专利名称：亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲环蛋白类化合物的一种新应用，尤其是亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘药物中的应用。
背景技术：
亲环蛋白(Cyclophilins)即环孢素A结合蛋白，是环孢素A的细胞内蛋白受体。1984年从小牛胸腺中分离、纯化出第1个环孢素A受体，被命名为亲环蛋白A，(Hardschumacher R，et al.Science；1984；226(4674)544)，是环孢素A的主要体内蛋白受体。亲环蛋白是普遍分布的细胞内蛋白，也可以分泌到胞外，已发现和克隆的亲环蛋白有130多种异构体(Galat A.Arch Biochem Biophys.1999；371(2)149)，存在于从细菌到真核生物几乎所有生物体中，它们构成了亲环蛋白家族，各种亲环蛋白之间氨基酸核心序列高度同源，结构高度保守。目前发现的人亲环蛋白家族至少有12个成员，按分子量大小可分为2个大的亚族，即单环类和多环类。hCyP18、hCyP19、hCyP20属于第1类，hCyP33、hCyP40、hCyP88、hCyP158、hCyP358、hCyP58、hCyP73属于第2类。
亲环蛋白在已知的其家族成员的共同生物学功能有(1)肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性，即通过催化寡肽中脯氨酸肽键的顺反异构来加速体内蛋白质的折叠，并起着分子伴侣的作用；(2)介导环孢素A的免疫抑制功能。环孢素A进入体内，与亲环蛋白(主要是亲环蛋白A)结合，形成亲环蛋白-环孢素A复合物，再与钙调神经磷酸酶(calcineurin，CN)结合，抑制钙调神经磷酸酶活性，并使其底物即激活的T细胞核因子(NF-AT)不能去磷酸化，使其不能从胞浆向胞核转移，抑制细胞因子IL-2、IL-2R、IL-4等基因的活化，从而在转录水平阻断T细胞的活化，即通过阻断T细胞信号传递而实现免疫抑制。(3)免疫调节作用。从亲环蛋白介导环孢素A的免疫抑制作用的机理推测，亲环蛋白可能与某些基因的转录与翻译有关。体内也可能存在亲环蛋白的天然配体，它们与各类亲环蛋白结合，形成一种新的免疫调节网络，调节机体的免疫功能。Bram等人发现(Bram RJ，et al.Nature 1994；371(6495)355)，在T淋巴细胞中存在着一种称之为钙离子信号调节亲环蛋白配体(CAML)，可能是亲环蛋白B的天然配体。当其在T细胞中高度表达时，能引起钙离子的内流，从而激活淋巴细胞内依赖钙离子的信号传导途径，对T淋巴细胞起免疫上调作用。体内也许存在着结构类似于环孢素A、FK506等的天然配体，它们与各类亲环蛋白结合后起免疫下调作用。(4)诱导某种细胞凋亡。细胞凋亡(apoptosis)是机体生长发育、细胞分化和病理状态下细胞自主性死亡的过程，又称为程序性细胞死亡(programmed cell death)。在体内外影响细胞凋亡的因素很多。已发现重组亲环蛋白A、B、C有依赖钙镁离子的核酸酶活性，可能在某些淋巴细胞凋亡中起作用(Montague JW，et al.J Biol Chem 1994；269(29)18877)。亲环蛋白引起细胞凋亡的机理不详，也许是与亲环蛋白的核酸酶活性有关，也许是亲环蛋白可以通过钙离子信号传递途径影响调控细胞凋亡的基因表达而间接地调控细胞凋亡。(5)亲环蛋白与某些免疫病相关。1992年，Harigai等人首先在系统性红斑狼疮患者血清发现IgG类和IgM类抗亲环蛋白自身抗体，阳性率分别为40％和20％，而且抗体水平与该病的发作、缓解相关(Harigai M，et al.Clin Immunol Immunopath 1992；63(1)58)。几乎同时Kratz等人也在系统性红斑狼疮患者和莱姆病患者血清中检测到了亲环蛋白自身抗体(Kratz A，et al.Clin Exp Immunol 1992；90(3)422)。武建国等在国内率先开展了这项研究工作，发现约有53％的系统性红斑狼疮患者血清中出现亲环蛋白自身抗体，且该抗体与其它自身抗体如抗核抗体、抗钙调素抗体之间无相关关系(武建国，等。中华微生物学和免疫学杂志1996；16(1)63)。亲环蛋白A通过与I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag聚蛋白(Gag polyprotein)结合，可能在HIV-1感染性病毒体的复制中起作用，这种作用能被环孢素A及环孢素A衍生物所阻断，故认为亲环蛋白与HIV-1感染有关，亲环蛋白A因此有可能作为HIV-1基因治疗的细胞靶点(Soifer HS，et al.MolTher 2004；9(suppl 1)s206)。(6)亲环蛋白可能与环孢素A的不良反应肾脏毒性有关。环孢素A的主要不良反应是肾脏毒性，其机理目前尚不清楚。Northernblot显示，小鼠的亲环蛋白C分布有一定的组织特异性。它在肾脏和免疫组织内含量最丰富，这恰好与环孢素A作用相对的组织特异性相一致，从而推测环孢素A肾脏毒性可能是由亲环蛋白C介导的。Otsuka等人用RT-PCR技术检测亲环蛋白A、亲环蛋白C的mRNA在肾单位节段的分布以及环孢素A对近曲小管中亲环蛋白C mRNA表达的影响，在研究中发现亲环蛋白C mRNA分布不均匀，它主要存在于对环孢素A毒性较敏感的部位-肾近曲小管与垂直小管，而亲环蛋白A mRNA分布均匀；环孢素A能促进近曲小管中亲环蛋白C mRNA表达。故认为亲环蛋白C可能在环孢素A引起的肾小管功能失调中起作用(Otsuka M，etal.Kidney Inter 1994；45(5)1340)。
由于亲环蛋白是环胞素A的细胞内受体，多年来其作用一直局限于亲环蛋白的细胞内作用。1991年Caroni等首先发现了细胞外分泌型亲环蛋白(Caroni P，et al.JBC1991；266(17)10739)，2000年Jin等证明了亲环蛋白A在氧化应激条件的表达和分泌及其在血管损伤中的作用(Jin ZG，et al.Circ Res 2000；87(9)789)。2002年Allain等的研究表明，细胞外亲环蛋白B可特异性增强记忆性CD4+T淋巴细胞的趋化和粘附作用(Allain F，et al.PNAS 2002；99(5)2714)，从而拉开了亲环蛋白细胞外作用研究的序幕(Bukrinsky MI.Trends immunol 2002；23(3)323)。亲环蛋白克隆的成功也促进了亲环蛋白细胞外活性研究的发展。但至今尚未报道在防治哮喘中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于基于上述研究的进展，研究设计亲环蛋白类化合物的新应用。
本发明提供了亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘药物中的应用。
本发明的技术方案基于下列原理环胞素A可用于哮喘的治疗，尤其是对于激素依赖性哮喘。环胞素A用于哮喘治疗的原理是类似于皮质激素的免疫抑制作用，环胞素A进入机体后与其胞内受体亲环蛋白结合抑制T淋巴细胞活化产生免疫抑制作用而治疗哮喘。但由于环胞素A副作用大、水溶性低和分子量大在临床应用上受到较大限制。本发明人认为，既然环胞素A通过其体内受体亲环蛋白而发挥免疫抑制作用治疗哮喘，而且亲环蛋白可以被非环胞素A类化合物激活，并在体内存在亲环蛋白的配体，那么可以通过增加亲环蛋白的量或激活亲环蛋白的活性直接发挥亲环蛋白的免疫抑制作用治疗哮喘，从而使亲环蛋白及其激动剂直接成为哮喘的治疗药物，替代环胞素A，并避免环胞素A的各种副作用。
本发明提供的亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘中的应用通过下述的实验方法证明一、人重组亲环蛋白的体内抗大鼠哮喘实验1.实验前，取人重组亲环蛋白，将其以不同的浓度进行稀释，置4℃冰箱备用。
2.取120克体重的清洁级SD大鼠，一次性腹腔注射含卵蛋白0.1毫克和氢氧化铝1毫克的生理盐水1.5毫升。两周后，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(50毫克/公斤体重)，在颈部正中纵向切口插入连接有三通开关的直径为2.5毫米的气管导管，供测定潮气量和流率，潮气量和流率用呼吸流量测定仪和压差传感器测定。胸内压用食道内压代替，将食道作横向切口，插入头端有四个侧孔的注水导管，后连血压换能器供测定食道内压，食道内压经生物信号处理系统后，与潮气量、流率和食道内压经模数转换后，进入计算机，由“功能学科实验软件1.11”自动记录潮气量、流率和食道内压曲线，并自动计算气道阻力和肺顺应性。为避免单个波的计算误差，每个气道阻力、肺顺应性的平均值由连续60秒内记录的潮气量、流率和食道内压算得的气道阻力、肺顺应性的平均值表示。
3.每只大鼠手术、插管结束后休息20分钟，将不同浓度的人重组亲环蛋白分别经颈外静脉注射人大鼠体内，10分钟后，连续记录大鼠气道阻力和肺顺应性3分钟，将这3分钟的气道阻力、肺顺应性的平均值做为大鼠哮喘发作前的正常值。然后按0.1毫克/公斤体重经颈外静脉注射卵蛋白激发大鼠哮喘发作。记录激发后每分钟的气道阻力和肺顺应性值，共记录30分钟。
4.计算注射不同剂量亲环蛋白注射对哮喘大鼠气道阻力的影响，以亲环蛋白注射组气道阻力较哮喘模型组明显降低作为亲环蛋白抗哮喘的有效作用。
5.结果证明人重组亲环蛋白抗大鼠哮喘具有剂量依赖性，在低剂量条件下呈现明显的抗哮喘作用。
二、人重组亲环蛋白的体外抗大鼠哮喘实验1.实验前，取人重组亲环蛋白，将其以不同的浓度进行稀释，置4℃冰箱备用。
2.制备SD大鼠离体气管螺旋条。处死大鼠后，迅速自甲状软骨下至气管分叉处剪下全部气管，放入盛有克-亨氏(Krebs-Henseleit)液的玻璃平皿中，剥离气管周围结缔组织，气管内以小玻璃棒作支撑，用小镊子提起一端，按螺旋形(每2-3个软骨为一个螺旋)将气管剪成宽约3mm的条状。
3.将制备的大鼠离体气管肌条标本放入盛有克-亨氏液的麦氏浴槽内，下端以较短的无弹性连线固定于大鼠立体定位系统的非弹性弯钩上，上端以较长的无弹性连线连至张力换能器上。浴槽内温度恒定在37℃，持续供给纯氧，初始负荷调节在500毫克，标本平衡30分钟后，开始给予不同浓度的人重组亲环蛋白。张力换能器与生物信号处理系统相连，经模数转换，输入计算机，由实时信号处理软件进行记录、计算和分析。
4.计算不同浓度人重组亲环蛋白对大鼠离体气管肌条的舒张作用，以人重组亲环蛋白对大鼠离体气管肌条有明显的舒张作为亲环蛋白抗哮喘的有效作用。
5.结果证明人重组亲环蛋白对大鼠离体气管肌条的舒张作用具有剂量依赖性，在低剂量条件下对大鼠离体气管肌条的舒张作用明显。
本发明提供的亲环蛋白类化合物包括亲环蛋白家族的所有成员，它们具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，具有介导孢素A的免疫抑制功能，具有免疫调节作用，具有诱导细胞凋亡作用，与免疫性炎症性疾病的发病相关。
本发明的另一目的是提供了具有药学效应的亲环蛋白激动剂筛选方法，该方法包括1)将亲环蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行抗哮喘药物筛选；2)根据亲环蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行抗哮喘药物筛选；3)将通过上述两种筛选方法获得的小分子化合物，进行动物体内与体外实验，获得这些小分子化合物的抗哮喘活性及其抗哮喘药物的开发。
本发明的研究实验结果证明了亲环蛋白类化合物的在体和离体的抗哮喘作用，本发明还提供了基于在体和离体抗哮喘作用的亲环蛋白类化合物激动剂在抗哮喘药物研发中筛选方法，这些对新的抗哮喘药物开发将具有很大的应用价值。
图1人重组亲环蛋白A的体内抗大鼠哮喘的实验结果。
图中纵座标为气道阻力，横座标为时间(分)图2人重组亲环蛋白A对大鼠离体气管肌条肌张力影响的实验结果。
图中纵坐标为张力变化(毫克)，横坐标的直方图依次为亲环蛋白A低剂量组、亲环蛋白A高剂量组、缓冲液低剂量组、缓冲液高剂量组。
具体实施例方式以下实施例仅为本发明应用的举例，本发明将不限于以下实施例。
实施例1人重组亲环蛋白A的体内抗大鼠哮喘实验实验前，取人重组亲环蛋白，将其稀释为1微克/毫升低剂量和200微克/毫升高剂量两种不同的浓度，置4℃冰箱备用。
取120克体重的清洁级SD大鼠，一次性腹腔注射含卵蛋白0.1毫克和氢氧化铝1毫克的生理盐水1.5毫升。两周后，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(50毫克/公斤体重)，在颈部正中纵向切口插入连接有三通开关的直径为2.5毫米的气管导管，供测定潮气量和流率，潮气量和流率用呼吸流量测定仪和压差传感器测定。胸内压用食道内压代替，将食道作横向切口，插入头端有四个侧孔的注水导管，后连血压换能器供测定食道内压，食道内压经生物信号处理系统后，与潮气量、流率和食道内压经模数转换后，进入计算机，由“功能学科实验软件1.11”自动记录潮气量、流率和食道内压曲线，并自动计算气道阻力和肺顺应性。为避免单个波的计算误差，每个气道阻力、肺顺应性的平均值由连续60秒内记录的潮气量、流率和食道内压算得的气道阻力、肺顺应性的平均值表示。
每只大鼠手术、插管结束后休息20分钟，将1微克/毫升、200微克/毫升浓度的人重组亲环蛋白分别经颈外静脉以0.1毫升/40克体重注射入大鼠体内，10分钟后，连续记录大鼠气道阻力和肺顺应性3分钟，将这3分钟的气道阻力、肺顺应性的平均值做为大鼠哮喘发作前的正常值。然后按0.1毫克/公斤体重经颈外静脉注射卵蛋白激发大鼠哮喘发作。记录激发后每分钟的气道阻力和肺顺应性值，共记录30分钟。
结果见图1，人重组亲环蛋白A低剂量组(1微克/毫升)的气道阻力在哮喘激发后第3、4、5、6、7分钟较哮喘模型组明显降低(P＜0.05)，人重组亲环蛋白A高剂量组(200微克/毫升)、缓冲液低剂量组、缓冲液高剂量组的气道阻力与哮喘模型组比较均无明显差异(P＞0.05)。证明人重组亲环蛋白抗大鼠哮喘具有剂量依赖性，在低剂量条件下呈现明显的抗哮喘作用。图中显示亲环蛋白低剂量组的气道阻力与哮喘模型组在同一时间点的比较有明显差异。
实施例2人重组亲环蛋白A对大鼠离体气管肌条肌张力影响的实验实验前，取人重组亲环蛋白，将其稀释为1微克/毫升低剂量和200微克/毫升高剂量两种不同的浓度，置4℃冰箱备用。
取240克体重的清洁级SD大鼠，处死大鼠后，迅速自甲状软骨下至气管分叉处剪下全部气管，放入盛有克-亨氏(Krebs-Henseleit)液的玻璃平皿中，剥离气管周围结缔组织，气管内以小玻璃棒作支撑，用小镊子提起一端，按螺旋形(每2-3个软骨为一个螺旋)将气管剪成宽约3mm的条状。
将制备的大鼠离体气管肌条标本放入盛有克-亨氏液的麦氏浴槽内，下端以较短的无弹性连线固定于大鼠立体定位系统的非弹性弯钩上，上端以较长的无弹性连线连至张力换能器上。浴槽内温度恒定在37℃，持续供给纯氧，初始负荷调节在500毫克，标本平衡30分钟后，开始给予1微克/毫升低剂量或200微克/毫升高剂量的人重组亲环蛋白100微升。将张力换能器与生物信号处理系统相连，经模数转换，输入计算机，由实时信号处理软件进行记录、计算和分析。
结果见图2，人重组亲环蛋白A低剂量组(1微克/毫升)的离体气管肌条张力明显舒张，与人重组亲环蛋白A高剂量组(200微克/毫升)、缓冲液低剂量组、缓冲液高剂量组的张力相比较有明显差异(P＜0.05)。证明人重组亲环蛋白对离体气管肌条张力的舒张具有剂量依赖性，在低剂量条件下呈现明显的舒张作用。图中*示亲环蛋白低剂量组对离体气管肌条张力的舒张作用较人重组亲环蛋白A高剂量组(200微克/毫升)、缓冲液低剂量组、缓冲液高剂量组明显增强。
实施例3人重组亲环蛋白A激动剂筛选研究根据人重组亲环蛋白A的三维结构，将人重组亲环蛋白A的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术和小分子化合物数据库，筛选出了18种与之相互作用的小分子化合物。
将人重组亲环蛋白A作为配体偶连到CM5芯片上，应用表面等离子共振技术对上述虚拟筛选出的18种小分子化合物进行配体垂钓检测，发现其中6种与人重组亲环蛋白A有较高的结合活性。将这6种植物来源的小分子化合物将是抗哮喘药物筛选的基础。
权利要求
1.一种亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘药物中的应用。
2.一种用于制备防治支气管哮喘药物的亲环蛋白类化合物中具有药物效应的亲环蛋白激动剂的筛选方法，其特征在于该方法包括1)将亲环蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行抗哮喘药物筛选；或2)根据亲环蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行抗哮喘药物筛选；3)通过上述筛选方法获得的小化合物，进行动物体内与体外实验，获得有抗哮喘活性的小分子化合物。
全文摘要
本发明提供了亲环蛋白类化合物在制备防治支气管哮喘药物中的应用。本发明通过对大鼠进行的体内和体外抗哮喘实验，证明了该类化合物有明显的抗哮喘作用。本发明还提供了具有药学效应的亲环蛋白激动剂的筛选方法。
文档编号A61K38/12GK1698880SQ200510026320
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月31日 优先权日2005年5月31日
发明者杨永清, 王宇, 崔建美, 王燕, 王培育, 刘艳艳 申请人:上海市针灸经络研究所, 上海中医药大学