专利名称：转铁蛋白(Tf)－超氧化物歧化酶(SOD )偶联物及制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属生物药物特别是转铁蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶联物及其制备工艺领域。
背景技术：
自从1968年美国学者McCord和Fridovich等人首先发现了超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase SOD，以下简称SOD)、并阐述了阴离子超氧化物自由基的生物学意义以来，人们已经从分子水平发现和揭示了体内自由基水平与临床各种疾病的发生密切相关，同时也发现了SOD对自由基的清除作用，例如血管硬化、肾炎、类风湿等疾病、特别是脑部疾病如帕金森氏病、老年性痴呆等病，均明显存在由于超氧化物自由基损伤导致的细胞变性、凋亡。SOD是一种高效的自由基清除剂，由于其为非亲脂性生物大分子，难以进入细胞，尤其难以通过脑毛细血管壁内皮的血脑屏障(Blood Brain Barrier BBB)，这给用SOD防治这些疾病带来了困难。目前由转铁蛋白(Transferrin Tf，以下简称Tf)及其受体(Transferrin ReceptorTfR)介导的胞体转运作用已被证实。近年来对以Tf或其受体的抗体为载体偶联药物作为肿瘤导向治疗的方法展开了广泛研究，并取得了一定的效果。但一直没有发现有疗效比较显著、技术比较成熟的有关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对病因与自由基损害密切相关的帕金森氏等疾病，提供一种有效发挥SOD的临床疾病防治作用的药物及其制备方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题将转铁蛋白Tf与超氧化物歧化酶SOD进行偶联形成Tf-SOD偶联物。
Tf-SOD偶联物的制备方法是第一步，分别从动物血浆及血液红细胞中用生化方法提取纯化Tf及SOD。
第二步，用蛋白偶合剂使Tf与SOD偶联形成Tf-SOD偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、SOD，得Tf-SOD偶联物纯品，经滤菌，检测SOD活性，检验合格即得产品。
Tf-SOD偶联物具有与Tf受体结合及SOD的生物活性，可将Tf作为一种转运因子与血管内皮细胞上的受体结合介导大分子药物SOD进入细胞及器官脑、心、肝、肾等，穿越血脑屏障，有效地发挥SOD临床疾病的防治作用，主要用于防治脑、心、肝、肾、血管等疾病，特别是大分子药物难以透过的帕金森氏病等脑部疾病。
具体实施例方式
本发明生产的能有效发挥SOD临床疾病防治作用的药物，是将转铁蛋白Tf与超氧化物歧化酶SOD进行偶联形成的Tf-SOD偶联物。
将Tf与SOD进行偶联形成Tf-SOD偶联物的制备工艺步骤为a.分别从动物血浆及血液红细胞中用生化方法提取纯化Tf及SOD。
b.用蛋白偶合剂使Tf与SOD偶联形成Tf-SOD偶联物，另将部分SOD标记上同位素碘125再与Tf偶联形成Tf-SOD-I125偶联物。分别用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、SOD、I125。得Tf-SOD偶联物、Tf-SOD-I125偶联物纯品，经滤菌，检测SOD活性，检验合格的Tf-SOD偶联物，可供疾病动物模型进行药效实验用。
用生产出的Tf-SOD偶联物进行小鼠血脑屏障穿透试验时，分别用SOD-I125、Tf-SOD-I125偶联物进行鼠颈动脉灌注，10分钟后用生理盐水对动物灌流，冲洗脑血管内残留的SOD-I125、Tf-SOD-I125，取出脑组织测定同位素含量。脑组织中Tf-SOD-I125组I125含量大于SOD-I125组。
结果如下表 脑组织中Tf-SOD-I125组I125含量大于SOD-I125组约7倍。
制造鼠帕金森氏病动物模型时，用亲神经性自由基损害剂甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)注射试验鼠。再用上述Tf-SOD偶联物对模型治疗组试验鼠进行保护性治疗，用免疫组织化学、电子显微技术及生化分析等手段，均可观察到实验动物脑组织、黑质胆碱能神经细胞等受到良好的保护。如黑质部位TH阳性细胞计数显示MPTP组885.0±167.5，Tf-SOD偶联物组2230.0±210.3，正常对照组2423.0±178.0。实验表明，Tf-SOD偶联物组细胞存活数显著高于MPTP组，而Tf-SOD偶联物组与正常对照组的细胞存活数不存在显著性差异。
以下是制备Tf-SOD偶联物的实施例实施例1一.Tf提取纯化1.盐析取血浆200ml，加入0.1M NaHCO354ml，混匀，滴加三氨乙酸-Cl35.4ml，25℃搅拌5小时，再加入硫酸铵63克，25℃放置3小时。然后7000rpm离心30分钟，弃上清液，取沉淀用30ml PH7.8 0.02M Tris-HCl缓冲液溶解，装入透析袋中，对上述缓冲液透析12小时，中间换液三次。
2.柱层析取上述盐析提取物上DEAE-sephacell柱，用PH7.8 0.02M Tris-HC缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5M NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集得到5个组份，第3组份为Tf。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
二.SOD提取纯化1.有机溶剂提取取红细胞200克，用生理盐水洗涤2次，用2倍体积蒸馏水搅拌溶解细胞30分钟，然后缓慢加入0.25倍体积95％乙醇和0.15倍体积氯仿，搅拌15分钟，离心去血红蛋白沉淀，取上清液装透析袋中，对PH7.6 0.02M磷酸缓冲液透析24小时，中间换液三次。
2.层析取上述提取液上DEAE-sephacell柱，用PH7.8 0.02M Tris-HC缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5M NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集得到4个组份，第3组份为SOD。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
三.Tf-SOD偶联物制备1.SOD活化反应取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇12mg。搅拌反应1.5小时，加入37mg甘氨酸终止反应。反应液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.40.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
2.Tf活化反应取Tf 400mg用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的45mgN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1.5小时，反应液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
3.Tf、SOD结合反应将上述活化反应后的Tf及SOD组份相混合，搅拌反应3小时。反应液经浓缩上sephadex G-200柱，用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，第1组份为Tf-SOD偶联物。进一步滤菌、冻干保存。
实施例2一.Tf提取纯化同实施例1；二.SOD提取纯化同实施例1；三.Tf-SOD偶联物制备1.SOD活化反应取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇27mg。搅拌反应1.5小时，加入37mg甘氨酸终止反应。反应液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
2.Tf活化反应取Tf400mg用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的30mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1.5小时，反应液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
3.Tf、SOD结合反应将上述活化反应后的Tf及SOD组份相混合，搅拌反应3小时。反应液经浓缩上sephadex G-200柱，用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，第1组份为Tf-SOD偶联物。进一步滤菌、冻干保存。
实施例3一.Tf提取纯化同实施例1；二.SOD提取纯化同实施例1；三.Tf-SOD偶联物制备1.SOD活化反应取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇43mg。搅拌反应1.5小时，加入37mg甘氨酸终止反应。反应液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
2.Tf活化反应取Tf400mg用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的13mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1.5小时，反应液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
3.Tf、SOD结合反应将上述活化反应后的Tf及SOD组份相混合，搅拌反应3小时。反应液经浓缩上sephadex G-200柱，用PH7.40.01M磷酸缓冲液平衡洗脱，其中第1组份为Tf-SOD偶联物。进一步滤菌、冻干保存。
以下是Tf-SOD偶联物的应用实例本发明Tf-SOD偶联物对小鼠帕金森病模型的药理效应选用40日龄小鼠(14-16克)随机分成3组1、MPTP实验组(制造帕金森模型)；2、Tf-SOD治疗组(针对帕金森模型治疗)；3、对照组(注射生理盐水)。实验结果实验进行30天后将实验小鼠用戊巴比妥钠麻醉，依次用生理盐水和4％多聚甲醛作动脉灌流，取脑组织进行实验观察。HE染色光镜分析和电镜分析，分别显示MPTP实验组脑组织神经元胞核固缩，出现空泡变性，Nissl体溶解；大量明显的髓鞘脱落。而在正常对照组及Tf-SOD治疗组中未见上述病理改变的形成。免疫组化分析脑黑质部位多巴胺细胞计数显示，Tf-SOD治疗组细胞存活数显著高于MPTP实验组(P＜0.05)，而与正常对照组不存在显著性差异(P＞0.05)。实验结果表明Tf-SOD偶联物可以通过血脑屏障，对小鼠帕金森病模型能产生良好的药理效应。
权利要求
1.一种转铁蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶联物，含有超氧化物歧化酶SOD，其特征是将转铁蛋白Tf与SOD进行偶联形成Tf-SOD偶联物。
2.一种转铁蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶联物的制备方法，其特征是工艺步骤为a.分别从动物血浆及血液红细胞中用生化方法提取纯化Tf及SOD；b.用蛋白偶合剂使Tf与SOD偶联形成Tf-SOD偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、SOD，得Tf-SOD偶联物纯品，经滤菌，检测SOD活性，检验合格即得产品。
全文摘要
一种转铁蛋白(Tf)－超氧化物歧化酶(SOD)偶联物，将转铁蛋白Tf与SOD进行偶联形成Tf－SOD偶联物。其制备工艺是首先分别从动物血浆及血液红细胞中用生化方法提取纯化Tf及SOD，再用蛋白偶合剂使Tf与SOD偶联形成Tf－SOD偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、SOD，得Tf－SOD偶联物纯品。该偶联物具有与Tf受体结合及SOD的生物活性，可将Tf作为一种转运因子与血管内皮细胞上的受体结合介导大分子药物SOD进入细胞及器官脑、心、肝、肾等，能有效发挥SOD临床疾病的防治作用，主要用于防治脑、心、肝、肾、血管等疾病。
文档编号A61P25/00GK1762489SQ200510018948
公开日2006年4月26日 申请日期2005年6月16日 优先权日2005年6月16日
发明者廖共山 申请人:广西医科大学