小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法

专利名称：小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及小鼠乳腺原基移植再生的方法。
背景技术：
乳腺是哺乳动物所有器官中唯一可以在动物成年后再生的器官，随着雌性动物怀孕周期的始动而再生形成有功能的乳腺结构，随着哺乳期结束而退化至怀孕前的状态。只要怀孕周期多次重复，乳腺的这种再生模式就可以重复进行。利用乳腺干细胞再生乳腺是近两年来兴起的一项高新技术。对于乳腺组织移植和从乳腺组织中分离的乳腺干细胞移植再生乳腺研究相对较多，研究结果证明移植后，乳腺组织和乳腺干细胞均能再生布满清除乳腺的受体脂肪垫。而对于乳腺原基的生物学和乳腺原基的移植再生功能性乳腺研究很少，Robinson于2001年首次进行了小鼠乳腺原基的移植，并获得乳腺组织的再生，但他们并没有获得泌乳的再生乳腺，而且他们采用先将2-3个乳腺原基与周围基质重构后再移植，在操作上繁琐，在移植时容易丢失，致使效率降低。另外，据为数很少的相关国外文献报道，目前主要是采用乳腺原基移植再生研究转基因小鼠乳腺发育情况(Geetika Chakravarty，et al.Molecular Endocrinology2003，17(6)1054-1065；Gertraud W Robinson.2004，Available onlinehttp//breast-cancer-research.com/content/6/3/105)。

发明内容
本发明针对上述领域的缺陷和现状，提供一种小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，为乳腺修复以及利用乳腺再生生产某种珍贵蛋白提供理论依据和技术支持。
小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，其特征在于用巴斯德吸管吸取供体小鼠的乳腺原基后移植于受体小鼠已清除乳腺组织的脂肪垫中。
所述巴斯德吸管的口径与乳腺原基直径相当。
所述吸取的方式采用三段式，将乳腺原基置于两段移植缓冲液之间。
所述移植缓冲液是1×PBS缓冲液。
所述乳腺原基还转有外源基因。
所述外源基因是抗人汉坦病毒抗体基因。
所述乳腺原基是刚剥离的乳腺原基或是体外培养过的乳腺原基。
所述体外培养的培养液是含10％FCS的DF12溶液。
本发明利用巴斯德吸管来移植乳腺原基，巴斯德吸管的口径与乳腺原基直径相当，是为转移乳腺原基方便和尽量减少移植时带取的移植缓冲液，采用巴斯德吸管移植优越性主要是相对其他学者的“重构法”简单便捷，一是可以减少体外操作时间，提高移植效率；二是可以提高乳腺原基移植的准确性，因为采用此法移植时，乳腺原基的移入都可在显微镜下通过移植缓冲液的移入而判断。巴斯德吸管所带的移植缓冲液量非常少，并且在移植后可从伤口处溢出，不会影响移植结果。用此移植方法可节省时间1/3，提高移植再生效率10％左右。移植前，将巴斯德吸管下端的口径拉制与乳腺原基的直径相当，采用三段式吸取乳腺原基，即先吸一段移植缓冲液，再将移植的乳腺原基吸入，最后再吸入一段移植缓冲液。再将小鼠乳腺原基注入到已清除乳腺组织的脂肪垫组织中，封合伤口、消毒，苏醒后正常饲养。受体小鼠被清除乳腺组织的脂肪垫是受体小鼠乳房去除乳腺组织后所剩组织。3周龄小鼠乳腺初步发育，分布在乳头和乳腺淋巴结之间，而乳腺脂肪垫已经形成，因此将乳头和淋巴结之间的乳腺组织清除，即可获得清除乳腺组织的脂肪垫，乳腺脂肪垫是乳腺发育必不可缺少的，所以将乳腺原基移植于清除乳腺的脂肪垫中，就能再生。
本发明还巧妙地应用抗人汉坦病毒抗体基因转基因小鼠为试验动物，系统研究其乳腺原基再生及其再生后泌乳情况。抗人汉坦病毒抗体是可溶性蛋白，如果乳腺原基中转入抗人汉坦病毒抗体，在再生乳腺分泌的乳汁中很容易分离并通过Western Blotting等手段检测。在整个实验过程中，抗人汉坦病毒抗体可以用于验证移植的效果，作为移植过程中的“指示剂”，同时为移植后再生小鼠乳腺成为动物乳腺生物反应器提供理论依据。
对于再生乳腺功能性检测是采用原位杂交和Western Blotting方法，即取一部分再生乳腺进行冰冻切片后，通过RNA探针杂交，证明转基因在转录水平的表达；取另一部分再生乳腺组织到小离心管中，添加等体积的纯净水，用眼科剪将再生乳腺剪碎，离心后，取中间清液，上样进行PAGE胶电泳，转硝酸纤维素膜后，用抗人IgG抗体杂交，最后用4-氯-1-萘酚显色，看有无特异的蛋白条带。经检测乳腺原基再生乳腺中在转录水平和蛋白翻译水平均表达了抗人汉坦病毒抗体基因，而且可以通过Western检出，证明本发明转基因乳腺原基移植再生功能性乳腺程序方法正确可行。
本发明获得乳腺原基移植后再生并泌乳的乳腺，本模型的建立，可以为人类临床乳腺切除后移植再生、乳腺生物反应器以及利用转基因乳腺移植治疗某些疾病提供理论依据和技术支持。本发明中采用巴斯德吸管进行移植，减少体外操作步骤，一是提高操作效率，二是减少乳腺原基在体外的时间，有利于乳腺原基移植后的成活。
将转有目的基因的转基因小鼠乳腺移植到清除乳腺组织的受体鼠脂肪垫中再生功能性乳腺，使目的基因在再生乳腺中表达并分泌相应的蛋白，从而为某基因对乳腺发育的影响、乳腺生物反应器以及器官的再生修复提供理论依据和技术支持。


图1PCR检测传代后转基因小鼠部分电泳图M为1kb梯度DNA分子量标准；+为阳性对照；一为模板是水的阴性对照；KB为以普通昆白小鼠基因组为模板的阴性对照；1、2、10为仅转有重链的转基因鼠，6、7、12为阴性鼠；3、4、5、8、9、11为双链整合阳性鼠。
图2为分离的单个的乳腺原基。
图3PCR检测围产期胎儿的转基因阳性小鼠部分电泳图M为1kb梯度DNA分子量标准；+为阳性对照；一为是阴性对照；6、9、10为仅转有轻链的转基因鼠，15、16为阴性鼠；1、2、3、4、5、7、8、11、12、13、17为双链整合阳性鼠。
图4再生乳腺组织的全组织染色图(移植8周后)图5再生乳腺组织的全组织染色图(泌乳)图6部分再生乳腺的PCR检测电泳图M为1kb梯度DNA分子量标准；+为阳性对照；一为阴性对照；2、3、4、5、6、7、8、10、11、13为双链整合阳性，1、9、12为阴性。
图7探针目的片断的PCR产物电泳图M为1kb梯度DNA分子量，1-12分别为不同PCR管的产物。
图8回收纯化后的探针目的片断的凝胶电泳检测图M为1kb梯度DNA分子量，1、2分别为相同的两个纯化产物。
图9重组质粒回收后的电泳检测第一泳道为1kb DNA分子量标准，2-4泳道为相同的三个重组质粒样本。
图10探针目的片断连接于T载体后测序检测的部分测序11再生乳腺的原位杂交结果图(阳性)图12再生乳腺的原位杂交阴性对照图13部分再生乳腺分泌乳汁的SDS-PAGE胶电泳图M为低分量标准蛋白，+为阳性乳样对照，1、2、3分别为3个再生乳腺分离物图14部分再生乳腺分泌乳汁的Western Blotting的检测M为低分量标准蛋白，+为阳性乳样对照，1、2、3分别为3个再生乳腺分离具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
一、材料和器具1、试验动物转人抗汉坦病毒抗体基因的转基因小鼠(昆白系)由本实验室准备，共同转有肾综合征出血热抗体轻链基因和重链基因，含此两种基因的质粒为中国疾病预防控制中心病毒研究所梁米芳研究院所赠(转化子插入片断序列见附录)。
正常野生型SPF级昆白系小鼠购自国家计划生育研究所动物部，于SPF级试验鼠房中按标准饲养，12小时光照，自由采食。
2、药品DPBS和DF12粉末培养基为Gibco公司产品；胎牛血清(FCS)为Hyclone公司产品；HRP酶标记抗人IgG H & L X-Adsorbed特异性抗体(11904-34L)购自美国USBiological公司；地高辛标记试剂盒为罗氏(Roche)公司产品；反转录酶为Invitrogen产品；RNA酶抑制剂(RNasin)为华美公司产品；不含RNA酶的DNA酶I(Promega)；Taq聚合酶为华美公司产品；质粒提取试剂盒为博大泰克生产产品；胶回收试剂盒购自毕龙公司(GENECLEANIII)；Trizol为Invitrogen公司产品；Tris、EDTA、CaCl2为Sigma公司产品；宿主菌大肠杆菌E.coliDH5α，质粒pGEM-T Easy购自promega公司；其它生化试剂多为国产分析纯产品。
3、主要仪器设备1)电泳仪DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂2)超净工作台北京净化设备厂3)-80℃超低温冰箱日本SANYO公司
4)制冰机日本SANYO公司5)超纯水仪美国MILLIPORE公司6)低温离心机Eppendorf公司7)高速冷冻离心机BECKMAN公司8)凝胶成像系统ALPHA INNOTECH公司9)PHS-3C酸度计上海虹益仪器厂10)自动灭菌锅日本SANYO公司11)测序仪ABI 377型DNA sequencer，美国PERKIN ELMER公司12)37℃恒温水浴仪美国LIFESCIENCE公司13)9700型PCR仪美国PERKIN ELMER公司14)ABI 377DNA测序仪美国PERKIN ELMER公司15)二氧化碳培养箱美国PERKIN ELMER公司5、试剂的配置DPBS缓冲液称取DPBS粉9.55g，使用超纯水溶解，调节pH值＝7.2，1L容量瓶定容，0.22um滤膜过滤除菌，pH＝7.4，4℃储藏备用。
DF12培养液称取DF12粉15.6g，使用超纯水溶解，调节pH值＝7.2，1L容量瓶定容，0.22um滤膜过滤除菌，pH＝7.4，4℃储藏备用。
STE缓冲液0.1Mol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌。
质粒提取溶液I50mMol/L葡萄糖，25mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mMol/L EDTA(pH8.0)，抽滤灭菌，4℃保存。
质粒提取溶液II0.2N NaOH，1％SDS，现用现配。
质粒提取溶液III5Mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml，混匀，抽滤灭菌，4℃保存。
4M NaOH80gNaOH溶于400ml水中，定容至500ml。
10％SDS100gSDS溶于900ml水中，加热助溶，定容至1000ml。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris碱溶于800ml水中，用HCl调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二钠加入到800ml水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
RNase溶液将RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
50×TAE242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。
氨苄青霉素(Amp)贮存液将氨苄青霉素钠溶于灭菌水配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g无水乙酸钠溶于80ml水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。
1Mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2水，过滤除菌，分装成10ml每份，贮存于-20℃，制备感受态时取出一份稀释至100ml，过滤除菌，预冷备用。
溴化乙锭贮存液在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。
6×凝胶加样缓冲液0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％(W/V)蔗糖水溶液，4℃保存。
DEPC处理水及溶液1000ml双蒸水中加入01.mlDEPC，于37℃过夜，高压灭菌；其他溶液的处理方法相同。
除DNA的10x反应Buffer400mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM MgCl2，10mM CaCl2酚∶仿(1∶1)等体积苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
1×PBS缓冲液

调pH值至7.2，加水至1000ml，DEPC处理，高压灭菌，分装保存20×SSCpH7.0，3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，用10N NaOH调pH值至7.0后，加水补至100ml，DEPC处理，高压灭菌2XSSCT2×SSC中加入0.1％Tween-20MAB溶液100mM马来酸(sigma M0375)，150mM NaCl，用10N NaOH调pH值至7.5MABTMAB中加入0.1％Tween-2010％BMB封闭液加入10％w/v封闭试剂(BMB 1096176)于MAB液中，加热溶解，混合均匀，高压灭菌，密封保存于-20℃。
2％封闭液10％血清，2％BM blocking regeat
500μg/mL肝素(肝磷脂)5mg肝素溶于10mLDEPC水中1％Tween-201g Tween-20溶于100mLDEPC水中10mg/ml Yeast tRNA10mg Yeast tRNA溶于1ml DEPC水中10mg/ml salmon sperm DNA10mg salmon sperm DNA溶于1ml DEPC水中4％多聚甲醛

PBST0.1％的Triton X-100，于PBS中10ug/ml proteinase K用PBS液稀释proteinase K到10ug/ml杂交液(HYB)

2*SSCT+50％甲酰胺(ph 4.5)

染色缓冲液

加水至100ml，过滤。
30％丙稀酰胺称量29g丙稀酰胺和1gN，N’-亚甲双丙稀酰胺溶于60ml水中，加热助溶，加水定容至100ml，0.22um滤器过滤，4℃避光保存。
10％过硫酸胺称量1g过硫酸胺溶于去离子水中，定容至10ml，4℃保存数周。
1.5M Tris.Cl(pH＝8.8)称量18g Tris溶于80ml去离子水中，调节pH至8.8，定容至100ml。
考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R250 1g，甲醇450ml，冰醋酸100ml，加水至450ml，溶解过滤后备用。
脱色液冰醋酸70ml，甲醇200ml，加去离子水1730ml，混匀使用。(25％甲醇，10％冰醋酸，现配现用)2X蛋白质电泳上样缓冲液SDS 500mg。巯基乙醇1ml，甘油3ml，1M Tris.Cl(pH＝6.8)2ml，用去离子水溶解并定容至10ml。
电极缓冲液Tris 3.03g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于去离子水并定容至1000ml。
10X蛋白质电泳缓冲液(pH＝8.3)Tris 30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于去离子水并定容至1000ml。
TEMEDSigma公司产品。
10X丽春红储存液丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，溶于去离子水中，定容1000ml。
TBS20mMol Tris.Cl(pH＝7.5)12.5％分离胶30％丙稀酰胺 12.5ml1mol/L Tris.Cl(pH＝8.8) 11.2ml10％SDS 0.3ml10％过硫酸胺 0.2mlTEMED 20μlH2O 6.2ml浓缩胶30％丙稀酰胺 1.67ml1mol/L Tris.Cl(pH＝6.8)1.25ml10％SDS 0.1ml10％过硫酸胺 0.1mlTEMED10μlH2O 7.03ml二、试验方法1、转基因小鼠的传代及其后代转基因阳性的检测为进一步扩大转基因小鼠的数量，对转基因小鼠进行传代并对其后代转基因阳性进行检测，以便获得数量足够的转基因阳性小鼠。检测方法采用PCR技术，即取2-3周龄转基因小鼠的尾巴组织样，提取DNA，以提取好的基因组为模板，利用pBC1载体XhoI位点两侧序列设计引物，上游引物5-GATTGACAAGTAATAGCTGTTTCCTC-3，下游引物5-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3进行PCR扩增反应，可以同时扩增出含有轻链基因的1.2kb的片断和重链基因的2.4kb片断，并以普通小鼠基因组作为阴性对照，载体pBC1-hG2LN和pBC1-hG2H作为阳性对照。扩增条件为94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，2min，共30个循环，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察。如图1.
2、乳腺原基的采集将双链整合的转基因雌性小鼠与双链整合的转基因雄性小鼠合笼配种，取围产期雌性母鼠的胎儿，立即放入DPBS缓冲液中，放在冰上，反复洗3遍，在体视显微镜下去除胎鼠头部及四肢，反复洗3遍，用眼科镊和游丝镊沿胎鼠体躯两侧壁分别剥离腹部皮肤，根据胎鼠生殖腺鉴别性别，仅留雌性胎鼠并寻找其乳腺原基，用游丝镊剥离乳腺原基(如图2)，在DPBS中用巴斯德吸管吹打洗涤3遍，转入含10％FCS的DF12中短期培养，同时采集胎鼠组织样品以备后续检测，在培养期间进行胎鼠组织样品进行DNA提取，并进行PCR检测，分析转基因阳性。
3、围产期胎儿的转基因阳性的鉴定提取采集的胎儿组织基因组DNA，采用人抗汉坦病毒抗体基因特异性引物扩增目的片断，琼脂糖电泳检测(如图3)，确定转基因阳性，移植时仅移植转基因阳性的乳腺原基。
4、受体鼠乳腺的清除将三周龄正常野生雌性小鼠按照体重的0.8～0.9％的比例注射戊巴比妥钠混合麻醉剂。待小鼠昏迷后，保定小鼠，腹部向上，四肢使用无菌的大头针固定在台面上。用碘酒棉擦拭腹股沟部位，用75％酒精棉球脱碘。将消毒部位的被毛刮除干净，然后用0.1％的新洁尔灭水溶液浸泡的棉球擦拭，尽量除去残留的被毛。用手术刀将此处的皮肤沿腹中线切开大约1cm长的切口，至第五对乳腺平行处。沿着第五对乳头的方向两侧作切口，与纵向的切口呈“Y”形结构。用0.1％的新洁尔灭浸泡的棉棒将切开的皮肤与腹膜分离至背侧处，暴露乳腺的全部结构。用止血钳将切开的皮肤固定并向腹外测翻开，将第四对乳头至腹股沟淋巴结之间的脂肪组织切除。对侧的乳腺重复此手术。
5、乳腺原基的移植即将检测为转基因阳性的乳腺原基移植到去除乳腺的脂肪垫中。其具体过程是首先拉制口径与乳腺原基稍大的巴斯德吸管，吸管头部以小火钝化，防止移植时对乳腺脂肪垫的损伤。按照移植缓冲液DPBS、乳腺原基、移植缓冲液DPBS的顺序三段式将2～3个乳腺原基吸入吸管前部备用。用游丝镊在去除乳腺的脂肪垫中央戳一个小洞，注意不要伤及血管，然后将装有乳腺原基的吸管头部插入脂肪垫的小洞中，稍稍回拉，并将乳腺原基吹入小洞中。对侧的乳腺重复此手术。在切口处加1～2滴0.9％生理盐水，缝合切口。碘酒棉消毒，酒精棉脱碘后，将小鼠放在37℃的恒温台等待苏醒。苏醒后的小鼠4～6小时内不提供饮水，然后正常饲养。
6、再生乳腺的检测采用全组织染色、PCR、原位杂交、Western Blotting检测方法分别对转基因乳腺原基再生乳腺中的转基因以及转基因的表达进行检测。
6.1全组织染色在乳腺原基移植后6～8周手术法采取部分受体鼠被移植的第四对乳腺组织，铺展在干净的载玻片上，将不同时期的小鼠乳腺完整从皮肤上取下，平展在载玻片上4℃，在多聚甲醛固定液中固定2～4小时，丙酮中脱脂2小时，100％酒精中浸泡1小时，重复三次，95％酒精溶液浸泡15分钟，重复三次，室温下，苏木精染色1小时，自来水蓝化1～2小时，0.1％乙酸50％酒精溶液，在室温下分色至适宜程度，70％、85％、95％酒精溶液依次脱水浸泡1小时，伊红酒精溶液染色至适宜程度，95％酒精溶液分色两次，每次20分钟，100％酒精脱水20分钟，重复3次，二甲苯透明30分钟，重复3次，树脂封片。Wade解剖镜，观察，Nikon E4500数码相机照相。如图4。
选取22只进行全组织染色检测再生情况，其中22对乳腺中有24只再生，再生率为54.5％，高出同类研究的40～50％水平近10个百分点，表明本移植方法的可行性。
由图4可以看出，乳腺原基移植后，可以在清除乳腺的脂肪垫中再生、延伸，并布满整个脂肪垫。移植受体鼠经过交配分娩后，其移植再生的乳腺可以分泌乳汁，并在再生的乳腺导管中蓄积(如图5)。虽然再生的乳腺没有定向分化的乳腺导管将分泌的乳汁排除体外，但乳腺原基移植后能够再生并能分泌乳汁，证明再生的乳腺具有正常乳腺的功能，为器官的移植再生提供了强有力的理论基础和技术手段。为器官移植再生提供了新的思路，即可以通过移植器官原基的方法再生一个新的具有功能的器官。
6.2PCR检测对分娩后的再生乳腺组织采集后分成3份，一份提基因DNA进行PCR检测，一份进行原位杂交，另一份进行Western Blotting检测抗体蛋白水平。乳腺组织DNA提取按常规组织基因组提取方法进行，采用特异的抗汉坦病毒抗体基因引物进行PCR检测，以便确认再生乳腺中转基因的存在。对41只受体鼠移植6～8周后配种，分娩后采集有再生现象的乳腺23只，进行转基因的PCR检测，82.6％的再生乳腺(19/23)均能检测出转基因，表明转基因乳腺原基再生后转基因的稳定性。如图6。
由图6可以看出，2、3、4、5、6、7、8、10、11、13号再生乳腺均能检测到转基因，说明转基因可稳定遗传给再生的乳腺组织，并证明再生的乳腺组织来源于乳腺原基。1、9、12为阴性，可能是所取组织中没有再生乳腺的结果，因为单凭肉眼，不能保证判断再生与否的100％正确性。
6.3原位杂交本研究采用RNA探针的原位杂交技术进行再生乳腺的转基因在转录水平的表达，根据人抗汉坦病毒抗体基因的cDNA序列，选取一定片断作为探针序列，体外扩增后，按地高辛标记试剂盒要求体外转录成带有地高辛标记的RNA探针，根据体外转录的方向可转录出正反两种探针，正义探针可以和表达的抗体基因RNA配对显阳性，反义探针与抗体基因RNA序列相同，作为阴性对照。
6.3.1探针目的序列的扩增根据人抗汉坦病毒抗体基因的cDNA序列，选重链基因196bp片断作为探针序列，上游引物5-TCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTAT-3，下游引物5-ATGAGCTCTAGCAAGGAGACCAAGAAGC-3。PCR反应条件94℃，1min；以94℃，30sec，57℃，30sec，72℃，30sec做30个循环。取2μl反应产物用2％琼脂糖电泳鉴定(如图7)。合并PCR产物，准备纯化。
6.3.2扩增产物的纯化，利用试剂盒(道普)纯化按照5∶1的比例往PCR反应体系中加入DNA Binding Solution，充分混均↓将吸附柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，12000rpm离心30秒↓倒掉收集管中的废液，加入500μl Column Wash Solution，12000rpm离心30秒↓重复步骤3一次，倒掉收集管中的废液，12000rpm离心30秒↓将吸附柱放入一支新的1.5ml离心管中，在吸附管膜中央加入30μl DP洗脱液，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。离心管中的液体即为回收的PCR产物，可立即使用或保存于-20℃备用↓取1μl电泳，检查回收的效果(如图8)6.3.3pGEM-T Easy载体的连接反应10μl连接体系Solution I 5.0μl载体 0.5μlDNA适量水 适量混匀，16℃水浴连接过夜，准备转化。
6.3.4感受态细胞的制备CaCl2法从新鲜平板上挑取E.coliDH5α单菌落，转到一含有50mlLB培养基的200ml的三角瓶中，于37℃以200rpm转速摇7小时左右，直到透过培养基可以模糊看清放在其下的四号字↓在无菌的条件下将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却到0℃↓于4℃以4000rpm离心10分钟，以回收菌体↓倒出培养液，将离心管倒置，使最后残留的痕量培养液流尽
↓用10ml 0.1Mol/LCaCl2·2H2O重悬菌体沉淀，冰浴15分钟↓于4℃以4000rpm离心10分钟，以回收菌体↓倒出培养液，将离心管倒置以使最后残留的痕量洗液流尽↓用2ml冰预冷的0.1Mol/L CaCl2重悬细菌沉淀↓分装细菌细胞，每管约200μl，存于-80℃6.3.5感受态效价的测定感受态的效价是指1μg质粒DNA所能转化出来的细菌数，其测定方法为如下用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的1.5ml微量离心管中，每管加1μl20ng/μl质粒DNA，轻弹外管壁以混匀内容物，之后于冰上放置30分钟↓将管放到预加热到42℃的水浴中试管架上，放置90秒↓快速将管置于冰上，冷却90秒↓每管加800μl LB液体培养基，然后将管转移到37℃摇床，温育45分钟↓颠倒离心管数次，各取50，200μl涂Amp板(其中Amp的含量为100ng/ml)↓将涂好的平板于37℃培养12-16小时，计数平板上菌落的数目，然后根据公式E＝1000*N(50μl)及E＝250*N(200μl)进行计算，其中N代表LB平板上菌落的数目。取两个E的平均值即可作为其效价。本实验测定效价为3.4×104。
6.3.6质粒DNA的转化从-70℃超低温冰箱取200μl感受态细胞↓加入10μl连接产物，在37℃放置10分钟↓涂于热平板(37℃)，过夜培养6.3.7质粒DNA或粘粒DNA的大量制备及纯化(碱裂解法)将一单菌落接入含Amp的200mlLB液体培养基中，37℃培养过夜↓将细菌培养液移入50ml的离心管，于4℃8000rpm离心5分钟回收菌体↓倒掉上清，将菌体沉淀重悬于10ml冰预冷的STE中，充分振荡洗涤
↓4℃，8000rpm离心5分钟重新回收细菌↓加入1ml冰预冷的质粒提取溶液I，剧烈振荡↓加入2ml新配制的质粒提取溶液II，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，于室温放置6分钟↓加入1.5ml冰预冷的质粒提取溶液III，用混合液缓缓自下而上浸润离心管全部管壁，尽量避免菌体散落在管壁上，冰上放置10分钟，管内出现白色絮状沉淀↓4℃，12000rpm离心15分钟↓用4层滤纸将上清过滤到另一50ml的离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟↓室温，12000rpm离心15分钟，沉淀核酸↓吸弃上清，于室温用70％乙醇洗涤沈淀及管壁数分钟，用真空装置吸取管壁及管底液体↓用350μl灭菌双蒸水溶解核酸沉淀↓将DNA溶液转入1.5ml离心管，再加入等体积的5Mol/L氯化锂溶液，充分混匀，于室温以12000rpm离心10分钟↓将上清转移到另一1.5ml离心管中，加等量的异丙醇，充分混匀，于室温以12000rpm离心10分钟，以回收核酸沉淀↓吸弃上清，室温用70％乙醇洗涤沈淀及管壁数分钟，倒出乙醇，用真空装置吸去管壁及底部液体↓用100μl灭菌双蒸水溶解沉淀，加入10μl 10mg/ml无DNase的RNase，于37℃放置1小时↓补加400μl灭菌双蒸水，用等体积的酚，酚∶仿，氯仿各抽提一遍↓将水相转移到另一离心管，加入1/4体积的NaAc(3M，pH5.2)，充分混匀，加入2倍体积的乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12000rpm离心15分钟，回收质粒DNA↓吸弃上清，加入1ml70％的乙醇，洗涤沉淀5分钟↓
用真空装置吸干沉淀，并溶于50μl灭菌双蒸水↓电泳检测，估计浓度(约4μg/μl)，如图96.3.8测序反应程序以检测插入片断的正确性测序反应体系的组成10μl反应体系5×buffer 1.5μlM13引物1.0μl模板 1.0μlMix2.0μlH2O 4.5μl1μl质粒模板中DNA的量约为200ng。
PCR反应条件95℃ 2min，循环95℃20sec；50℃ 15sec；60℃4min；30cycles纯化每个测序反应管内加60μl 70％乙醇(室温)，混匀↓室温放置约10分钟，4℃，12000rpm离心20分钟↓弃上清，再加60μl 70％乙醇(室温)，混匀↓4℃，12000rpm离心5分钟↓弃上清，37℃干燥电泳每个样品管加3μl去离子甲酰胺，振荡混匀↓95℃变性3分钟，迅速置冰上或4℃存放↓用377型测序仪电泳(部分测序图如图10)6.3.9DIG探针的标记及标记效果的检测RNA探针的制备和标记用于合成cDNA探针的质粒有来自鼠伤寒杆菌SP6噬菌体或来自大肠杆菌T7噬菌体的强启动子。噬菌体聚合酶对启动子有很高的特异性，用限制性内切酶(SpeI或NcoI)在外源DNA下游使质粒线性化以后，以此为模板，在SP6或T7噬菌体依赖于DNA聚合酶的催化下，体外转录一条与模板互补的单链RNA，作为阳性探针，而体外转录的模板链作为阴性对照探针。因此，RNA探针的合成都起始于噬菌体启动子，终止于线状DNA分子末端的转录物只与模板双链中的一条链互补。这样可以制备转基因探针的模板链和互补链。利用模板链作为阴性对照，互补链作为探针链。
地高辛标记法

37℃孵育2h↓加入2μl DnaseI(10U/μl)，37℃孵育15分钟，除去DNA模板。
↓加入2μl 0.2M EDTA终止反应。
↓然后加入3μl 2M NaAc(pH 4.0)和无水乙醇，混匀，-20℃过夜。
↓12000rpm，4℃离心20min，70％乙醇洗涤。
↓待沉淀干燥后，将其溶于100μl H2O中，分装冻存。
探针标记效果的测定在39μl灭菌水中加入1μl 经标记的RNA溶液，组成的溶液本实验称之为I、II、III等来代表。本实验假定经标记的RNA的浓度为1μg/μl，然后组成如下浓度递度A10μl溶液I+23μl灭菌水，其终浓度为300pg/μl。
B5μl溶液I+45μl灭菌水，其终浓度为100pg/μl。
C5μl溶液A+45μl灭菌水，其终浓度为30pg/μl。
D5μl溶液B+45μl灭菌水，其终浓度为10pg/μl。
E5μl溶液C+45μl灭菌水，其终浓度为3pg/μl。
在测试条的5个区自上而下点上A，B，C，D，E 5种溶液，各点1μl。将测试条在室温下晾干数分钟，用5支10ml的试管，装制下列溶液试管12ml bufferII；试管22ml抗体溶液(2ml bufferII中加入1μl抗体)；试管32ml bufferI试管42ml bufferIII；试管52ml显色液(2ml buffer III中加入40μlNBT/BCIP将晾干的测试条和对照条背对背叠在一起并作如下处理试管12分钟；试管23分钟；试管31分钟；试管45分钟；试管55-30分钟(置暗室)观察测试条与对照条的显色结果，比较探针标记的效果(对照条的标记结果自上而下分别为300pg/μl，100pg/μl，30pg/μl，10pg/μl，3pg/μl)。
6.3.10玻片的预处理用一个玻璃烧杯按2∶1的比例配制300ml硝酸/盐酸混合液↓将盖薄片和载玻片一个一个放入酸液中，浸泡过夜↓将酸小心倒入废液缸中↓用自来水彻底冲洗玻片直到洗过的水的PH回复到约5.5至6.0↓再用蒸馏水冲洗3遍↓放在带盖容器里，在150℃高温灭菌6小时↓待自然冷却。密封放在一干燥的地方待用↓用水配制适量500μg/ml多聚-L-赖氨酸(Sigma P1399)溶液↓将载玻片浸入到多聚-L-赖氨酸溶液中，室温孵育10分钟，然后用灭菌DEPC水冲洗3遍↓风干45分钟，密封放在一干燥的地方待用6.3.11乳腺组织的采取、固定与保存采取分娩后2-3天的再生乳腺，将组织在固定液中洗涤，除去表面的组织碎片，浸于4℃固定液中3小时。再移入15％蔗糖磷酸缓冲液中，4℃冰箱过夜。次日冰冻切片，并放入-70℃冰箱保存备用。
6.3.12再生乳腺切片的原位杂交将切片从冰箱取出，室温放置5分钟，放入1×PBT中洗3次，每次5分钟↓用4ug/ml蛋白酶K消化，10分钟↓放入1×PBT中洗3次，每次5分钟
↓在4％多聚甲醛中固定20分钟↓用1×PBT将多聚甲醛固定液洗净(2次，每次10分钟)↓在未加入探针的杂交液(HYB)中于42℃，预杂交1小时↓再在含0.15～1ng/μL探针的HYB中42℃杂交过夜↓在37℃下，在50％HYB+50％2×SSC中洗两次，每次30分钟，于2×SSC洗一次，30分钟，在0.2×SSC中洗两次，每次30分钟↓在室温，MABT中洗两次，每次5分钟，↓在2×封闭液中至少封闭处理1h↓在用2×封闭液稀释2000的抗地高辛抗体(BM)中于4℃过夜↓室温下，MABT+10％FCS中洗25分钟，MABT中洗25分钟，再在MABT中洗1小时以上，再在MABT中洗25分钟↓在染色缓冲液中洗3次，每次5min。
↓在染色液中于室温下显色(染色液每毫升染色缓冲液+4.5μL NBT+3.5μL X-phosphate，BM)于暗处放置.隔一定时间取出载玻片在解剖镜下检查显色情况。
↓当出现理想的信号背景比时，于PBT中洗2次，每次10min，以TE液终止显色反应，吹风机风干，中性封片剂封片，镜检、拍照。
对再生乳腺进行原位杂交检测，再生乳腺原位杂交呈阳性结果，如图11，12，进一步证明再生的乳腺组织源于移植的乳腺原基，并且表明转基因能在再生的泌乳期乳腺转录水平上进行表达。
6.4Western Blotting检测采取分娩后的再生乳腺，放入小离心管中，加入等体积的纯净水，用干净的眼科剪剪碎乳腺组织，使再生乳腺分泌的乳汁充分溶解在水中，5000rpm离心12分钟，调整酸碱度，沉淀其中的酪蛋白，离心取上清，-20度保存，或直接上样进行Western检测。将处理好的乳样15微升与2倍的蛋白上样缓冲液混合，沸水浴10分钟，上样，电泳后，35伏电压转膜过夜后，用抗人IgG抗体进行杂交，以检测再生乳腺中抗体分泌的情况。
6.4.1SDS-PAGE凝胶电泳的制备、电泳及蛋白质考马斯亮兰染色将配好的分离胶沿玻璃板壁缓缓倒入已经准备好的凝胶模子里，加入过程中防止气泡产生。加至距离低玻璃板顶端2厘米处，立即覆盖一层去离子水，待胶层与水层的界面清晰时，表明分离胶已经凝固好倒出分离胶上的水层，立即将浓缩胶溶液加入分离胶上面，插入样品槽模板，注意防止气泡产生，胶凝固后拔出样品槽模板。将标准分子量蛋白和未知样品1∶1溶于蛋白质上样缓冲液中，煮沸10分钟。在电泳槽内加入电极缓冲液，用微量进样器将样品加入电泳槽内。电压50V，电泳至二甲苯青进入分离胶时，升高电压至90V。电泳结束后，将胶取出后考马斯亮蓝染色过夜。脱色4小时，隔两小时换一次脱色液。检测电泳结果，拍照。如图13。
6.4.2western blotting戴上手套，按照SDS-PAGE胶的尺寸大小剪取硝酸纤维膜(NC膜)及三张滤纸。将切好的凝胶块、NC膜和滤纸在转移缓冲液中浸泡15分钟。按照转移夹-纤维素-三层滤纸-NC膜-三层滤纸-纤维素-转移夹的顺序放好，凝胶与NC膜之间不要接触，以免引起短路。凝胶与NC膜之间不能有气泡。将制备好的转移夹插入电泳槽中，加入转移缓冲液，以近胶一侧为负极，近膜一侧为正极连接转移电泳仪。将电泳仪置于4℃冰箱中，30～40V电泳转移，过夜。电泳结束后，用丽春红对NC膜染色，检测蛋白是否转移到NC膜上，确认后，用蒸馏水洗净染料。将NC膜与适量体积的TBST(3％BSA)封入塑料袋中，在摇床上室温摇动，封闭30分钟。按照1∶1000将一抗稀释到10mlTBST(3％BSA)放入NC膜，在室温在摇床上孵育2小时。用TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。按照1∶50将辣根酶标记马抗山羊IgG(H+L)稀释到10mlTBST溶液，放入NC膜，于室温下在摇床上杂交1小时。用TBST洗涤NC膜5次，每次10分钟。取50ul 10％的4-氯-1-萘酚加入2ml甲醇，用TBE补充至10ml，并加35ul的过氧化氢，混匀配制成显色液。加入NC膜封入塑料袋中显色。当蛋白质条带强度适合时，弃去显色液，用去离子水洗涤数次，终止显色反应。观察，拍照。(图14)对再生乳腺组织进行Western检测，再生乳腺分泌乳汁中能检测到人抗汉坦病毒抗体蛋白，表明乳腺原基移植后能再生功能性乳腺。
三、结果1、共移植65只受体鼠，无一例死亡，其中除两只伤口愈合不好外，其他伤口愈合良好，移植后至采样期间无发现生长异常情况。
2、全组织染色选取22只进行全组织染色检测再生情况，其中22对乳腺中有24只再生，再生率为54.5％，高出同类研究的40-50％水平近10个百分点，表明本移植方法的可行性。如图4、5，乳腺原基移植后，可以在清除乳腺的脂肪垫中再生、延伸，并布满整个脂肪垫。移植受体鼠经过交配分娩后，其移植再生的乳腺可以分泌乳汁，并在再生的乳腺导管中蓄积。虽然再生的乳腺没有定向分化的乳腺导管将分泌的乳汁排除体外，但乳腺原基移植后能够再生并能分泌乳汁，证明再生的乳腺具有正常乳腺的功能，为器官的移植再生提供了强有力的理论基础和技术手段。为器官移植再生提供了新的思路，即可以通过移植器官原基的方法再生一个新的具有功能的器官。
3、再生乳腺的PCR检测对41只受体鼠移植6-8周后配种，分娩后采集有再生现象的乳腺23只，进行PCR、原位杂交和Western检测。再生乳腺进行转基因的PCR检测，82.6％的再生乳腺(19/23)均能检测出转基因，表明转基因乳腺原基再生后转基因的稳定性。由图6可以看出，2、3、4、5、6、7、8、10、11、13号再生乳腺均能检测到转基因，说明转基因可稳定遗传给再生的乳腺组织，并证明再生的乳腺组织来源于乳腺原基。1、9、12为阴性，可能是所取组织中没有再生乳腺的结果，因为单凭肉眼，不能保证判断再生与否的100％正确性。
4、再生乳腺的原位杂交对再生乳腺进行原位杂交检测，再生乳腺原位杂交呈阳性结果，如图11、12，进一步证明再生的乳腺组织源于移植的乳腺原基，并且表明转基因能在再生的泌乳期乳腺转录水平上进行表达。
5、再生乳腺分泌乳成分的Western检测对再生乳腺组织进行Western检测，再生乳腺分泌乳汁中能检测到人抗汉坦病毒抗体蛋白，表明乳腺原基移植后能再生功能性乳腺，如图14。
6、系列检测研究结果表明采用本发明的乳腺原基移植方法可获得具有分泌功能的再生乳腺组织。
附录轻链转化子插入片断测序结果1ATC TTC CCA TTC ACA GGA ATC GCG GAT CCT CGA GTA CCA TGG GAT46GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTA AGG91GGT TAA CAG TAG CAG GCT TGA GGT CTG GAC ATA TAT ATG GGT GAC136AAT GAC ATC CAC TTT GCC TTT CTC TCC ACA GGC GTG CAC TCC GAT181ATC GCC CTC ACG CAG CCT GCC TCC GTG TCT GGG TCT CCT GGA CAG226TCG ATC ACC ATC TCC TGC ACT GGA ACC AGC AGT GAC GTT GGT GGT271TAT AAC TAT GTC TCC TGG TAC CAA CAA CAC CCA GGC AAA GCC CCC316AAA CTC ATA ATT TAT GAT GTC AGT AAT CGG CCC TCA GGG GTT TCT361ACT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TCC CTG ACC406ATC TCT GGG CTC CAG GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT TAC TGC AGT451TCC AGA AGA AGC GGC AGC ACG ATG GTT TTC GGC GGA GGG ACC AAG496CTC GAG ATC AAA CGT GAG TAG AAT AGA TCT AAC TTA ATT AAG GAA541TAG GGG AAG CTA GGA AGA AAC TCA AAA CAT CAA GAT TTT AAA TAC586GCT TCT TGG TCT CCT TGC TAT AAT TAT CTG GGA TAA GCA TGC TGT631TTT CTG TCT GTC CCT AAC ATG CCC TGT GAT TAT CCG CAA ACA ACA676CAC CCA AGG GCA GAA CTT TGT TAC TTA AAC ACC ATC CTG TTT GCT721TCT TTC CTC AGG AAC TGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT CTT CCC766GCC ATC TGA TGA GCA GTT GAA ATC TGG AAC TGC CTC TGT TGT GTG811CCT GCT GAA TAA CTT CTA TCC CAG AGA GGC CAA AGT ACA GTG GAA856GGT GGA TAA CGC CCT CCA ATC GGG TAA CTC CCA GGA GAG TGT CAC901AGA GCA GGA CAG CAA GGA CAG CAC CTA CAG CCT CAG CAG CAC CCT946GAC GCT GAG CAA AGC AGA CTA CGA GAA ACA CAA AGT CTA CGC CTG991CGA AGT CAC CCA TCA GGG CCT GAG TTC ACC GGT GAC AAA GAG CTT1036CAA CAG GGG AGA GTG TTA GAG GGA CTA GTC GAG GAT CCG GAC CCT1081TCC C
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权利要求
1.小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，其特征在于用巴斯德吸管吸取供体小鼠的乳腺原基后移植于受体小鼠已清除乳腺组织的脂肪垫中。
2.根据权利要求1所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述巴斯德吸管的口径与乳腺原基直径相当。
3.根据权利要求1所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述吸取采用三段式，将乳腺原基置于两段移植缓冲液之间。
4.根据权利要求3所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述移植缓冲液是1×PBS。
5.根据权利要求1所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述乳腺原基还转有外源基因。
6.根据权利要求5所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述外源基因是抗人汉坦病毒抗体基因。
7.根据权利要求1所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述乳腺原基是刚剥离的乳腺原基或是体外培养过的乳腺原基。
8.根据权利要求4所述的小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，所述体外培养的培养液是含10％FCS的DF12溶液。
全文摘要
本发明涉及小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法，其特征在于用巴斯德吸管吸取供体小鼠的乳腺原基后移植于受体小鼠已清除乳腺组织的脂肪垫中。本发明获得乳腺原基移植后再生并泌乳的乳腺，本模型的建立，可以为人类临床乳腺切除后移植再生、乳腺生物反应器以及利用转基因乳腺移植治疗某些疾病提供理论依据和技术支持。将转有目的基因的转基因小鼠乳腺移植到清除乳腺组织的受体鼠脂肪垫中再生功能性乳腺，使目的基因在再生乳腺中表达并分泌相应的蛋白，从而为某基因对乳腺发育的影响、乳腺生物反应器以及器官的再生修复提供理论依据和技术支持。
文档编号A61F2/02GK1695570SQ20051001162
公开日2005年11月16日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者韩建永, 李宁 申请人:李宁