专利名称：人源抗呼吸道合胞病毒中和性基因工程Fab抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程和生物制药技术领域。
背景技术：
本发明涉及预防和治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性针对呼吸道合胞病毒的基因工程单克隆抗体。
呼吸道合胞病毒(RSV)是世界及我国范围内婴幼儿下呼吸道感染尤其是严重下呼吸道感染(肺炎、毛细支气管炎)的最重要病原，也是免疫抑制病人及老年人呼吸道感染的主要危险因素。在全世界每年可引起650万婴幼儿发病，100万人死亡。然而对于由RSV引起的严重感染尚无特异有效的药物治疗，长期以来人们一直致力于用具有高滴度中和抗体血浆中提炼而成的人IgG预防和治疗RSV感染，虽然证实了抗体预防和治疗RSV感染的作用[2，3]，但由于伴随的血源感染等问题而使这种血制品正逐渐被人单克隆抗体所替代。
1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术的问世，为所有需要制备和使用特异性抗体的研究领域提供了全新的手段，是免疫学乃至医学上的一个里程碑。但由于杂交瘤技术筛选制备人单抗存在难度大，成功率低，选择范围小，表达细胞系不稳定，抗体滴度低、费用昂贵等不足之处，并且即使是将其人源化程度达到最高也只是达到了90％的人源化，剩余的鼠源性高变区在抗体长期应用中也会产生严重的人抗鼠抗体排斥反应，导致抗体治疗效价减低或失效，甚至还会给患者带来严重的副反应。随着分子生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，特别是80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源基因工程单克隆抗体的开发研究取得突破性进展并由基础研究阶段步入了实质性应用研究和开发阶段。噬菌体抗体库技术与DNA重组技术相结合，使单克隆抗体的制备可以绕过杂交瘤途径，甚至不经过免疫就可以完成。人们可以通过在分子基因水平上对抗体进行随意重组，获得各种形式的特异性鼠源和人源抗体以及一些用常规方法难以获得的人单抗；并能在基因水平控制抗体的表达水平、提高抗体的特异性和亲和力；尤其是所获得的全分子抗体，具有人体内天然抗体的各种特性，克服了鼠源性单克隆抗体发挥ADCC与CDC作用的时间较短等等鼠源性单克隆抗体的弱点，并且无免疫源性。此技术简单易行，稳定有效。使原本非常困难、耗时耗财耗力的人源抗体的研究大大加快了进程。从而越来越显示出单克隆抗体在基础研究、实验室诊断、临床治疗和预防的应用价值和开发前景。
作为一类新兴起的生物工程药，人源抗病毒基因工程抗体以其对人体无免疫原，无污染源，特异性抗病毒疗效及连续规模生产可行性等优势逐渐成为预防和治疗病毒疾病的一类有实际运用前景的新产品。在美国FDA批准上市67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体就有9种，等待批准的抗体有三十多种。抗RSV F蛋白抗原表位的人源化单克隆抗体Palivizumab(PZ)作为惟一一个预防人类感染性疾病的人源化单克隆抗体已于美国在临床上使用，是已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源基因工程抗体之一，其商品名为“SynagisTM″。在美国运用噬菌体表面表达技术获得的人源抗RSV F蛋白基因工程单克隆抗体是人源抗病毒基因工程抗体的研究中最成功的例子。除此之外，噬菌体抗体库技术和DNA重组技术的联合运用，已成功研制的人源抗病毒抗体还有人获得性免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、丙肝病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、流感病毒等。因此，作为特异性抗病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一，抗RSV抗体制剂研制成功，将为国内首创，有可能获一类新药证书。
本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出中和性抗RSV的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。
发明内容
本发明是通过基因工程手段结合运用噬菌体表面表达技术，直接从人抗体基因库中筛选出的2株抗呼吸道合胞病毒的基因工程单克隆抗体Fab段基因，获得此抗体基因及其在原核细胞中的表达，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行的特异性抗体药物。
本发明陈述的人源抗RSV基因工程Fab抗体包括(1)是一种人源的在原核细胞中获得稳定有效表达的重组IgG Fab抗体，由重链δ和轻链Kappa链组成，分别命名为RSVFab58和RSVFab88。
(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区域(Complementarity-Dertemining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。
(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗RSV抗体基因库的特异性富集筛选获得，轻链和重链相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。
(4)特异性识别RSV纯化抗原，并具有潜在的抗RSV感染的中和活性。
(5)利用上述获得的Fab抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞和重组病毒系统中表达此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的其他基因，获得对RSV感染具有中和活性的抗体产物。
利用传统的杂交瘤细胞技术获得鼠源单克隆抗体的制备已非常成熟。但该技术用于制备人源单克隆抗体难度大，细胞系通常不稳定，长期传代易于丢失抗体基因。本发明所陈述的人源抗RSV基因工程Fab抗体，是在获得抗体基因的基础上获得基因的表达产物，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并可根据不同需要任意改建抗体基因，从而获得一种可行的临床预防和治疗用的抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。在这些实施例中，为说明本发明，采用的噬菌体表达载体为pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。
所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司)。所用噬菌体为商品化产品VCSM13(美国Invitrogene公司)。呼吸道合胞病毒为首都儿科研究所病毒室保存、传代的Long株，为对外公开性毒株。
实施例1-4为人源抗RSV基因工程Fab抗体RSVFab58和RSVFab88的筛选制备方法；实施例5为人源抗RSV基因工程Fab抗体RSVFab58和RSVFab88的基因特征；实例6-7为人源抗RSV基因工程Fab抗体RSVFab58和RSVFab88的蛋白及功能特征。
实例1人源IgG Fab段基因的PCR扩增用淋巴细胞分离液从RSV感染病儿(经病毒分离和双份血清抗体测定确定)恢复期收集的抗凝血中分离淋巴细胞，用TriZol(美国Gibco，BRL)提取总细胞RNA，用Olig-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco，BRL)逆转录成cDNA，用一组特异性IgG Fab Gamma链、Kampa链及Lamda链引物(引物序列见文献“人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达”病毒学报1997年12月第13卷第4期297-308页，表1)，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94℃1分钟，54℃1分钟、72℃2分钟，35个循环(PE480)，上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱Spin-X(美国Gibco，BRL)纯化后，获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物。
实例2噬菌体抗体基因库的建立将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻、重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu，(电转条件为Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37℃1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液，37℃1小时，加入80-100ml前述SB，37℃2小时后加入辅助噬菌体VCSM131×1012PFU/ml，1小时后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃摇床培养过夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌体上清，经9000rpm，20分钟，4℃离心后，用2ml 0.02M PBS PH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20℃冰柜中。
实例3用于抗体库富集筛选的RSV抗原的制备呼吸道合胞病毒在Hep-2细胞上培养直到细胞出现病变达到“++++”后收获，按文献(Crowe J.E.J.，P.T.Bui，A.R.Davis，et al.Afurther attenuated derivative of a cold-passaged temperature-sensitive mutant of humanrespiratory syncytial virus retains immunogenicity and protective efficacy against wild-typechallenge in seronegative chimpanzees.Vaccine，1994，12783-790.)方法通过蔗糖垫层超速离心纯化RSV抗原，纯化后的RSV抗原可直接用于包被ELISA板。
实例4富集筛选采用纯化的RSV抗原包被ELISA板，对上述建立的人抗RSV抗体库进行了6轮富集筛选。我们对每轮筛选后随机挑取的克隆进行了限制性内切酶切鉴定分析。用Xbal/Xhol酶切后，有轻重链基因插入的克隆应切出大小约为2.4Kb及3.0Kb两条带。随筛选轮数的增加，具有RSV特异性的噬菌体得到了高度富集。
实例5人IgG Fab抗体RSVFab58和RSVFab88的可变区基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit(美国Qiagen)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序为自动测序。RSVFab58和RSVFab88确定为不同的序列。所获序列均用DNA Strider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理，并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实为人源抗RSV基因工程Fab抗体，RSVFab58和RSVFab88基因由人IgGδ链和Kappa链组成，其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成，即VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3和VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3。序列资料如附图，是抗体RSVFab58和RSVFab88的可变区基因的核酸序列和氨基酸序列。
实例6将带有RSVFab58和RSVFab88抗体轻重链基因插入的阳性克隆接种SB细菌培养液，当细菌长至OD＝0.2-0.3时，加入1mM IPTG，在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液10倍浓缩量的PBS(0.02M PH7.4)悬起，反复冻融3次，高速离心后其上清即为表达的Fab抗体。
实例7采用噬菌体表面呈现技术从上述所建立的呼吸道合胞病毒特异性噬菌体抗体基因库中筛选到了2株抗RSV Fab抗体基因RSV fab58和RSV Fab88，用ELISA方法对其原核表达产物进行抗原结合检测，确定为特异性抗RSV抗体。
总而言之，本发明陈述的人源抗RSV基因工程抗体，是在获得抗体基因的基础上获得抗体基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，能够特异性识别RSV抗原。因此正在通过进一步的工作，包括对所获得的特异性抗体作进一步的功能性验证，利用噬菌体库技术制备的抗体与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征，制备抗体制剂，可望能为临床提供特异有效而副作用小的抗体药物用于预防和治疗由呼吸道合胞病毒感染引起的严重下呼吸道感染。
附图为RSVFab58和RSVFab88轻重链可变区由核甘酸序列及推导的氨基酸序列，包括抗体可变区的框架区(FR)和高变区(CDR)。
权利要求
1.人源抗RSV基因工程抗体，其特征在于(1)为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的2株基因重组的人源抗RSV基因工程单克隆抗体Fab抗体，分别命名为RSVFab58和RSVFab88，均由δ链和Kappa链组成。(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如摘要附图。(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗RSV抗体基因库的特异性富积筛选表达获得，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列重链CDR1区氨基酸序列为RSV58SNSAA，RSVFab88SNSAA CDR2区为RSV58LGRTYYRSKWYNDYAVS，RSV88LGRTYYRSKWYNDYAVS；CDR3区为RSV58YCAREGRSSSWHPRYGMDV，RSV88YCARRYSSGWWLKDAFDI。其轻链CDR1区氨基酸序列为RSVFab58SCRAS，RSVFab88SSSYL；CDR2区为RSV58DASSRATGIPDRFSGSG，RSV88GASSRATGIPDRFSGSG；CDR3区为RSV58CQQYDGSAFTSGPGTKVDIR，RSV88CQQYGSSPRTFGQGTKLEIK。(4)特异性识别纯化的RSV抗原。
2.人源抗RSV基因工程Fab抗体的用途，其特征在于利用上述获得的Fab抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及重组病毒系统中表达此抗体基因或以此为基础进行改建的基因，获得具有中和RSV感染的抗体产物。
3.根据权利要求1人源抗RSV基因工程Fab抗体，其特征在于编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源抗RSV抗体基因，可被用于在原核细胞、酵母细胞、真核细胞和重组病毒表达系统中表达抗RSV的中和抗体或多肽产物。
4.根据权利要求1人源抗RSV基因工程Fab抗体，其特征在于编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源抗RSV抗体基因，其核苷酸序列或由此产生的氨基酸序列可被用于表达抗RSV中和性抗体或多肽产物。
5.根据权利要求1人源抗RSV基因工程Fab抗体，其特征在于所述抗体具有特异性识别RSV蛋白上的抗原并与之相结台，从而具有潜在的阻断呼吸道合胞病毒感染的功能。
全文摘要
人源抗呼吸道合胞病毒基因工程抗体，包括2株Fab段抗体基因、基因产物及其应用。其特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合呼吸道合胞病毒的功能性抗体，命名为RSVFab58；RSVFab88。其今后的可能用途在于利用上述获得的Fab抗体或IgG全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中产生此抗体，可在临床上预防或治疗由呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道感染尤其是严重下呼吸道感染(肺炎、毛细支气管炎)。
文档编号A61P31/00GK1986569SQ20051013243
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者钱渊, 梁米芳, 肖玮 申请人:首都儿科研究所, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所