WFI)以及本说明书(上述)中所述的溶剂，其含有至少一种选自如下的成分(i)当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH在3-9之间的试剂，其中所述试剂以约0.1mM-100mM的量存在，和(ii)以足以使重构的溶液基本上等渗的量存在的张力调节剂。在一个实施方案中，所述载体是WFI；在另一实施方案中，所述溶剂包含组氨酸。
发明的实施方案实施方案1一种含有药物的药盒，所述药盒包含a)在第一单元形式中，含有多肽和至少一种稳定剂的组合物，其中所述组合物具有不超过约3％的含湿量，以及用于容纳所述第一单元的容器装置；和，b)在第二单元形式中，含有用于重构(溶解)所述组合物的溶剂和至少一种选自如下的成分之施用载体(iii)当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂，其中所述试剂以约0.1mM-100mM的量存在，
(iv)以足以使得自溶解第一单元形式的组合物于第二单元形式之施用载体的溶液基本上等渗的量的张力调节剂；和用于容纳所述第二单元形式的容器装置。
实施方案2根据实施方案1的药盒，其中所述第一单元形式含有至少一种选自表面活性剂、抗氧化剂、糖和多元醇的成分。
实施方案3根据实施方案2或实施方案2的药盒，其中所述第二单元形式还含有至少一种选自表面活性剂、抗氧化剂、糖和多元醇的成分。
实施方案4根据实施方案1-3中任一项的药盒，其中所述多肽为凝血因子，诸如因子VIII，因子IX，因子X，因子II，因子V，因子VII。
实施方案5根据实施方案1-3中任一项的药盒，其中所述多肽为维生素K依赖性多肽，诸如因子VII，因子IX，因子X，因子II，蛋白C，蛋白S，促凝血酶。
实施方案6根据实施方案4或5的药盒，其中凝固因子多肽选自人因子VIII，人因子VIIa，因子VII-相关多肽，人因子IX，人因子X，活化的人蛋白C。
实施方案7根据实施方案6的药盒，其中FVII相关多肽是选自如下的因子VII变异体L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，和S336G-FVII。
实施方案8根据实施方案6的药盒，其中FVII相关多肽是因子VII变异体，其中所述因子VII变异体与人因子VIIa(野生型因子VII)的活性之比至少为1.25(当于如本发明所述的一种或多种“体外蛋白水解测定法″和″体外水解测定法″测定)。
实施方案9根据实施方案1-8中任一项的药盒，所述″当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂″存在的量为约0.1mM-约50mM；诸如约0.1mM-约40mM；约0.1mM-约35mM；约0.1mM-约30mM；约0.5mM-约25mM；约1mM-约20mM；约1mM-约15mM；约5mM-约20mM；或约5mM-约15mM。
实施方案10根据实施方案1-9中任一项的药盒，其中所述″当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂″选自柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、谷氨酸、PIPES和甘氨酰甘氨酸或至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能够提供所示范围内的pH值。
实施方案11根据实施方案1-10中任一项的药盒，其中所述第二单元形式包含试剂，当溶于水性溶剂时其适于保持所述组合物的pH范围在4-7；优选的范围在4.5-7.5，诸如5-7，或5.5-6.5。
实施方案12根据实施方案1-11中任一项的药盒，其中所述第二单元形式包含组氨酸。
实施方案13根据实施方案1-12中任一项的药盒，其中所述″张力调节剂″选自醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇或至少两种所列调节剂的混合物；优选的选自氯化钠、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇、氯化钙或其混合物。
实施方案14根据实施方案13的药盒，其中所述″张力调节剂″包含Ca2+或Mg2+。
实施方案15根据实施方案1-14中任一项的药盒，其中所述第一和第二单元形式之一或二者还含有防腐剂。
实施方案16根据前述任一实施方案的药盒，其中所述第一单元形式含有至少一种选自下组的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；
d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；和f)表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
实施方案17根据实施方案16的药盒，其中其中抗氧化剂与甘露醇的组合还包含糖。
实施方案18根据实施方案16的药盒，其中甲硫氨酸与多元醇的组合还包含糖。
实施方案19根据实施方案16的药盒，其中糖与甘露醇的组合还包含抗氧化剂。
实施方案20根据实施方案16的药盒，其中蔗糖与多元醇的组合还包含抗氧化剂。
实施方案21根据实施方案16或17任一项的药盒，其中抗氧化剂与甘露醇的组合(a)还包含表面活性剂。
实施方案22根据实施方案16或18任一项的药盒，其中甲硫氨酸和多元醇的组合(b)还包含表面活性剂。
实施方案23根据实施方案16或19任一项的药盒，其中糖和甘露醇的组合(c)还包含表面活性剂。
实施方案24根据实施方案16或20任一项的药盒，其中蔗糖和多元醇的组合(d)还包含表面活性剂。
实施方案25根据实施方案16的药盒，其中所述稳定剂是表面活性剂和甲硫氨酸的组合(e)。
实施方案26根据前述任一实施方案的药盒，其中抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽之任意一种的肽。
实施方案27根据前述任一实施方案的药盒，其中糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖。
实施方案28根据前述任一实施方案的药盒，其中多元醇选自甘露醇、山梨醇和木糖醇。
实施方案29根据前述任一实施方案的药盒，其中所述第一单元形式的组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约5％w/w、优选不超过约4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、1.5％w/w、或不超过约1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
实施方案30根据前述任一实施方案的药盒，其中所述第一单元形式的组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约6％w/w，优选不超过约5％w/w、4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、或不超过约1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化的形式。
实施方案31根据前述任一实施方案的药盒，其中所述多元醇的量的范围为约5％w/w-90％w/w，优选约18％w/w-88％w/w，18％-83％，25％-80％，40％-80％，50％-80％，或约50％w/w-70％w/w。
实施方案32根据前述任一实施方案的药盒，其中所述糖的量的范围为约0-85％w/w，优选约3％w/w-80％w/w，7％-75％，10％-70％，10％-50％，10％-40％，或约10％w/w-35％w/w。
实施方案33根据前述任一实施方案的药盒，其中所述多元醇与所述糖的重量比的范围是约100∶1-1∶50，优选约50∶1-1∶10；20∶1-1∶5；10∶1-1∶2；6∶1-1∶2；4∶1-1∶1；或约4∶1-3∶2。
实施方案34根据前述任一实施方案的药盒，其中第一单元形式还包含张力调节剂。
实施方案35根据前述任一实施方案的药盒，其中表面活性剂选自聚山梨酸酯，诸如聚山梨酸酯20或80；聚氧乙烯烷基醚，诸如Brij35_；或泊洛沙姆，诸如泊洛沙姆188或407；以及其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物或聚乙二醇(PEG)，诸如PEG 8000。
实施方案36根据前述任一实施方案的药盒，其中所述糖为蔗糖。
实施方案37根据前述任一实施方案的药盒，其中所述多元醇为甘露醇。
实施方案38根据前述任一实施方案的药盒，其中因子VII多肽存在的浓度为约0.6mg/ml-约10.0mg/ml，诸如约0.6mg/ml-约6mg/ml，约0.6mg/ml-约5mg/ml，或约0.6mg/ml-约4mg/ml。
实施方案39根据前述任一实施方案的药盒，其中所述含湿量不超过约2.5％w/w，优选不超过约2％w/w，最优选不超过约1.5％w/w。
实施方案40根据前述任一实施方案的药盒，其中所述第一单元形式为冻干饼。
实施方案41根据前述任一实施方案的药盒，其中所述第一单元形式包含因子VII多肽，甘露醇，蔗糖，和选自如下的表面活性剂聚山梨酸酯或泊洛沙姆，诸如吐温80_或泊洛沙姆188_。
实施方案42根据实施方案41的药盒，其还含有甲硫氨酸。
实施方案43根据实施方案41或42的药盒，其中所述第二单元形式含有L-组氨酸，其量为约0.1mM-约50mM；诸如约0.1mM-约40mM；约0.1mM-约35mM；约0.1mM-约30mM；约0.5mM-约25mM；约1mM-约20mM；约1mM-约15mM；约5mM-约20mM；或约5mM-约15mM。
实施方案44根据实施方案41-43任一项的药盒，所述第二单元形式含有一种或多种选自如下的成分CaCl2，NaCl，和甘氨酰甘氨酸。
实施方案45一种制备多肽的液体制剂的方法，所述方法包括步骤a)提供实施方案1-44中任一项所述的第一单元形式和第二单元形式；b)将所述第一和第二单元形式混合以提供施用载体中的溶解的组合物液体溶液。
实施方案46一种治疗凝固因子应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的根据实施方案45的方法制备的所述凝固因子之液体制剂。
实施方案47根据实施方案46的方法，其中所述凝固因子应答性综合征是血友病，且所述凝固因子是因子VIII或因子IX；或者所述综合征为脓毒症，且所述凝固因子是蛋白C或活化的蛋白C。
实施方案48根据实施方案46用于治疗FVII应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的由实施方案45方法制备的所述生物试剂的液体制剂。
实施方案49根据实施方案48的方法，所述综合征选自血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
实施方案50因子VII多肽用于制备呈实施方案1-44中任一项定义的药盒形式的药物的用途，用于治疗因子VII应答性综合征。
实施方案51一种组合物，其包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；以及约0.06-0.08mg/mL量的聚山梨酸表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
实施方案52根据实施方案51的组合物，其中抗氧化剂与甘露醇的组合还包含糖。
实施方案53根据实施方案51的组合物，其中甲硫氨酸与多元醇的组合还包含糖。
实施方案54根据实施方案51的组合物，其中糖与甘露醇的组合还包含抗氧化剂。
实施方案55根据实施方案51的组合物，其中蔗糖与多元醇的组合还包含抗氧化剂。
实施方案56根据前述实施方案51-55中任一项的组合物，其中抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽之任意一种的肽实施方案57根据前述实施方案51-56中任一项的组合物，其中糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。
实施方案58根据前述实施方案51-57中任一项的组合物，其中多元醇选自甘露醇、山梨醇、和木糖醇。
实施方案59根据前述实施方案51-58中任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约5％w/w、优选不超过约4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、1.5％w/w、或不超过约1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
实施方案60根据前述实施方案51-59中任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量约6％w/w、优选不超过约5％w/w、4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、或不超过约1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化的形式。
实施方案61根据前述实施方案51-60中任一项的组合物，其中所述多元醇的量的范围为约5％w/w-90％w/w，优选约18％w/w-88％w/w，18％-83％，25％-80％，40％-80％，50％-80％，或约50％w/w-70％w/w。
实施方案62根据前述实施方案51-61中任一项的组合物，其中所述糖的量的范围为约0-85％w/w，优选约3％w/w-80％w/w，7％-75％，10％-70％，10％-50％，10％-40％，或约10％w/w-35％w/w。
实施方案63根据前述实施方案51-62中任一项的组合物，其中所述多元醇与所述糖的重量比为约100∶1-1∶50，优选约50∶1-1∶10；20∶1-1∶5；10∶1-1∶2；6∶1-1∶2；4∶1-1∶1；或约4∶1-3∶2。
实施方案64根据前述实施方案51-63中任一项的组合物，其中还包含试剂，当溶于水性溶剂时其适于保持所述组合物的pH在3-9之间；优选的pH范围为4-7，更优选的范围为4.5-6.5，甚至更优选的范围为5.5-6.5。
实施方案65根据实施方案64的组合物，其中所述试剂选自柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、谷氨酸、PIPES和甘氨酰甘氨酸或至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能够提供所示范围内的pH值。
实施方案66根据前述实施方案51-65中任一项的组合物，其中还包含张力调节剂。
实施方案67根据实施方案66的组合物，其中所述张力调节剂选自醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、甘露醇、甘油和丙二醇实施方案68根据前述实施方案51-67中任一项的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨酸酯20或80，优选聚山梨酸酯80。
实施方案69根据前述实施方案51-68中任一项的组合物，其中所述糖是蔗糖。
实施方案70根据前述实施方案51-69中任一项的组合物，其中所述多元醇是甘露醇。
实施方案71根据前述实施方案51-70中任一项的组合物，其中所述因子VII多肽选自人因子VIIa，重组人因子VIIa和因子VII序列变异体。
实施方案72根据实施方案71的组合物，其中所述因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa。
实施方案73根据前述实施方案51-72中任一项的组合物，其中所述因子VII多肽是因子VII相关多肽，其中所述因子VII相关多肽与野生型因子VII的活性之比至少为1.25，当于如本发明所述的一种或多种“体外蛋白水解测定法″和″体外水解测定法″测定。
实施方案74根据前述实施方案51-73中任一项的组合物，其中因子VII多肽存在的浓度为约0.6mg/ml-约10.0mg/ml，诸如约0.6mg/ml-约6mg/ml，约0.6mg/ml-约5mg/ml，或约0.6mg/ml-约4mg/ml。
实施方案75根据前述实施方案51-74中任一项的组合物，其中所述含湿量不超过约2.5％w/w，优选不超过约2％w/w，最优选不超过约1.5％w/w。
实施方案76根据前述实施方案51-75中任一项的组合物，其中，组合物是冻干饼。
实施方案77根据前述实施方案中任一项的组合物，所述组合物包含因子VII多肽，甘露醇，蔗糖，和泊洛沙姆80，诸如吐温80_。
实施方案78根据实施方案77的组合物，其还包含甲硫氨酸。
实施方案79根据前述实施方案77-78中任一项的组合物，其还含有L-组氨酸。
实施方案80根据前述实施方案77-79中任一项的组合物，其中还含有一种或多种选自如下的成分CaCl2，NaCl，和甘氨酰甘氨酸。
实施方案81根据前述实施方案51-80中任一项的组合物，选自
实施方案82根据实施方案81的组合物，选自
实施方案83根据前述实施方案81或82中任一项的组合物，其含有聚山梨酸酯80，量为0.07mg/mL。
实施方案84根据前述实施方案81-83中任一项的组合物，其含有FVIIa多肽，量为1.0mg/mL。
实施方案85根据前述实施方案81-84中任一项的组合物，其还含有至少一种选自如下的组分Ca2+，量为约10mM，优选为CaCl2 x2H2O；NaCl，量为约50mM或约40mM，例如39mM；组氨酸，优选L-组氨酸，量为约10mM。
实施方案86根据前述实施方案81-85中任一项的组合物，其具有的pH为5.5，或5.6，或5.7，或5.8，或5.9，或6.0，或6.1，或6.2，或6.3，或6.4，或6.5。
实施方案87一种制备如实施方案51-86中所定义的组合物的方法，包括步骤i)提供溶液中的因子VII多肽，所述溶液包含至少一种选自如下的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；e)甲硫氨酸；以及聚山梨酸酯表面活性剂，量为约0.06-0.08mg/mLii)加工所述溶液以获得具有含湿量不超过约3％w/w的固体组合物。
实施方案88根据实施方案87的方法，其中所述抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽之任意一种的肽。
实施方案89根据实施方案87的方法，其中所述糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖。
实施方案90根据实施方案87的方法，其中所述多元醇选自甘露醇、山梨醇和木糖醇。
实施方案91根据实施方案87的方法，其中所述多元醇存在的量为约0.5-约75mg/ml，优选约2-45mg/ml，诸如约5mg/ml-45mg/ml，约5-35mg/ml，约5-25mg/ml，5-20mg/ml，20-40mg/ml，或约20-约30mg/ml。
实施方案92根据实施方案87的方法，其中所述糖存在的量范围为约0.5-75mg/ml，优选约2-45mg/ml，诸如约5mg/ml-45mg/ml，约5-35mg/ml，约5-25mg/ml，或约5-20mg/ml。
实施方案93根据实施方案87的方法，其中所述抗氧化剂的量范围为约0.05-10mg/ml，优选约0.1-5mg/ml，更优选约0.1mg/ml-2.5mg/ml，甚至更优选约0.1-2mg/ml，最优选约0.1-1mg/ml。
实施方案94根据实施方案87的方法，其中所述，其中所述糖为蔗糖。
实施方案95根据实施方案87的方法，其中所述抗氧化剂为甲硫氨酸。
实施方案96根据实施方案87的方法，其中所述多元醇为甘露醇。
实施方案97根据实施方案87的方法，其中所述加工包括冻干。
实施方案98一种治疗FVII应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的根据实施方案51-86中任一项所定义的组合物实施方案99根据实施方案98的方法，其中所述综合征选自血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
实施方案100因子VII多肽用于制备治疗因子VII应答性综合征的药物的用途，所述药物含有实施方案51-86中任一项所定义的组合物。
实施方案101根据实施方案100的用途，其中所述综合征选自血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
下述实施例以示例方式提供，而不意在限制实施例一般方法实施例1用于测定稳定性指示参数的分析方法A.通过反相HPLC(RP-HPLC)测定氧化形式HPLC柱用粒度5μm且孔径300_的丁基键合硅石填充4.5×250mm柱。柱温70℃。洗脱液A水99.9％v/v和三氟乙酸0.1％v/v。洗脱液B乙腈80％v/v、三氟乙酸0.09％v/v和水19.91％v/v。用30分钟X％B-(X+13)％B的线性梯度对柱进行洗脱。流速1.0ml/min。检测214nm。
氧化形式是因子VII多肽的甲硫氨酸亚砜。例如，FVII的两种主要衍生物是Met(O)298FVII和Met(O)306FVII。
氧化形式的含量表述成配制后组合物中以氧化形式回收的因子VII占因子VII初始量的百分比。
B.通过高效凝胶渗透层析(GP-HPLC)测定因子VII多肽的聚集体在7.5×300mm的Waters多肽Pak 300 SW柱上进行GP-HPLC，使用含5％异丙醇的0.2M硫酸铵pH7.0作为流动相。流速0.5ml/min。检测215nm。
聚集体的含量表述成配制后组合物中以二聚体、寡聚物和多聚物形式回收的因子VII占因子VII初始量的百分比。
实施例2测试因子VII多肽的生物学活性的测定法因子VIIa活性的测试可以通过简单的初步体外测试(″体外水解测定法″)来测试因子VIIa活性从而选择合适因子VIIa变体的合适测定法。
体外水解测定法可以测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(二者在下文中都称为″因子VIIa″)的比活。可以进行平行测定，从而直接比较它们的比活。该测定法是在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行的。向因子VIIa(终浓度100nM，溶于含有0.1M NaCl、5mMCaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4)中加入呈色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(S-2288，Chromogenix，瑞典)至终浓度1mM。在SpectraMaxTM340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将保温20分钟期间形成的吸光率减去不含酶的空白孔的吸光率，用于计算变体与野生型因子VIIa的活性之间的比率比率＝(因子VIIa变异体的405nm吸光率)/(野生型因子VIIa的405nm吸光率)。
据此，可鉴定出与天然因子VIIa相比活性相当或更高的因子VIIa变异体，诸如例如变异体的活性与天然因子VII(野生型因子FVII)的活性之间的比率接近或超过1.0的变异体。
还可以使用生理学底物来测量因子VIIa或因子VIIa变异体的活性，诸如因子X，合适的浓度是100-1000nM，其中在加入合适呈色底物(如S-2765)后测量所生成的因子Xa(″体外蛋白水解测定法″)。另外，活性测定法可以在生理温度进行。
体外蛋白水解测定法平行测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变异体(二者在下文中都称为″因子VIIa″)，从而直接比较它们的比活。该测定法是在微量滴定板(MaxiSrp，Nunc，丹麦)中进行的。将因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)(溶于100μl含0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4)保温15分钟。然后加入50μl含有0.1M NaCl、20mM EDTA、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mMHepes pH7.4终止对因子X的切割。加入呈色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)至终浓度0.5mM，测量所生成的因子Xa的量。在SpectraMaxTM340读板仪(MolecularDevices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将10分钟内形成的吸光率减去不含FVIIa的空白孔的吸光率，用于计算变异体与野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比率比率＝(因子VIIa变异体的405nm吸光率)/(野生型因子VIIa的405nm吸光率)。
据此，可鉴定出与天然因子VIIa相比活性相当或更高的因子VIIa变异体，诸如例如变异体的活性与天然因子VII(野生型因子FVII)的活性之间的比率接近或超过1.0的变异体。
凝血酶生成测定法可以在包含生理浓度的所有相关凝集因子和抑制剂以及活化血小板的测定法中测量因子VII或因子VII相关多肽或者因子VIII或因子VIII相关多肽(如变异体)生成凝血酶的能力，如Monroe等人，Brit.J.Haematol.，99542-547，1997的第543页所述(收入本文作为参考)。
凝结测定法还可以使用一步凝结测定法(测定法4)来测量因子VII多肽的活性，该方法基本上如WO 92/15686或US 5,997,864中所述进行。简而言之，将待测样品在50mM Tris(pH 7.5)、0.1％BSA中稀释，并取100μl与100μl缺乏因子VII的血浆和200μl含10mM Ca2+的促凝血酶原激酶C一起保温。测量凝结时间，并与使用连续稀释的参考标准或含柠檬酸盐的正常人血浆合并液获得的标准曲线进行比较。
工作实施例实施例3分别带有和不带有组氨酸的rFVIIa组合物的稳定性数据可见，不存在组氨酸的冻干有利，因为形成较少的二聚体/寡聚物。
组合物
对于组合物A1，C1，E1，G1，I1，和K1的重构，使用1.55mg/mL组氨酸溶剂；对于组合物B1，D1，F1，H1，J1，和L1，使用注射用水(WFI)。
实施例4分别带有和不带有组氨酸、和/或甘氨酰甘氨酸、和/或NaCl冻干的rFVIIa组合物的稳定性数据可见，不存在NaCl时冻干是有利的，因为会降低饼崩塌的风险。
为了重构，使用1.55mg/mL组氨酸溶剂(对于组合物A2，I2和Q2)；对于组合物B2，J2和R2，使用注射用水(WFI)。
为了重构，使用1.55mg/mL组氨酸溶剂(对于组合物C2，K2，和S2)；对于组合物D2，L2和T2，使用注射用水(WFI)。
为了重构，使用1.55mg/mL组氨酸溶剂加NaCl 2.92mg/mL(对于组合物E2，M2和U2)；对于组合物F2，N2和V2，使用生理盐水2.92mg/mL。
为了重构，使用1.55mg/mL组氨酸溶剂加NaCl 2.92mg/mL(对于组合物G2，O2和X2)；对于组合物H2，P2和Y2，使用生理盐水2.92mg/mL。
实施例5组合物的制备通常，组合物从纯化的大体积溶剂中制备。加入赋形剂，将溶剂稀释至期望的rFVIIa浓度。所得溶液利用无菌的膜过滤器无菌过滤(0.2微米孔径或等价物)，填充入无菌玻璃小管将小管冻干，用橡胶帽封闭，用铝箔型帽密封。
实施例6比较在冻干前添加或不添加L-组氨酸制剂中形成的可溶性聚集体的含量制备如下制剂(所有浓度示为mg/ml)
如实施例5所述制备制剂，利用填充体积5.3ml。冻干后，二聚体、寡聚物和多聚物形式的含量如实施例3所述用GP-HPLC测量。结果如下
结果显示，冻干后，不加入L-组氨酸的制剂1和2具有较低的二聚体和寡聚物形式的含量，与含有L-组氨酸的相应制剂3和4相比。
实施例7冻干的rFVIIa制剂之稳定性制剂含有rFVIIa1.0mg/mlNaCl 2.34mg/mlCaCl2， 2H2O 1.47mg/ml甘氨酰甘氨酸 1.32mg/ml聚山梨酸酯80 0.07mg/mlL-甲硫氨酸0.5mg/ml甘露醇25mg/ml蔗糖 10mg/mlpH6.0利用1.1ml的填充体积通过如实施例5所述制备。
制剂置于25℃和40℃的暗处。根据下表收集样品。冻干产品于10mM L-组氨酸溶剂中重构后，如实施例3测定二聚体/寡聚物/聚合物以及氧化形式，而活性通过如实施例4所述一步凝结测定法确定。
n.d.未测定实施例8在因素设计研究中研究了氯化钠对冻干饼的可见外观的影响，可变的参数中有氯化钠的含量。包括在研究中的四种制剂的结果示于下表中。
所有制剂还含有rFVIIa 1.0mg/mL氯化钙 1.47mg/mL甘氨酰甘氨酸 1.32mg/mL聚山梨酸酯80 0.1mg/mL甘露醇 40mg/mL蔗糖 10mg/mL此外，制剂1和2含有0.5mg/mL甲硫氨酸。
pH调整为6.0(制剂1和4)
5.0(制剂2和3)实施例9FVII多肽组合物的稳定性数据可见，在25℃贮藏6个月后所述组合物就形成二聚体/寡聚物而言是稳定的。
组合物
对于组合物A-9至H-9的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9，D-9，F-9和H-9的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9至H-9，但是具有pH4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9至H-9，但是具有pH5.5。
对于组合物A-9-1至H-9-1的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9-1，D-9-1，F-9-1和H-9-1的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-1至H-9-1，但是具有pH4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-1至H-9-1，但是具有pH5.5。
对于组合物A-9-2至H-9-2的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9-2，D-9-2，F-9-2和H-9-2的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-2至H-9-2，但是具有pH4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-2至H-9-2，但是具有pH5.5。
对于组合物A-9-3至H-9-3的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9-3，D-9-3，F-9-3和H-9-3的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-3至H-9-3，但是具有pH 4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-3至H-9-3，但是具有pH 5.5。
对于组合物A-9-4至H-9-4的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9-4，D-9-4，F-9-4和H-9-4的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-4至H-9-4，但是具有pH4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-4至H-9-4，但是具有pH5.5。
对于组合物A-9-5至H-9-5的重构，要使用注射用水(WFI)。
对于组合物B-9-5，D-9-5，F-9-5和H-9-5的重构，也可使用1.55mg/mL组氨酸溶剂。
也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-5至H-9-5，但是具有pH4.5。此外，也制备了含有相同成分和成分的量的组合物做为组合物A-9-5至H-9-5，但是具有pH5.5。
权利要求
1.一种含有药物的药盒，所述药盒包含a)在第一单元形式中，含有凝血因子多肽和至少一种选自如下的稳定剂的组合物表面活性剂、抗氧化剂、糖和多元醇，其中所述组合物具有不超过约3％的含湿量，以及用于容纳所述第一单元形式的容器装置；和，b)在第二单元形式中，含有用于重构(溶解)所述组合物的溶剂和至少一种选自如下的成分之施用载体(v)当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂，其中所述试剂以约0.1mM-100mM的量存在，(vi)足以使得自溶解第一单元形式的组合物于第二单元形式之施用载体所产生的重构溶液基本上等渗的量的张力调节剂；和用于含有所述第二单元形式的容器装置。
2.权利要求1的药盒，其中所述第二单元形式还含有至少一种选自表面活性剂、抗氧化剂、糖和多元醇的成分。
3.权利要求1或2的药盒，其中所述多肽选自人因子VIII，人因子VIIa，人因子IX，人因子X，活化的人蛋白C，或因子VII序列变异体。
4.权利要求1-3中任一项的药盒，其中所述“当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂″存在的量为约0.1mM-约50mM；诸如约0.1mM-约40mM；约0.1mM-约35mM；约0.1mM-约30mM；约0.5mM-约25mM；约1mM-约20mM；约1mM-约15mM；约5mM-约20mM；或约5mM-约15mM。
5.权利要求1-4中任一项的药盒，其中所述″当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9的试剂″选自柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、谷氨酸、PIPES和甘氨酰甘氨酸，或至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能够提供所示范围内的pH值。
6.权利要求1-5中任一项的药盒，其中所述第二单元形式包含一种试剂，当溶于水性溶剂时其适于保持所述组合物的pH范围在4-7；优选的在4.5-7.5，诸如5-7，或5.5-6.5。
7.权利要求1-6中任一项的药盒，其中所述第二单元形式包含组氨酸，优选的量为约0.1mM-约50mM；诸如约0.1mM-约40mM；约0.1mM-约35mM；约0.1mM-约30mM；约0.5mM-约25mM；约1mM-约20mM；约1mM-约15mM；约5mM-约20mM；或约5mM-约15mM。
8.权利要求1-7中任一项的药盒，其中所述″张力调节剂″选自醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇，或至少两种所列调节剂的混合物；优选地选自氯化钠、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇、氯化钙或其混合物。
9.前述任一项权利要求的药盒，其中所述第一单元形式含有至少一种选自下组的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；e)甲硫氨酸；f)表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
10.权利要求9的药盒，其中抗氧化剂与甘露醇的组合(a)还包含糖。
11.权利要求9的药盒，其中甲硫氨酸与多元醇的组合(b)还包含糖。
12.权利要求9的药盒，其中糖与甘露醇的组合(c)还包含抗氧化剂。
13.权利要求9的药盒，其中蔗糖与多元醇的组合(d)还包含抗氧化剂。
14.权利要求9-13中任一项的药盒，其还含有表面活性剂。
15.前述权利要求中任一项的药盒，其中抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽之任意一种的肽；优选甲硫氛酸。
16.前述权利要求中任一项的药盒，其中糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖；优选蔗糖。
17.前述权利要求中任一项的药盒，其中多元醇选自甘露醇、山梨醇和木糖醇；优选甘露醇。
18.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述第一单元形式的组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约5％w/w、优选不超过约4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、1.5％w/w、或不超过约1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
19.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述第一单元形式的组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约6％w/w，优选不超过约5％w/w、4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、或不超过约1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化的形式。
20.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述多元醇的存在量范围是约5％w/w-90％w/w，优选约18％w/w-88％w/w、18％-83％、25％-80％、40％-80％、50％-80％或约50％w/w-70％w/w。
21.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述糖的存在量范围是约0％w/w-85％w/w、优选约3％w/w-80％w/w、7％-75％、10％-70％、10％-50％、10％-40％、或约10％w/w-35％w/w。
22.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述多元醇与所述糖的重量比的范围是约100∶1-1∶50，优选约50∶1-1∶10、20∶1-1∶5、10∶1-1∶2、6∶1-1∶2、4∶1-1∶1，或约4∶1-3∶2.
23.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述第一单元形式还包含张力调节剂。
24.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述表面活性剂选自聚山梨酸酯，诸如聚山梨酸酯20或80；聚氧乙烯烷基醚，诸如Brij 35_；或泊洛沙姆，诸如泊洛沙姆188或407；以及其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物或聚乙二醇(PEG)，诸如PEG 8000。
25.前述权利要求中任一项的药盒，其中因子VII多肽存在的浓度是约0.6mg/ml-约10.0mg/ml，诸如约0.6mg/ml-约6mg/ml、约0.6mg/ml-约5mg/ml、或约0.6mg/ml-约4mg/ml。
26.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述第一单元形式是冻干饼。
27.前述权利要求中任一项的药盒，其中所述第二单元形式含有一种或多种选自如下的成分CaCl2，NaCl，和甘氨酰甘氨酸。
28.一种制备凝血因子多肽的液体制剂的方法，所述方法包括步骤a)提供权利要求1-27中任一项所述的第一和第二单元形式；b)将所述第一和第二单元形式混合以提供施用载体中组合物的溶解的液体溶液。
29.一种治疗凝固因子应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的根据权利要求28的方法制备的所述凝固因子之液体制剂。
30.权利要求29的方法，其中所述综合征是FVII应答性综合征且所述凝固因子是因子VII多肽。
31.权利要求30的方法，其中所述综合征选自获得性或先天性血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、Glanzmann血小板无力症、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝固因子抑制剂，如因子VIII或IX的抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
32.因子VII多肽用于制备呈权利要求1-27中任一项所述形式的药盒之药物的用途，所述药物用于治疗因子VII应答性综合征。
33.一种组合物，其包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；e)甲硫氨酸；以及约0.06-0.08mg/mL量的聚山梨酸表面活性剂；所述组合物具有不超过约3％的含湿量。
34.权利要求33的组合物，其中抗氧化剂与甘露醇的组合还包含糖。
35.权利要求33的组合物，其中甲硫氨酸与多元醇的组合还包含糖。
36.权利要求27的组合物，其中糖与甘露醇的组合还包含抗氧化剂。
37.权利要求27的组合物，其中蔗糖与多元醇的组合还包含抗氧化剂。
38.前述权利要求27-37中任一项的组合物，其中抗氧化剂选自同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽之任意一种的肽；优选甲硫氨酸。
39.前述权利要求27-38中任一项的组合物，其中糖选自蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖；优选蔗糖。
40.前述权利要求27-39中任一项的组合物，其中多元醇选自甘露醇、山梨醇和木糖醇；优选甘露醇。
41.前述权利要求27-40中任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约5％w/w、优选不超过约4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、1.5％w/w、或不超过约1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
42.权利要求27-51中任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量约6％、优选不超过约5％w/w、4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、或不超过约1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化的形式。
43.权利要求27-42中任一项的组合物，其还包含当溶于水性溶剂时适于保持所述组合物的pH范围在3-9，优选的pH范围在4-7，更优选的范围在4.5-6.5，甚至更优选的范围在5.5-6.5的试剂。
44.权利要求43的组合物，其中所述试剂选自柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、谷氨酸、PIPES和甘氨酰甘氨酸，或至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能够提供所示范围内的pH值。
45.权利要求27-44中任一项的组合物，其还含有张力调节剂。
46.权利要求45的组合物，其中所述张力调节剂选自醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇，或至少两种所列调节剂的混合物；优选地选自氯化钠、氯化镁、甘露醇、甘油、丙二醇、氯化钙或其混合物。
47.权利要求27-46中任一项的组合物，其中所述聚山梨酸酯表面活性剂选自聚山梨酸酯20或80，优选聚山梨酸酯80。
48.权利要求27-47中任一项的组合物，其中所述因子VII多肽选自人因子VIIa、重组人因子VIIa和因子VII序列变异体。
49.权利要求48的组合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa。
50.权利要求27-49中任一项的组合物，其中因子VII多肽是因子VII序列变异体，在本说明书所述“体外蛋白裂解测定法″和″体外水解测定法″的一种或多种方法中进行测试时，所述变异体与野生型因子VII的活性比是至少1.25。
51.权利要求27-50中任一项的组合物，其中因子VII多肽存在的浓度为约0.6mg/ml-约10.0mg/ml，诸如约0.6mg/ml-约6mg/ml，约0.6mg/ml-约5mg/ml，或约0.6mg/ml-约4mg/ml。
52.权利要求27-51中任一项的组合物，选自
53.权利要求52的组合物，选自
54.权利要求52的组合物，选自
55.权利要求52-54中任一项的组合物，其含有聚山梨酸酯80，量为约0.07mg/mL。
56.权利要求52-55中任一项的组合物，其含有FVIIa多肽，量为约1.0mg/mL。
57.权利要求52-56中任一项的组合物，还含有至少一种选自如下的成分量为约10mM的Ca2+，优选为CaC12x2H20；量为约50mM或约40mM，例如39mM的NaCl；组氨酸，优选量为约10mM的L-组氨酸。
58.权利要求52-57中任一项的组合物，具有pH为5.5，或5.6，或5.7，或5.8，或5.9，或6.0，或6.1，或6.2，或6.3，或6.4，或6.5。
59.一种制备权利要求27-58中定义的组合物的方法，包括步骤i)提供溶液中的因子VII多肽，所述溶液包含至少一种选自如下的稳定剂a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸；以及聚山梨酸酯表面活性剂，其量为约0.06-0.08mg/mL；ii)加工所述溶液以获得具有含湿量不超过约3％w/w的固体组合物。
60.一种治疗FVII-应答性综合征的方法，包括向需要的受试者施用有效量的权利要求27-57中任一项定义的组合物。
61.权利要求60的方法，其中所述综合征选自获得性或先天性血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、Glanzmann血小板无力症、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝固因子抑制剂，如因子VIII或IX的抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
62.因子VII多肽用于制备治疗因子VII-应答性综合征的药物的用途，所述药物包含权利要求27-58中任一项定义的组合物。
63.权利要求62的用途，其中所述综合征选自获得性或先天性血友病A、获得性或先天性血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、Glanzmann血小板无力症、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝固因子抑制剂，如因子VIII或IX的抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症和抗凝剂疗法。
全文摘要
本发明涉及化学上以及物理上稳定的药盒和组合物，其含有多肽，特别是因子VII或因子VII相关多肽，使得这些组合物能够在室温进行贮藏、操作和使用。
文档编号A61K38/36GK1917861SQ200480037799
公开日2007年2月21日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月19日
发明者B·L·汉森, M·B·延森, T·科恩菲尔特 申请人:诺和诺德医疗保健公司