专利名称：知母皂苷bⅱ在制备用于防治脑卒中药物或产品中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及知母皂苷BII的用途，具体涉及知母皂苷BII在制备防治脑卒中(脑中风)药物或产品中的用途。
背景技术：
脑中风是由于颅内外血管阻塞或破裂而造成的急性脑功能损伤，严重危害中老年人的生命健康，也是造成中老年人致死、致残的主要原因之一。脑卒中患者约有1/3在发病不久后死亡，幸存者由于偏瘫、失语等后遗症致残丧失工作甚至生活自理能力。目前通常治疗脑中风有两种方法一种是通过增加血流量改善动脉中氧和葡萄糖不足；另一种是保护神经元，减少脑组织缺血可能性，降低神经元的兴奋毒性死亡。用于临床治疗的神经元保护剂有钙离子通道阻断剂，谷氨酸受体拮抗剂，NMDA拮抗剂等。与脑卒中的高发病率、高致死率及高致残率相比，目前用于预防治疗脑卒中的药物品种较少，远远不能满足临床需要。
中药知母为百合科(Liliaceae)知母属多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的根茎，主产于河北、内蒙古、山西及东北等地，中医用作苦寒清热药，有清热泻火，滋阴润燥的功效，主要治疗外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴和肠燥便秘等。知母的主要成分是甾体皂苷(steroidal saponins)，到目前为止，文献报道从知母中分离得到32种甾体皂苷及皂苷元；其次还有黄酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。1963年川崎敏男等首次分出知母皂苷BII，但并未阐明其结构结构。1991年南云清二等首次阐明了知母皂苷BII的化学结构(Seiji NAGUMO et al，药学杂志(日)，1991；111(1)306-310)。以后Noboru Nakashima (NOBORU NAKASHIMA et al，Journal ofNatural Products，1993；56(3)345-350)、马百平(马百平等，药学学报，1996；31(4)271-277)、Masayasu Kimula(Masayasu KIMURAet al，Biol.Pharm.Bull，1996；19(7)926-931)和 Jianying Zhang(Jianying ZHANG et al，Clinica Chimica Acta，1999；28979-88)等先后报道了知母皂苷BII的分离及活性。
知母皂苷BII(Timosaponin BII)，又名原知母皂苷AIII(Prototimosaponin AIII)等，是中药知母中的主要成分，结构为(25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羟基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷[(25S)-26-0-β-D-glucopyranosyl-22-hydroxy-5β-furostane-3β，26-diol-3-0-β-D-glncopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranoside]。结构如下 已报道的知母皂苷BII的药理活性主要有1.降血糖作用。知母皂苷BII可以降低链尿霉素糖尿病小鼠的血糖水平，但并不促进葡萄糖的吸收和胰岛素的释放，推测降血糖机制是抑制肝糖元的分解。(NOBORU NAKASHIMA et al，Journal of NaturalProducts，1993；56(3)345-350)2.抑制血小板聚集。知母皂苷BII具有显著的抗人血小板聚集及延长凝血时间的活性。(Jianying ZHANG et al，Clinica Chimica Acta，1999；28979-88)3.清除自由基活性。利用顺磁方法，观察到知母皂苷BII(5mg/ml)对Fenton反应体系产生的羟自由基的清除率为57％。(马百平等，药学学报，1996；31(4)271-277)4.抗痴呆活性。马百平等报道了知母皂苷BII具有一定的防治老年性痴呆的作用。(发明专利申请公开书，公开号CN1212966，申请号97119680.X)。
陈万生等报道了知母总皂苷用于制备防治脑卒中药物的用途(发明专利申请公开书，公开号CN1451384A，申请号03116824.8)。该申请中公开的知母总皂苷的特征为知母皂苷BII、E、B、AIII的含量之和≥50％。
发明内容
本发明的发明人通过多年潜心研究，首次发现和证实了单体化合物知母皂苷BII防治脑卒中的活性，其特征为知母皂苷BII可明显改善局灶性脑缺血大鼠神经症状，缩小脑梗塞范围，减轻脑水肿程度；明显改善模型动物的血液流变性、减轻脑缺血所致炎性损伤等。
因此，本发明涉及知母皂苷BII在制备用于预防或治疗脑卒中药物或产品中的用途。
本发明还涉及用于预防或治疗脑卒中的药物组合物或产品，其包括作为活性成分的知母皂苷BII和药用载体或赋形剂。
根据本发明，本发明的知母皂苷BII是以基本纯的形式使用，如知母皂苷BII的纯度≥90％。
根据本发明，本发明含知母皂苷BII的药物组合物或产品可以各种途径使用，并配制成各种剂型，如口服制剂，如片剂，胶囊，溶液，悬浮液，非肠道给予剂型，如注射剂，软膏，贴剂等。
根据本发明，知母皂苷BII(20mg/kg、40mg/kg)各组连续给药7天后，能显著降低大脑中动脉血栓形成大鼠的神经症状评分；可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞范围；40mg/kg组能明显降低脑含水量，与模型组相比有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)。
根据本发明，皮下注射肾上腺素加冰水浸泡法可致急性血瘀大鼠模型，知母皂苷BII(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)可明显降低模型大鼠高、中、低切变率下的全血粘度以及血浆粘度，与模型组相比有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)；知母皂苷BII 40mg/kg组可明显提高模型大鼠的红细胞变形能力，降低红细胞聚集指数，与模型组相比有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)。
以插线法制备脑缺血再灌注模型，通过ELISA法测定各组大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量，结果表明知母皂苷BII对脑缺血再灌大鼠的炎症反应具有明显的保护作用。
综上所述，知母皂苷BII具有防治脑卒中的作用。
具体实施例方式
下面的实施例用于进一步说明本发明，但其不意味着对本发明的任何限制。
实施例1.
知母皂苷BII对三氯化铁诱导大脑中动脉血栓形成(MCAT)大鼠缺血性脑损伤的影响一、方法1.知母皂苷BII对大脑中动脉血栓形成大鼠神经症状及脑梗塞范围的影响1.1.分组及给药实验动物随机分为6组，即MCAT模型组、假手术组、喜得镇0.6mg/kg组、知母皂苷BII 10mg/kg组、20mg/kg组、40mg/kg组，动物连续灌胃给药七天，每日给药容积为5mL/kg。第七天给药60分钟后施行手术。假手术组和MCAT模型组灌服等容积的0.5％CMC溶液。
1.2.大脑中动脉血栓栓塞性大鼠缺血性脑损伤模型的制备按Tamura及刘氏[7-8]等的方法，稍加改进。大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(0.35g/kg)麻醉，右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，于实体显微镜下，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm的骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μL的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。室温控制在24℃。假手术组除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
1.3.神经症状评分方法对试验动物在术后6h和24h，按Bederson[9]等的方法稍加改进，进行行为检测。评分标准①提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称前伸，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或兼具，记为1分。②将动物置于平面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力记为0分；如手术对侧阻力下降，记为1分。③将动物两前肢置一金属网上，观察肌张力。双侧肌张力对等且有力为0分；手术对侧前肢肌张力下降记为1分。④提鼠尾，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高，动物的行为障碍越严重。
1.4.脑梗塞范围的评定方法动物经行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃以下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC 1.5ml，1M K2HPO40.1ml，其余加水至刻度)，37℃避光温孵30分钟，取出后置于10％甲醛液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量及患侧脑重量的百分比作为脑梗塞范围(％)。
2.知母皂苷BII对大脑中动脉血栓形成大鼠脑组织含水量的影响
2.1.分组、给药及造模方法。同1。
2.2.脑组织含水量的测定方法术后24h断头取脑，左右半脑分开，用滤纸吸干表面水分，分别称量左右脑湿重，105℃烘烤48h至恒重，精确称量干重，依据下式计算脑水含量。
脑水含量＝(湿重-干重)/湿重×100％3.统计学处理实验数值以x±s表示，结果用SPSS软件统计，组间比较，进行t检验。
二、结果1.知母皂苷BII对大脑中动脉血栓形成大鼠神经症状和脑梗塞范围的影响结果见表4-1。
表4-1知母皂苷BII对大脑中动脉血栓栓塞性大鼠神经症状及脑梗塞范围的影响(x±s)
注与空白组相比，ΔΔP＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01结果表明，除假手术组外，MCAT模型组及各给药组动物均有不同程度的梗塞灶及偏瘫样症状。知母皂苷BII 20mg/kg、40mg/kg组能显著缩小模型动物的脑梗塞范围，改善神经症状(P＜0.05，P＜0.01)。
2.知母皂苷BII对大脑中动脉血栓形成大鼠脑组织含水量的影响结果见表4-2。
表4-2知母皂苷BII对大脑中动脉血栓形成大鼠脑组织含水量的影响(x±s)
注与空白组相比，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05从上表可以看出，知母皂苷BII 40mg/kg可以明显降低模型大鼠患侧脑水含量，改善脑水肿(P＜0.05)。
讨论与小结大脑中动脉血栓模型是局灶性脑缺血的常用动物模型，它可以比较客观地模拟临床脑梗塞多发于大脑中动脉这一事实，易控制局部条件，复制成功率高，且与临床脑卒中发病过程类似，血栓部位固定。结果显示，术后6h、24h动物出现偏瘫样症状，脑血栓形成侧脑含水量明显增加，TTC染色可见明显的脑梗塞灶。知母皂苷BII 20mg/kg、40mg/kg组可以明显改善大鼠神经症状，缩小脑梗塞范围，与模型组相比有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)；知母皂苷BII 40mg/kg组可以明显减轻脑水肿程度，与模型组相比有显著差异(P＜0.05)。这一结果提示该药物具有保护缺血性脑损伤的作用。
实施例2.
知母皂苷BII对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响一、方法1.分组及给药实验动物按体重随机分为6组，即模型对照组、正常对照组、尼莫地平12mg/kg组、知母皂苷BII 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg组。动物连续灌胃给药五天，每日给药容积为5ml/kg。正常对照组和模型对照组灌服等容积的0.5％CMC溶液。
2.造模方法根据毛腾敏[14]的方法，稍加改进。第五日给药后1小时，予以大鼠皮下注射肾上腺素0.8mg/kg两次，间隔4小时。并于首次注射肾上腺素后2小时，将大鼠浸泡于4℃冰水中5分钟后，取出。
3.全血粘度及血浆粘度测定末次给药后1小时，大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.35g/kg)麻醉，颈总动脉采血，以1％肝素抗凝。取肝素抗凝血0.8ml用血液粘度仪进行检测，以高切(200S-1)、中切(30S-1)、低切(5S-1)及低切(1S-1)状态时测定的血液粘度表示全血粘度；另取抗凝血以3000rpm离心8分钟，其上清液为血浆，取0.8ml血浆用血液粘度仪测试100S-1时的血浆粘度。
4.红细胞聚集性和变形性测定取肝素抗凝血40μl加红细胞变形液1ml混匀，取样0.8ml，用红细胞变形/聚集测试仪测试，以红细胞最大变形指数(MAXDI)和曲线下面积(SSS)表示红细胞变形性；另取抗凝血0.8ml，用红细胞变形/聚集测试仪测试，以红细胞最大聚集指数(MAXD)和曲线下面积(SS)表示红细胞聚集性。
5.统计学处理实验数值以x±s表示，结果用SPSS软件统计，组间比较，进行t检验。
二、结果1.知母皂苷BII对急性血瘀模型大鼠全血粘度、血浆粘度的影响结果见表10-1。
表10-1知母皂苷BII对急性血瘀模型大鼠全血粘度及血浆粘度的影响(x±s)
注与空白组相比，ΔΔP＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01结果显示，造模后24h，血瘀模型大鼠的全血粘度、血浆粘度明显升高，与正常对照组相比有明显差异(P＜0.01)；知母皂苷BII 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg组均可以明显降低模型大鼠高、中、低切变率下的全血粘度及血浆粘度(P＜0.05，P＜0.01)。
2.知母皂苷BII对急性血瘀模型大鼠红细胞聚集性和变形性的影响结果见表10-2。
表10-2知母皂苷BII对急性血瘀模型大鼠红细胞聚集性和变形性的影响(x±s)
注与空白组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01结果显示，造模后24h，与空白组相比，血瘀模型大鼠红细胞聚集指数明显增加，变形指数明显降低(P＜0.05，P＜0.01)；与模型大鼠相比，知母皂苷BII 40mg/kg组能明显升高模型大鼠的红细胞变形指数，降低红细胞聚集指数(P＜0.05，P＜0.01)。
三、讨论与小结血液流变学是研究血液的流动性、聚集性、凝固性和血细胞变形性的一门科学。缺血性脑血管病患者存在全血比粘度、血浆比粘度、红细胞聚集指数及纤维蛋白原等多项血液流变学指标的改变。因而改善血液流变学，降低血液粘度、降低红细胞聚集性、提高红细胞变形性等对缺血性脑血管病的防治具有非常重要的作用。研究中采用大鼠皮下注射大剂量肾上腺素，模拟暴怒时机体状态，以冰水浸泡模拟寒邪侵袭，迅速复制出血液呈粘、浓、凝、聚状态的急性血瘀模型。从本实验结果来看，知母皂苷BII能明显抑制急性血瘀模型大鼠红细胞聚集性、提高红细胞变形性，明显降低急性血瘀大鼠高、中、低切变率下的全血粘度和血浆粘度，说明药物具有明显的改善血液流变学作用。
实施例3.
知母皂苷BII对脑缺血再灌注大鼠脑组织炎症因子的影响以插线法制备脑缺血再灌注模型，通过ELISA法测定各组大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量，从而研究知母皂苷BII对脑缺血再灌模型大鼠炎症因子的保护作用。
一、方法1.分组及给药将大鼠按体重随机分为六组，即假手术组、模型组、尼莫地平组(12mg/kg)、知母皂苷BII.10mg/kg、40mg/kg组，药物均用0.5％CMC配制。各组动物在观察饲养两日后用于实验。先连续给药五天，每日给药容积为10ml/kg，其中假手术组和模型组灌服等量0.5％CMC，每日给药一次，于第五日晨给药一小时后进行手术造模。
2.造模方法根据Koizum and Nagasawa的方法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。将大鼠以10％水合氯醛按0.35g/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，局部皮毛消毒后手术。分离右颈总动脉(CCA)、右颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)并埋线备用，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形尼龙线(直径为0.25mm，距球端2cm处作标记，栓线前端经石蜡处理后备用)。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎尼龙线与入口处ICA段，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为18.5±0.5mm左右，实现大脑中动脉阻塞而致脑缺血。再次结扎入口处，尼龙线外留约1cm，缝合肌肉皮肤，腹腔注射硫酸庆大霉素0.4ml/只。3h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模型完成。假手术组仅结扎右侧颈总动脉，不作切口，不插线。动物入选的标准动物于缺血3h后出现对侧前肢倦曲或行走转圈或行走向对侧倾倒体征则纳入，动物无此体征或于3h后仍不清醒者剔除。
3.组织匀浆的制备动物于缺血3h再灌21h后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，然后将剩余的右侧大脑半球在4℃下以生理盐水制成10％组织匀浆。
4.IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β定量ELISA测定(1)建立标准曲线设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100ul，第一孔加标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100ul弃去，使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
(2)加样待测品孔每孔各加入待测样品150ul。
(3)将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
(4)洗板用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
(5)每孔中加入第一抗体工作液50ul，置37℃60分钟。
(6)洗板同前。
(7)每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃60分钟。
(8)洗板同前。
(9)每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。
(10)每孔加入1滴终止液混匀。
(11)在492nm处测吸光值。
5.结果计算将所有OD值都减除空白值后再行计算，以标准品1000、500、250、125、62、31、16、0PG/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线，再根据样品OD值在该曲线图上查出相应炎症因子的含量。
6.统计学处理实验数值以x±s表示，结果用SPSS软件统计，组间比较，进行t检验。
二、结果知母皂苷BII对脑缺血再灌注大鼠炎症因子的影响表 知母皂苷BII对缺血再灌大鼠IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量的影响(x±s)
注与假手术组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实验结果表明，与假手术组相比，脑缺血再灌模型组大鼠脑组织中前炎症因子IL-1β、TNF-α的含量明显增高，保护性炎症因子IL-10、TGF-β的含量亦明显增高，且差别具有显著性意义；阳性药尼莫地平及知母皂苷BII 40mg/kg组均能明显降低诸炎症因子的含量，对脑缺血再灌大鼠的炎症反应具有明显的保护作用。
权利要求
1.知母皂苷BII在制备用于预防或治疗脑卒中(脑中风)的药物或产品中的用途。
2.权利要求1所述的知母皂苷BII的用途，其特征在于所述知母皂苷BII的纯度为≥90％。
全文摘要
本发明涉及知母皂苷BII在制备用于防治脑卒中(脑中风)药物或产品中的用途。实验证明，知母皂苷BII可明显改善局灶性脑缺血大鼠神经症状，缩小脑梗塞范围，减轻脑水肿程度；明显改善模型动物的血液流变性、减轻脑缺血所致炎性损伤等。
文档编号A61K31/704GK1692908SQ20051005946
公开日2005年11月9日 申请日期2005年3月25日 优先权日2004年4月29日
发明者马百平, 徐秋萍, 赵阳, 熊呈琦, 谭大维 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所