用于诊断非小细胞肺癌的方法

专利名称：用于诊断非小细胞肺癌的方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体涉及癌症治疗和诊断领域。尤其，本发明涉及利用在所述癌细胞中呈现提高的表达的基因KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1诊断非小细胞肺癌的方法。
背景技术：
肺癌为一种最普遍的致死性人肿瘤。已报道了与肺癌的发展和进展有关的许多遗传改变。虽然遗传变化有助于预后的努力和对转移的风险或对某些治疗的应答的预测，有关单个或有限数目的分子标记的信息通常未能提供用于非小细胞肺癌(NSCLC)临床诊断的令人满意的结果(Mitsudomi等.，Clin Cancer Res 64055-63(2000)；Niklinski等.，Lung Cancer.34 Suppl2S53-8(2001)；Watine，BMJ 320379-80(2000))。到目前为止NSCLC为最常见的形式，几乎占肺肿瘤的80％(Society，A.C.Cancer Facts and Figures2001(2001))。尽管多-模式治疗有最新的进展，总的10年存活率仍低达10％，因为大部分NSCLC直到晚期阶段才诊断出来(Fry，W.A.等.，Cancer861867-76(1999))。尽管考虑基于铂的化疗法被认为是用于NSCLC治疗的参照标准，那些药物仅能延长患有晚期NSCLC的患者存活约六周(Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group，BMJ.311899-909(1995))。许多靶向治疗正被研究以用于该疾病，包括酪氨酸激酶抑制剂，但至今仅在有限数目的患者中取得有希望的效果且一些接受者遭受严重的不良反应(Kris M.N.R.，Herbst R.S.Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.21292a(A1166)(2002))。
已报道了与肺癌的发展和进展有关的许多遗传改变，但精确的分子机制仍不清楚(Sozzi，G.Eur.J.Cancer 3763-73(2001))。最近十年已出现包括紫杉醇、多烯紫杉醇、吉西他滨和长春瑞宾在内的新开发的细胞毒试剂以提供患有晚期NSCLC患者多种治疗选择；然而，每种新疗法与基于顺氯氨铂的疗法相比仅可稍微改善存活(Schiller，J.H.等.，N.Engl.J.Med.34692-98(2002)；Kelly，K.等.，J.Clin.Oncol.193210-3218(2001))。由此，新的治疗策略，如分子-靶向试剂的开发，是临床医师急切等待的。
数以千计的基因在cDNA微阵列上表达水平的系统分析是鉴定参与致癌作用途径的未知分子的有效方法(Kikuchi，T.等.，Oncogene 222192-2205(2003)；Kakiuchi，S.等.，Mol.Cancer Res.1485-499(2003)；Zembutsu，H.等.，Int.J.Oncol.2329-39(2003)；Suzuki，C.等.，Cancer Res.637038-7041(2003))并且可揭示用于新的抗-癌药物和肿瘤标记物开发的候选靶标。为了分离用于NSCLC诊断、治疗和预防的新的分子靶标，通过激光-捕获显微解剖从37个癌组织制备纯的肿瘤细胞群并且在含有23,040个基因的cDNA微阵列上分析NSCLC细胞的基因组范围内的表达分布型(Kikuchi，T.等.，Oncogene 222192-2205(2003))。在那些实验过程中，KOC1(GenBank登录号NM_006547)和neuromedin U(NMU；GenBank登录号NM_006681)被鉴定为肺肿瘤中常常过表达并且对于NSCLC细胞的生长必不可少的基因。
细胞-至-细胞的通讯是多细胞机体发育和维持的前提。早就观察到植物细胞中的一些细胞间信息-交换系统如化学突触、间隙连接和胞间连丝，但哺乳动物细胞中仅在最近报道了细胞间包含高灵敏的纳米管(nanotubular)结构，隧道纳米管(tunneling nanotube)(TNT)的新的转运系统(Rustom，A.等.，Science 303，1007-1010(2004)。所述结构促进膜囊和细胞器的选择性转移；因此如在植物中一样，哺乳动物体细胞中的TNT可通过运载转录因子或核糖核粒子(RNP)而促进细胞-至-细胞的转运系统(Nakajima，K.等.，Nature 413，307-311(2001)；Lucas，W.J.等.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2，849-857(2001))。一些研究者已证明了哺乳动物体细胞内的一些RNA-结合蛋白和马达蛋白如驱动蛋白和动力蛋白间的相互作用，以及哺乳动物生殖细胞中的细胞间mRNA转运(Brendza，R.P.等.，Science 289，2120-2122(2000)；Chennathukuzhi，V.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，15566-15571(2003)；Villace，P.等.，Nucleic Acids Res.32，2411-2420(2004).；Morales，C.R.等.Dev.Biol.246，480-494(2002))。然而，还没有报道描述涉及RNA-结合蛋白和马达蛋白复合物的哺乳动物体细胞中细胞间mRNA的转运系统。
已在卵母细胞和果蝇以及非洲蟾蜍的发育胚胎，及体细胞如成纤维细胞和神经元中报道了mRNA定位现象(King，M.L.等.，Bioessays 21546-557(1999)；Mowry，K.L.，Cote，C.A.FASEB J.13435-445(1999)；Lasko，P.J.Cell Biol.150F51-56(2000)；Steward，O.Neuron 189-12(1997))。β肌动蛋白(ACTB)mRNA定位于鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的前导层(leadinglarnellae)(Lawrence，J.B.，Singer，R.H.Cell 45407-415(1986))以及发育神经元的生长锥(Bassell，G.J.等.，J.Neurosci.18251-265(1998))。ACTBmRNA的定位取决于zipcode，一种位于mRNA 3’UTR的顺式作用元件(Kislauskis，E.H.等.，J.Cell Biol.123165-172(1993))。反式-作用因子，zipcode结合蛋白1(ZBP1)，用ACTB mRNA的zipcode亲和纯化(Ross，A.F.等.，Mol.Cell Biol.17，2158-2165(1997))。鉴定ZBP1后，在大量生物体包括非洲蟾蜍、果蝇、人和小鼠中鉴定了另外的同系物(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 142729-2733(1997)；Deshler，J.O.等.，Science 2761128-1131(1997)；Doyle，G.A.等.，Nucleic Acids Res.265036-5044(1998))。ZBP1家族成员在生殖胚胎成纤维细胞中和一些类型的癌症中表达(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 142729-2733(1997)；Mueller，F.等.，Br.J.Cancer 88；699-701(2003))。ZBP1样蛋白包含位于该蛋白质NH2-末端部分的两个RNA-识别基序(RRM)以及位于COOH-末端的四个hnRNPK同源(KH)结构域。
KOC1(别名IGF-II mRNA-结合蛋白3IMP-3)为IMP(IMP-1、IMP-2和IMP-3)的一种，其属于ZBP1家族成员并且呈现与IGF-II前导3mRNA以及与相互印记(reciprocally imprinted)的H19 RNA的多重附着(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 142729-2733(1997))。虽然KOC1为最先报道在胰腺癌中过表达(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 142729-2733(1997)；Mueller，F.等.，Br.J.Cancer 88699-701(2003))，其在癌细胞中或甚至在正常哺乳动物体细胞中的精确功能仍不清楚。
KOC1与非洲蟾蜍Vg1 RNA-结合蛋白(Vg1RBP/Vera)定向进化同源，其在卵母细胞成熟期间介导Vg1 mRNA定位至卵母细胞的营养极，并且IMP-1与ZBP1定向进化同源。IMP主要位于胞质并且其细胞分布从以独特浓度集中在核周区域和片状足中，一直到完全离域(delocalized)的模式都有。H19RNA与IMP共-定位，并且该高-亲和力附着位点的除去导致截短的RNA的离开原位(Runge，S.等.，J.Biol.Chem.27529562-29569(2000))，提示IMP参与RNA的胞质转运。IMP-1能与微管联合(Nielsen，F.C.等.，J.Cell Sci.1152087-2097(2002)；Havin，L.等.，Genes Dev.121593-1598(1998))，并且很可能涉及马达蛋白如驱动蛋白、肌球蛋白和动力蛋白。另一方面，Oskar mRNA定位至后极需要驱动蛋白I(Palacios，I.M.，St.Johnston D.Development 1295473-5485(2002)；Brendza，R.P.等.，Science2892120-2102(2000))。
KIF11(别名EG5)为驱动蛋白家族的成员，并且在建立和/或确定细胞分裂期间形成的特定微管排列的稳定性中起作用。该作用可包括KIF 11影响与细胞分裂有关的其他蛋白质组分分布的能力(Whitehead，C.M.，Rattner，J.B.J.Cell Sci.1112551-2561(1998)；Mayer，T.U.等.，Science 286971-974(1999))。
NMU为第一个从猪脊髓分离的神经肽。其对平滑肌具有强烈活性(Minamino，N.等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1301078-1085(1985)；Domin，J.等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1401127-1134(1986)；Conlon，J.M.等.，J.Neurochem.51988-991(1988)；Minamino，N.等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.156355-360(1988)；Domin，J.等.，J.Biol.Chem.26420881-20885(1989)，O’Harte，F.等.，Peptides 12809-812(1991)；Kage，R.等.，Regul.Pept.33191-198(1991)；Austin，C.等.，J.Mol.Endocrinol.12257-263(1994)；Fujii，R.等.，J.Biol.Chem.27521068-21074(2000))，并且在哺乳动物物种中NMU主要分布于胃肠道和中枢神经系统中(Howard，A.D.等.，Nature 40670-74(2000)；Funes，S.等.，Peptides 231607-1615(2002))。NMU的外周活性包括平滑肌的刺激、血压升高、消化道中离子转运的改变和喂食的调节(Minamino，N.等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1301078-1085(1985))；然而，没有阐明致癌作用期间NMU的作用。神经肽在外周作为旁分泌和自分泌因子起作用而调节各种生理过程并且充当神经系统中的神经递质或神经调质。通常，通过结合神经肽而介导传递信号的受体为具有七个跨膜结构域的G蛋白-偶联受体(GPCR)的超家族成员。两种已知NMU受体，NMU1R和NMU2R，显示与其他神经肽受体如GHSR和NTSR1的高度同源性，后两者相应的已知配体分别为Ghrelin(GHRL)和神经降压素(NTS)。如视紫质GPCR家族的其他成员一样，NMU1R(FM3/GPR66)和NMU2R(FM4)具有包含高度保守基序的七个预测的α-螺旋跨膜结构域(Fujii，R.等.，J.Biol.Chem.27521068-21074(2000)；Howard，A.D.等.，Nature 40670-74(2000)；Funes，S.等.，Peptides 231607-1615(2002))。
NMU蛋白的C-末端天冬酰胺结构和C-末端的hepatapeptide核为其在平滑肌细胞中的收缩活性所必需的(Westfall，T.D.等.，J.Pharmacol.Exp.Ther.301987-992(2002)；Austin，C.J.Mol.Endocrinol.14157-169(1995))。最近的研究提出证据，即NMU在下丘脑水平作用而抑制食物摄入；因此该蛋白质可以是进食和体重的生理调节剂(Howard，A.D.等.，Nature 40670-74(2000)；Maggi，C.A.等.，Br.J.Pharmacol.99186-188(1990)；Wren，A.M.等.，Endocrinology143227-234(2002)；Ivanov，T.R.等.，Endocrinology 1433813-3821(2002))。然而，至今没有报道提示致癌作用中涉及NMU的过表达。
设计用来揭示致癌作用机理的研究促进了抗-肿瘤剂的分子靶标的鉴定。例如，最初开发以抑制与Ras有关的生长-信号途径的法尼基转移酶抑制剂(FTI)(其活化取决于翻译后的法尼基化)已有效用于治疗动物模型中Ras-依赖的肿瘤(He等.，Cell 99335-45(1999))。利用抗-癌药物和抗-HER2单克隆抗体trastuzumab的组合对人进行的临床试验已在进行，以用于拮抗原癌基因受体HER2/neu；并且已取得临床反应和乳癌患者的总存活率的改善(Lin 等.，Cancer Res.616345-9(2001))。酪氨酸激酶抑制剂，STI-571，其选择性灭活bcr-abl融合蛋白，已开发用以治疗慢性髓细胞性白血病，在这种疾病中bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化在白细胞转化中起着关键作用。这些种类的试剂设计用来抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita等.，Cancer Res.617722-6(2001))。因此，癌细胞中普遍上调的基因产物可用作潜在靶标用以开发新的抗癌剂。
已证实CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别存在于I类MHC分子上的源自肿瘤-相关抗原(TAA)的表位肽，并且裂解肿瘤细胞。自从发现作为TAA第一个例子的MAGE家族，已利用免疫方法发现了许多其他的TAA(Boon，Int.J.Cancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J.Exp.Med.183725-9(1996)；van der Bruggen等.，Science 2541643-7(1991)；Brichard等.，J.Exp.Med.178489-95(1993)；Kawakami等.，J.Exp.Med.180347-52(1994))。一些已发现的TAA目前处于作为免疫疗法靶标的临床开发阶段。至今发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen等.，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等.，J.Exp.Med.180347-52(1994))，SART(Shichijo等.，J.Exp.Med.187277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941914-8(1997))。另一方面，已被证实在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物被显示作为诱导细胞免疫应答的靶标而识别。所述基因产物包括p53(Umano等.，Brit.J.Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等.，Brit.J.Cancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等.，Int.J.Cancer 8092-7(1999))，等等。
尽管关于TAA在基础和临床研究中有重要进展(Rosenbeg等.，NatureMed.4321-7(1998)；Mukherji等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928078-82(1995)；Hu等.，Cancer Res.562479-83(1996))，仅可得到有限数目的用于癌症治疗的候选TAA。TAA在癌细胞中大量表达，并且同时其表达只限于癌细胞中的TAA将作为免疫治疗靶标的有希望的候选者。此外，诱导强有力和特异性的抗癌免疫应答的新TAA的鉴定预计可促进各种类型癌症中肽接种策略的临床用途(Boon and can der Bruggen，J.Exp.Med.183725-9(1996)；van der Bruggen等.，Science 2541643-7(1991)；Brichard等.，J.Exp.Med.178489-95(1993)；Kawakami等.，J.Exp.Med.180347-52(1994)；Shichijo等.，J.Exp.Med.187277-88(1998)；Chen 等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941914-8(1997)；Harris，J.Natl.Cancer Inst.881442-5(1996)；Butterfield等.，Cancer Res.593134-42(1999)；Vissers等.，Cancer Res.595554-9(1999)；van der Burg等.，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等.，Cancer Res.574465-8(1997)；Fujie等.，Int.J.Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等.，Int.J.Cancer 81459-66(1999)；Oiso等.，Int.J.Cancer 81387-94(1999))。
已重复报道来自某些健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对该肽应答而产生显著水平的IFN-γ，但在51Cr-释放测定法中很少以HLA-A24或-A0201限制性方式对肿瘤细胞产生细胞毒性(Kawano等.，Cancer Res.603550-8(2000)；Nishizaka等.，Cancer Res.604830-7(2000)；Tamura等.，Jpn.J.Cancer Res.92762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201两者为日本人、以及白种人中的一种常见HLA等位基因(Date等.，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等.，J.Immunol.1554307-12(1995)；Kubo等.，J.Immunol.1523913-24(1994)；Imanishi等.，Proceedingof the eleventh International Histocompatibility Workshop and ConferenceOxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等.，Tissue Antigen49129(1997))。因此，通过这些HLA呈递的癌的抗原性肽尤其可用于日本人和白种人当中的癌症治疗。此外，众所周知体外低-亲和力CTL的诱导通常由使用高浓度肽而产生，在抗原呈递细胞上(APC)生成高水平的特定肽/MHC复合物，而APC将有效活化这些CTL(Alexander-Miller等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934102-7(1996))。
虽然用于癌症治疗的分子-靶标药物的开发取得进展，有响应的肿瘤类型的范围以及治疗有效性仍非常有限。由此，开发新的抗癌剂很迫切，其针对对恶性细胞具高特异性的分子并且很可能引起最低的或没有不良反应。为了实现该目标，需要鉴定已很好地确定了其生理机理的分子。针对这些目标的有效策略将根据cDNA微阵列上获得的遗传信息筛选癌细胞中上调基因与通过用RNAi系统诱导功能丧失表型而高-通量筛选其对细胞生长的作用相结合(Kikuchi，T.等.，Oncogene 222192-2205(2003))。
发明概要本发明提供通过确定非小细胞肺癌-相关基因的表达水平而诊断或确定受试者中非小细胞肺癌(NSCLC)易感性的方法，所述非小细胞肺癌-相关基因选自源自患者的生物样品中的KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1。其中任何基因相比该基因正常对照水平表达水平的提高表明受试者患有NSCLC或正处于发生NSCLC的风险中。
本发明还提供给予为诊断患有NSCLC的患者提供预后的方法。尤其，该方法包括检测KOC1、KIF11或结合KIF11表达的KOC1的表达。
“正常对照水平”指正常、健康个体中或已知未患NSCLC的个体群体中检测的任何基因的表达水平。对照水平为源自单个对照群体或来自多个表达模式的单一表达模式。与“正常对照水平”相反，“对照水平”为其疾病状态的背景已知的(即，癌性的或非-癌性的)个体或个体群体中检测的基因的表达水平。因此，对照水平可基于正常、健康个体中，已知未患NSCLC的个体群体中，NSCLC患者或患者群体中的基因表达水平而确定。对应于非小细胞肺癌患者或患者群体中该基因表达水平的对照水平称为“NSCLC对照水平”。此外对照水平可以为来自之前检测过的细胞的表达模式数据库。
生物样品中检测的基因KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的任何一种表达水平相比正常对照水平的提高表明受试者(从其获得样品)患有NSCLC。或者，生物样品中任何一种或所有基因的表达水平可以与同一基因的NSCLC对照水平相比较。
基因表达相比对照水平提高或降低10％、25％、50％或更多。或者，基因表达相比对照水平提高或降低1倍、2倍、5倍或更多倍。通过例如在芯片或阵列上检测NSCLC基因探针与患者来源的生物样品的基因转录本杂交而测定表达。患者-来源的生物样品可以是源自受试者，例如已知患有或疑是患有NSCLC的患者的任何样品。例如，生物样品可以是包含唾液、血液、血清、血浆或肺细胞的组织。
本发明还提供包括选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的两个或更多个基因的基因表达水平模式的非小细胞肺癌参照表达分布型。
本发明还提供包括两种或多种检测试剂的试剂盒，其检测选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的一种或多种基因的表达(例如，通过检测mRNA和多肽)。还提供了结合选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的一种或多种基因的多核苷酸阵列。本发明的试剂盒还可包含用于检测用于NSCLC预后的KIF11和KOC1表达的试剂。本发明还提供检测用于调节RNA转运活性的化合物的试剂盒。试剂盒可包括表达KIF11多肽，或功能等同物、KOC1多肽或功能等同物和所转运的RNA以及DCTN1的细胞。本发明的试剂盒还可用于筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物。试剂盒可包括KOC1多肽或功能等同物，以及由KOC1多肽或功能等同物结合的RNA。
本发明进一步提供通过将表达NSCLC-相关基因的检测细胞与检测化合物接触并且确定NSCLC-相关基因表达水平而鉴定抑制NSCLC-相关基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1)表达水平的化合物的方法。检测细胞可以是NSCLC细胞。与该基因正常对照水平相比表达水平降低表明检测化合物为NSCLC-相关基因的表达或功能的抑制剂。因此相比对照水平，如果化合物抑制KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的表达水平，则该化合物预计降低NSCLC的症状。
另外，本发明提供筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法。该方法包括将选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的多肽与检测化合物接触，并且选择结合该多肽或抑制该多肽生物学活性的检测化合物。本发明进一步提供筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，其包括将检测化合物与表达KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白或导入包含在报告基因上游的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因转录调控区的载体的细胞接触，并且随后选择降低KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白或由报告基因编码的蛋白质表达水平的检测化合物的步骤。根据这些筛选方法，相比对照水平抑制生物学活性或表达水平的检测化合物预计降低NSCLC的症状。此外，本发明提供筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，其中检测KIF11与KOC1，或GHSR1b或NTSR1与NMU之间的结合。抑制KIF11和KOC1，或GHSR1b或NTSR1和NMU之间结合的化合物预计降低NSCLC的症状。
我们检测了肺癌中新的细胞内和细胞间RNA-转运系统，包括KOC1和KIF11的反式激活。肺肿瘤中这两种分子的复合物能结合编码已知在细胞间粘附、癌细胞发展和肿瘤发生中起作用的蛋白质的mRNA，并且通过特细的细胞间结构将其转运至邻近的细胞。尤其，这里提供的证据表明KOC1在KOC1的N末端RRM结构域中结合KIF11。此外，这里提供的证据显示通过显性负性KOC1突变体抑制它们的结合有效地抑制NSCLC细胞的体外生长。例如，包含RRM结构域的KOC1片段(或编码它们的核酸)可用作显性负性片段以抑制细胞增殖并且因此治疗癌症。另外，该KOC1片段可包括核糖核蛋白K-同源的(KH)结构域。
本发明还提供鉴定调节RNA转运活性的多肽和其他化合物的方法。例如，可通过将具有KIF11多肽或其功能等同物的多肽与可在适于RNA转运的条件下由KIF11转运的RNA接触而检测多肽的RNA转运活性。另外，可通过将具有KIF11多肽或其功能等同物的检测试剂与可在适于RNA转运的条件下由KIF11转运的RNA接触而检测调节RNA转运活性的试剂。通过检测试剂抑制KOC1多肽或功能等同物与RNA(所述RNA由KOC1，或KOC1和KIF11的复合物结合)之间结合的能力而检测可用于治疗NSCLC的试剂。
肺癌组织微阵列的免疫组织化学分析证实KOC1和KIF11的反式激活与肺癌患者预后差明显有关。
还提供用于治疗或预防NSCLC的方法和用于所述方法的组合物。治疗方法包括通过给予受试者降低KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达的反义RNA、短的干扰RNA(siRNA)或核酶的组合物，或包含结合并且抑制由所述基因编码的多肽功能的抗体或其片段的组合物而治疗或预防受试者中NSCLC的方法。本发明的组合物还可包括显性负性的KOC1突变体(或编码它的核酸)，其包括含有一个或多个KOC1 RRM结构域和/或KH结构域的KOC1片段。
本发明还包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者中NSCLC的方法通过给予受试者含有由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的多肽或该多肽的免疫活性片段的疫苗而进行。免疫活性片段为长度比全长的天然存在的蛋白质短并且其导入体内时诱导免疫应答的多肽。例如，免疫活性片段包括至少8个残基长度的多肽，其在体内刺激免疫细胞如T细胞或B细胞。免疫细胞的刺激可通过检测细胞增殖、细胞因子(例如，IL-2)的加工或抗体的产生而测量。
其他的治疗方法包括其中给予通过本发明的筛选方法选择的化合物的方法。
本发明还包括包含有义链和反义链的双链分子。有义链包括对应于包含在KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因mRNA内靶序列的核糖核苷酸序列，而反义链为有义链的互补序列。本发明的所述双链分子可用作针对KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的siRNA。此外，本发明涉及编码本发明双链分子的载体。
本申请还提供利用针对KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的任何反义多核苷酸或siRNA，或结合由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的多肽的抗体治疗和/或预防NSCLC的组合物。其他组合物包括含有通过本发明的筛选方法选择的化合物作为活性组分的组合物。
可理解的是上述发明概要及其后的详细说明均为优选的实施方案，而不是本发明或本发明其他可选实施方案的限制。
附图简述

图1显示证实KOC1和KIF11之间关系的照片。
(a)描述了证实KOC1和KIF11之间相互作用的KOC1和KIF11免疫共沉淀的结果。A549细胞用Flag-标记的KIF11和myc-标记的KOC1瞬时共转染，与抗-Flag M2琼脂糖免疫沉淀，并且随后用抗-myc抗体免疫印迹。相反，利用相同的载体和细胞组合，该细胞与抗-myc琼脂糖免疫沉淀并且用抗-Flag M2抗体免疫印迹。对应于免疫印迹蛋白的条带仅在两种构建体均共转染的时候发现。
(b)描述了显示KOC1和KIF11共定位的免疫细胞化学染色结果。COS-7细胞用FLAG-标记的KIF11和myc-标记的KOC1瞬时转染，并且利用FITC-标记的抗-FLAG抗体和若丹明标记的抗-myc抗体主要在胞质中检测其共定位。
(c)描述了来自肺癌细胞系A549和LC319提取物的内源性KOC1和KIF11交互免疫共沉淀的结果。(上图)两种细胞提取物与抗-KOC1抗体的免疫沉淀的Western-印迹分析，在免疫沉淀物中检测到KIF11蛋白。(下图)提取物与抗-KIF11抗体免疫沉淀的Western-印迹，在免疫沉淀物中检测到KOC1蛋白。
图2显示证实肺肿瘤和正常组织中KOC1和KIF11共活化的照片。
(a)描述了检查NSCLC和相应的正常肺组织临床样品中KOC1和KIF11表达的QRT-PCR结果。Y轴表明两种基因(KOC1或KIF11/ACTB)的相对表达率。
(b)描述了检查20种肺癌细胞系当中KOC1和KIF11表达的QRT-PCR结果。
(c)描述了检测正常人组织中KOC1和KIF11表达的Northern-印迹分析结果。
图3显示证实KOC1和KIF11之间关系的照片。
(a)显示缺乏一个或两个末端区域的五个KOC1缺失突变体的示意图，N-和C-末端分别用FLAG和HA标记。KH，核糖核蛋白K-同源的结构域。
(b)描述了用于鉴定结合KIF11的KOC1区域的免疫沉淀实验结果。KOC1DEL4和KOC1DEL5构建体(其缺乏两种RNA-识别基序)(RRM)未保留任何可感知的与内源性KIF11互相作用的能力。
图4显示证实KOC1和KOC1-相关mRNA之间关系的照片。
(a)描述了用免疫沉淀的KOC1缺失突变体和DIG-标记的RAB35全长mRNA的用于鉴定KOC1中mRNA-结合区域Western印迹结果。
(b)描述了用免疫沉淀的KOC1缺失突变体和DIG-标记的RAB35全长mRNA的用于鉴定KOC1中mRNA-结合区域的Northwestern结果。KOC1DEL3和KOC1DEL5，不结合任何这些mRNA，以及KOC1DEL4(其为仅具有四个KH结构域的构建体)显示与类似的对mRNA的结合亲和力，而KOC1DEL2为无C-末端两个KH结构域的构建体。
(c)描述了用于证实IP-微阵列和转染入A549细胞中的各种KOC1缺失突变体直接结合至55个候选基因(参见表2)当中代表性的八个内源性mRNA(CCT2、SBP2、SLC25A3、RAB35、PSMB7、GL、PKP4和WINS1)能力的IP-RT-PCR结果。
图5显示呈现活的培养的哺乳动物细胞中KOC1-KIF11-mRNA核糖核蛋白复合物运动的照片。
(a)为显示KOC1-KIF11蛋白复合物转运的照片。共定位表达荧光青(ECFP)KOC1和黄(EYFP)KIF11蛋白的小粒子，并且经过特细的细胞间结构(箭头)在连接的COS-7细胞间一起转移。
(b)为显示KOC1-RAB35mRNA RNP复合物从含有高水平KOC1-RNP复合物(细胞A)的一个COS-7细胞转运至具有更低水平该复合物(仅用Cellnacker(蓝)染色；细胞B)的另一个细胞的照片。KOC1(绿色)-RAB35 mRNA(红色)复合物的小粒子以及KOC1粒子(绿色)经过特细的细胞间结构(箭头)从细胞A转移至细胞B。
图6显示KOC1-KIF11-mRNA核糖核蛋白复合物定位的照片。
(a)描述了证实内源性的KIF11和DCTN1间直接相互作用的来自A549和LC319细胞提取物的免疫沉淀结果(上图和下图)。
图7显示呈现转运进入受体细胞的KOC1-相关mRNA翻译的照片。
(a)为显示通过原位杂交监测的转运进入受体细胞的mRNA翻译的照片。
(b)为基于受体细胞中转运的mRNA的蛋白质合成的照片。具有全长RAB35 mRNA的构建体与myc标记序列在阅读框中融合(上图)。CellTracker-染色的受体细胞(蓝色)胞质中myc-标记的RAB35蛋白利用免疫细胞化学的共定位(下图)。
(c)为显示基于受体细胞中转运的mRNA的蛋白质合成的照片。具有全长RAB35 mRNA的构建体与EGFP蛋白序列在阅读框中融合。
(d)为基于受体细胞中转运的mRNA的蛋白质合成的照片。CellTracker阳性的受体细胞(蓝色)中EGFP-融合的RAB35蛋白利用延时录像显微镜加以观察。显示EGFP和相关的DIC图象。
(e)为显示用RAB35-EGFP和HA-标记的-KOC1载体共转染的COS-7细胞与用RAB35-EGFP和模拟质粒载体共转染的那些细胞之间RAB35-EGFP融合蛋白的蛋白水平无显著差异的照片。此表明KOC1不大可能干扰RAB35-EGFP mRNA的翻译。
图8显示KIF11siRNA对细胞的作用。
(a)描述了通过针对KIF11的siRNA对NSCLC细胞生长的抑制。通过半定量RT-PCR分析A549细胞中响应于特异性siRNA(si-KIF#1、#2和#3)或对照siRNA(EGFP、LUC、SC)的KIF11的表达。
(b)描述了通过三次重复MTT测定法评估的A549细胞响应si-KIF#1、#2、#3、EGFP、LUC或SC的存活力。
图9显示显性负性KOC1对细胞的作用。
(a)描述了证实KOC1缺失-突变体KOC1DEL3与LC319细胞中内源性的KIF11相互作用的免疫沉淀结果。
(b)描述了免疫沉淀结果，证实过表达RRM结构域的LC319细胞中内源性的KOC1和KIF11之间复合物形成降低。
(c)描述了通过三次重复的MTT测定法评估的LC319细胞响应KOC1DEL3的剂量-依赖性显性负性作用的存活力。X轴表明单次测定中转染进入LC319细胞的KOC1DEL3质粒-DNA的剂量(μg)。
(d)描述了检测用KOC1DEL2构建体转染的A549细胞中内源性的KOC1和KIF11之间复合物形成降低的免疫沉淀结果。
(e)描述了检测A549细胞中KOC1DEL2与内源性的KIF11相互作用的免疫沉淀结果。
(f)描述了通过三次重复的MTT测定法评估的A549细胞响应KOC1DEL2的剂量-依赖性显性负性作用的存活力。X轴表明单次测定中转染进入A549细胞的KOC1DEL2质粒-DNA的剂量(μg)。
图10显示RAB35siRNA对细胞的作用。
(a)描述了分析A549细胞中响应si-RAB35或对照siRNA的mRNA下调(knock-down)作用的半定量RT-PCR结果。
(b)显示用特异性siRNA或对照质粒(EGFP、混杂的(Scramble)或荧光素酶)转染的A549细胞的MTT测定结果。误差线表示三次重复测定的标准偏差。
图11显示过表达KOC1和KIF11与NSCLC中更坏结果的关联。
(a)描述了来自外科-切除的SCC组织的代表性样品利用抗-KOC1(左)和抗-KIF11(右)多克隆抗体在组织微阵列上(×200)的免疫组织化学评估结果。
(b)描述了根据组织微阵列上KOC1的表达(左图)和KIF11表达(右图)的肿瘤-特异性存活时间的Kaplan-Meier分析结果。
图12为通过微管上的KOC1-KIF11-DCTN1复合物的胞内和细胞-至-细胞mRNA转运机理的示意模型。
KOC1核糖核蛋白复合物(包括KIF11马达-蛋白和DCTN1)通过哺乳动物体细胞内或体细胞之间的微管结构转运KOC1-相关的mRNA。该模型暗示，在将对癌生长或发展至关重要的mRNA从一个细胞转运至另一个细胞的系统中，正增殖的癌细胞可通过使用这一分子复合物而活跃通讯。图8显示NMU和GHSR1b/NTSR1之间的关系。
图13显示描述NSCLC细胞系中检测的候选受体NMU和其已知配体表达的半定量RT-PCR分析结果。
(b)显示正常人组织中的GHSR1b表达。
(c)描述了利用FITC-标记的抗-FLAG抗体显示用FLAG-标记的GHSR1b或NTSR1瞬时转染的COS-7细胞的细胞表面上NMU和GHSR1b/NTSR1共定位的免疫细胞化学染色结果。
(d)描述了NMU与GHSR1b/NTSR1的相互作用。COS-7细胞用相同的载体瞬时转染，并且通过流式细胞术检测若丹明标记的NMU-25与细胞表面结合。作为这些测定法的阴性对照，制备三种配体/细胞组合1)未-转染的COS-7细胞；2)NMU-25-若丹明相对于未-转染的COS-7细胞；和3)仅用GHSR1b或NTSR1转染的COS-7细胞。
(e)描述了利用用NMU-25处理的LC319和PC-14细胞的受体-配体结合测定结果。
(f)描述了NMU-处理的NSCLC细胞的cAMP产生。
图14显示siRNA对细胞的作用。
(a)描述了通过针对GHSR1b和NTSR1的siRNA对NSCLC细胞生长的抑制。通过半定量RT-PCR分析A549和LC319细胞中响应特异性siRNA(si-GHSR或si-NTSR1)或对照siRNA(EGFP、LUC、SCR)的GHSR或NTSR1的表达。
(b)描述了三次重复MTT测定评估A549或LC319细胞响应si-GHSR、NTSR1、EGFP、LUC或SCR的存活力的结果。
图15显示了NMU的候选下游基因的确认。
(a)描述了在si-NMU作用下NMU转录本时间依赖性降低。
(b)描述了来自用si-NMU处理的LC319细胞中mRNA的半定量RT-PCR实验结果，使用证实候选的下游靶基因表达的时间依赖性降低的基因-特异性引物。
(c)描述了利用来自与NMU-25或BSA(对照)(100μM)温育的LC319细胞的mRNA检测作为NMU候选下游靶基因的FOXM1诱导的半定量RT-PCR结果。
图16显示FOXM1siRNA对细胞的作用。
(a)描述了针对FOXM1的siRNA对NSCLC细胞的生长的抑制。通过半定量RT-PCR(上图)分析A549细胞中响应特异性siRNA(si-FOXM1)或对照siRNA(EGFP、LUC、SCR)的FOXM1的表达。通过三次重复MTT测定评估A549细胞响应si-FOXM1、EGFP、LUC或SCR(下图)的存活力。
(b)描述了NSCLC细胞的生长受针对FOXM1的siRNA的抑制。通过半定量RT-PCR(上图)分析LC319细胞中响应特异性siRNA(si-FOXM1)或对照siRNA(EGFP、LUC、SCR)的FOXM1的表达。通过三次重复MTT测定评估A549细胞响应si-FOXM1、EGFP、LUC或SCR(下图)的存活力。
图17为自分泌NMU-GHSR1b致癌信号途径中的NMU-受体相互作用促进癌细胞生长和侵袭的示意模型。
NMU结合至GHSR1b和/或NTSR1引起腺苷酸环化酶的活化，胞内cAMP的累积并且随后cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的活化。PKA的催化亚基(C)从调节亚基(R)的释放引起下游FOXM1基因和/或相关靶基因的活化。
发明详述除非另外明确表明，如此处所用的单词“a”、“an”和“the”指“至少一个”。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。此外，除非另外明确表明，术语“基因”、“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。
为了研究肺致癌作用机理并且鉴定可用作诊断标记物或用于开发新的分子疗法靶标的基因，通过cDNA微阵列搜索在非小细胞肺癌(NSCLC)中特异性上调的基因。通过所述分析，鉴定了数个候选的治疗靶基因。两个基因，含有KH结构域的蛋白质在癌中过表达(KOC1)神经调节肽U(NMU)在临床NSCLC样品以及检测的NSCLC细胞系中大量表达。然而，在相应的非-癌肺组织中几乎检测不到其表达。过表达内源性NMU的NSCLC细胞的生长受抗-NMU抗体的显著抑制。此外，NSCLC细胞用针对KOC1和/或NMU的siRNA的处理抑制所述基因的表达并且导致NSCLC细胞的生长抑制。而且，鉴定到KOC1结合癌细胞的驱动蛋白家族成员11(KIF11)，而NMU结合神经肽G蛋白-偶联受体(GPCR)、生长激素促分泌受体1b(GHSR1b)和神经降压素受体1(NTSR1)。鉴定到NMU配体-受体系统活化人类forkhead box M1(FOXM1)。令人感兴趣的是，GHSR1b、NTSR1、FOXM1和KIF11全在NSCLC细胞中特异性地过表达。
RNA结合蛋白KOC1和微管马达蛋白KIF11为胚胎发生和致癌作用中所需的一些种类的mRNA定位所必需的(图12)。如之前本发明人报道的，NSCLC细胞用特异性siRNA的处理以降低KOC1的表达导致生长抑制。该研究中，证实KIF11与NSCLC细胞中的KOC1相关并且是肺肿瘤中KOC1生长-促进作用的靶标。本发明人揭示KOC1不仅与KIF11在人正常组织、NSCLC和细胞系中共定位，而且直接与体外NSCLC细胞中的KIF11相互作用，并且NSCLC细胞用针对KIF11的siRNA的处理降低KIF11表达并且导致生长抑制。结果表明KOC1-KIF11信号传导影响NSCLC细胞的生长。如下面所示，KOC1的显性负性片段(例如，含有RRM结构域的那些)可用于抑制癌细胞的增殖。通过表达分析，在大部分NSCLC样品中，而不是正常的肺组织中检测到KOC1和KIF11表达的提高。由于用于本分析的大多数临床NSCLC样品处于早期和可行手术的阶段，结合纤维镜(fiberscopic)经支气管活检(TBB)或痰液细胞学，KOC1和KIF11可方便地用作诊断早期阶段肺癌的生物标志物。
因此，KOC1和KIF11为NSCLC中致癌途径所必需的。此处报道的数据提供了用于设计靶向KOC1-KIF11途径的特异性针对肺癌的新抗-癌药物的证据。还显示siRNA可用于治疗化疗抗性的晚期肺癌。
用siRNA-NMU转染的NSCLC细胞的亚-G1级分显著的提高提示阻断自分泌NMU-信号途径可诱导凋亡。本发明人还找到支持该途径在致癌作用中的重要性的其他证据；例如，将NMU添加入培养基中，可以剂量-依赖型方式促进COS-7细胞的生长，以及抗-NMU抗体添加入所述培养基可能通过中和NMU活性而抑制该NMU-增强的细胞生长。此外，内源性过表达NMU的NSCLC细胞的生长受抗NMU抗体的显著抑制。体外测定中NMU的表达还导致COS-7细胞侵入的显著增强。这些结果表明NMU是NSCLC的重要的生长因子并且与癌细胞侵入有关，以自分泌方式起作用，以及筛选靶向NMU-受体生长-促进途径的分子是用于治疗NSCLC的有效治疗方法。通过免疫组织化学分析，在大部分NSCLC(SCC、ADC、LCC和BAC)和SCLC样品中，而不是在正常肺组织中检测到NMU蛋白表达的提高。由于NMU为分泌蛋白并且用于本分析的大多数临床NSCLC样品处于早期和可行手术的阶段，结合纤维镜(fiberscopic)经支气管活检(TBB)、痰液细胞学或验血，NMU可方便地用作早期-阶段肺癌诊断的生物标志物。
已知两种受体，NMU1R(FM3/GPR66)和NMU2R(FM4)与NMU相互作用。然而在此呈现的结果表明这两种已知的受体不是NSCLC中自分泌NMU-信号途径的靶标；反而，GHSR1b和NTSR1证明是肺肿瘤中NMU生长-促进作用的靶标。本发明人揭示NMU-25结合细胞表面上的这些受体，并且NSCLC细胞用针对GHSR1b或NTSR1的siRNA的处理降低受体的表达并且导致凋亡。结果表明NMU通过经GHSR1b和/或NTSR1起作用而影响NSCLC细胞的生长(图14)。GHSR为Ghrelin(GHRL)的已知受体，是近来鉴定的能刺激人中垂体生长激素释放和食欲的28个氨基酸的肽(Lambert，P.D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.984652-4657(2001)；Petersenn，S.等.，Endocrinology 1422649-2659(2001)；Kim K.等.，Clin.Endocrinol.54705-860(2001)；Kojima，M.等.，Nature 402656-660(1999))。对于已知为GHRL受体的两种转录本GHSR1a和GHSR1b，NSCLC组织和细胞系中仅检测到GHSR1b的过表达。由于GHRL不在检测的NSCLC中表达，怀疑GHSR1b通过结合NMU，而不是GHRL而在肺肿瘤中具有生长促进功能。
NTSR1为神经降压素(NTS)的三种受体的一种，神经降压素为完成许多中枢和外周功能的脑和胃肠肽(Heasley，L.E.Oncogene 201563-1569(2001))。NTS调节多巴胺的传递和垂体激素的分泌，并且在脑中发挥低温和止痛作用，虽然其作为外周激素在消化道和心血管系统中起作用。其他人已报道NTS在一些人癌症中产生和分泌，包括小-细胞肺癌(SCLC)(Heasley，L.E.Oncogene 201563-1569(2001))。在本发明中检测的15个NSCLC细胞系的四个中检测到NTS的表达(图13a)，但NTS的表达模式不一定与NMU或NTSR1的一致。因此NTS可与NMU一起，通过NTSR1或NSCLC小亚型中的其他受体促进NSCLC的生长。本实验中表达NMU的大部分癌细胞系和临床NSCLC也表达GHSR1b和/或NTSR1，表明这些配体-受体相互作用参与对NSCLC中NMU生长-促进活性很重要的途径。
NMU信号途径通过反式激活包括FOXM1的一组下游基因而影响肺癌细胞的生长促进。已知FOXM1在几种类型的人癌症中过表达(Teh，M.T.等.，Cancer Res.62，4773-4780.；van den Boom，J.等.，(2003).Am.J.Pathol.163，1033-1043.；Kalinichenko，V.V.等.，(2004).Genes.Dev.18，830-850)。最初在果蝇中鉴定的“forkhead”基因家族，包括具有保守的100个氨基酸的DNA-结合基序的转录因子，并且已显示在调节参与细胞生长、增殖、分化、寿命和转化的基因表达中起重要作用。人肝细胞瘤HepG2细胞系中的共转染测定证实FOXM1蛋白刺激细胞周期蛋白B1(CCNB1)和细胞周期蛋白D1(CCND1)的表达(Wang，X.等.，(2002).Proc.Nat.Acad.Sci.99，16881-16886.)，提示这些细胞周期蛋白基因为直接的FOXM1转录靶标并且FOXM1调控对于细胞分裂和脱离有丝分裂必需的基因的转录网络。应当指出我们观察到大部分NSCLC系列中CCNB1的活化和其与FOXM1表达良好的一致性(数据没有显示)。NSCLC细胞中NMU对细胞生长的促进可反映FOXM1的反式激活，其因此影响那些分子途径的功能。因此，NMU，以及该分子的两种新揭示的受体GHSR1b和NTSR1以及其下游基因FOXM1参与NSCLC中的自分泌生长-促进途径。此处报道的数据提供了用于设计特异性针对肺癌的新抗-癌药物的基础，该药物靶向NMU-GHSR1b/NTSR1-FOXM1途径。还显示干扰该途径的siRNA可用于治疗化疗抗性的晚期肺癌。
这些数据表明KOC1-KIF11信号途径在肺致癌作用中经常上调，以及对NSCLC而言重要的自分泌生长因子NMU通过GHSR1b和NTSR1受体分子起作用。因此，这些复合物中组分的选择性抑制可抑制肺致癌作用的发展和/或进展并且靶向这些途径可方便地用于肺癌患者治疗的治疗性和诊断性策略中。
诊断非小细胞肺癌(NSCLC)通过测量源自受试者的生物制品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平，可确定受试者中NSCLC的存在或发生NSCLC的倾向性。本发明包括确定(例如，测量)生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中的至少一种，以及多至所有的表达水平。
根据本发明，检测NSCLC-相关基因，KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的基因转录本以确定所述基因的表达水平。基因的表达水平可通过检测基因的表达产物，包括转录和翻译产物，如mRNA和蛋白质而检测。基于用于已知序列的GenBankTM数据库条目提供的序列信息，KIF11(NM_004523)、GHSR1b(NM_004122)、NTSR1(NM_002531)和FOXM1(No.NM_202003)基因可利用本领域普通技术人员熟知的技术检测和测量。KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的核苷酸序列分别描述为SEQID NO1、3、5和106，并且由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列描述为SEQ ID NO2、4、6和107。
例如，序列数据库条目内的对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的序列可用于构建用于通过例如Northern印迹杂交分析检测其mRNA的探针。探针杂交至受试者生物样品中的基因转录本还可在DNA阵列上进行。阵列的使用优选用于检测多个NSC基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1)的表达水平。作为另一个例子，所述序列可用于构建用于在例如基于扩增的检测方法中，如基于反向-转录的聚合酶链式反应(RT-PCR)中特异性扩增KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的引物。此外，可根据由所述基因编码的表达蛋白质的量而分析KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平。用于确定表达蛋白质量的方法包括免疫测定方法。另外，还可根据由所述基因编码的表达蛋白质的生物学活性而确定KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平。例如，由KIF11基因编码的蛋白质已知结合KOC1，并且因此所述基因的表达水平可通过测量由于表达的蛋白质而对KOC1的结合能力而检测。此外，已知KIF11蛋白具有细胞增殖活性。因此，KIF11基因的表达水平可利用所述细胞增殖活性作为指标而确定。另一方面已知GHSR1b和NTSR1蛋白结合NMU，并且也具有细胞增殖活性。因此，与KIF11类似，GHSR1b和NTSR1基因的表达水平可通过测量其对NMU的结合能力或由于表达的蛋白质而具有的细胞增殖活性而检测。
任何生物材料可用作用于确定表达水平的生物样品，只要可在样品中检测任何KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因，并包括检测细胞群体(即，受试者来源的组织样品)。优选，所述生物样品包括肺细胞(获自肺的细胞)。还可在血液、血清或其他的体液如痰液中测量基因表达。此外，检测样品可以是从组织纯化的细胞。
根据所述方法诊断NSCLC的受试者优选为哺乳动物并且包括人、非-人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
将生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1 FOXM1基因中一种或多种的表达水平与参照样品中相同基因的表达水平比较。该参照样品包括具有已知参数的，即癌的或非-癌的，一种或多种细胞。参照样品应该源自组织类型与检测样品类似的组织。或者，可根据源自所测定的参数或环境已知的细胞的分子信息数据库而确定对照的表达水平。
生物样品中基因表达水平的模式是否指示NSCLC的存在取决于参照细胞群体的组成。例如，当参照细胞群体由非-癌细胞组成时，检测生物样品中与参照类似的基因表达水平表明检测生物样品为非-癌的。另一方面，当参照细胞群体由癌细胞组成时，生物样品中与参照类似的基因表达分布型表明检测生物样品包括癌细胞。
检测生物样品可与多个参照样品比较。多个参照样品中的每种可在已知参数中有不同。因此，检测样品可与已知包含例如，NSCLC细胞的参照样品比较，并且同时与已知包含例如，非-NSCLC细胞(正常细胞)的第二种参照样品比较。
根据本发明，在生物样品中确定一种或多种NSCLC-相关基因，KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的表达并且与相同基因的正常对照水平比较。短语“正常对照水平”指通常在源自未患有NSCLC的群体的生物样品中找到的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达分布型。来自对照和检测受试者的生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平可同时确定，或正常对照水平可通过根据通过分析之前从对照组收集的样品中该基因表达水平而获得的结果的统计方法来确定。源自患者来源的组织样品的生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达水平的提高表明受试者患有NSCLC或处于发生NSCLC的风险中。
当检测生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平不同于参照超过1.0、1.5、2.0、5.0、10.0或更多倍时，可认为该表达水平改变。或者，当检测生物样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平比参照提高或降低至少50％、60％、80％、90％或更多时，可认为该表达水平改变。
检测样品和参照样品之间基因表达的差异可用对照，例如持家基因标准化。例如，对照多核苷酸包括已知其表达水平在癌和非-癌细胞之间无不同的那些。检测和参照样品中对照多核苷酸的表达水平可用于标准化对于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因检测的表达水平。用于本发明中的对照基因包括β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋白P1。
此处鉴定的差异性表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因还允许监测NSCLC的疗程。该方法中，从经受NSCLC治疗的受试者提供检测生物样品。如果所需，在治疗之前、期间或之后的不同时间点从受试者获得多个检测生物样品。随后测定样品中一种或多种KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达并且与具有已知NSCLC状态而未经治疗的参照样品相比较。
如果参照样品不包含NSCLC细胞，检测生物样品和参照样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达水平的相似性表明治疗的有效。然而，检测和参照样品中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达水平的差异表明不太有利的临床结果或预后。尤其，KOC1、KIF11或KOC1表达的提高结合KIF11表达的提高与不良的预后显著相关。
术语“有效的”指治疗引起病理地上调的基因(包括目前的指示基因，KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1)表达的降低，或受试者中NSCLC大小、发病率或转移性潜力的降低。当预防性地应用治疗时，“有效的”指该治疗延迟或防止NSCLC的发生或减轻NSCLC的临床症状。NSCLC的评估可利用标准的临床方案完成。此外，结合任何已知用于诊断或治疗NSCLC的方法确定治疗的有效性。例如，NSCLC经组织病理学诊断或通过确定症状的异常如久咳、嘶哑、咳血、体重损失、食欲不振、气促、喘气、支气管炎或肺炎的反复发作以及胸痛而诊断。
此外，用于诊断NSCLC的本方法还可通过比较患者-来源的生物样品中KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、FOXM1基因或其组合(例如，KOC1和KIF11)的表达水平而应用于评估癌症患者的预后。或者，可测量整个疾病阶段生物样品中基因的表达水平以评估患者的预后。
相比正常对照水平，KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达水平的提高表明不太有利的预后。相比正常对照水平，KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达水平的相似性表明患者更良好的预后。优选，受试者的预后可通过比较KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达分布型而评估。一些实施方案中，测定KIF11和KOC1的表达水平。
表达分布型本发明还提供包括两个或多个KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的基因表达水平模式的NSCLC参照表达分布型。该表达分布型用作用于NSCLC诊断或发展该疾病易感性的对照，监测疗程并且评估患有疾病的受试者的预后。
本发明的试剂盒本发明还提供包括两种或多种检测试剂的试剂盒，例如特异性结合或识别一种或多种KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的核酸。特异性结合或识别一种或多种KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的所述核酸通过寡核苷酸序列举例说明，其与KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多核苷酸的部分互补是结合由KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的多肽的抗体。所述试剂以试剂盒的形式包装在一起。所述试剂，如核酸或抗体(结合固体基质或分别与将其结合至基质的试剂包装在一起)、对照试剂(阳性的和/或阴性的)和/或检测所述核酸或抗体的设备优选包装在分开的容器中。用于进行所述测定的说明书(例如，书面的、磁带、VCR、CD-ROM等等)可包括在试剂盒中。试剂盒的测定形式可以为本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。
例如，检测试剂固定于固体基质如多孔带上以形成至少一个检测位点。该多孔带的测量或检测区域可包括多个检测位点，每个检测位点含有检测试剂。检测带还可含有用于阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点位于与检测带分开的条带上。选择性地，不同的检测位点可含有不同量的固定试剂，即第一个检测位点中较高的量和随后的位点中较少的量。添加检测生物样品后，呈现可检测信号的位点数提供了样品中存在的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因，或由所述基因编码的多肽量的定量指示。检测位点可以任何适合可检测的形状配置并且通常为覆盖测试条宽度的条或点的形状。
或者，试剂盒包含包括两个或多个KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因序列的核酸基底阵列。根据结合阵列测试条或芯片的水平确定KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因代表的2个或3个基因的表达。基底阵列可例如在固体基底上，例如美国专利No.5,744,305中所述的“芯片”。
一些实施方案中，试剂盒可用于预测NSCLC的预后。这些实施方案中的试剂盒可包括用于检测编码KIF11或KOC1氨基酸序列的mRNA的试剂，用于检测蛋白质的试剂或用于检测KIF11或KOC1蛋白生物学活性的试剂。
本发明还提供用于调节RNA转运活性的化合物检测的试剂盒。该试剂盒可包括表达KIF11多肽或功能等同物、KOC1多肽或功能等同物和所转运的RNA以及DCTN1的细胞。
本发明的试剂盒还可用于筛选用于治疗或防止NSCLC的化合物。试剂盒可包括KOC1多肽或功能等同物，以及由KOC1多肽或功能等同物结合的RNA。本发明中，用KOC1-KIF11复合物的RNA转运蛋白活性可转运的任何RNA可用作被转运的RNA。优选的RNA可选自表2中显示的基因的转录本或其片段。待转运的RNA还可经标记用于检测RNA转运蛋白活性。此外，本发明中，KOC1和KIF11多肽或其功能等同物作为与具有用于通过显微镜检查或细胞成像系统观察的信号生成蛋白质的融合蛋白表达。例如，ECFP、EYFP和EGFP可用作信号生成蛋白质。
阵列和多个本发明还包括包含一种或多种KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的核酸基底阵列。阵列上的核酸特异性对应于一种或多种由KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因表示的多核苷酸序列。通过检测核酸结合至阵列而确定KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中2个、3个或4个的表达水平。
本发明还包括分离的多个(即，两种或多种核酸的混合物)核酸。该核酸为液相的或固相的，例如固定于如硝酸纤维素膜的固相支持物上。该多个包括通过KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因表示的一种或多种多核苷酸。根据本发明另外的实施方案，该多个包括通过KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因表示的2个、3个或4个多核苷酸。
芯片DNA芯片为便于同时比较大量基因表达水平的装置。可例如通过“Microarray Biochip Technology”(Mark Schena，Eaton Publishing，2000)，等等中公开的方法实现基于DNA芯片的表达分布型。
DNA芯片包含固定的高-密度探针以检测大量基因。因此，许多基因的表达水平可通过单-轮分析同时评估。即，可用DNA芯片确定样本的表达分布型。本发明基于DNA芯片的方法包含下列步骤(1)合成对应于标记基因的aRNA或cDNA；(2)用标记基因的探针杂交aRNA或cDNA；和(3)检测与探针杂交的aRNA或cDNA并且定量其mRNA的量。
术语“aRNA”指用RNA聚合酶转录自模板cDNA的RNA。用于基于DNA芯片表达分布型的aRNA转录试剂盒为市场上可买到的。利用所述试剂盒，可利用T7RNA聚合酶从作为模板的连接T7启动子的cDNA合成aRNA。另一方面，通过利用随机引物的PCR，可利用作为模板的合成自mRNA的cDNA扩增cDNA。
或者，DNA芯片包含探针，其已点样在其上，以检测本发明的标记基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因)。点样于DNA芯片上的标记基因数目没有限制，并且可利用KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的1个、2个、3个或所有基因。任何其他的基因以及标记基因可点样于DNA芯片上。例如，针对其表达水平几乎不改变的基因的探针可点样于DNA芯片上。当测定结果用来在多个芯片之间或不同的测定之间比较时，所述基因可用于标准化测定结果。
探针设计用于所选的每个标记基因，并且点样于DNA芯片上。所述探针可以是，例如包含5-50个核苷酸残基的寡核苷酸。用于在DNA芯片上合成所述寡核苷酸的方法为本领域技术人员所知。更长的DNA可通过PCR或化学合成。用于将通过PCR等等合成的长DNA点样于玻璃载玻片上的方法也为本领域技术人员所知。通过如上所述方法获得的DNA芯片可用于诊断本发明的NSCLC。
制备的DNA芯片与aRNA接触，随后检测探针和aRNA之间的杂交。aRNA可在之前用荧光染料标记。荧光染料如Cy3(红色)和Cy5(绿色)可用于标记aRNA。来自受试者和对照的aRNA分别用不同的荧光染料标记。可根据信号强度的差异评估两者间表达水平的差异。DNA芯片上荧光染料的信号可通过扫描仪检测并且利用专门的程序分析。例如，来自Affymetrix的程序组为用于DNA芯片分析的软件包。
鉴定抑制NSCLC-相关基因表达的化合物通过将表达NSCLC-相关基因的检测细胞与检测化合物接触并且确定NSCLC-相关基因的表达水平或活性而鉴定抑制靶标NSCLC-相关基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因)表达水平或活性的化合物。相比正常对照水平的表达降低表明检测化合物为NSCLC-相关基因的抑制剂。根据该方法鉴定的所述化合物可用于抑制NSCLC。
检测细胞可以是细胞群体并且包括任何细胞，只要该细胞表达靶标NSCLC-相关基因。例如，检测细胞可以是源自NSCLC细胞的永生化的细胞系。或者，检测细胞可以是用任何KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因转染的细胞，或其已用可操作连接至报告基因的任何所述基因的调控序列(例如，启动子)转染。
筛选化合物利用KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因，由所述基因或该基因的转录调控区编码的蛋白质，可筛选改变该基因表达或由该基因编码的多肽生物学活性的化合物。所述化合物预计用作治疗或防止NSCLC的药物。
因此，本发明提供利用本发明多肽筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法。该筛选方法的实施方案包含步骤(a)将检测化合物与由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的多肽接触；(b)检测本发明的多肽和检测化合物之间的结合活性；和(c)选择结合所述多肽的化合物。
如底下更详细解释的，KOC1和KIF11形成具有RNA转运活性的复合物。因此，本发明还提供鉴定调节RNA转运活性的多肽和其他化合物的方法。例如，可通过将KIF11多肽(SEQ ID NO2)或其功能等同物与可在适于RNA转运的条件下由KIF11转运的RNA接触而检测多肽的RNA转运活性。如底下详细描述的，RNA转运水平可利用熟知的技术测量，如通过RNA免疫沉淀。
KIF11多肽的功能等同物为一种多肽，其具有相当于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的以及，例如包括SEQ ID NO2(KIF11)的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸(通常小于五个)经取代、缺失或插入的多肽的生物学活性。或者，多肽可以是包括与SEQ ID NO2具有至少约80％同源性(也称为序列同一性)的氨基酸序列的多肽。其他的实施方案中，多肽可由在严谨条件下(如底下定义的)杂交至由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸所编码。
一些实施方案中，KIF 11多肽或功能等同物与KOC1多肽或其功能等同物接触。KOC1多肽的功能等同物为一种多肽，其具有相当于由SEQ ID NO105的氨基酸序列组成的以及，例如包括SEQ ID NO105的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸(通常小于五个)经取代、缺失或插入的多肽的生物学活性。或者，多肽可以是包括与SEQ ID NO105具有至少约80％同源性(也称为序列同一性)的氨基酸序列的多肽。其他的实施方案中，多肽可由在严谨条件下(如底下定义的)杂交至由SEQ ID NO104的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸所编码。一些实施方案中，功能等同物包括至少一个RRM或KH结构域。
本发明还提供鉴定调节RNA转运活性的试剂的方法。这些方法中，怀疑调节RNA转运活性的试剂与KIF11多肽或功能等同物。检测转运的RNA的水平并且与缺少该试剂时的对照水平比较。
用于筛选的多肽可以是重组多肽或源自天然的或其部分肽的蛋白质。接触检测化合物的多肽可以为，例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、结合至载体的形式或与其他多肽融合的融合蛋白。
作为筛选结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的方法，可利用本领域技术人员熟知的的许多方法。所述筛选可例如通过利用本领域熟知的方法的免疫沉淀方法进行。本发明的蛋白质可利用标准方法重组产生。例如，编码任何KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1多肽的基因通过将该基因插入用于外源基因的表达载体中，如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8而在动物细胞中表达。用于表达的启动子可以是通常所用的任何启动子并且包括例如SV40早期启动子(Rigby inWilliamson(ed.)，Genetic Engineering，Vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α启动子(Kim等.，Gene 91217-23(1990))，CAG启动子(Niwa等.，Gene 108193-200(1991))，the RSV LTR promoter(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))SRα启动子(Takebe等.，Mol Cell Biol 8466(1988))，CMV即刻早期启动子(Seed and Aruffo，ProcNatl Acad Sci USA 843365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman等.，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK启动子等等。可根据任何方法，例如电穿孔方法(Chu等.，Nucleic Acids Res 151311-26(1987))、磷酸钙方法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))、DEAE葡聚糖方法(Lopata等.，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)，Sussman andMilman，Mol Cell Biol 41642-3(1985))、脂质体转染方法(Derijard，B Cell71025-37(1994)；Lamb等.，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran等.，Science 259230-4(1993))等等进行基因导入动物细胞中以表达外源基因。NSC多肽还可以作为融合蛋白表达，所述融合蛋白包括通过引入已揭示了其对多肽N-或C-末端的特异性的单克隆抗体表位至该多肽的N或C末端而包含单克隆抗体识别位点(表位)，。可利用市场上可买到的表位-抗体系统(Experimental Medicine 1385-90(1995))。可通过利用其多克隆位点而表达具有例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等等的融合蛋白的载体是市场上可买到的。
还报道了为了避免由于融合蛋白而改变原始多肽的性能而通过仅引入由一些至若干氨基酸组成的小的表位而制备的融合蛋白。表位，如多组氨酸(His-tag)、流感聚集体HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-tag)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-tag)、E-tag(单克隆噬菌体上的表位)等等，以及识别它们的单克隆抗体可用作用于筛选结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
免疫沉淀中，通过将这些抗体添加至利用合适的去污剂制备的细胞裂解物而形成免疫复合物。该免疫复合物由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽、包括与该多肽结合能力的多肽以及抗体组成。除了利用针对上述表位的抗体外，也可利用针对KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体进行免疫沉淀，该抗体可根据常规方法制备并且可以是任何形式的，如单克隆或多克隆抗体，并且包括通过用该多肽免疫动物如兔而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，以及重组抗体(例如，人源化的抗体)。
具体地，可利用本领域熟知的技术制备针对KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体。例如，用作抗原以获得抗体的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽可源自任何动物种类，但优选源自哺乳动物如人、小鼠或大鼠，更优选源自人。用作抗原的多肽可重组产生或分离自天然来源。根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的全长蛋白质或部分肽。部分肽可包括，例如KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的氨基(N)-端或羧基(C)-端片段。
任何哺乳动物可用该抗原免疫，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，利用啮齿目、兔形目或灵长目的动物。啮齿目的动物包括，例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目的动物包括，例如兔。灵长类的动物包括，例如狭鼻亚目的猴(古时的猴)如猕猴、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法为本领域所知。抗原的腹膜内注射或皮下注射为哺乳动物免疫的标准方法。更具体地，抗原可稀释并且悬浮于合适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等等中。如果所需，抗原悬浮液可与合适量的标准佐剂混合，如弗氏完全佐剂、制成乳剂，且随后给予哺乳动物。优选，每4至21天给予与适当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原。合适的载体也可用于免疫。如上免疫后，通过标准方法检查血清的所需抗体量的提高。
可通过收集来自检查过血清中所需抗体提高的免疫的哺乳动物的血液，并且通过任何常规方法从血液分离血清而制备针对KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的多克隆抗体。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及含有可从血清分离的多克隆抗体的级分。可利用例如用多肽偶联的亲和柱，并且进一步利用A蛋白或G蛋白柱纯化该级分而从仅识别KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的级分制备免疫球蛋白G或M。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的并且如上所述检查血清中所需抗体水平提高的哺乳动物收集免疫细胞，并且进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾脏。与上述免疫细胞融合的其他优选的亲本细胞包括，例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，并且更优选具有通过药物而选择融合细胞的获得性性能的骨髓瘤细胞。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞可根据已知方法，例如Milstein等的方法融合(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))。
通过细胞融合获得的杂交瘤可通过将其培养在标准的选择培养基中而选择，如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的培养基)。在HAT培养基中持续细胞培养数天至数周，即足以允许除了所需的杂交瘤外所有其他的细胞(非-融合的细胞)死亡的时间。随后，进行标准的极限稀释以筛选和克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述方法外，其中非-人动物用用于制备杂交瘤的抗原免疫，如由EB病毒感染的人淋巴细胞可用KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽、表达该多肽的细胞或其体外裂解物免疫。随后，免疫的淋巴细胞与能无穷分裂的源自人的骨髓瘤细胞，如U266融合，以得到产生所需人抗体的杂交瘤，即可获得能结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体(未审查的公开的日本专利申请No.(JP-A)Sho 63-17688)。
获得的杂交瘤随后移植入小鼠腹腔内并且提取腹水。获得的单克隆抗体可例如通过硫酸铵沉淀、A蛋白或G蛋白柱、DEAE离子交换层析或偶联本发明任何靶标蛋白质(KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1多肽)的亲和柱纯化。抗体不仅可用于本筛选方法中，而且可用于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的纯化和检测，并且还可用作多肽激动剂和拮抗剂的候选物。此外，该抗体可应用于与KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽有关的疾病包括如以下所述的NSCLC的抗体治疗。
因此获得的单克隆抗体还可利用遗传工程技术重组制备(参见，例如，Borrebaeck和Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，由MacMillanPublishers LTD(1990)在英国出版)。例如，可从免疫细胞，如产生抗体的杂交瘤或免疫的淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，插入合适的载体中，并且导入宿主细胞以制备重组抗体。所述重组抗体还可用于本筛选。
此外，用于筛选等等的抗体可以是抗体的片段或修饰的抗体，只要其结合一种或多种KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1多肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston等.，Proc NatlAcadSci USA 855879-83(1988))。更具体地，抗体片段可以通过用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体而产生。或者，可构建编码该抗体片段的基因，插入表达载体中，并且在合适的宿主细胞中表达(参见，例如，Co等.，JImmunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178476-96(1989)；Pluckthunand Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol121652-63(1986)；Rousseaux等.，Methods Enzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗体可通过用各种分子，如聚乙二醇(PEG)偶联而修饰。修饰的抗体可通过抗体的化学修饰获得。这些修饰方法为本领域常规的。
或者，抗体可作为可变区源自非人类抗体而恒定区源自人抗体之间的嵌合抗体获得，或作为人源化抗体获得，其包括源自非人类抗体的互补决定区(CDR)，源自人抗体的框架区(FR)以及恒定区。所述抗体可利用已知技术制备。
可通过用相应的人抗体序列取代啮齿类CDR或CDR序列而进行人源化(参见，例如，Verhoeyen等.，Science 2391534-1536(1988))。因此，所述人源化的抗体为嵌合抗体，其中实质上小于完整的人可变域已由来自非-人物种的相应序列取代。
还可利用除人框架和恒定区之外包括人可变区的全长人抗体。所述抗体可利用本领域已知的各种技术产生。例如体外方法包括噬菌体上展示的人抗体片段重组文库的利用(例如，Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227381(1991))。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如其中内源性的免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠中而制备人抗体。该方法例如在美国专利No.6,150,584、5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中描述。
如上获得的抗体可经纯化以实现同质性。例如，可根据用于常规蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，抗体可通过适当选择的和柱层析，如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦及其他的联合使用而分开和分离(AntibodiesA LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限于此。A蛋白柱和G蛋白柱可用作亲和柱。所用的例证性的A蛋白柱包括，例如Hyper D、POROS和琼脂糖凝胶F.F.(Pharmacia)。
例证性的层析，除亲和的之外包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。可通过液相层析，如HPLC和FPLC进行层析过程。
当抗体为小鼠IgG抗体时，可例如用A蛋白琼脂糖凝胶或G蛋白琼脂糖凝胶沉淀免疫复合物。如果KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽作为具有如GST的表位的融合蛋白而制备，利用特异性结合这些表位的物质，如谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B，可以与利用KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体同样的方法形成免疫复合物。
可遵行或根据例如文献中的方法进行免疫沉淀(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE通常用于免疫沉淀的蛋白质的分析并且结合的蛋白质可利用具有合适浓度的凝胶通过蛋白质的分子量而分析。由于结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质难以通过普通的染色法如Coomassie染色或银染检测，该蛋白质的检测灵敏度可通过将细胞在含有放射性同位素，35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养，标记细胞中的蛋白质，并且检测该蛋白质而改进。目的蛋白可直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶纯化并且当揭示蛋白质的分子量时可确定其序列。
作为用于利用该多肽筛选结合任何KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1多肽的蛋白质的方法，可利用例如West-Western印迹分析(Skolnik等.，Cell 6583-90(1991))。具体地，可通过利用噬菌体载体(例如，ZAP)从期望表达结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的细胞、组织、器官(例如，如肺细胞的组织)或培养的细胞(尤其源自NSCLC细胞的那些)制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白质，将表达的蛋白质固定于滤器上，将纯化的和标记的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽与上述滤器反应，并且根据标记物检测表达结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的斑点而获得结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质。KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽可通过利用生物素和抗生物素蛋白间的结合，或通过利用特异性结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体，或融合至KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的肽或多肽(例如，GST)标记。还可利用使用放射性同位素或荧光等等的方法。
另外，本发明筛选方法的另一实施方案中，可使用利用细胞的双-杂交体系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields andSternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
双-杂交体系统中，KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽融合至SRF-结合区域或GAL4-结合区域并且在酵母细胞中表达。从期望表达结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的细胞制备cDNA文库，使得该文库当表达时融合至VP16或GAL4转录活化区域。cDNA文库随后导入上述酵母细胞中并且从检测的阳性克隆分离源自该文库的cDNA(当结合本发明多肽的蛋白质在酵母细胞中表达时，两者的结合激活报告基因，使得可检测阳性克隆)。由cDNA编码的蛋白质可通过将如上分离的cDNA导入大肠杆菌并且表达该蛋白质而制备。
作为报告基因，除HIS3基因之外，可利用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、荧光素酶基因等等。
还可利用亲和层析筛选结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的化合物。例如，KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽可固定于亲和柱的载体上，并且含有能结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的蛋白质的检测化合物被施加至该柱。此处检测化合物可以是例如，细胞提取物、细胞裂解物等等。装载检测化合物后，洗涤柱，并且可制备结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的化合物。
当检测化合物为蛋白质时，分析获得的蛋白质的氨基酸序列，根据该序列合成寡DNA，并且利用寡DNA作为探针筛选cDNA文库以获得编码该蛋白质的DNA。
利用表面胞质团共振现象的生物传感器可用作检测或定量本发明中结合的化合物的方法。当使用所述生物传感器时，利用微小量的多肽并且无需标记(例如，BIAcore，Pharmacia)可实时观察到作为表面胞质团共振信号的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽和检测化合物间的相互作用。因此，利用生物传感器如BIAcore可以评估KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽和检测化合物间的结合。
用于筛选当固定的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽暴露于合成的化合物，或天然物质库或随机噬菌体肽展示文库时结合分子的方法，以及利用基于组合化学技术的高-通量(Wrighton等.，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))分离结合KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的蛋白质和化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法为本领域技术人员所熟知。
另外，本发明提供利用KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，包括如下步骤(a)将检测化合物与KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽接触；(b)检测步骤(a)的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的生物学活性；和(c)与缺少该检测化合物时检测的生物学活性相比，选择抑制KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽生物学活性的化合物。
由于由KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中任何编码的蛋白质具有促进NSCLC细胞细胞增殖的活性，可利用该活性作为指标可筛选抑制这些蛋白质中一种的此活性的化合物。
任何多肽可用于筛选，只要其包括KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的生物学活性。所述生物学活性包括细胞-增殖活性和结合由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的蛋白质的其他蛋白的能力。例如，可利用由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的人蛋白质并且还可利用功能等同于这些蛋白质的多肽。所述多肽可由细胞内源性或外源性地表达。
通过该筛选分离的化合物为KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”指通过与之结合而抑制KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽功能的分子。此外，通过该筛选而分离的化合物为抑制KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽与分子(包括DNA和蛋白质)体内相互作用的化合物候选物。
当本方法中所检测的生物学活性为细胞增殖时，其可例如通过制备表达KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的细胞，在检测化合物存在下培养该细胞，并且测定细胞增殖的速度，测量细胞周期等等，以及通过测量菌落形成活性而检测。
如以上详细论述的，通过调控KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的表达水平，可控制NSCLC的发作和进展。因此，可用于NSCLC治疗或预防的化合物可通过利用一种或多种KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因表达水平作为指标的筛选而鉴定。本发明上下文中，所述筛选可包括例如下列步骤(a)将检测化合物与表达KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中一种或多种的细胞接触；和(b)与缺少该检测化合物时检测的表达水平相比，选择降低一种或多种所述基因表达水平的化合物。
表达KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中至少一种的细胞包括，例如建立自NSCLC细胞的细胞系；所述细胞可用于本发明的上述筛选(例如，A549、NCI-H226、NCI-H522、LC319)。可通过本领域技术人员熟知的方法评估表达水平。在筛选方法中，降低至少一种所述基因表达水平的化合物可选择作为用于NSCLC治疗或预防的候选试剂。
另外，本发明的筛选方法可包括下列步骤(a)将检测化合物与其中已导入载体的细胞接触，该载体包括一种或多种所述标记基因的转录调控区以及在所述转录调控区调控下表达的报告基因，其中所述标记基因选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1；(b)测量所述报告基因的活性；和
(c)相比对照，选择降低所述报告基因表达水平的化合物。
合适的报告基因和宿主细胞为本领域所熟知。筛选所必需的报告构建体可利用标记基因的转录调控区制备。当标记基因的转录调控区为本领域技术人员所已知时，可利用先前的序列信息制备报告构建体。当标记基因的转录调控区仍未经确认时，包含所述转录调控区的核苷酸片段可从基于所述标记基因核苷酸序列信息(例如，基于5′上游的序列信息)的基因组文库分离。
在本发明用于治疗或预防NSCLC的化合物筛选方法的另外的实施方案中，所述方法利用KIF11至KOC1，或GHSR1b或NTSR1至NMU的结合能力。
如上所述，本发明人揭示KOC1不仅与KIF11在人正常组织、NSCLC和细胞系中共定位，而且直接与体外NSCLC细胞中的KIF11相互作用，并且NSCLC细胞用针对KIF11的siRNA的处理降低其表达并且导致生长抑制。结果提示KOC1-KIF11信号传导影响NSCLC细胞的生长。因此，预计KOC1和KIF11间结合的抑制导致细胞增殖的抑制，并且抑制所述结合的化合物可用作治疗或预防NSCLC的药物。该筛选方法包括步骤(a)在检测化合物存在时将KIF11多肽或其功能等同物与KOC1或其功能等同物接触；(b)检测所述多肽和KOC1之间的结合；和(c)选择抑制所述多肽和KOC1之间结合的检测化合物。
此外，如上所述，本发明人揭示了GHSR1b和NTSR1可能作为肺肿瘤中NMU生长-促进作用的靶标。本发明人揭示NMU-25结合细胞表面上的这些受体，并且NSCLC细胞用针对GHSR1或NTSR1的siRNA的处理降低受体的表达并且导致凋亡。结果提示NMU通过经GHSR1b和/或NTSR1起作用而影响NSCLC细胞的生长(图14)。因此，预计GHSR1b或NTSR1和NMU间结合的抑制导致细胞增殖的抑制，并且抑制所述结合的化合物可用作治疗或预防NSCLC的药物。该筛选方法包括步骤(a)在检测化合物存在时将GHSR1b或NTSR1多肽或其功能等同物与NMU接触；(b)检测所述多肽和NMU之间的结合；和(c)选择抑制所述多肽和NMU之间结合的检测化合物。
用于筛选的KOC1和KIF11多肽，或GHSR1b或NTSR1和NMU多肽可以是重组多肽或源自天然的蛋白质，或还可以是其部分肽，只要其维持相互结合的能力。维持结合能力的所述部分肽此处称为“功能等同物”。用于所述筛选的KOC1和KIF11多肽，或GHSR1b或NTSR1和NMU多肽可以为，例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、结合至载体的形式或与其他多肽融合的融合蛋白。
作为筛选抑制KOC1和KIF11，或GHSR1b或NTSR1和NMU之间结合的化合物的方法，可利用本领域技术人员熟知的许多方法。所述筛选可作为体外测定系统进行，例如在细胞系统中。更具体地，首先，KOC1或KIF11，或者GHSR1b或NTSR1，或NMU结合至支持物，并且另一种蛋白质与检测化合物一起添加至此。然后，温育、洗涤混合物，并且检测和/或测量结合至支持物的另一种蛋白质。
可用于结合蛋白质的支持物的例子包括不溶的多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；以及合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选可利用用上述材料制备的可买到的珠和平皿(例如，多孔平皿，生物传感器芯片等等)。当利用珠时，其可填充入柱中。或者，磁珠的利用也是本领域已知的，并且能通过磁性很容易地分离结合在珠上的蛋白质。
可根据常规方法将蛋白质结合至支持物，如化学键接和物理吸附。或者，蛋白质可通过特异性识别所述蛋白质的抗体结合至支持物。此外，也可通过抗生物素蛋白和生物素完成蛋白质与支持物的结合。
蛋白质之间的结合在缓冲液，例如但不限于，磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中进行，只要所述缓冲液不抑制蛋白质之间的结合。
本发明中，利用表面胞质团共振现象的生物传感器可用作用于检测或定量已结合蛋白质的设备。当使用所述生物传感器时，利用微小量的多肽并且无需标记(例如，BIAcore，Pharmacia)可实时观察到作为表面胞质团共振信号的所述蛋白质间的相互作用。因此，利用生物传感器如BIAcore可以评估KOC1和KIF11，或GHSR1b或NTSR1和NMU间的结合。
或者，KOC1或KIF11，或者GHSR1b或NTSR1，或NMU可经标记，并且结合的蛋白质的标记物可用于检测或测量已结合的蛋白质。具体地，预-标记其中一种所述蛋白质后，标记的蛋白质在检测化合物存在时与另一种蛋白质接触，并且随后在洗涤后根据标记物检测或测量已结合的蛋白质。
标记物质如放射性同位素(例如，3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(例如，荧光素异硫氰酸盐(FITC)、若丹明)和生物素/抗生物素蛋白可用于本方法中蛋白质的标记。当蛋白质用放射性同位素标记时，可通过液体闪烁法进行检测或测量。或者，用酶标记的蛋白质可通过添加所述酶的底物以检测底物的酶促变化，如生色而用吸光计检测或测量。此外，如果荧光物质用作标记物，结合的蛋白质可利用荧光光度计检测或测量。
此外，KOC1和KIF11，或GHSR1b或NTSR1和NMU的结合也可利用KOC1和KIF11，或GHSR1b或NTSR1和NMU的抗体检测或测量。例如，将固定于支持物上的KOC1多肽与检测化合物和KIF11接触后，温育和洗涤混合物，并且可利用KIF11的抗体进行检测或测量。或者，KIF11可固定于支持物上，而KOC1的抗体可用作所述抗体。当利用GHSR1b或NTSR1和NMU的组合时，GHSR1b或NTSR1多肽可固定于具有检测化合物和NMU的支持物上，温育和洗涤混合物，并且可利用NMU的抗体进行检测或测量。或者，NMU可固定于支持物上，而GHSR1b或NTSR1的抗体可用作所述抗体。
在本筛选中利用抗体的情况下，抗体优选用上述的其中一种标记物质标记，并且基于所述标记物质检测或测量。或者，KOC1或KIF11，或GHSR1b或NTSR1，或NMU的抗体可用作一抗，所述一抗可用标记物质标记的二抗检测。此外，可利用G蛋白或A蛋白柱检测或测量本发明筛选中结合至所述蛋白质的抗体。
另外，本发明筛选方法的另一实施方案中，可使用利用细胞的双-杂交体系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；thereferences“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields andSternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
双-杂交体系统中，例如，KOC1多肽融合至SRF-结合区域或GAL4-结合区域并且在酵母细胞中表达。结合KOC1多肽的KIF11多肽融合至VP16或GAL4转录活化区域并且也在检测化合物存在时在酵母细胞中表达。或者，KIF11多肽可融合至SRF-结合区域或GAL4-结合区域，并且KOC1多肽融合至VP16或GAL4转录活化区域。当GHSR1b或NTSR1和NMU的组合用于双-杂交体系统时，例如，GHSR1b或NTSR1多肽融合至SRF-结合区域或GAL4-结合区域并且在酵母细胞中表达。结合GHSR1b或NTSR1多肽的NMU多肽融合至VP16或GAL4转录活化区域并且也在检测化合物存在时在酵母细胞中表达。或者，NMU多肽可融合至SRF-结合区域或GAL4-结合区域，并且GHSR1b或NTSR1多肽融合至VP16或GAL4转录活化区域。当检测化合物不抑制KOC1和KIF11，或GHSR1b或NTSR1和NMU之间的结合时，两者的结合激活报告基因，使得可检测阳性克隆。
作为报告基因，除HIS3基因之外，可利用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、荧光素酶基因等等。
此外，当GHSR1b或NTSR1和NMU的组合用于所述筛选方法时，由于GHSR1b和NTSR1为在细胞表面上天然表达的多肽，在本筛选方法优选的实施方案中，所述多肽在活细胞的表面上表达。当多肽在活细胞表面上表达时，可通过检测引起肿瘤细胞生长刺激作用的自分泌和旁分泌信号传导的方法检测多肽和NMU之间的结合(Heasley，Oncogene 201563-1569(2001))。例如，GHSR1或NTSR1多肽和NMU之间的结合可通过下列检测(1)检测细胞中钙或cAMP的浓度(e.g.FLIPR分析，Biochem.Biophys.Res.Commun.276435-438，2000；Nature 40670-74，2000；J.Biol.Chem.27521068-21074，2000)；(2)检测多肽的活化；(3)检测多肽和G蛋白之间的相互作用(e.g.FLIPR assay，Biochem.Biophys.Res.Commun.276435-438，2000；Nature 40670-74，2000；J.Biol.Chem.27521068-21074，2000，或用125I标记的多肽的结合测定法)；(4)检测磷脂酶C或其下游途径的活化(Oncogene 201563-1569，2001)；(5)检测蛋白激酶级联的激酶的活化，如Raf、MEK、ERK和蛋白激酶D(PKD)(Oncogene 201563-1569，2001)；(6)检测酪氨酸激酶Src/Tec/Bmx-家族成员的活化(Oncogene 201563-1569，2001)；(7)检测Ras和Rho家族成员的活化，MAP家族JNK成员中成员的调节或肌动蛋白细胞骨架的重构(Oncogene 201563-1569，2001)；
(8)检测通过多肽活化介导的任何信号复合物的活化；(9)检测多肽亚细胞定位的变化，其包括多肽的配体-诱导的内在化/内吞(J.Cell Sci.，1132963-2975，2000；J.Histochem.Cytochem.481553-1563，2000；Endocrinology October 23，2003.as doi10.1210/en.2003-0974)；(10)检测多肽下游任何转录因子的活化或其下游基因的活化；和(11)检测细胞的细胞增殖、转化或任何其他的致癌表型。
任何检测化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清、发酵微生物的产物、来自海洋生物的提取物、植物提取物、纯化的或粗制的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然的化合物可用于本发明的筛选方法。本发明的检测化合物还可利用任何本领域已知的组合文库方法中的许多方法获得，包括(1)生物学文库，(2)可空间定位的平行的固相或液相文库，(3)需要反卷积(deconvolution)的合成文库的方法，(4)“一珠一化合物”文库方法和(5)利用亲和层析选择的合成文库方法。利用亲和层析选择的生物学文库方法限于肽文库，而另四种方法适用于肽、非-肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，Anticancer Drug Des.12145(1997))。用于分子文库合成的方法的实例可在本领域找到(DeWitt等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909(1993)；Erb等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422(1994)；Zuckermann等.，J.Med.Chem.372678(1994)；Cho等.，Science 2611303(1993)；Carell等.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059(1994)；Carell等.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061(1994)；Gallop等.，J.Med.Chem.371233(1994))。化合物文库可存在于溶液中(see Houghten，Bio/Techniques 13412(1992))或珠(Lam，Nature 35482(1991))，芯片(Fodor，Nature 364555(1993))，细菌(US Pat.No.5,223,409)，孢子(US Pat.No.5,571,698；5,403,484，and 5,223,409)，质粒(Cull等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865(1992))或噬菌体上(Scott and Smith，Science 249386(1990)；Delvin，Science 249404(1990)；Cwirla等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378(1990)；Felici，J.Mol.Biol.222301(1991)；US Pat.Application 2002103360)。根据本发明的筛选方法暴露于细胞或蛋白质的检测化合物可以是单个化合物或化合物的组合。当化合物组合用于本发明的筛选方法时，该化合物可按顺序或同时接触。
通过本发明的筛选方法分离化合物为抑制KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽活性的药物，用于治疗或预防导致例如细胞增生性疾病如NSCLC的疾病的候选物。其中通过本发明的筛选方法获得的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或替换而转换的化合物包括在通过本发明的筛选方法获得的化合物中。有效抑制过表达基因，即KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因表达的化合物认为具有临床益处并且可进一步检测其在动物模型或检验受试者中防止癌细胞生长的能力。
选择适于特定的个体的用于治疗和/或预防NSCLC的治疗剂个体遗传组成的差异可导致其代谢不同药物相对能力的差异。在受试者中代谢以充当抗-NSCLC剂的化合物可通过诱导受试者细胞中基因表达模式从癌症状态的特征至非-癌状态的基因表达模式特征的变化而证实自身。因此，此处公开的差异性表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因允许通过在源自所选择受试者的检测细胞(或检测细胞群体)中检测候选化合物而选择特别适用于受试者的假定的NSCLC治疗或预防抑制剂。
为了鉴定适于特定的受试者的抗-NSCLC剂，源自受试者的检测细胞或检测细胞群体暴露于治疗剂并且确定KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因中一种或多种的表达。
检测细胞或检测细胞群体包含表达NSCLC-相关基因的NSCLC细胞。优选，检测细胞或检测细胞群体包含肺细胞。例如，检测细胞或检测细胞群体在候选剂存在时温育并且测量检测细胞或细胞群体的基因表达模式，且与一个或多个参照分布型，例如NSCLC参照表达分布型或非-NSCLC参照表达分布型比较。
检测细胞或检测细胞群体中KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中一种或多种的表达相对于含有NSCLC的参照细胞群体的降低指示该试剂为治疗性的。
检测试剂可以为任何化合物或组合物。例如，检测试剂为免疫调节剂。治疗或预防NSCLC的方法本发明提供筛选用于治疗、减轻或预防受试者中NSCLC的方法。治疗化合物预防性地或治疗性地给予患有NSCLC或处于发生NSCLC风险中(或对发生NSCLC易感)的受试者。所述受试者利用标准的临床方法或通过检测KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因或多肽异常的表达或活性水平而确定。预防性的给予在疾病明显的临床症状体现之前进行，使得疾病或病症的进展得到预防或者延缓。
该方法包括降低基因的一种或多种基因产物的表达或功能或两者，相对于来自NSCLC细胞来源的相同的组织类型的正常细胞，该基因的表达在NSCLC细胞中异常提高(“过表达的基因”；KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因)。该表达可通过本领域已知的任何方法抑制。例如，受试者可用降低受试者中KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因中一种或多种的量的有效量的化合物治疗。化合物的给予可以是全身的或局部的。所述治疗性的化合物包括降低内源性地存在于NSCLC细胞中的所述基因的表达水平的化合物(即，下调过表达基因KIF11、GHSR1b和/或NTSR1基因表达的化合物)。所述治疗性化合物的给予在受试者NSCLC细胞中对抗异常-过表达基因的作用并且预计改善受试者的临床病情。所述化合物可通过本发明上述的筛选方法获得。
本发明的调节由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的蛋白质活性、并可用于治疗或预防NSCLC的化合物除了蛋白质，包括这些蛋白质的天然-存在的同性质的配体、肽、肽模拟物和其他小分子。
或者，这些过表达基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1和/或FOXM1)的表达可通过给予受试者抑制或拮抗所述过表达基因表达的核酸而抑制。反义寡核苷酸、siRNA或核酶，其破坏所述过表达基因的表达，可用于抑制过表达基因的表达。
如上所述，对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的任何核苷酸序列的反义-寡核苷酸可用于降低所述基因的表达水平。对应于在NSCLC中上调的KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的反义-寡核苷酸可用于NSCLC的治疗或预防。具体地，所述基因的反义-寡核苷酸可通过结合任何由这些基因编码的相应的多肽，或其相应的mRNA，由此抑制所述基因的转录或翻译，促进mRNA的降解，和/或抑制由KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1核苷酸编码的蛋白质的表达，并且最后抑制所述蛋白质的功能而起作用。如此处所用的术语“反义-寡核苷酸”包括与靶序列完全互补的核苷酸和具有一个或多个核苷酸错配的那些核苷酸，只要反义-寡核苷酸可特异性杂交靶序列。例如，本发明的反义-寡核苷酸包括与KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的任何核苷酸序列的超过至少15个连续核苷酸直至全长序列具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高的同源性(也称为序列同一性)的多核苷酸。本领域已知的算法可用于确定同源性。此外，反义-寡核苷酸的衍生物或修饰的产物也可用作本发明的反义-寡核苷酸。修饰产物的例子包括低烷基膦酸修饰物如甲基膦酸盐型或乙基膦酸盐型，硫代磷酸酯修饰物和氨基磷酸盐修饰物。
本发明的siRNA分子也可通过其特异性杂交来自此处公开的基因的mRNA或cDNA的能力而限定。对于本发明的目的术语“杂交”或“特异性杂交”用于指两种核酸分子在“严谨杂交条件”下杂交的能力。短语“严谨杂交条件”指在该条件下核酸分子杂交至通常在核酸复杂混合物中的靶序列，而对于其他序列不能检测到的条件。严谨条件为序列-依赖性的并且在不同环境中不同。较长的序列在高温时特异性杂交。在Tijssen Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，中查找核酸杂交的广泛指导，“杂交原理和核酸检测策略概述”(1993)。通常，选择严谨条件为在确定的离子强度pH时比具体序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为与靶标互补的探针中的50％以平衡状态杂交至靶序列(因为靶序列过量存在，Tm时，50％的探针以平衡状态被占据)时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件还可通过去稳定剂如甲酰胺的添加而实现。对于选择性的或特异性的杂交，阳性信号至少为本底的两倍，优选10倍于本底杂交。例证性的严谨杂交条件如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃温育，或5×SSC、1％SDS，在65℃温育，用0.2×SSC和0.1％SDS在50℃洗涤。反义-寡核苷酸和其衍生物通过结合编码所述蛋白质的DNA或mRNA，抑制其转录或翻译，促进mRNA的降解以及抑制蛋白质的表达，由此导致蛋白质功能的抑制而对产生由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的蛋白质的细胞起作用。
反义-寡核苷酸和其衍生物可通过与对衍生物无活性的合适的基底材料混合而制成外用制剂，如搽剂或泥罨剂。
本发明的反义-寡核苷酸抑制至少一种通过KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的任何一种编码的蛋白质的表达，以及因此可用于抑制蛋白质的生物学活性。
抑制过表达基因的一种或多种基因产物的多核苷酸还包括小干扰RNA(siRNA)，其包括编码由KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因编码的过表达蛋白质的核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸组合。术语“siRNA”指防止目的mRNA翻译的双链RNA分子。将siRNA导入细胞的标准技术可用于本发明的治疗或预防，包括其中DNA为RNA转录模板的那些。构建siRNA使得单个转录本具有来自目的基因的有义和互补的反义序列，例如发夹。
该方法用于抑制具有KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因上调表达的细胞的基因表达。靶细胞中siRNA结合至KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因转录本导致KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白质经细胞生产的降低。寡核苷酸的长度为至少约10个核苷酸并且可以是天然存在的转录本一样长。优选寡核苷酸为约19个至约25个核苷酸长度。最优选，寡核苷酸为小于约75个，约50个或约25个核苷酸的长度。本发明优选的siRNA包括作为靶序列的具有SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108核苷酸序列的多核苷酸，其全部证实可有效用于抑制NSCLC细胞系的细胞存活力。具体地，用于本发明的优选siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’其中[A]为对应于KIF11、NTSR1或FOXM1靶序列的核糖核苷酸序列；[B]为由约3个至约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；以及[A’]为与[A]互补的核糖核苷酸序列。在此，短语“KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的靶序列”指当导入NSCLC细胞系中时，可有效用于抑制细胞存活力的序列。KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因优选的靶序列包括包含SEQ ID NO32、33、34、35、36、37和108的核苷酸序列。互补序列[A’]和[A]相互杂交形成双链，并且具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的完整siRNA分子形成发夹环结构。如此处所用的，术语“互补的”指多核苷酸的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，并且核苷酸单元的杂交或结合表明在形成含有极少或无错配的稳定双链体(双链构型)的合适条件下该单元之间的物理或化学相互作用。在一优选的实施方案中，所述双链体包含每10个碱基对不超过1个错配。尤其优选的双链体为完全互补的并且不包含错配。用于本发明的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因mRNA的siRNA包含比KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因整个mRNA短的靶序列，并且具有整个长度为500个、200个或75个核苷酸的序列。本发明还包括含有此处所述一种或多种核酸的载体，以及含有该载体的细胞。本发明分离的核酸可用于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的siRNA或编码siRNA的DNA。当核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选长于约19个核苷酸，并且更优选长于约21个核苷酸。
此外，可利用可从Ambion网址获得的(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)siRNA设计计算机程序设计siRNA的核苷酸序列。通过计算机程序根据下列方案选择用于siRNA的核苷酸序列siRNA靶位点的选择1.从转录本的AUG起始密码子开始，向下游搜索AA二核苷酸序列。记录每个AA的存在以及作为潜在siRNA靶位点的3′附近的19个核苷酸。Tuschl，等Genes Dev 13(24)3191-7(1999)不建议针对5′和3′非翻译区(UTR)以及靠近起始密码子(75个碱基内)的区域设计siRNA，因为这些可能富含调节蛋白结合位点，并且针对这些区域而设计的核酸内切酶和siRNA的复合物可能干扰UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物的结合。
2.将潜在的靶位点与人基因组数据库比较并且排除考虑任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列。可利用BLAST进行同源性搜索，其可在NCBI的服务器上www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。
3.选择用于合成的合格的靶序列。在Ambion的网址上，可沿用于评估的基因长度选择一些优选的靶序列。
siRNA抑制过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的表达并且由此可用于抑制该蛋白质的生物学活性。为此，包含siRNA的组合物可用于治疗或预防非小细胞肺癌。
抑制过表达基因KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的一种或多种基因产物的核酸还包括针对该基因的核酶。
核酶抑制过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的表达并且由此可用于抑制该蛋白质的生物学活性。因此，包含核酶的组合物可用于治疗或预防NSCLC。
通常，核酶分为大核酶和小核酶。大核酶称为裂解核酸磷酸酯键的酶。与大核酶反应后，反应位点由5’-磷酸和3’-羟基组成。大核酶进一步分为(1)在5’-剪接位点通过鸟嘌呤核苷催化酯基转移的I组内含子RNA；(2)经套索结构通过两步反应催化自剪接的II组内含子RNA；和(3)在5’位点通过水解裂解tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组分。另一方面，小核酶具有比大核酶小的大小(约40bp)并且裂解RNA以产生5’-羟基和2’-3’环磷酸。锤头形核酶(Koizumi等.，FEBSLett.228225(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323349(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic AcidsRes.196751(1992))归入小核酶中。用于设计和构建核酶的方法为本领域所知(参见Koizumi等.，FEBSLett.228225(1988)；Koizumi等.，NucleicAcids Res.177059(1989)；Kikuchi and Sasaki，NucleicAcids Res.196751(1992))并且可基于编码KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的核苷酸序列的序列信息，根据产生核酶的常规方法构建抑制过表达NSC蛋白表达的核酶。
核酶抑制过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白的表达并且由此可用于抑制该蛋白质的生物学活性。因此，包含核酶的组合物可用于治疗或预防NSCLC。
或者，过表达基因的一种或多种基因产物的功能通过给予结合或者抑制该基因产物功能的化合物而抑制。例如，化合物为结合过表达基因产物或基因产物的抗体。
本发明涉及抗体的用途，尤其是由任何上调基因KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1编码的蛋白质的抗体，或该抗体的片段。如此处所用的，术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其具有特异性地与包含用于合成抗体的抗原(即，上调的基因产物)的分子或与与之密切相关的抗原互相作用(结合)的特定结构。结合过表达KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1核苷酸的抗体可以是任何形式，如单克隆或多克隆抗体，并且包括通过用该多肽免疫动物如兔而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，人抗体和通过遗传重组产生的人源化的抗体。此外，用于本发明治疗或预防NSCLC方法中的抗体可以是抗体的片段或修饰的抗体，只要其结合一种或多种由标记基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因)编码的蛋白质。用于本治疗或预防NSCLC方法中的抗体和抗体片段可经修饰，并且包括化学修饰的和嵌合抗体。可根据上文所述的方法获得所述抗体和抗体片段。
当获得的抗体给予人体时(抗体治疗)，人抗体或人源化抗体优选用于降低免疫原性。
例如，具有全部人抗体基因的转基因动物可用如KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽、表达该多肽的细胞或其裂解物免疫。随后从动物收集抗体产生细胞并且与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，该多肽的人抗体可从其制备(参见WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735和WO96-34096)。
或者，产生抗体的免疫细胞，如免疫的淋巴细胞可经致癌基因永生化并且用于制备单克隆抗体。
本发明提供利用过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体治疗或预防NSCLC的方法。根据该方法，给予药学有效量的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体。以足以降低KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1蛋白活性的剂量给予过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体。或者，结合肿瘤细胞特定的细胞表面标志物的抗体可用作给药工具。因此，例如，与细胞毒剂偶联的过表达的KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体可以足以损害肿瘤细胞的剂量给予。
此外，此处公开的蛋白质的显性负性突变体可用于治疗或预防NSCLC。例如，可利用特异性结合KIF11的KOC1的片段。如此处所用的“KOC1的显性负性片段”为KOC1的突变形式，其能与KIF11或转运的RNA络合而使得复合物的RNA转运蛋白活性削弱。因此，显性负性片段为功能不等同于全长KOC1多肽的片段。优选的显性负性片段为包括KOC1的至少一个RRM结构域的那些。或者，在另一实施方案中，显性负性片段具有两个RRM结构域以及零至三个KH结构域。例如KOC1DEL2(2xRRM+2xKH)和KOC1DEL3(2xRRM，无KH)为用于显性负性作用的优选片段。KOC1DEL2和KOC 1DEL3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO105的位点1至406和1-197组成。片段通常小于约300个氨基酸，通常小于约200个氨基酸。
本发明还涉及治疗或预防受试者中NSCLC的方法，包括给予所述受试者包含由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸或其片段的疫苗。多肽的给予在受试者中诱导抗-肿瘤免疫。因此，本发明进一步提供用于诱导抗肿瘤免疫的方法。多肽或其免疫活性片段可有效用作NSCLC的疫苗。有时蛋白质或其片段可以结合T细胞受体(TCR)的形式或呈递于抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞、树突状细胞(DC)或B细胞上的形式给予。由于DC强的抗原呈递能力，利用DC为APC中最优选的。
本发明中，术语“针对NSCLC的疫苗”指接种入动物中后具有诱导抗-肿瘤免疫或免疫性以抑制NSCLC的功能的物质。通常，抗-肿瘤免疫包括如下的免疫应答-针对肿瘤的细胞毒淋巴细胞的诱导，-识别肿瘤的抗体的诱导，和-抗-肿瘤细胞因子产生的诱导。
因此，当某些蛋白质在接种入动物中后诱导这些免疫应答的任何一项时，判断该蛋白质具有抗-肿瘤免疫的诱导作用。可通过体内或体外观察宿主免疫系统对该蛋白质的应答而检测蛋白质对抗肿瘤免疫的诱导。
例如，用于检测细胞毒T淋巴细胞的诱导方法为大家所熟知。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递至T细胞和B细胞。由于该抗原的刺激作用，对由APC呈递的抗原回答的T细胞以抗原特定的方式分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒T淋巴细胞；CTL)，并且随后增殖(此称为T细胞的活化)。因此，CTL经某些肽的诱导可通过将该肽经APC呈递至T细胞，并且检测CTL的诱导而评估。此外，APC具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性白细胞和NK细胞的作用。由于CD4+T细胞在抗-肿瘤免疫中也很重要，可利用作为指示物的这些细胞的活化效果评估该肽的抗-肿瘤免疫诱导作用。
利用树突状细胞(DC)作为APC评估CTL诱导作用的方法为本领域熟知。DC为APC中具有最强CTL诱导作用的代表性的APC。该方法中，检测多肽开始与DC接触并且随后DC与T细胞接触。检测与DC接触后对靶细胞具有细胞毒作用的T细胞表明检测多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。可例如利用作为指示物的51Cr标记的肿瘤细胞的溶解检测CTL对肿瘤的活性。或者，利用3H-胸苷摄入活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指示物评估肿瘤细胞损伤程度的方法也是熟知的。
除了DC，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。报道通过在GM-CSF和IL-4存在时培养PBMC而增强CTL的诱导。类似地，显示CTL通过在钥孔血蓝素(KLH)和IL-7存在时培养PBMC得到诱导。
通过这些方法证实的具有CTL诱导活性的检测多肽为具有DC活化作用以及随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可有效用作NSCLC的疫苗。此外，通过与多肽接触而获得诱导针对NSCLC的CTL能力的APC可用作NSCLC的疫苗。此外，由于多肽抗原通过APC的呈递而获得细胞毒性的CTL也可用作NSCLC的疫苗。利用APC和CTL的抗-肿瘤免疫而用于NSCLC的所述治疗方法称为细胞免疫疗法。
通常，当利用用于细胞免疫疗法的多肽时，已知通过结合多个具有不同结构的多肽并且将其与DC接触提高CTL-诱导的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，利用多个类型片段的混合物是有利的。
或者，抗-肿瘤免疫通过多肽的诱导可通过观察肿瘤抗体产生的诱导而证实。例如，当多肽的抗体在用多肽免疫的实验动物中诱导时，并且当肿瘤细胞的生长、增殖或转移受那些抗体抑制时，可确定该多肽具有诱导抗-肿瘤免疫的能力。
抗-肿瘤免疫通过给予本发明的疫苗而诱导，并且抗-肿瘤免疫的诱导能够治疗和预防NSCLC。NSCLC的治疗或NSCLC发作的预防包括任何阶段，如NSCLC细胞生长的抑制，NSCLC细胞的退化和NSCLC细胞出现的抑制。患有NSCLC的个体死亡率的降低，血液中标记基因(除KIF11、GHSR1b和/或NTSR1基因之外)的降低，伴随NSCLC的可检测症状的减轻等等也包括在NSCLC的治疗或预防内。所述治疗和预防作用优选统计上显著的。例如，观察中，在5％或更低的显著水平时，其中NSCLC疫苗的治疗或预防作用与无疫苗给予的对照相比较。例如，Student’s t检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA可用于统计分析。
上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的多核苷酸或载体可与佐剂结合。佐剂指当与具有免疫活性的蛋白质一起(或依次)给予时增强对该蛋白质免疫应答的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等等，但不限于此。此外，本发明的疫苗可适当地与药学可接受载体结合。所述载体的例子为无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等等。此外，根据需要该疫苗可包含稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。疫苗全身或局部给予。疫苗的给予可通过单次给予进行或通过多次给予而增强。
当利用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可例如通过先体外后体内的方法治疗或预防NSCLC。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，该细胞与多肽先体外后体内接触，并且随后诱导APC或CTL，所述细胞可给予受试者。APC也可通过将编码所述多肽的载体先体外后体内导入PBMC而诱导。体外诱导的APC或CTL可在给予之前克隆。通过克隆和培养具有破坏靶细胞的高活性的细胞，可更有效地完成细胞免疫疗法。此外，以该方式分离的APC和CTL可用于不仅针对所述细胞来源的个体，而且针对其他个体相似类型疾病的细胞免疫疗法。
此外，本发明提供治疗或预防受试者中NSCLC的方法，其中根据任何上述筛选方法获得的化合物给予受试者。根据本发明的任何筛选方法获得任何化合物可给予受试者，只要其降低KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的一种或多种基因产物的表达或功能或其两者。
siRNA和编码其的载体表达用于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的siRNA的载体的转染导致NSCLC细胞的生长抑制。因此，本发明的另一方面提供包含有义-链和反义-链的双-链分子(该分子作为KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的siRNA起作用)以及编码所述双-链分子的载体。
本发明的所述双-链分子包括有义链和反义链，其中有义链包括对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中反义链包括与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双-链分子，并且其中所述双-链分子当导入表达KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的细胞时，抑制所述基因的表达。
本发明的所述双-链分子可以是源自其原始环境的多核苷酸(即，当其为天然存在的分子时的天然环境)，从其天然状态经物理或化学改变的，或化学合成的。根据本发明，所述双-链分子包括由DNA、RNA和其衍生物组成的那些。DNA适当地由碱基如A、T、C和G组成，在RNA中T由U代替。
如上所述，术语“互补的”指多核苷酸的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，并且核苷酸单元的杂交或结合表明在形成含有极少或无错配的稳定双链体(双链构型)的合适条件下该单元之间的物理或化学相互作用。在一优选的实施方案中，所述双链体包含每10个碱基对不超过1个错配。尤其优选的双链体为完全互补的并且不包含错配。
本发明的所述双-链分子包含比KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的完整mRNA短的对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列的核糖核苷酸序列。在此，短语“KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的目的序列”指当导入NSCLC细胞系中时，可有效用于抑制细胞存活力的序列。具体地，靶序列包括来自选自SEQ ID NO1、3、5或106中的一种或多种的核苷酸序列的至少约10个，或适当地约19个至约25个连续的核苷酸。即，本双链分子的有义链由至少约10个核苷酸，适当地长于19个核苷酸，并且更优选长于21个核苷酸组成。优选的靶序列包括SEQ ID NO32、33、34、35、36、37和108的序列。包括有义链和反义链的本双-链分子为短于约100个，优选75个，更优选50个并且最优选25个核苷酸长度的寡核苷酸。本发明合适的双-链分子为约19个至约25个核苷酸长度的寡核苷酸。此外，为了增强siRNA的抑制活性，核苷酸“u”可加至靶序列反义链的3’端。添加的“u”的数目为至少2个，通常2至10个，优选2至5个。添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子通常如上所述对反义分子进行修饰。其他修饰也是可能的，例如胆固醇-偶联的siRNA显示改进的药理学性能(Song等.Nature Med.9347-351(2003))。
此外，本发明的双-链分子可以是包括经单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链的单个核糖核苷酸转录本。即，本双-链分子可具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’其中[A]为对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列的核糖核苷酸序列；[B]为由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列(环序列)；和[A’]为与[A]互补的核糖核苷酸序列。互补序列[A’]和[A]相互杂交形成双链，并且具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的完整siRNA分子形成发夹环结构。
区域[A]杂交[A’]，并且随后形成由区域[B]组成的环。环序列可选自http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html中所述的，或Jacque，J.-M.等.Nature 418435-438(2002)中所述的那些。可包括在本双-链分子内的环序列的另外的例子包括CCC、CCACC或CCACACCJacque，J.M.等.，Nature，Vol.418435-438(2002)；UUCGLee，N.S.等.，Nature Biotechnology 20500-505(2002)；Fruscoloni，P.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)1639-1644(2003)；和UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.等.，.Nature Reviews Molecular CellBiology 4457-467(2002)。
本发明优选的具有发夹环结构的siRNA显示如下。下列结构中，环序列可选自CCC、UUCG、CCACC、CCACACC或UUCAAGAGA中的一种或多种。这些序列当中，最优选的环序列为UUCAAGAGA(对应DNA中的“ttcaagaga”)guuaguguac gaacuggag-[B]-cuccaguuc guacacuaac(用于SEQ ID NO32的靶序列)；gugucucugu uggagaucu-[B]-agaucucca acagagacac(用于SEQ ID NO33的靶序列)；gaaggcaguu gaccaacac-[B]-guguugguc aacugccuuc(用于SEQ ID NO34的靶序列)；ccucuaccug uccagcaug-[B]-caugcugga cagguagagg(用于SEQ ID NO35的靶序列)；guucaucagc gccaucugg-[B]-ccagauggc gcugaugaac(用于SEQ ID NO36的靶序列)；ggucgucaua caggucaac-[B]-guugaccug uaugacgacc(用于SEQ ID NO37的靶序列)；和gcagcagaaa cgaccgaau-[B]-auucggucg uuucugcugc(用于SEQ ID NO108的靶序列)。
本发明进一步提供编码本发明双-链分子的载体。该载体编码具有二级结构的转录本并且其包括有义链和反义链，并且适当地包括连接有义链和反义链的单链核糖核苷酸序列。该载体优选包括邻近编码本双-链分子区域的调控序列，该调控序列指导该分子在合适细胞中的表达。例如，本发明的双-链分子为通过将其编码序列克隆入载体而胞内转录的，该载体包含例如，来自小核RNA(snRNA)U6的RNA pol III转录单元或人H1 RNA启动子。
或者，该载体例如通过将靶序列克隆入表达载体以使目标序列以允许其表达(DNA分子的转录)的方式可操作连接至载体的调控序列而产生(Lee，N.S.等.，Nature Biotechnology 20500-505(2002))。例如，具有靶序列反义序列的RNA分子的转录由第一个启动子(例如，连接至所克隆DNA 3’-端的启动子)驱动并且具有靶序列有义链的RNA分子的转录由第二个启动子(例如，连接至所克隆DNA 5’-端)的启动子序列驱动。表达的有义和反义链在体内相互杂交而产生siRNA构建体以沉默包括所述靶序列的基因。此外，可分别利用两个构建体(载体)产生siRNA构建体的有义和反义链。
为了将载体导入细胞，可利用转染-增强剂。FuGENE(Rochediagnostices)，脂质转染胺2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)作为转染-增强剂是有用的。治疗或预防NSCLC的药物组合物本发明提供用于治疗或预防NSCLC的组合物，其包括通过筛选改变NSCLC-相关基因表达或活性的化合物的方法而选择的化合物。
当给予通过本发明的筛选方法分离的，作为用于人和其他哺乳动物，如小鼠、大鼠、荷兰猪、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒或黑猩猩的药物而治疗细胞增殖性疾病(例如，非小细胞肺癌)的化合物时，所述分离的化合物可直接给予或利用常规的药物制备方法配制为剂型。该组合物的所述药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔的和经舌的)、阴道或肠胃外(包括肌内的、皮下的和静脉内的)给予的那些或用于通过吸入或吹入给予的那些剂型。剂型可选择性地包装为分散的剂量单位。
适于口服的药物制剂包括胶囊剂、扁囊剂或片剂，每种包含预定量的活性组分。制剂也包括粉剂、粒剂、溶液、悬浮液或乳剂。活性组分选择性地作为丸剂、药糖剂、或糊剂给予。用于口服的片剂和胶囊剂可包含常规的赋形剂如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可通过任选地与一种或多种配制组分压缩或铸模而制备。可通过将以自由流动形式如粉剂或粒剂的活性组分，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑的、表面活性或分散剂混合而在合适的机器中压缩以制备压制片。模制片可通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物在合适的机器中铸模而制备。片剂可根据本领域熟知的方法包衣。口服液体制剂可以是例如，水性的或油性的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂形式，或可以以在使用前用水或其他合适的赋形剂重构的干产物存在。所述液体制剂可包含常规的添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体(其可包括可食用油)或防腐剂。可选择性地配制片剂以提供活性组分在体内缓慢或受控制的释放。片剂包装可包含每月需要的一个片剂。这些制剂中的药物的制剂或剂量得到在指定范围内的可获得的合适剂量。
用于肠胃外给药的剂型包括水性的和非水的无菌注射溶液，其可包含抗-氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得该制剂与指定受体的血液等渗的溶质；以及水性的和非水的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和稠化剂。制剂可以单元剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以冷冻干燥(冻干)的状况保存，马上使用之前仅需添加无菌的液体载体，例如盐水、用于注射的水。或者，制剂可用于连续输液而存在。可从之前所述的无菌粉剂、粒剂和片剂类型制备临时的注射溶液和悬浮液。
用于直肠给予的制剂包括具有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂。用于口中，例如向颊或舌下局部给予的制剂包括糖锭，其包含在调味基质如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性组分，以及包括在基质如凝胶、甘油、蔗糖或阿拉伯胶中的活性组分的锭剂。对于活性组分的鼻内给予，可利用液体喷雾或可分散性粉剂或滴剂的形式。滴剂可用还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性的或非水的基质配制。
用于通过吸入给予的组合物通过吹入器、喷雾器、密封的包装或其他方便的投递气雾剂喷雾的设备方便地投递。密封的包装可包括合适的挥发剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在密封的气雾剂的情况下，可通过提供投递可计量的量的阀而确定剂量单位。
或者，对于通过吸入或吹入的给药，组合物可采取干粉组合物的形式，例如活性组分和合适的粉剂基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂型存在，例如以胶囊剂、弹药、凝胶或其中粉末可借助于吸入器或吹入器给予的薄膜包装的单位剂型。
其他的制剂包括可移植的装置和释放治疗剂的粘附膜片。
当需要时，可采用适合活性组分持续释放的上述制剂。该药物组合物还可包含其他的活性组分如抗菌剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应了解的是除了尤其上述的组分外，本发明的制剂可包括考虑所述制剂类型而在本领域中常规的其他试剂，例如适于口服的那些可包括调味剂。
优选的单位剂量制剂为那些包含如下所述有效量的活性组分或其合适的级分的制剂。
对于上述每种情况，组合物，例如多肽和有机化合物以每天约0.1至约250mg/kg的剂量口服或通过注射给予。用于成人的剂量范围通常为约5mg至约17.5g/天，优选约5mg至约10g/天，并且最优选约100mg至约3g/天。以分散的单位提供的片剂或其他单位剂量形式可方便地包含在所述剂量时或作为多个相同剂量时有效的量，例如包含约5mg至约500mg，通常约100mg至约500mg的单位。
采用的剂量取决于因素的数目，包括受试者年龄和性别，所治疗的精确病症以及其严重程度。同时给药途径可根据病情和其严重程度改变。
本发明进一步提供用于治疗或预防NSCLC的组合物，其包含抑制选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的任何一个基因表达的活性组分。所述活性组分可以为针对该基因的反义-寡核苷酸、siRNA或核酶，或衍生物，如反义-寡核苷酸、siRNA或核酶的表达载体。活性组分可通过与对衍生物无活性的合适的基底材料混合而制成外用制剂，如搽剂或泥罨剂。
此外，如需要，活性组分可通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、防腐剂、镇痛剂等等而制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂、脂质体胶囊剂、注射剂、溶液、鼻滴剂和冻干剂。这些可根据用于制备含有核酸的药物的常规方法制备。
优选，反义-寡核苷酸衍生物、siRNA衍生物或核酶衍生物通过直接施加至生病部位或通过注射入血管而使其到达疾病部位而给予患者。封固剂也可用于组合物中以提高耐久性和膜-可通透性。封固剂的例子包括脂质体、聚L-赖氨酸、脂类、胆固醇、lipofectin和其衍生物。
所述组合物的剂量可根据患者病情和所需的用量而适当地调整。例如，给予0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg的剂量范围。
本发明的另一个实施方案为用于治疗或预防NSCLC的组合物，其包含针对由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1基因的任何一个编码的多肽的抗体或结合该多肽的抗体片段。
虽然根据症状存在一些差异，当口服给予正常的成人(60kg体重)时，用于治疗或预防NSCLC的抗体或其片段的剂量为每天约0.1mg至约100mg，优选每天约1.0mg至约50mg并且更优选每天约1.0mg至约20mg。
当以注射至正常成人(60kg体重)的形式肠胃外给予时，虽然根据患者的病情，疾病的症状和给予的方法而存在一些差异，适当的静脉内注射剂量为每天约0.01mg至约30mg，优选每天约0.1至约20mg并且更优选每天约0.1至约10mg。同样，在其他动物的情况下，给予转换成60kg体重的量是可能的。
给出下列实例以举例说明本发明并且帮助普通技术人员制备和使用其。实例并不试图以任何方式限制本发明的范围。
除非另外规定的，此处所用的所有技术和科学名词具有本发明所属本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与此处所述的那些相似的或同等的方法和材料可用于本发明的实践或检验，底下描述了合适的方法和材料。此处引用的任何专利、专利申请和出版物通过引用并入本文。
实施本发明的最佳方式材料和方法(1)患者和组织样品早前经知情同意，从37个患者获得原发NSCLC样品，其中22个归为腺癌(ADC)，14个归为鳞状细胞癌(SCC)以及一个归为腺鳞癌(Kikuchi，T.等.，Oncogene 22，2192-2205(2003))。十五个额外的原发NSCLC(包括七个ADC和八个SCC)与来自在我们的研究所进行手术的患者的临近正常肺组织样品一起获得。
(2)细胞系用于该研究的30种人NSCLC和4种SCLC细胞系如下腺癌(ADC)A427、A549、NCI-H23、NCI-H522、LC174、LC176、LC319、PC3、PC9、PC 14、PC 14-PE6、NCI-H1373、NCI-H1435、NCI-H1793、SK-LU-1、NCI-H358、NCI-H1650和SW1573；腺鳞癌(ASC)NCI-H226、NCI-H596和NCI-H647；鳞状细胞癌(SCC)RERF-LC-AI、SW-900、SK-MES-1、EBC-1、LU61、NCI-H520、NCI-H1703和NCI-H2170；大-细胞癌(LCC)LX1；和SCLCDMS114、DMS273、SBC-3和SBC-5。人小气道上皮细胞，SAEC在购自Cambrex Bio Science Inc的优化的培养基(SAGM)中培养。还提供人支气管上皮细胞系，BEAS2B细胞。
34种人NSCLC或SCLC癌细胞系和两种正常的支气管表皮细胞系在补充有5或10％胎牛血清的合适培养基中以单细胞层培养(参见表1)。
表1
(3)半定量RT-PCR分析利用Trizol试剂(Life Technologies，Inc.)根据制造商的方案从培养的细胞和临床组织提取总RNA。提取的RNA和正常人组织聚(A)RNA用DNase I(Nippon Gene)处理并且利用寡(dT)引物和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)反-转录。半定量RT-PCR实验用下列合成的基因-特异性引物或用β-肌动蛋白(ACTB)-特异性引物作为内部对照进行KOC1，5’-TAAATGGCTTCAGGAGACTTCAG-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-GGTTTTAAATGCAGCTCCTATGTG-3’(SEQ.ID.NO.8)；KIF11，5’-CTGAACAGTGGGTATCTTCCTTA-3’(SEQ.ID.NO.9)和5’-GATGGCTCTTGACTTAGAGGTTC-3’(SEQ.ID.NO.10)；NMU，5’-TGAAGAGATTCAGAGTGGACGA-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-ACTGAGAACATTGACAACACAGG-3’(SEQ.ID.NO.12)；NMU1R，5’-AAGAGGGACAGGGACAAGTAGT-3’(SEQ.ID.NO.13)和5’-ATGCCACTGTTACTGCTTCAG-3’(SEQ.ID.NO.14)；
NMU2R，5’-GGCTCTTACAACTCATGTACCCA-3’(SEQ.ID.NO.15)和5’-TGATACAGAGACATGAAGTGAGCA-3’(SEQ.ID.NO.16)；GHSR1a，5’-TGGTGTTTGCCTTCATCCT-3’(SEQ.ID.NO.17)和5’-GAATCCCAGAAGTCTGAACA-3’(SEQ.ID.NO.18)；GHSR1b，5’-ACGGTCCTCTACAGTCTCA-3’(SEQ.ID.NO.19)和5’-CACAGGGAGAGGATAGGA-3’(SEQ.ID.NO.20)；NTSR1，5’-AGTGGGCTCAGAGTCTAGCAAAT-3’(SEQ.ID.NO.21)和5’-TATTGAGAGATACACGGGGTTTG-3’(SEQ.ID.NO.22)；GHRL，5’-TGAGCCCTGAACACCAGAGAG-3’(SEQ.ID.NO.23)和5’-AAAGCCAGATGAGCGCTTCTA-3’(SEQ.ID.NO.24)；NTS，5’-TCTTCAGCATGATGTGTTGTGT-3’(SEQ.ID.NO.25)和5’-TGAGAGATTCATGAGGAAGTCTTG-3’(SEQ.ID.NO.26)；ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ.ID.NO.27)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ.ID.NO.28)。
优化PCR反应的循环数以确保扩增对数期内的产物强度。
定量实时RT-PCR(QRT-PCR)分析和northern-印迹分析KOC1和KIF11基因的表达水平通过利用ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems)用QRT-PCR测量。利用Trizol试剂(LifeTechnologies，Inc.)根据制造商的方案从培养的细胞和临床组织提取总RNA。提取的RNA和正常人组织聚(A)RNA用DNase I(Nippon Gene)处理并且利用寡(dT)引物和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)反-转录。TaqMan Pre-Developed Assay Human ACTB(Applied Biosystems；#4333762F)用于作为定量对照的ACTB基因。通过利用Primer Express软件如下设计每种基因的引物对和TaqMan探针KOC1，5’-ACGAACTCATTTGCTCACTCCTT-3’(有义)(SEQ.ID.NO.98)，5’-ACCCACACCCAACACAATTGT-3’(反义)(SEQ.ID.NO.99)，5’-ACAGCAAAGCCC-3’(TaqMan-MGB探针)(SEQ.ID.NO.100)；KIF11，5’-TTCACCCTGACAGAGTTCACAAA-3’(有义)(SEQ.ID.NO.101)5’-GGGTGGTCTCCCATAATAGCAA-3’(反义)(SEQ.ID.NO.102)，5’-AGCCCACTTTAGAGTATAC-3’(TaqMan-MGB探针)(SEQ.ID.NO.103)。
用于每种基因和ACTB基因的PCR在单个试管中一式两份进行。结果表示为这两种独立检测的平均值。
(4)Northern-印迹分析人多组织斑点(BD Biosciences Clontech)与32P-标记的KOC1、KIF11和GHSR1的PCR产物杂交。KOC1、KIF11和GHSR1的cDNA探针通过利用类似于以上的引物的RT-PCR制备。预杂交、杂交和洗涤根据供应商的推荐进行。斑点用增强型BAS屏(BIO-RAD)在室温下(RT)放射自显影30至168小时。
抗-KOC1和抗-KIF11抗体的产生表达KOC1(全长)和KIF11(对应于密码子361-1056的部分氨基酸序列)的质粒(每种在N-末端包含His-标记的表位)利用pET28载体(Novagen)制备。重组蛋白质在大肠杆菌BL21密码子阳性株(Stratagene)中表达，利用TALON树脂(BD Biosciences Clontech)根据供应商的方案纯化，并且接种兔。根据标准方法在亲和柱上纯化免疫血清。亲和纯化的抗-KOC1和抗-KIF11抗体用于western-印迹分析、免疫沉淀和免疫染色。利用NCI-H520细胞的裂解物(其不表达内源性的IMP-1、-2和-3，但已用HA-标记的IMP-1、-2和-3表达载体转染)通过western-印迹分析证实抗-KOC1抗体特异于KOC1并且不与其他的同源蛋白质，IMP-1和IMP-2交叉反应。
KOC1缺失突变体的构建和用于鉴定KOC1-KIF11结合区域的免疫沉淀测定KOC1和其若干结构域(图3a)克隆入N-末端FLAG-标记的和C-末端HA-标记的pCAGGS载体的合适位点。仅用KOC1缺失突变体转染的COS-7细胞与抗-HA琼脂糖(SIGMA)免疫沉淀。内源性的KIF11条带用亲和-纯化的抗-KIF11抗体通过Western印迹法检测。
表3缺失突变体通过RT-PCR构建的引物序列
用于鉴定KOC1-相关mRNA的RNA-免疫沉淀和cDNA微阵列筛选我们采用Niranjanakumari等的RNA免疫沉淀方案(Niranjanakumari，S.等.Methods26，182-190(2002))分析体内涉及KOC1的RNA-蛋白质相互作用。从五个肺癌细胞系(A549、LC319、PC14、RERF-LC-AI和SK-MES-1)分离免疫沉淀的RNA。如之前所述，来自每种免疫沉淀RNA(IP-RNA)的基于T7扩增的RNA(aRNA)和来自总RNA(对照)的2.5-μg等分试样分别在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在时反转录，(Kikuchi，T.等.Oncogene 22，2192-2205(2003))，用于杂交至呈现32,256个基因的cDNA微阵列(IP-微阵列分析)。为了证实通过IP-微阵列分析确定的KOC1与mRNA的结合，利用基因-特异性引物进行RT-PCR实验并且用抗-KOC1抗体免疫沉淀来自NSCLC细胞提取物的RNA(IP-RT-PCR)。为了证实结合KOC1-相关mRNA必需的KOC1区域，还如下进行来自用不同的KOC1缺失突变体转染的免疫沉淀提取物的KOC1-相关mRNA的northwestern印迹分析和IP-RT-PCR。
表4 IP-RT-PCR的引物序列
Northwestern印迹分析来自用KOC1缺失突变体(μM)转染的细胞的免疫沉淀提取物在2xSDS-样品缓冲液中煮沸，通过10-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶(BIO-RAD)电泳并且转移至聚偏二氟乙二烯膜(Hybond-P)。膜随后在封闭缓冲液(10mM Tis-HCl(pH 7.8)，150mM NaCl，1mg/ml酵母tRNA)中室温下封闭1小时，并且用50ml的10mM Tris-HCl(pH 7.8)5分钟洗涤两次且与DIG-标记的RNA探针在5ml NWB缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.8)，1mMEDTA，50mM NaCl，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯基吡咯烷酮，0.02％BSA)中室温下温育2小时。膜用NWB缓冲液洗涤4次并且随后利用DIG核酸检测试剂盒(Roche)根据供应商的方案检测结合蛋白质的RNA探针。
KOC1和KIF11蛋白以及KOC1-相关RAB35 mRNA的活-细胞成像利用pECFP-N1载体(BD Biosciences Clontech)制备表达ECFP-融合的KOC1(ECFP-KOC1)蛋白的质粒。还利用pEYFP-N1载体(BD BiosciencesClontech)制备表达EYFP-融合的KIF11(EYFP-KIF11)蛋白的质粒。通过活细胞成像系统(Power IX81，OLYMPUS)和共聚焦显微镜(TCSSP2-AOB S，Leica Microsystems；FV1000 FLUOVIEW，OLYMPUS)捕捉用表达ECFP-KOC1或EYFP-KIF11蛋白的质粒转染的COS-7细胞的延时图象5-15小时。
利用DAVIS Lab’s方案(http://www.ed.ac.uk/～ilan)进行携带KOC1-相关基因RAB35全长cDNA序列的线性化质粒的体外转录。为了产生与KOC1体内共定位的荧光核糖探针(riboprobes)，利用mCAP RNA加帽试剂盒(Stratagene)在Alexa Fluor 546-标记的UTP(Molecular Probes)存在下转录质粒。利用pEGFP-N1载体(BD Biosciences Clontech)构建了表达EGFP-融合的KOC1(EGFP-KOC1)蛋白的质粒。为了进行共定位的EGFP-KOC1和Alexa Fluor 546-标记的RAB35 mRNA的活-细胞成像，最初已用pEGFP-KOC1转染的COS-7细胞36小时后用Alexa Fluor 546-标记的RAB35 mRNA(每个3.5-cm培养皿3μg)在RNase抑制剂(TAKARA)存在下另外转染。利用脂质转染胺2000(Invitrogen)根据制造商的方案转染质粒-DNA和RNA样品。细胞用PBS洗涤两次，并且在用标记的mRNA转染后90分钟添加新鲜的培养基。在用共聚焦显微镜(FV1000 FLUOVIEW，OLYMPUS)进行活-细胞成像3-6小时前，细胞在温箱(37℃，5％CO2)中恢复30分钟。为了研究mRNA通过KOC1-RNP复合物从一个细胞到另一个细胞的特异性转运，制备了两种不同的COS-7-来源的细胞；用pEGFP-KOC1和Alexa Fluor 546-标记的RAB35 mRNA转染的COS-7细胞和另一种，仅用CellTracker(MolecularProbes)根据供应商的方案标记的亲本COS-7细胞。在用共聚焦显微镜进行活-细胞成像6小时之前混合这两种细胞群体并且共培养12小时。
为了研究受体细胞中通过KOC1-RNP复合物转运的mRNA的翻译，制备了两种类型的COS-7-来源的细胞；一种类型为用pCAGGS-FLAG标记的-KOC1和-KIF11共转染的COS-7细胞。培养24小时后，包含EGFP-融合的RAB35全长mRNA的质粒再转染入这些细胞中。另一种类型为仅用CellTracker(蓝色)标记的COS-7细胞。在用录像显微镜进行活-细胞成像12小时之前混合这两种细胞类型并且共培养24小时。CellTracker-染色的受体细胞(蓝色)中以及这两种细胞之间特细的结构上EGFP-标记的RAB35mRNA和对应的蛋白质的合成通过原位杂交和延时录像显微镜检查检测。
荧光原位杂交用与RAB35或EGFP mRNA互补的DIG-标记的探针在60℃进行原位杂交16小时。利用碱性磷酸酶生色底物NBT-BCIP检测DIG标记。洗涤、固定且在光学显微镜上显现细胞。
固定的细胞与和RAB35mRNA互补的DIG-标记的混合物在50％甲酰胺/2X SSC中42℃杂交16小时。洗涤、固定且在共聚焦显微镜上显现细胞。
(5)RNA干扰测定为了制备表达短干扰RNA(siRNA)的质粒载体，通过利用一组引物，5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’(SEQ ID No44)和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQ ID No45)以及作为模板的人胎盘DNAPCR扩增包含启动子区域的H1RNA基因的基因组片段。利用TA克隆试剂盒根据供应商的方案(Invitrogen)纯化产物并且克隆入pCR2.0质粒载体。包含H1RNA的BamHI和XhoI片段位于pcDNA3.1(+)核苷酸1257和56之间，并且通过利用5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID No46)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID No47)的PCR扩增该片段。
连接DNA变成用于PCR扩增的模板，引物为5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQ ID No48)和5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQ ID No49)。
产物用HindIII消化，并且随后自连接而产生具有SEQ ID NO50所示核苷酸序列的psiH1BX3.0载体质粒。
编码siRNA的DNA片段插入如下列质粒序列(SEQ ID NO50)中用(-)所示的核苷酸489-492的缺口中。
利用30μl脂质转染胺2000(Invitrogen)，将10μg siRNA-表达载体转染入NSCLC细胞系A549和LC319中，两细胞系均内源性过表达KOC1、KIF11、NMU、GHSR1b、NTSR1、RAB35和FOXM1。超过90％的转染的细胞表达合成的siRNA，并且这些细胞中靶基因(KIF11、GHSR1b、NTSR1、RAB35或FOXM1)的内源性表达得到有效抑制。转染的细胞在合适浓度的遗传霉素(G418)存在下培养五天，并且随后通过吉姆萨染色和三次重复的MTT测定测量细胞数目和存活力。用于RNAi的合成的寡核苷酸的靶序列如下对照1(EGFP增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因，Aequoreavictoria EGFP的突变体)，5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.ID.NO.29)；对照2(荧光素酶Photinus pyralis荧光素酶基因)，5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’(SEQ.ID.NO.30)；对照3(Scramble编码5S和16S rRNA的叶绿体Euglena gracilis基因)，5’-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’(SEQ.ID.NO.31)；siRNA-KIF11-1(#1)，5’-GTTAGTGTACGAACTGGAG-3’(SE Q.ID.NO.32)；siRNA-KIF11-2(#2)，5’-GTGTCTCTGTTGGAGATCT-3’(SEQ.ID.NO.33)；siRNA-KIF 11-3(#3)，5’-GAAGGCAGTTGACCAACAC-3’(SEQ.ID.NO.34)；siRNA-GHSR-1(si-GHSR-1)，5’-CCTCTACCTGTCCAGCATG-3’(SEQ.ID.NO.35)；siRNA-NTSR1-1(si-NTSR1-1)，5’-GTTCATCAGCGCCATCTGG-3’(SEQ.ID.NO.36)；siRNA-NTSR1-2(si-NTSR1-2)，5’-GGTCGTCATACAGGTCAAC-3’(SEQ.ID.NO.37)，siRNA-RAB35(si-RAB35)，5’-GAGATGTTCAACTGCATCA-3’(SEQ.ID.NO.114)，siRNA-FOXM1(si-FOXM1)，5’-GCAGCAGAAACGACCGAAT-3’(SEQ.ID.NO.108)。
用于这些siRNA的寡核苷酸显示如下。通过将下列双-链寡核苷酸克隆入psiH1BX3.0载体中的BbsI位点制备每种构建体。对每种寡核苷酸序列列出相对于SEQ ID NO1、3、5、112和106的KIF11、GHSR1b、NTSR1、RAB35和FOXM1核酸序列的相应核苷酸位置。每种寡核苷酸为KIF11、GHSR1b、、RAB35和FOXM1靶序列的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列的组合。下面还显示每种siRNA的发夹环结构的核苷酸序列。(核酸内切酶识别位点从每种发夹环结构序列中排除)。
KIF11si1 288-306(用于gttagtgtac gaactggag/SEQ ID NO32的靶序列)(插入F)Tccc gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEQ IDNO51(插入R)Aaaa gttagtgtacgaactggag tctcttgaa ctccagttcgtacactaac/SEQ IDNO52(发夹)gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEQ ID NO53KIF11 si2 612-630(用于gtgtctctgt tggagatct/SEQ ID NO33的靶序列)(插入F)Tccc gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEQ IDNO54(插入R)Aaaa gtgtctctgt tggagatct tctcttgaa agatctccaacagagacac/SEQ IDNO55(发夹)gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEQ ID NO56
KIF11 si3 1700-1718(用于gaaggcagtt gaccaacac/SEQ ID NO34的靶序列)(插入F)Tccc gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEQID NO57(插入R)Aaaa gaaggcagtt gaccaacac tctcttgaa gtgttggtcaactgccttc/SEQID NO58(发夹)gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEQ ID NO59GHSR1b si1 237-255(用于cctctacctg tccagcatg/SEQ ID NO35的靶序列)(插入F)Tccc cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEQID NO60(插入R)Aaaa cctctacctg tccagcatg tctcttgaa catgctggacaggtagagg/SEQID NO61(发夹)cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEQ ID NO62NTSR1 si1 933-951(用于gttcatcagc gccatctgg/SEQ ID NO36的靶序列)(插入F)Tccc gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEQID NO63(插入R)Aaaa gttcatcagc gccatctgg tctcttgaa ccagatggcgctgatgaac/SEQID NO64(发夹)gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEQ ID NO65NTSR1 si2 1074-1092(用于ggtcgtcata caggtcaac/SEQ ID NO37的靶序列)(插入F)Tccc ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEQID NO66(插入R)Aaaa ggtcgtcata caggtcaac tctcttgaa gttgacctgtatgacgacc/SEQID NO67(发夹)ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEQ ID NO68RAB35 si 620-638(用于gagatgttca actgcatca/SEQ ID NO114的靶序列)(插入F)Tccc gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc/SEQID NO115(插入R)Aaaa gagatgttca actgcatca tctcttgaa tgatgcagt tgaacatctc/SEQID NO116(发夹)gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc/SEQ ID NO117FOXM1 si 1240-1258(用于gcagcagaaacgaccgaat/SEQ ID NO108的靶序列)(插入F)Tccc gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc/SEQID NO109(插入R)Aaaa gcagcagaaa cgaccgaat tctcttgaa attcggtcg tttctgctgc/SEQID NO110(发夹)gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc/SEQ IDNO111.
为了验证本发明的RNAi系统，利用半定量RT-PCR最初证实单个对照siRNA(EGFP、荧光素酶和Scramble)降低已瞬时转染入COS-7细胞的相应靶基因的表达。在用于该测定的细胞系中用半定量RT-PCR证实KIF11、GHSR1b、NTSR1、RAB35和FOXM1表达通过其各自的siRNA(si-KIF11-1、si-KIF11-2、si-KIF11-3、si-GHSR-1、si-NTSR1-1、si-NTSR1-2、si-RAB35和si-FOXM1)而不是通过对照被下调。
显性负性测定利用KOC1缺失突变体进行显性负性测定以研究KOC1-KIF11复合物在肺癌细胞生长或存活中的功能作用。KOC1DEL3和KOC1DEL2构建体(图3a；10μg)、模拟质粒(10μg)或以终剂量为10-μgDNA(KOC1DEL3或KOC1DEL2相对于模拟(μg)分别为，7.5∶2.5；5∶5；或2.5∶7.5的)两构建体的质粒混合物转染入LC319细胞。转染的细胞在G418存在下培养7天并且通过三次重复的MTT测定测量其存活力。
(6)免疫共沉淀和MALDI-TOF质谱法人肺癌细胞系LC319细胞用双侧标记的pCAGGS-n3FH(NH2-端的FLAG、COOH-端的HA)-KOC1表达载体或空载体(模拟转染)转染。细胞在冰上在IP-缓冲液(0.5％NP-40，50mM Tris-HCl，150mM NaCl和蛋白酶抑制剂)中提取30分钟。提取物在14,000rpm离心15分钟，并且上清利用抗-Flag M2琼脂糖(Sigma-Aldrich)和抗-HA珠(Sigma-Aldrich)免疫沉淀1-2小时。珠用IP-缓冲液洗涤六次，并且在除去最终的洗涤级分后通过将珠在Laemmli样品缓冲液中煮沸而洗脱蛋白质。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE分开并且用银染染色。通过凝胶提取法提取125kD-条带，并且用于利用MALDI-TOF质谱法的质谱测序。该分析确定KIF11为该125kD的产物。
为了证实KOC1和KIF11之间的相互作用，A549细胞用Flag-标记的KIF11和myc-标记的KOC1瞬时共转染并且该细胞用抗-Flag M2琼脂糖免疫沉淀。随后，细胞用抗-myc抗体(9E10；Santa Cruz)免疫印迹。然后，利用相同的载体和细胞组合，细胞用抗-myc琼脂糖(SIGMA)免疫沉淀并且用抗-Flag M2抗体(Sigma-Aldrich)免疫印迹。
如下所述，为了进一步证实该相互作用，A549细胞用Flag-标记的KIF11和myc-标记的KOC1瞬时共转染，并且通过利用FITC-标记的抗-FLAG抗体和若丹明-标记的抗-myc抗体的免疫细胞化学染色检测FITC-标记的KIF11和若丹明-标记的KOC1主要在胞质中的共定位。
(7)免疫细胞化学传代后培养在盖玻片上的A549细胞培养24小时，并且用Flag-标记的KIF11和myc-标记的KOC1共转染。温育24小时后，细胞用丙酮/甲醇(1∶1)在冰上固定5分钟，RT下在CAS BLOCK(ZYMED)中封闭7分钟，并且随后与兔抗-Flag多克隆抗体(SIGMA)在RT温育1小时。固定的细胞用PBS洗涤3次，与抗-兔IgG-FITC在RT反应1小时。随后再次封闭细胞，并且用抗-myc抗体(9E10；Santa Cruz)在RT温育1小时。最后抗-小鼠IgG-若丹明在RT施加至该细胞1小时。细胞在Leica TCS SP2-AOBS共聚焦显微镜上观察。
免疫组织化学和组织-微阵列分析如其它地方所公开的，使用福尔马林-固定的NSCLC构建肿瘤-组织微阵列(Kononen，J.等.，Nat.Med.4，844-847(1998)；Sauter，G.等.，Nat.Rev.DrugDiscov.2，962-972(2003))。在三个独立研究者在对临床随后的数据无预先认识下，根据染色强度半定量评估的KOC1和KIF11的阳性情况为缺乏或阳性。
(8)配体-受体结合测定为了鉴定NMU-25直接结合其候选受体GHSR1a、GHSR1b和NTSR1，进行下列实验。利用引物GHSR1a(5’-GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3’(SEQ.ID.NO.38)和5’-CGCGGATCCGCGTGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCC-3’(SEQ.ID.NO.39)，GHSR1b(5’-GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3’(SEQ.ID.NO.40)和5’-CGCGGATCCGCGGAGAGAAGGGAGAAGGCACAGGGA-3’(SEQ.ID.NO.41)，和NTSR1(5’-GGAATTCCATGCGCCTCAACAGCTCCGCGCCGGGAA-3’(SEQ.ID.NO.42)和5’-CGCGGATCCGCGGTACAGCGTCTCGCGGGTGGCATTGCT-3’(SEQ.ID.NO.43)通过RT-PCR扩增每个受体基因的完整编码区。
产物用EcoR1和BamH1消化并且克隆入p3XFLAG-CMV10载体(Sigma-Aldrich Co.)的合适位点。如上所述，利用FuGENE6，用GHSR1b或NTSR1表达质粒转染COS-7细胞。转染的COS-细胞与0.5μM若丹明-标记的NMU-25肽(NMU-若丹明Phoenix Pharmaceuticals.Inc.)培养12小时，PBS(-)中洗涤五次，并且室温下在4％低聚甲醛溶液中固定60分钟。随后细胞与FLAG-标记的GHSR1a、GHSR1b或NTSR1蛋白(Sigma-Aldrich Co.)的抗体温育，用偶联至FITC的山羊抗-效鼠二抗(Cappel)染色并且在激光-共聚焦显微镜检查(TCS SP2 AOBSLeicaMicrosystems)下观察。此外，制备用于该测定的三个不同的阴性对照1)未添加NMU-25-若丹明的未-转染的COS-7细胞；2)用NMU-25-若丹明处理的未-转染的COS-7细胞；和3)无NMU-25-若丹明的用GHSR1a、GHSR1或NTSR1转染的COS-7细胞。用已知的NMU受体(NMU1R)转染的COS-7细胞用作该测定的阳性对照。
为了证实NMU-25结合候选受体，利用相同系列的COS-7细胞进行流式细胞术分析。具体地，COS-7细胞以1×105细胞/100-mm平皿的密度接种平皿并且用GHSR1b、NTSR1或NMU1R表达载体转染；转染后24小时，细胞与0.5μMNMU-25-若丹明温育12小时，洗涤，胰蛋白酶化，收集在PBS中，并且在PBS中再洗涤一次。通过流式细胞术测定结合若丹明-标记的NMU-25的细胞群体。
为了进一步证实NMU-25结合NSCLC细胞上内源性的候选受体，利用LC319和PC-14细胞进行受体-配体结合测定。简要地，测定之前24小时，这些胰蛋白酶化的细胞接种于96-孔黑色-壁，透亮-底的微量滴定板上。除去培养基并且细胞在10倍过量的未标记竞争剂下与Cy5-NMU-25温育。在暗处37℃温育平皿24小时并且在8200 Cellular Detection System(AppliedBiosystems)上扫描。8200分析软件产生数字化的灰度等级图象，定量结合在每个细胞表面上的荧光量并且计数荧光细胞。
cAMP水平的测量胰蛋白酶化的LC319细胞接种于96-孔微量滴定板(5.0×104细胞)上并且在10％FCS(+)RPMI-1640培养基中培养24小时，并且随后在测定之前20分钟培养基换为无血清RPMI-1640培养基/1mM IBMX(异丁基甲基黄嘌呤)。利用cAMP EIA System(Amersham Biosystems)测量cAMP水平之前，细胞用NMU-25肽温育20分钟。
胞内Ca2+流动测定测定之前24小时，胰蛋白酶化的LC319细胞接种于聚D-赖氨酸涂布的384-孔黑色壁，透亮底的微量滴定板(1.0×104细胞/mL)上。细胞用1mMFluo-4-AM荧光指示剂染料在测定缓冲液(Hank’s平衡盐溶液，20mMHEPES，2.5mM丙磺舒)中负载1小时，用测定缓冲液洗涤三次，并且随后放回温箱中10分钟然后在荧光成像板读数器(FLIPR，Molecular Devices)上测定。荧光相对于基线的最大变化用于确定细胞对NMU-25肽刺激作用的应答。
通过cDNA微阵列鉴定NMU的下游基因LC319细胞用NMU的siRNA(si-NMU)或荧光素酶的siRNA(对照siRNA)转染。转染后12、24和36小时提取mRNA，用Cy5或Cy3染料标记并且共杂交至所述包含32,256个基因的cDNA微阵列玻片上(Kakiuchi，S.，等.，(2004).Hum.Mol.Genet.13，3029-3043.，Ochi，K.等.，(2004).Int.J.Oncol.24，647-655.)。数据标准化后，进一步分析具有比截止值更高信号的基因。利用SOM聚类分析最初选择与NMU表达的时间依赖性降低相一致的其强度显著降低的基因。用下列基因-特异性引物，FLJ42024(5’-AAAAAGGGGATGCCTAGAACTC-3’(SEQ.ID.NO.118)和5’-CTTTCAGCACGTCAAGGACAT-3’(SEQ.ID.NO.119))，GCDH(5’-ACACCTACGAAGGTACACATGAC-3’(SEQ.ID.NO.120)和(5’-GCTATTTCAGGGTAAATGGAGTC-3’(SEQ.ID.NO.121))，CDK5RAP1(5’-CAGAGATGGAGGATGTCAATAAC-3’(SEQ.ID.NO.122)和(5’-CATAGCAGCTTTAAAGAGACACG-3’(SEQ.ID.NO.123))，LOC134145(5’-CCACCATAACAGTGGAGTGGG-3’(SEQ.ID.NO.124)(5’-CAGTTACAGGTGTATGACTGGGAG-3’(SEQ.ID.NO.125))，NUP188(5’-CTGAATACAACTTCCTGTTTGCC-3’(SEQ.ID.NO.126)和(5’-GACCACAGAATTACCAAAACTGC-3’(SEQ.ID.NO.127))，利用来自用于微阵列杂交的LC319细胞的相同mRNA的半定量RT-PCR实验确认NMU的候选下游基因。
候选基因的表达通过半定量RT-PCR另外检测，其利用在72和96小时分离自用1μMNMU-25或用BSA在0和48小时时间点处理的LC319细胞的mRNA。
结果(1)鉴定KIF11为与KOC1互相作用蛋白质提取用pCAGGS-n3FH-KOC1载体转染的LC319细胞并且用抗-FlagM2单克隆抗体免疫沉淀，并且随后用抗-HA单克隆抗体免疫沉淀。包含KOC1的蛋白质复合物在SDS-PAGE凝胶上用银染染色。提取125kD的条带(该条带在模拟转染中缺乏)并且通过质谱测序确定为KIF11(NM_004523；SEQ.ID.NO.1)。
(2)证实KOC1和KIF11之间的相互作用用Flag-标记的KIF11和myc-标记的KOC1共转染的A549细胞、用KIF11或KOC1转染的细胞、和未-转染的细胞，用抗-Flag M2琼脂糖免疫沉淀并且随后用抗-myc抗体免疫印迹。相反，相同系列的A549细胞用抗-myc琼脂糖免疫沉淀并且用抗-Flag M2抗体免疫印迹。当共转染两种构建体时仅发现单个条带(图1a)。免疫细胞化学表明FLAG-标记的FITC-标记KIF11与myc-标记的若丹明-标记KOC1在A549胞质中共定位(图1b)。
然后，利用H520细胞的裂解物(其已证实不表达内源性的IMP-1、-2和-3(KOC1)，但已用HA-标记的IMP-1、-2和-3(KOC1)表达载体转染)通过western印迹分析证实抗-KOC1抗体特异于KOC1并且不与其他的同源蛋白质，IMP-1和IMP-2交叉反应。提取用pCAGGS-FLAG-标记的-KOC1载体或模拟载体(对照)转染的LC319细胞的裂解物并且用抗-Flag M2单克隆抗体免疫沉淀。包含KOC1的蛋白质复合物在SDS-PAGE凝胶上用SilverQuest(Invitrogen)染色。在来自用KOC1表达质粒转染的细胞的裂解物中而不是对照裂解物(模拟质粒)的免疫沉淀中特异性地检测到125-kD的条带。随后的MALDI-TOF质谱分析鉴定该125-kD蛋白质为驱动蛋白家族的成员KIF11。利用亲和-纯化的抗-KOC1和抗-KIF11多克隆抗体，通过用来自A549和LC319的提取物进行的免疫沉淀实验证实内源性KOC1和KIF11之间直接的相互作用(图1c)。
(3)NSCLC中KIF11的表达在原发NSCLC(临床样品)和肺癌细胞系中进行KIF11表达的证实。在16个NSCLC病例的12个中(8个ADC中的5个和8个SCC中的7个)证实KIF11表达提高。此外，在15个NSCLC细胞系的14个中观察到KIF11的上调。
随后再检验原发NSCLC组织和肺癌细胞系，并且在通过定量RT-PCR检验的18个NSCLC临床样品以及所有20个NSCLC或SCLC细胞系中发现KIF11的表达提高(图2a，b)。有关的KOC1和KIF11基因的mRNA水平相对于ACTB基因显著相关(通过Spearman等级关联r＝0.702，P＝0.0029的)。这两种基因在几乎所有肺癌细胞系中共活化(通过Spearman等级关联r＝0.458，P＝0.0359)。
(4)正常人组织中的KIF11表达在23个检查的正常人组织中，KIF11 cDNA作为探针的Northern印迹法鉴定了作为非常弱条带的4.5-和5.5-kb转录本，仅在胎盘、睾丸和骨髓中可见。报道的KIF11的cDNA序列认为对应于更大的转录本。为了研究对应于更小条带的转录本，反转录从睾丸组织和NSCLC细胞系分离的mRNA。通过利用四组引物的PCR扩增KIF11 cDNA的完整序列，但在这些样品中未发现交互剪接的转录本。因此，该更小的条带可能反映与一些相关基因的转录本的交叉杂交。正常人组织中KIF11的表达模式与KOC1的表达模式显著相关(图2c)。
KOC1中KIF11-结合区域的鉴定为了确定与KIF11相互作用必需的KOC1的特定结构域，用具有NH2(N)-端FLAG或COOH(C)-端HA-标记的序列(KOC1DEL1-5；图3a)的五个缺失-构建体中的一个转染COS-7细胞。用单克隆抗-HA的免疫沉淀表明KOC1DEL4和KOC1DEL5构建体(两者均缺乏两个RNA-识别基序(RRM))不能与内源性的KIF11相互作用，虽然所有的具有两个RRM的KOC1构建体保留对KIF11的结合亲和力(图3b)。
利用RNA-免疫沉淀和cDNA微阵列分离与KOC1-KIF11复合物相关的mRNA已知KOC1蛋白可能通过其两个功能性RRM和四个K-同源的(KH)结构域呈现对IGF2前导-3mRNA的多重附着(Nielsen，J.等.，Mol.CellBiol.19，1262-1270(1999))。然而，在我们所检查的任何肺癌细胞系或临床NSCLC组织样品中未检测到IGF2mRNA的表达。因此，为了阐明KOC1在肺致癌作用中的功能，搜索与KOC1互相作用并且可能因此在肺癌的生长和/或进展中起重要作用的mRNA。首先，利用抗-KOC1抗体和五个NSCLC细胞系(A549、LC319、PC 14、RERF-LC-AI和SK-MES-1)免疫沉淀mRNA。随后，Cy-5-标记的免疫沉淀的RNA(IP-mRNA)和从每个相匹配细胞系分离的Cy-3-标记的总RNA在人cDNA微阵列(IP-微阵列)上共杂交。筛选的32,256个基因当中，鉴定了总共55个基因，其在检测的五个NSCLC细胞系的至少四个中(参见表2)，与总RNA相比富含IP-mRNA，并且通过利用IP-mRNA作为模板的RT-PCR(IP-RT-PCR)证实所有那些候选物的富集。为了检验RNA-免疫沉淀的特异性，利用IP-mRNA作为模板，用β-肌动蛋白(ACTB)mRNA进行RT-PCR实验；没有ACTB被抗-KOC1抗体沉淀。作为RNA-免疫沉淀的本底对照，利用标准的兔IgG和五个NSCLC细胞系沉淀mRNA，并且证实检测的八个KOC1相关mRNA(CCT2、SBP2、SLC25A3、RAB35、PSMB7、GL、PKP4和WINS1)中没有一个被正常的兔IgG沉淀。还通过RT-PCR证实NSCLC样品中许多候选基因表达提高(数据没有显示)。为了检验KOC1-KIF11复合物的形成是否需要这些KOC1-相关mRNA的共同存在，利用细胞裂解物进行免疫沉淀实验，所述细胞裂解物用30单位的RNase T1(SIGMA)在体外处理或未处理，并且发现在存在和缺乏mRNA时两种蛋白质的相互作用无差异，提示KOC1-KIF11复合物的形成不太可能需要这些特定的mRNA。
通过追循该策略，我们已能表明KOC1和KIF11不仅在大多数临床NSCLC样品和细胞系中共同过表达，而且通过这些基因的产物形成的复合物通过促进细胞内和细胞间mRNA-转运系统，对于NSCLC细胞的生长和发展是必不可少。
已在卵母细胞，和果蝇以及非洲蟾蜍的发育胚胎，及体细胞如成纤维细胞和神经元中报道了胞内mRNA通过RNA-结合蛋白的转运(King，M.L.等.，Bioessays 21，546-557(1999)；Mowry，K.L.&Cote，C.A.Faseb.J.13，435-445(1999)；Lasko，P.，J.Cell Biol.150，F51-56(2000)；Steward，O.Neuron18，9-12(1997))。β-肌动蛋白mRNA转运至鸡-胚胎成纤维细胞(CEF)的前导层以及正发育神经元的生长锥(Lawrence，J.B.& Singer，R.H.Cell 45，407-415(1986)；Bassell，G.J.等.，J.Neurosci.18，251-265(1998))。ACTBmRNA的定位取决于“zipcode”，一种位于mRNA 3’UTR的顺式作用元件(Kislauskis，E.H.等.，J.Cell Biol.123，165-172(1993))。相应的反式-作用因子，zipcode结合蛋白1(ZBP1)，通过用ACTB mRNA的zipcode的亲和纯化鉴定(Ross，A.F.等.，Mol.Cell Biol.17，2158-2165(1997))此后，在大量生物体包括非洲蟾蜍、果蝇、小鼠和人中鉴定了ZBP1的同系物(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 14，2729-2733(1997)；Deshler，J.O.等.，Science 276，1128-1131(1997)；Doyle，G.A.等.，Nucleic Acids Res.26，5036-5044(1998))。ZBP1-样蛋白质包含N-末端区域的两个RRM以及C-末端的四个hnRNP KH(核糖核蛋白K-同源性)结构域。KOC1，一种IGF2mRNA-结合蛋白，认为是ZBP1家族的成员；其呈现对IGF2前导-3mRNA的多重附着(Nielsen，J.等.，Mol.Cell Biol.19，1262-1270(1999))并在几种类型的癌症中过表达(Mueller-Pillasch，F.等.，Oncogene 14，2729-2733(1997)；Zhang，J.Y.等.，Clin.Immunol.100，149-156(2001)；Mueller，F.等.，Br.J.Cancer 88，699-701(2003)；Wang，T.等.，Br.J.Cancer 88，887-894(2003))。然而，由于我们在所检测的大多数NSCLC细胞系或临床样品中未能检测到IGF2前导-3mRNA的表达，怀疑KOC1可通过与其他mRNA相互作用以及其他mRNA的转运而介导肺癌细胞的生长。当结合cDNA微阵列(IP-微阵列)进行RNA-免疫沉淀实验时，在NSCLC细胞中鉴定了可能与KOC1相关的十多个候选mRNA(参见表2)。该列表包括编码具有细胞-粘附功能的蛋白质的基因(PKP4、L1CAM1)，编码具有癌-细胞发展和侵入功能的蛋白质的基因(IGFBP2)，以及结合小GTP功能的蛋白质的基因(RAB35)，(Papagerakis，S.等.，Hum.Pathol.34，565-572(2003)；Fogel，M.等.，Cancer Lett.189，237-247(2003)；Wang，H.等.，Cancer Res.63，4315-4321(2003)；Zhao，H.等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.293，1060-1065(2002))其许多在临床NSCLC样品中高水平表达(数据没有显示)。转运mRNA(其产物与细胞的生长或运动有关)的系统的活化令人很感兴趣，并且顺着这方面的进一步研究可产生对肺的癌发生更好的理解。
表2
(1)探针组通过所有五个细胞系的倍数变化值(IP-mRNA/输入RNA)的总和(*)排列(2)na未注释(3)N/C阴性对照KOC1中mRNA-结合区域的鉴定为了确定结合KOC1-相关mRNA必需的KOC1的区域，利用在A549细胞中表达的KOC1缺失-突变体的免疫沉淀的重组蛋白(图4a)和DIG-标记的RAB35mRNA(其为一种KOC1相关mRNA)进行Northwestern印迹分析。KOC1DEL3(其缺乏四个KH结构域)和KOC1DEL5(其缺乏N-末端的两个RRM和C-末端的两个KH结构域)不结合RAB35mRNA。另一方面，相比全长KOC1构建体，KOC1DEL4(其为仅具有四个KH结构域的构建体)和KOC1DEL2(无C-末端两个KH结构域的构建体)显示对mRNA非常弱的结合亲和力(图4b)，提示两个RRM与C-末端的两个KH结构域对结合KOC1-相关mRNA的重要性。
进一步在A549细胞中表达五个KOC1缺失-突变体并且用细胞裂解物进行两次免疫沉淀实验，第一次用单克隆的抗-HA抗体，然后用单克隆的抗-FLAG M2抗体。利用IP-mRNA，检测了每种缺失-蛋白质结合选自上述列表(参见表2)的八种内源性mRNA(CCT2、SBP2、SLC25A3、RAB35、PSMB7、GL、PKP4和WINS1)的能力。结果与Northwestern印迹分析完全一致，独立证实C-末端的两个KH结构域和N-末端的两个RRM为KOC1有效结合mRNA必不可少的(图4c)。
KOC1-KIF11核糖核蛋白复合物和KOC1-相关mRNA的微管依赖的细胞内和细胞间转运为了进一步研究KOC1和KIF11的功能作用，制备用来表达ECFP-KOC1(青色)和EYFP-KIF11(黄色)的质粒。随后将这两个质粒一起转染入COS-7细胞，并且利用免疫荧光录像-显微镜检查和实时共聚焦显微镜检查检测其定位。表达KOC1和KIF11的细胞突出(protrude)进入病变(process)，并且随后与附近的细胞接触(数据没有显示)。对活细胞更详细的观察发现KOC1与KIF11形成复合物(KOC1-KIF11 RNP复合物；绿色粒子)，其通过连接两个细胞的特细结构从一个细胞转运至另一个细胞(图5a)。KOC1-KIF11复合物从一个细胞至另一个细胞的运动似乎为单向的。
此外，为了检测KOC1-KIF11复合物是否可特异性地将KOC1-相关mRNA从具有高水平KOC1-RNP复合物的一个细胞转运至具有低水平该复合物的另一个细胞，混合和共培养两种不同的细胞群体；一种为用pEGFP-KOC1(绿色)以及Alexa Fluor 546-标记的全长RAB35mRNA(红色)转染的COS-7细胞，并且另一种为仅用CellTracker(蓝色)标记的亲本COS-7细胞。注意到不仅KOC1粒子(绿色)，而且KOC1-RAB35mRNA(黄色)的RNP粒子通过特细的结构从前一类细胞转移至后一类细胞(图5b)。利用A549细胞上的原位杂交(在该细胞中KOC1和KIF11均过表达)，进一步证实内源性的RAB35mRNA(绿色)定位于特细的细胞间结构上以及胞质中(数据没有显示)。
还通过免疫细胞化学研究，利用亲和-纯化的抗-KOC1或抗-KIF11作为一抗以及Alexa594-标记的抗-兔IgG作为二抗(Molecular Probe)和抗-α-微管蛋白-FITC单克隆抗体研究了KOC1和KIF11粒子在桥接单个A549细胞的微管特细结构上的内源性定位。用10μM微管破坏剂nocodazole(SIGMA)处理四小时的A549细胞，随着胞质中微管的解聚，呈现崩塌和内源性KOC1和KIF11的聚集。此外，细胞之间的残留结构上未发现粒子。结果提示涉及KOC1-KIF11复合物的微管-依赖性转运机理的可能性。为了进一步阐明详细的KOC1-KIF11复合物在NSCLC细胞转运mRNA的机理，搜索可与KIF11互相作用的其他组分。利用LC319细胞裂解物用抗-KIF11多克隆抗体进行的免疫沉淀鉴定了150-kDa的蛋白质，其随后通过MALDI-TOF质谱分析确定为dynactin 1(DCTN1；p150，glued同系物，果蝇)。DCTN1为DCTN的最大亚基，其结合胞质马达-蛋白动力蛋白并且活化顺着微管的囊泡转运(Holzbaur，E.L.&Tokito，M.K.Genomics 31，398-399(1996)；Tokito，M.K.等.，Mol.Biol.Cell 7，1167-1180(1996))，或结合KIF11而可能参与中心体的分离(Blangy，A.等.，J.Biol.Chem.272，19418-19424(1997))。还通过免疫细胞化学，利用亲和-纯化的抗-KOC1或抗-KIF11多克隆抗体作为一抗以及Alexa488-标记的抗-兔IgG作为二抗以及抗-DCTN1单克隆抗体(BD transduction Laboratories，#610473)作为一抗和抗-Alexa594-标记的抗-兔IgG作为二抗的组合，观察KOC1/KIF11和DCTN1在单个A549细胞之间特细结构上的内源性共定位。并且利用抗-KIF11的多克隆抗体和抗-DCTN1的单克隆抗体(BD transductionLaboratories，#610473)，用来自A549和LC319细胞的提取物通过免疫沉淀实验证实内源性KIF11和DCTN1之间直接的相互作用(图6a)。
为了进一步证实mRNA的KIF11依赖性细胞间转运，检测了monastrol的作用，其为特异性抑制KIF11的细胞-渗透性抑制剂。之前的报道表明monastrol通过直接结合马达结构域而部分抑制KIF11 ATPase活性(DeBonis，S.等.，Biochemistry 42，338-349(2003)；Kononen，J.等.，Nat.Med.4，844-847(1998))。A549细胞用150μMmonastrol(SIGMA)处理24小时诱导内源性KIF11和外源性EYFP-KIF11顺着微管在单星中心的累积，以及细胞周期在具有单极纺锤体(其称为“单星纺锤体”)的有丝分裂中停滞。A549细胞用150μMmonastrol处理24小时诱导具有单极纺锤体，其也称为“单星纺锤体”的有丝分裂细胞的细胞周期停滞，并且还引起内源性KIF11顺着微管在单星中心处累积。另一方面，monastrol处理2-小时内，大多数非-有丝分裂的细胞失去进入病变的突起并且随后失去与附近细胞的接触。另外通过用延时录像-显微镜检查来计数细胞间特细结构数目而进行的定量分析(n＝252个结构)证实检测的非-有丝分裂细胞中超过半数的细胞-至-细胞连接经一小时monastrol处理而消失。然而，细胞解除暴露于monastrol后六小时，胞间桥构造重新构成并且观察到处于正常有丝分裂过程的细胞，表明KIF11为特细的细胞间结构形成必不可少的(数据没有显示)。
一些细胞失去进入病变的突起并且随后不与附近的细胞接触。活细胞更详细的观察发现没有KOC1-KIF11 RNP复合物(绿色粒子)通过连接两个细胞的特细结构从一个细胞转运至另一个细胞，所述特细结构随后在观察期间消失。
该研究中，我们证实人肺癌中KOC1、KIF11和DCTN1的内源性的相互作用，并且揭示那些复合物在将mRNA从一个细胞转运至另一个细胞的可能的作用。DCTN1，DCTN的最大亚基，结合胞质马达-蛋白动力蛋白并且活化顺着微管的囊泡转运(Holzbaur，E.L.&Tokito，M.K.Genomics 31，398-399(1996))。Dynein-DCTN的相互作用可能为囊泡和细胞器的轴突转运机理的关键组分(Holzbaur，E.L.&Tokito，M.K.Genomics 31，398-399(1996)；Tokito，M.K.等.，Mol.Biol.Cell 7，1167-1180(1996))。据报道DCTN结合动力蛋白对神经元功能很关键，因为特异性破坏该结合的抗体阻断顺着微管的囊泡运动。已经观察到DCTN1和KIF11的体外相互作用以及其在有丝分裂期间的共定位(Blangy，A.等.，J.Biol.Chem.272，19418-19424(1997))，但是没有报道显示涉及该复合物的细胞间转运系统。由于我们的实验中驱动蛋白家族的成员KIF11在NSCLC中与KOC1一起过表达，我们提示KOC1、KIF11和DCTN1直接的相互作用可能在建立肺癌细胞间微管的特定排列中起着重要作用。
在受体细胞中通过转运的KOC1-相关mRNA的蛋白质合成为了阐明mRNA通过KOC1-KIF11RNP复合物的转运是否为生理学相关的(受体细胞可通过翻译转运的mRNA合成蛋白质)，我们构建了全长RAB35mRNA(KOC1/KIF11复合物的一个结合靶标)的表达载体，读框中融合myc标记的和EGFP蛋白序列。我们随后研究了该嵌合mRNA是否可从一个细胞转运至另一个细胞并且随后翻译成受体细胞中的蛋白质产生。表达FLAG-标记的KOC1和KIF11的COS7细胞用具有这些RAB35mRNA-表达构建体的构建体转染(细胞A)。亲本mRNA-受体COS-7细胞仅用CellTracker染色(蓝色；细胞B)。这两种细胞群体混合在一起并且共培养24小时。我们首先通过利用反义EGFP作为探针的原位杂交证实了细胞A和B之间RAB35-EGFP mRNA的细胞间运输；细胞共培养24小时后，在CellTracker-染色的细胞B以及这两种细胞类型之间的特细结构上检测到RAB35-EGFP mRNA的弱-染(图7a)。我们随后分别利用免疫细胞化学和延时录像显微镜检查检测了CellTracker-染色的B型细胞中EGFP-融合的RAB35蛋白的存在(图7b和7c)。在利用延时录像显微镜检查观察期间，无可见的EGFP-蛋白粒子从A型细胞转运至B型细胞，但是在胞质器官中逐步出现EGFP蛋白，其似乎为B型细胞中的内质网(ER)(图7d)。这些结果表明KOC1和KIF11应当与mRNA中的亚群在功能上相关，所述亚群编码可能诱导细胞增殖和/或粘附的蛋白质，并且KOC1和KIF11的存在为细胞-至-细胞转运不可缺少的。虽然之前的报道提示高KOC1水平可能干扰结合的mRNA如IGF2前导-3的翻译，将KOC1和全长RAB35-EGFP mRNA构建体一起共转染入COS-7细胞的实验没有检测到RAB35-EGFP-融合蛋白水平的降低(图7e)。
我们的实验还揭示接触附近细胞的突出病变的形成，并且显示转染的RAB35mRNA和KOC1蛋白在表达高水平内源性KOC1和KIF11的两种肺癌细胞系(A549和LC319)特细细胞间结构上的共分布。另一方面，未发现转染的RAB35 mRNA在表达KIF11而不是KOC1的NCI-H520细胞中的特定定位。该观察支持KOC1和KIF11共活化对癌细胞中通讯的重要性。在已知的人癌症的细胞-至-细胞通讯系统中，恶性胶质瘤细胞和血管内皮细胞之间功能性间隙连接的形成似乎影响肿瘤中的血管生成(Zhang，W.等.，CancerRes.59，1994-2003(1999)；Zhang，W.等.，J.Neurosurg.98，846-853(2003))。然而，据我们所知我们的报道是借助通过哺乳动物体细胞中结合马达蛋白的核糖核蛋白颗粒的途径描述mRNA细胞间转运以及评估其对对癌细胞的生长和存活很重要的细胞间网络的形成的生物学重要性的首次报道。
(5)针对KIF11的siRNA抑制NSCLC细胞的生长与含有这三种对照中任何siRNA和模拟转染的细胞相比，KIF11的siRNA质粒转染入A549(图8a)或LC319细胞(数据没有显示)抑制KIF11的mRNA表达。与降低的mRNA表达相一致，A549和LC319细胞显示细胞存活力和通过MTT(图8b)和克隆-形成测定测量的克隆数目的显著降低(数据没有显示)。还利用延时录像观察研究了针对KIF11的siRNA对细胞间转运的作用。观察到与monastrol处理类似的现象；一些细胞减少进入病变的突出，以及连接两个细胞的特细结构的消失。
为了研究KOC1-KIF11相互作用对肺癌细胞生长或存活的功能重要性，检测包含两个RRM的KOC1缺失片段，其能与KIF11相互作用(KOC1DEL3；图3a，b)抑制内源性KOC1和KIF11之间直接相互作用的显性负性功能。将KOC1DEL3和模拟质粒(对照)转染入LC319细胞并且检测KOC1DEL3与内源性KIF11的相互作用。进一步通过免疫沉淀证实RRM结构域的过表达降低KOC1和KIF11之间复合物的形成(图9a，b)。令人期望的是，如通过MTT测定测量的，该片段的转染引起细胞存活力显著的剂量-依赖性降低(P＜0.001，KOC1DEL3相对于模拟；图9c)。我们还证实仅包含KH-结构域对照的构建物的转染不影响增殖。
此外，为了研究KOC1-KIF11相互作用对肺癌细胞生长或存活的功能重要性，检测KOC1的缺失片段(其缺乏对mRNA结合必不可少的C-末端的两个KH-结构域，但能与KIF11相互作用(KOC1DEL2；图3a，b))抑制内源性KOC1和KIF11之间直接相互作用的显性负性功能。我们将KOC1DEL2和模拟质粒(对照)转染入A549细胞并且检测KOC1DEL2与内源性KIF11的相互作用(图9d)。进一步通过免疫沉淀验证KOC1DEL2的过表达降低内源性KOC1和KIF11之间复合物的形成(图9e)。如所期望的，如通过MTT测定测量的，该显性负性片段的转染引起细胞存活力显著的剂量依赖性降低(P＝0.0006，KOC1DEL2相对于模拟；图9f)。
我们还检测了这些KIF11-转运mRNA调控肺癌细胞细胞生长或存活的一些生物学作用，构建了表达针对RAB35的siRNA(si-RAB35)的质粒，siRAB35鉴定为KOC1-RNP复合物-相关的mRNA。与对照相比，质粒(si-RAB35)转染入A549细胞显著抑制内源性RAB35的表达，并且引起细胞存活力和克隆数目(通过MTT和克隆-形成测定测量)的显著降低(图10a，b)。
KOC1和KIF11的过表达与NSCLC患者不良的预后的关联性利用由265个NSCLC组织组成的组织微阵列，我们用抗-KOC1和抗-KIF11多克隆抗体进行免疫组织化学分析(图11a)。265个病例中，172个为KOC1染色阳性的(64.9％)；129个病例为KIF11阳性的(48.7％)。这些肿瘤中KOC1的表达模式与KIF11的表达显著一致(X2＝60.8，P＜0.0001)。我们随后提问KOC1和/或KIF11的过表达是否可能与临床结果有关。我们发现NSCLC中KOC1的表达与pT因子状态(X2＝23.1，P＜0.0001)和肿瘤特定的5-年存活率(Log-rank检验的P＝0.0115)显著相关(图11b，上图)。NSCLC中KIF11的表达与pT因子状态(X2＝15.0，P＜0.0001)、pN因子(X2＝4.4，P＝0.0356)和5-年存活率(Log-rank检验的P＝0.0008)显著相关(图11b，下图)。通过pT单变量分析，pN、性别和KOC1/KIF11表达每种都与NSCLC患者中不良的肿瘤-特定的存活率显著相关。此外，通过利用Cox比例-危险模型的多变量分析确定KOC1和KIF11为独立的预后因数(分别地，P＝0.0499和P＝0.0259)。
(6)NSCLC中NMU候选受体的筛选两种已知的NMU受体，NMU1R(FM3/GPR66)和NMU2R(FM4)在能量体内平衡中起着重要作用。(Fujii，R.等.，J.Biol.Chem.27521068-21074(2000)；Howard，A.D.等.，Nature 40670-74(2000)；Funes，S.等.，Peptides 231607-1615(2002))。NMU1R存在于多种外周人组织中(Fujii，R.等.，J.Biol.Chem.27521068-21074(2000)；Howard，A.D.等.，Nature 40670-74(2000)；Funes，S.等.，Peptides 231607-1615(2002))，而NMU2R仅位于脑中。为了研究NMU1R和NMU2R基因是否在NSCLC中表达，在正常的人脑和肺中，NSCLC细胞系中和临床组织中通过半定量RT-PCR实验分析这些NMU受体的表达。在检测的任何细胞系或临床样品中未检测到NMU1R和NMU2R的表达，虽然NMU1R在肺中表达而NMU2R在脑中表达(数据没有显示)，提示NMU可能通过与其他受体相互作用而调节肺癌细胞的生长。
由于NMU2R和NMU1R最初作为已知的神经肽GPCR的同系物分离，未鉴定的NMU受体推测属于其与NMU1R/NMU2R呈现某些同源性的相同家族的成员。由此，利用BLAST程序搜索候选的NMU受体。本发明人表达分布型数据中的结果和其在NSCLC中的高表达水平表明GHSR1b(NM_004122；SEQ ID NO3和4)以及NTSR1(NM_002531；SEQ ID NO5和6)为良好的候选者。GHSR具有两个转录本，1a型和1b型。全长的人1a型cDNA编码具有七个跨膜结构域的366个氨基酸的预测多肽，七个跨膜结构域为G蛋白-偶联受体的典型特征。单个内含子将其开放读框分为编码跨膜结构域1-5和6-7的两个外显子，因此将GHSR1a置于GPCR的含有内含子的一类中。1b型为转录自单个外显子的未剪接的mRNA变体，该外显子编码具有五个跨膜结构域的289个氨基酸的多肽。利用对每种变体的特异性引物半定量RT-PCR分析表明GHSR1a不在NSCLC中表达。另一方面，GHSR1b和NTSR1在一些NSCLC细胞系中以相对高的水平表达，而根本不在正常肺中表达(图13a)。GHSR1b的产物具有与NMU1R 46％的同源性，并且NTSR1编码具有与NMU1R 47％同源性的418个氨基酸。
(7)NSCLC中NMU候选受体的鉴定为了证实NMU和GHSR1b/NTSR1之间直接的相互作用，用用来表达FLAG-标记的GHSR1b或NTSR1的质粒瞬时转染COS-7细胞，并且在若丹明-标记的NMU-存在下培养。随后利用偶联至FITC的抗-FLAG抗体检测FLAG-标记的GHSR1b/NTSR1和NMU-25-若丹明的细胞定位，并且发现NMU-25和两个受体中任何一个受体一起定位于细胞膜上(图13c)。在涉及任何一个下列配体/细胞组合的对照测定中未观察到NMU-25与这些受体的共定位1)与未用任何一个受体质粒转染的COS-7细胞温育的NMU-25-若丹明；2)在无NMU-25-若丹明时温育的未-转染的COS-7细胞；和3)用任何一个受体质粒转染的COS-7细胞，但在无NMU-25-若丹明时温育。通过流式细胞术证实结果，其揭示若丹明-标记的NMU-25结合至表达这两种受体中任何一个的COS-7细胞的表面(图13d)以及若丹明-标记的NMU-25以剂量依赖性方式结合至COS-7细胞的表面。
(8)正常人组织中的GHSR1b表达因为当时没有精确报道正常人组织中GHSR1b的表达，利用人多重组织Northern-印迹确定GHSR1b的分布。用GHSR1b cDNA作为探针的Northern印迹法鉴定了与1.1-kb的转录本GHSR1a相比为非常弱的信号条带的0.9-kb转录本，在检测的23种正常人组织中，在心脏、肝脏、骨骼肌、胰腺和胃中可见(图13b)。
为了进一步证实NMU-25结合NSCLC细胞上内源性的GHSR1b和NTSR1，利用LC319和用NMU-25处理的PC-14细胞进行受体-配体结合测定。检测了Cy5-标记的NMU-25结合至这两种细胞系的表面，该细胞系表达这两种受体，但几乎不表达NMU1R/NMU2R(图13e)。
已报道GPCR的生物学活性配体特异性结合至其同性质的受体并且引起第二-信使如胞内-Ca2+和cAMP水平的提高。因此测定NMU在LC319细胞中通过其与GHSR1b/NTSR1相互作用而诱导第二-信使的能力。当细胞在NMU-25(在培养基中终浓度3-100μM)的存在下培养时，以NMU-25剂量依赖性方式观察到表达GHSR1b和NTSR1的LC319细胞中cAMP的产生，而不是Ca2+流出。结果证实NSCLC细胞表达功能性的GHSR1b/NTSR1(图13f左图)。通过添加GHSR1b/NTSR1的其他报道的配体GHRL或NTS证实该作用为NMU-25特异性的(图13f右图)。此外，GHRL和NTS引起LC319细胞中胞内钙的流动应答(数据没有显示)，提示未充分了解的GHSR1b和/或NTSR1的各种功能。
(9)NSCLC细胞的生长通过针对GHSR/NTSR1的siRNA的抑制此外，利用用来表达针对GHSR或NTSR1的siRNA(si-GHSR-1，si-NTSR1-1和si-NTSR1-2)的质粒检测NMU-受体相互作用在肺的癌发生中的生物学重要性。与包含任何三种对照siRNA的细胞相比，这些质粒中任何一个转染入A549或LC319细胞抑制内源性受体的表达(图14a)。与受体降低的表达一致，A549和LC319细胞呈现细胞存活力(图14b)和克隆数目的(数据没有显示)显著降低。这些结果强烈支持NMU通过与GHSR1b和NTSR1相互作用而可能在NSCLC的发生/进展中起着非常重要的作用的可能性。
NMU下游基因的鉴定为了进一步阐明NMU-信号途径并且鉴定由NMU调节的下游基因，针对NMU的siRNA(si-NMU)或针对LUC的siRNA(对照siRNA)转染入过表达的NMU的LC319细胞，并且利用包含32,256个基因的cDNA微阵列监测基因表达的下调。在通过该方法检测的许多基因中，进行自组织作图(SOM)聚类分析以进一步选择候选基因。SOM聚类为最初由Kohonen(Kohonen，T.(1990).The self-organizing map.IEEE 78，1464-1480.)开发的数据采集和显象方法并且应用于来自微阵列的基因表达数据分析。聚类方法类似于k-均值聚类(Kaech，S.M.，等.，(2002).Cell 111，837-851.)但不同在于基于表达模式将基因分组，并且组间关系通过二维图说明。通过我们的偏差滤器的基因通过5×4SOM分组。
我们最初利用SOM聚类分析选择70个基因，其强度随着NMU表达的降低而显著降低(图15a)。半定量RT-PCR分析证实用si-NMU而不是用对照LUC的siRNA转染的LC319细胞中候选转录本以时间依赖性方式降低(图15b)。与正常肺组织的转录本相比，还证实这些转录本在表达外源NMU的LC319细胞中上调大于2倍。同时在肺癌组织和细胞系中评估这些基因随着NMU表达的过表达(数据没有显示)。最后鉴定6个候选NMU靶基因，其满足上述选择标准；FOXM1、FLJ42024、GCDH、CDK5RAP1、LOC134145和NUP188(图15b)。
和正常肺组织相比肺癌中FOXM1 mRNA水平显著提高并且其表达呈现与NMU和NMU的两种受体GHSR1b和NTSR1良好的一致性，而FOXM1在肺致癌作用中的功能仍不清楚。因此，选择FOXM1进一步分析。为了确定FOXM1经NMU配体-受体信号的特定诱导，表达GHSR1b和NTSR1的LC319细胞在培养基中终浓度100μM的NMU-25或BSA(对照)存在下培养。NMU-25-处理的细胞显示比对照细胞更高的FOXM1表达(图15c)。此外，和用模拟载体转染的对照细胞相比，还证实在表达外源NMU的LC319细胞中FOXM1的上调(数据没有显示)。
随后利用用来表达FOXM1的siRNA(si-FOXM1)的质粒检测FOXM1经NMU信号传导的活化对肺癌细胞生长或存活的生物学重要性。与包含三种中任何一种的对照siRNA的细胞相比，si-FOXM1转染入A549或LC319细胞抑制内源性FOXM1的表达(图16a和16b)。与FOXM1降低的表达一致，A549和LC319细胞呈现细胞存活力和克隆数目的显著降低(图16a和b)。这些结果强烈证实NMU通过与GHSR1b/NTSR1的相互作用以及其下游靶标如FOXM1随后的活化，可显著影响肺癌细胞的生长。
用此处NMU的siRNA处理的LC319细胞的微阵列数据证实NMU信号途径可通过反式激活一组下游基因而影响肺癌细胞的生长促进，下游基因包括其蛋白质产物可作为转录因子起作用并且能调控细胞生长或参与信号转导的转录本。通过另外的生物学测定我们提供证实FOXM1转录因子为NMU信号传导的下游靶标的证据。已知FOXM1在几种类型的人癌症中过表达(Teh，M.T.等.，Cancer Res.62，4773-4780.；van den Boom，J.等.，(2003).Am.J.Pathol.163，1033-1043.；Kalinichenko，V.V. 等.，(2004).Genes.Dev.18，830-850)。最初在果蝇中鉴定的“forkhead”基因家族，包括具有保守的100-氨基酸DNA-结合基序的转录因子，并且已显示在调节参与细胞生长、增殖、分化、寿命和转化的基因表达中起重要作用。人肝细胞瘤HepG2细胞系中的共转染测定证实FOXM1蛋白刺激细胞周期蛋白B1(CCNB1)和细胞周期蛋白D1(CCND1)的表达(Wang，X.等.，(2002).Proc.Nat.Acad.Sci.99，16881-16886.)，提示这些细胞周期蛋白基因为直接的FOXM1转录靶标并且FOXM1控制对于细胞分裂和脱离有丝分裂必需的基因的转录网络。应当指出我们观察到所检测的大部分NSCLC系列中CCNB1的活化和其与FOXM1表达良好的一致性(数据没有显示)。另一方面，还证实p27(Kip1)和p19(Arf)(CDKN2A)与FOXM1相互作用并且抑制FOXM1的转录活性(Kalinichenko，V.V.等.，(2004).Genes.Dev.18，830-850)。NSCLC细胞中细胞生长通过NMU的促进可反映FOXM1的反式激活，其因此影响那些分子途径的功能。
通过在组织微阵列上的免疫组织化学分析，在大部分NSCLC(SCC、ADC、LCC和BAC)和SCLC样品中，而不是在正常肺组织中检测到NMU蛋白表达提高。由于NMU为分泌蛋白并且用于我们的分析的大多数临床NSCLC样品处于早期和可行手术的阶段，结合纤维镜经支气管活检(TBB)、或验血，NMU可用作早期-阶段肺癌诊断的生物标志物。
总之，已显示NMU和两种新揭示的该分子的受体GHSR1b和NTSR1，很可能通过调节下游靶基因的转录而对NSCLC中的自分泌生长-促进途径起着重要作用。此处报道的数据强烈暗示设计特异性针对肺癌的新抗-癌药物的可能性，其靶向NMU-GHSR1b/NTSR1途径。还提示siRNA本身干扰该途径的潜力，以作为晚期化疗-抗性肺癌治疗的新方法。
工业实用性相比正常肺组织，人基因KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的表达在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达明显提高。因此，这些基因可方便地用作NSCLC的诊断标志物并且因此编码的蛋白质可用于NSCLC的诊断分析中。
本发明人还显示KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的表达促进细胞生长，而细胞生长受对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的小干扰RNA的抑制。这些发现表明KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1和FOXM1蛋白中每种促进致癌活性。因此，这些原癌蛋白的每种为用于抗-癌药物开发的有效靶标。例如，可发现阻断KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1的表达，或阻止其活性的试剂作为抗-癌剂的治疗应用，尤其用于NSCLC治疗的抗-癌剂。所述试剂的例子包括针对KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的反义寡核苷酸，小干扰RNA和核酶，以及识别KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1或FOXM1多肽的抗体。
虽然本发明已根据其具体的实施方案详细描述，对于本领域技术人员显而易见的是在不背离本发明的精神和范围下可进行各种改变和改进。
序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司<120>用于诊断非小细胞肺癌的方法<130>ONC-A0401P<150>US 60/555,789<151>2004-03-23<160>127<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4908<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(141)..(3311)<400>1acctgcgtgc agtcggtcct ccaggccacg cagcgcccga gagtaccagg gagactccgg 60cccctgtcgg cgccaagccc ctccgcccct cacagcgccc aggtccgcgg ccgggccttg 120attttttggc ggggaccgtc atg gcg tcg cag cca aat tcg tct gcg aag aag 173Met Ala Ser Gln Pro Asn Ser Ser Ala Lys Lys1 5 10aaa gag gag aag ggg aag aac atc cag gtg gtg gtg aga tgc aga cca221Lys Glu Glu Lys Gly Lys Asn Ile Gln Val Val Val Arg Cys Arg Pro15 20 25ttt aat ttg gca gag cgg aaa gct agc gcc cat tca ata gta gaa tgt269Phe Asn Leu Ala Glu Arg Lys Ala Ser Ala His Ser Ile Val Glu Cys30 35 40gat cct gta cga aaa gaa gtt agt gta cga act gga gga ttg gct gac317Asp Pro Val Arg Lys Glu Val Ser Val Arg Thr Gly Gly Leu Ala Asp45 50 55aag agc tca agg aaa aca tac act ttt gat atg gtg ttt gga gca tct365Lys Ser Ser Arg Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Met Val Phe Gly Ala Ser60 65 70 75act aaa cag att gat gtt tac cga agt gtt gtt tgt cca att ctg gat413Thr Lys Gln Ile Asp Val Tyr Arg Ser Val Val Cys Pro Ile Leu Asp80 85 90gaa gtt att atg ggc tat aat tgc act atc ttt gcg tat ggc caa act461Glu Val Ile Met Gly Tyr Asn Cys Thr Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr95 100 105ggc act gga aaa act ttt aca atg gaa ggt gaa agg tca cct aat gaa509
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agt aca ttg gaa tat gct cat aga gca aag aac ata ttg aat aag cct1229Ser Thr Leu Glu Tyr Ala His Arg Ala Lys Asn Ile Leu Asn Lys Pro350 355 360gaa gtg aat cag aaa ctc acc aaa aaa gct ctt att aag gag tat acg1277Glu Val Asn Gln Lys Leu Thr Lys Lys Ala Leu Ile Lys Glu Tyr Thr365 370 375gag gag ata gaa cgt tta aaa cga gat ctt gct gca gcc cgt gag aaa1325Glu Glu Ile Glu Arg Leu Lys Arg Asp Leu Ala Ala Ala Arg Glu Lys380 385 390 395aat gga gtg tat att tct gaa gaa aat ttt aga gtc atg agt gga aaa1373Asn Gly Val Tyr Ile Ser Glu Glu Asn Phe Arg Val Met Ser Gly Lys400 405 410tta act gtt caa gaa gag cag att gta gaa ttg att gaa aaa att ggt1421Leu Thr Val Gln Glu Glu Gln Ile Val Glu Leu Ile Glu Lys Ile Gly415 420 425gct gtt gag gag gag ctg aat agg gtt aca gag ttg ttt atg gat aat1469Ala Val Glu Glu Glu Leu Asn Arg Val Thr Glu Leu Phe Met Asp Asn430 435 440aaa aat gaa ctt gac cag tgt aaa tct gac ctg caa aat aaa aca caa1517Lys Asn Glu Leu Asp Gln Cys Lys Ser Asp Leu Gln Asn Lys Thr Gln445 450 455gaa ctt gaa acc act caa aaa cat ttg caa gaa act aaa tta caa ctt1565Glu Leu Glu Thr Thr Gln Lys His Leu Gln Glu Thr Lys Leu Gln Leu460 465 470 475gtt aaa gaa gaa tat atc aca tca gct ttg gaa agt act gag gag aaa1613Val Lys Glu Glu Tyr Ile Thr Ser Ala Leu Glu Ser Thr Glu Glu Lys480 485 490ctt cat gat gct gcc agc aag ctg ctt aac aca gtt gaa gaa act aca1661Leu His Asp Ala Ala Ser Lys Leu Leu Asn Thr Val Glu Glu Thr Thr495 500 505aaa gat gta tct ggt ctc cat tcc aaa ctg gat cgt aag aag gca gtt1709Lys Asp Val Ser Gly Leu His Ser Lys Leu Asp Arg Lys Lys Ala Val510 515 520gac caa cac aat gca gaa gct cag gat att ttt ggc aaa aac ctg aat1757Asp Gln His Asn Ala Glu Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Asn Leu Asn525 530 535agt ctg ttt aat aat atg gaa gaa tta att aag gat ggc agc tca aag1805Ser Leu Phe Asn Asn Met Glu Glu Leu Ile Lys Asp Gly Ser Ser Lys540 545 550 555caa aag gcc atg cta gaa gta cat aag acc tta ttt ggt aat ctg ctg1853Gln Lys Ala Met Leu Glu Val His Lys Thr Leu Phe Gly Asn Leu Leu560 565 570tct tcc agt gtc tct gca tta gat acc att act aca gta gca ctt gga1901Ser Ser Ser Val Ser Ala Leu Asp Thr Ile Thr Thr Val Ala Leu Gly575 580 585
tct ctc aca tct att cca gaa aat gtg tct act cat gtt tct cag att1949Ser Leu Thr Ser Ile Pro Glu Asn Val Ser Thr His Val Ser Gln Ile590 595 600ttt aat atg ata cta aaa gaa caa tca tta gca gca gaa agt aaa act1997Phe Asn Met Ile Leu Lys Glu Gln Ser Leu Ala Ala Glu Ser Lys Thr605 610 615gta cta cag gaa ttg att aat gta ctc aag act gat ctt cta agt tca2045Val Leu Gln Glu Leu Ile Asn Val Leu Lys Thr Asp Leu Leu Ser Ser620 625 630 635ctg gaa atg att tta tcc cca act gtg gtg tct ata ctg aaa atc aat2093Leu Glu Met Ile Leu Ser Pro Thr Val Val Ser Ile Leu Lys Ile Asn640 645 650agt caa cta aag cat att ttc aag act tca ttg aca gtg gcc gat aag2141Ser Gln Leu Lys His Ile Phe Lys Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Lys655 660 665ata gaa gat caa aaa aag gaa cta gat ggc ttt ctc agt ata ctg tgt2189Ile Glu Asp Gln Lys Lys Glu Leu Asp Gly Phe Leu Ser Ile Leu Cys670 675 680aac aat cta cat gaa cta caa gaa aat acc att tgt tcc ttg gtt gag2237Asn Asn Leu His Glu Leu Gln Glu Asn Thr Ile Cys Ser Leu Val Glu685 690 695tca caa aag caa tgt gga aac cta act gaa gac ctg aag aca ata aag2285Ser Gln Lys Gln Cys Gly Asn Leu Thr Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys700 705 710 715cag acc cat tcc cag gaa ctt tgc aag tta atg aat ctt tgg aca gag2333Gln Thr His Ser Gln Glu Leu Cys Lys Leu Met Asn Leu Trp Thr Glu720 725 730aga ttc tgt gct ttg gag gaa aag tgt gaa aat ata cag aaa cca ctt2381Arg Phe Cys Ala Leu Glu Glu Lys Cys Glu Asn Ile Gln Lys Pro Leu735 740 745agt agt gtc cag gaa aat ata cag cag aaa tct aag gat ata gtc aac2429Ser Ser Val Gln Glu Asn Ile Gln Gln Lys Ser Lys Asp Ile Val Asn750 755 760aaa atg act ttt cac agt caa aaa ttt tgt gct gat tct gat ggc ttc2477Lys Met Thr Phe His Ser Gln Lys Phe Cys Ala Asp Ser Asp Gly Phe765 770 775tca cag gaa ctc aga aat ttt aac caa gaa ggt aca aaa ttg gtt gaa2525Ser Gln Glu Leu Arg Asn Phe Asn Gln Glu Gly Thr Lys Leu Val Glu780 785 790 795gaa tct gtg aaa cac tct gat aaa ctc aat ggc aac ctg gaa aaa ata2573Glu Ser Val Lys His Ser Asp Lys Leu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ile800 805 810tct caa gag act gaa cag aga tgt gaa tct ctg aac aca aga aca gtt2621Ser Gln Glu Thr Glu Gln Arg Cys Glu Ser Leu Asn Thr Arg Thr Val
815 820 825tat ttt tct gaa cag tgg gta tct tcc tta aat gaa agg gaa cag gaa2669Tyr Phe Ser Glu Gln Trp Val Ser Ser Leu Asn Glu Arg Glu Gln Glu830 835 840ctt cac aac tta ttg gag gtt gta agc caa tgt tgt gag gct tca agt2717Leu His Asn Leu Leu Glu Val Val Ser Gln Cys Cys Glu Ala Ser Ser845 850 855tca gac atc act gag aaa tca gat gga cgt aag gca gct cat gag aaa2765Ser Asp Ile Thr Glu Lys Ser Asp Gly Arg Lys Ala Ala His Glu Lys860 865 870 875cag cat aac att ttt ctt gat cag atg act att gat gaa gat aaa ttg2813Gln His Asn Ile Phe Leu Asp Gln Met Thr Ile Asp Glu Asp Lys Leu880 885 890ata gca caa aat cta gaa ctt aat gaa acc ata aaa att ggt ttg act2861Ile Ala Gln Asn Leu Glu Leu Asn Glu Thr Ile Lys Ile Gly Leu Thr895 900 905aag ctt aat tgc ttt ctg gaa cag gat ctg aaa ctg gat atc cca aca2909Lys Leu Asn Cys Phe Leu Glu Gln Asp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Thr910 915 920ggt acg aca cca cag agg aaa agt tat tta tac cca tca aca ctg gta2957Gly Thr Thr Pro Gln Arg Lys Ser Tyr Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Val925 930 935aga act gaa cca cgt gaa cat ctc ctt gat cag ctg aaa agg aaa cag3005Arg Thr Glu Pro Arg Glu His Leu Leu Asp Gln Leu Lys Arg Lys Gln940 945 950 955cct gag ctg tta atg atg cta aac tgt tca gaa aac aac aaa gaa gag3053Pro Glu Leu Leu Met Met Leu Asn Cys Ser Glu Asn Asn Lys Glu Glu960 965 970aca att ccg gat gtg gat gta gaa gag gca gtt ctg ggg cag tat act3101Thr Ile Pro Asp Val Asp Val Glu Glu Ala Val Leu Gly Gln Tyr Thr975 980 985gaa gaa cct cta agt caa gag cca tct gta gat gct ggt gtg gat tgt3149Glu Glu Pro Leu Ser Gln Glu Pro Ser Val Asp Ala Gly Val Asp Cys990 995 1000tca tca att ggc ggg gtt cca ttt ttc cag cat aaa aaa tca cat 3194Ser Ser Ile Gly Gly Val Pro Phe Phe Gln His Lys Lys Ser His1005 1010 1015gga aaa gac aaa gaa aac aga ggc att aac aca ctg gag agg tct 3239Gly Lys Asp Lys Glu Asn Arg Gly Ile Asn Thr Leu Glu Arg Ser1020 1025 1030aaa gtg gaa gaa act aca gag cac ttg gtt aca aag agc aga tta 3284Lys Val Glu Glu Thr Thr Glu His Leu Val Thr Lys Ser Arg Leu1035 1040 1045cct ctg cga gcc cag atc aac ctt taa ttcacttggg ggttggcaat 3331
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<211>1056<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Ser Gln Pro Asn Ser Ser Ala Lys Lys Lys Glu Glu Lys Gly1 5 10 15Lys Asn Ile Gln Val Val Val Arg Cys Arg Pro Phe Asn Leu Ala Glu20 25 30Arg Lys Ala Ser Ala His Ser Ile Val Glu Cys Asp Pro Val Arg Lys35 40 45Glu Val Ser Val Arg Thr Gly Gly Leu Ala Asp Lys Ser Ser Arg Lys50 55 60Thr Tyr Thr Phe Asp Met Val Phe Gly Ala Ser Thr Lys Gln Ile Asp65 70 75 80Val Tyr Arg Ser Val Val Cys Pro Ile Leu Asp Glu Val Ile Met Gly85 90 95Tyr Asn Cys Thr Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Thr Gly Lys Thr100 105 110Phe Thr Met Glu Gly Glu Arg Ser Pro Asn Glu Glu Tyr Thr Trp Glu115 120 125Glu Asp Pro Leu Ala Gly Ile Ile Pro Arg Thr Leu His Gln Ile Phe130 135 140Glu Lys Leu Thr Asp Asn Gly Thr Glu Phe Ser Val Lys Val Ser Leu145 150 155 160Leu Glu Ile Tyr Asn Glu Glu Leu Phe Asp Leu Leu Asn Pro Ser Ser165 170 175Asp Val Ser Glu Arg Leu Gln Met Phe Asp Asp Pro Arg Asn Lys Arg180 185 190Gly Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val His Asn Lys Asp195 200 205Glu Val Tyr Gln Ile Leu Glu Lys Gly Ala Ala Lys Arg Thr Thr Ala210 215 220Ala Thr Leu Met Asn Ala Tyr Ser Ser Arg Ser His Ser Val Phe Ser225 230 235 240Val Thr Ile His Met Lys Glu Thr Thr Ile Asp Gly Glu Glu Leu Val245 250 255Lys Ile Gly Lys Leu Asn Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Asn Ile260 265 270Gly Arg Ser Gly Ala Val Asp Lys Arg Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ile275 280 285
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595 600 605Lys Glu Gln Ser Leu Ala Ala Glu Ser Lys Thr Val Leu Gln Glu Leu610 615 620Ile Asn Val Leu Lys Thr Asp Leu Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Leu625 630 635 640Ser Pro Thr Val Val Ser Ile Leu Lys Ile Asn Ser Gln Leu Lys His645 650 655Ile Phe Lys Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Lys Ile Glu Asp Gln Lys660 665 670Lys Glu Leu Asp Gly Phe Leu Ser Ile Leu Cys Asn Asn Leu His Glu675 680 685Leu Gln Glu Asn Thr Ile Cys Ser Leu Val Glu Ser Gln Lys Gln Cys690 695 700Gly Asn Leu Thr Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Gln Thr His Ser Gln705 710 715 720Glu Leu Cys Lys Leu Met Asn Leu Trp Thr Glu Arg Phe Cys Ala Leu725 730 735Glu Glu Lys Cys Glu Asn Ile Gln Lys Pro Leu Ser Ser Val Gln Glu740 745 750Asn Ile Gln Gln Lys Ser Lys Asp Ile Val Asn Lys Met Thr Phe His755 760 765Ser Gln Lys Phe Cys Ala Asp Ser Asp Gly Phe Ser Gln Glu Leu Arg770 775 780Asn Phe Asn Gln Glu Gly Thr Lys Leu Val Glu Glu Ser Val Lys His785 790 795 800Ser Asp Lys Leu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ile Ser Gln Glu Thr Glu805 810 815Gln Arg Cys Glu Ser Leu Asn Thr Arg Thr Val Tyr Phe Ser Glu Gln820 825 830Trp Val Ser Ser Leu Asn Glu Arg Glu Gln Glu Leu His Asn Leu Leu835 840 845Glu Val Val Ser Gln Cys Cys Glu Ala Ser Ser Ser Asp Ile Thr Glu850 855 860Lys Ser Asp Gly Arg Lys Ala Ala His Glu Lys Gln His Asn Ile Phe865 870 875 880Leu Asp Gln Met Thr Ile Asp Glu Asp Lys Leu Ile Ala Gln Asn Leu885 890 895Glu Leu Asn Glu Thr Ile Lys Ile Gly Leu Thr Lys Leu Asn Cys Phe900 905 910
Leu Glu Gln Asp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Thr Gly Thr Thr Pro Gln915 920 925Arg Lys Ser Tyr Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Val Arg Thr Glu Pro Arg930 935 940Glu His Leu Leu Asp Gln Leu Lys Arg Lys Gln Pro Glu Leu Leu Met945 950 955 960Met Leu Asn Cys Ser Glu Asn Asn Lys Glu Glu Thr Ile Pro Asp Val965 970 975Asp Val Glu Glu Ala Val Leu Gly Gln Tyr Thr Glu Glu Pro Leu Ser980 985 990Gln Glu Pro Ser Val Asp Ala Gly Val Asp Cys Ser Ser Ile Gly Gly995 10001005Val Pro Phe Phe Gln His Lys Lys Ser His Gly Lys Asp Lys Glu1010 1015 1020Asn Arg Gly Ile Asn Thr Leu Glu Arg Ser Lys Val Glu Glu Thr1025 1030 1035Thr Glu His Leu Val Thr Lys Ser Arg Leu Pro Leu Arg Ala Gln1040 1045 1050Ile Asn Leu1055<210>3<211>870<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(870)<400>3atg tgg aac gcg acg ccc agc gaa gag ccg ggg ttc aac ctc aca ctg 48Met Trp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Phe Asn Leu Thr Leu1 5 10 15gcc gac ctg gac tgg gat gct tcc ccc ggc aac gac tcg ctg ggc gac 96Ala Asp Leu Asp Trp Asp Ala Ser Pro Gly Asn Asp Ser Leu Gly Asp20 25 30gag ctg ctg cag ctc ttc ccc gcg ccg ctg ctg gcg ggc gtc aca gcc144Glu Leu Leu Gln Leu Phe Pro Ala Pro Leu Leu Ala Gly Val Thr Ala35 40 45acc tgc gtg gca ctc ttc gtg gtg ggt atc gct ggc aac ctg ctc acc192Thr Cys Val Ala Leu Phe Val Val Gly Ile Ala Gly Asn Leu Leu Thr50 55 60atg ctg gtg gtg tcg cgc ttc cgc gag ctg cgc acc acc acc aac ctc240
Met Leu Val Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Thr Thr Thr Asn Leu65 70 75 80tac ctg tcc agc atg gcc ttc tcc gat ctg ctc atc ttc ctc tgc atg288Tyr Leu Ser Ser Met Ala Phe Ser Asp Leu Leu Ile Phe Leu Cys Met85 90 95ccc ctg gac ctc gtt cgc ctc tgg cag tac cgg ccc tgg aac ttc ggc336Pro Leu Asp Leu Val Arg Leu Trp Gln Tyr Arg Pro Trp Asn Phe Gly100 105 110gac ctc ctc tgc aaa ctc ttc caa ttc gtc agt gag agc tgc acc tac384Asp Leu Leu Cys Lys Leu Phe Gln Phe Val Ser Glu Ser Cys Thr Tyr115 120 125gcc acg gtg ctc acc atc aca gcg ctg agc gtc gag cgc tac ttc gcc432Ala Thr Val Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Phe Ala130 135 140atc tgc ttc cca ctc cgg gcc aag gtg gtg gtc acc aag ggg cgg gtg480Ile Cys Phe Pro Leu Arg Ala Lys Val Val Val Thr Lys Gly Arg Val145 150 155 160aag ctg gtc atc ttc gtc atc tgg gcc gtg gcc ttc tgc agc gcc ggg528Lys Leu Val Ile Phe Val Ile Trp Ala Val Ala Phe Cys Ser Ala Gly165 170 175ccc atc ttc gtg cta gtc ggg gtg gag cac gag aac ggc acc gac cct576Pro Ile Phe Val Leu Val Gly Val Glu His Glu Asn Gly Thr Asp Pro180 185 190tgg gac acc aac gag tgc cgc ccc acc gag ttt gcg gtg cgc tct gga624Trp Asp Thr Asn Glu Cys Arg Pro Thr Glu Phe Ala Val Arg Ser Gly195 200 205ctg ctc acg gtc atg gtg tgg gtg tcc agc atc ttc ttc ttc ctt cct672Leu Leu Thr Val Met Val Trp Val Ser Ser Ile Phe Phe Phe Leu Pro210 215 220gtc ttc tgt ctc acg gtc ctc tac agt ctc atc ggc agg aag ctg tgg720Val Phe Cys Leu Thr Val Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Arg Lys Leu Trp225 230 235 240cgg agg agg cgc ggc gat gct gtc gtg ggt gcc tcg ctc agg gac cag768Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ala Val Val Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln245 250 255aac cac aag caa acc gtg aaa atg ctg ggt ggg tct cag cgc gcg ctc816Asn His Lys Gln Thr Val Lys Met Leu Gly Gly Ser Gln Arg Ala Leu260 265 270agg ctt tct ctc gcg ggt cct atc ctc tcc ctg tgc ctt ctc cct tct864Arg Leu Ser Leu Ala Gly Pro Ile Leu Ser Leu Cys Leu Leu Pro Ser275 280 285ctc tga870Leu
<210>4<211>289<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Trp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Phe Asn Leu Thr Leu1 5 10 15Ala Asp Leu Asp Trp Asp Ala Ser Pro Gly Asn Asp Ser Leu Gly Asp20 25 30Glu Leu Leu Gln Leu Phe Pro Ala Pro Leu Leu Ala Gly Val Thr Ala35 40 45Thr Cys Val Ala Leu Phe Val Val Gly Ile Ala Gly Asn Leu Leu Thr50 55 60Met Leu Val Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Thr Thr Thr Asn Leu65 70 75 80Tyr Leu Ser Ser Met Ala Phe Ser Asp Leu Leu Ile Phe Leu Cys Met85 90 95Pro Leu Asp Leu Val Arg Leu Trp Gln Tyr Arg Pro Trp Asn Phe Gly100 105 110Asp Leu Leu Cys Lys Leu Phe Gln Phe Val Ser Glu Ser Cys Thr Tyr115 120 125Ala Thr Val Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Phe Ala130 135 140Ile Cys Phe Pro Leu Arg Ala Lys Val Val Val Thr Lys Gly Arg Val145 150 155 160Lys Leu Val Ile Phe Val Ile Trp Ala Val Ala Phe Cys Ser Ala Gly165 170 175Pro Ile Phe Val Leu Val Gly Val Glu His Glu Asn Gly Thr Asp Pro180 185 190Trp Asp Thr Asn Glu Cys Arg Pro Thr Glu Phe Ala Val Arg Ser Gly195 200 205Leu Leu Thr Val Met Val Trp Val Ser Ser Ile Phe Phe Phe Leu Pro210 215 220Val Phe Cys Leu Thr Val Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Arg Lys Leu Trp225 230 235 240Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ala Val Val Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln245 250 255Asn His Lys Gln Thr Val Lys Met Leu Gly Gly Ser Gln Arg Ala Leu260 265 270
Arg Leu Ser Leu Ala Gly Pro Ile Leu Ser Leu Cys Leu Leu Pro Ser275 280 285Leu<210>5<211>4131<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(373)..(1629)<400>5tcaagctcgc cccgcgcagc ccgagccggg ctgggcgctg tcctcggggg cctggggaac 60cgcgcggttt ggagatcgga ggcacctgga acccgtggca agcgccgagc cgggagacag 120cccgaggaac cacgggttct ggagctagga gccggaagct gggagtccgg aggagagcgg 180agcccggagc ccggagcccg gggcggcgcg tctgggtctg gcgcttcccg actggacggc 240gcgcccgctg gtcttcgcca cgcgccctcc cctgggctcg cgttcatcgg tccccgcctg 300agacgcgccc actcctgccc ggacttccag ccccggaggc gccggacaga gccgcggact 360ccagcgccca cc atg cgc ctc aac agc tcc gcg ccg gga acc ccg ggc acg 411Met Arg Leu Asn Ser Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr1 5 10ccg gcc gcc gac ccc ttc cag cgg gcg cag gcc gga ctg gag gag gcg459Pro Ala Ala Asp Pro Phe Gln Arg Ala Gln Ala Gly Leu Glu Glu Ala15 20 25ctg ctg gcc ccg ggc ttc ggc aac gct tcg ggc aac gcg tcg gag cgc507Leu Leu Ala Pro Gly Phe Gly Asn Ala Ser Gly Asn Ala Ser Glu Arg30 35 40 45gtc ctg gcg gca ccc agc agc gag ctg gac gtg aac acc gac atc tac555Val Leu Ala Ala Pro Ser Ser Glu Leu Asp Val Asn Thr Asp Ile Tyr50 55 60tcc aaa gtg ctg gtg acc gcc gtg tac ctg gcg ctc ttc gtg gtg ggc603Ser Lys Val Leu Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Leu Phe Val Val Gly65 70 75acg gtg ggc aac acg gtg acg gcg ttc acg ctg gcg cgg aag aag tcg651Thr Val Gly Asn Thr Val Thr Ala Phe Thr Leu Ala Arg Lys Lys Ser80 85 90ctg cag agc ctg cag agc acg gtg cat tac cac ctg ggc agc ctg gcg699Leu Gln Ser Leu Gln Ser Thr Val His Tyr His Leu Gly Ser Leu Ala95 100 105ctg tcc gac ctg ctc acc ctg ctg ctg gcc atg ccc gtg gag ctg tac747
Leu Ser Asp Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Met Pro Val Glu Leu Tyr110 115 120 125aac ttc atc tgg gtg cac cac ccc tgg gcc ttc ggc gac gcc ggc tgc 795Asn Phe Ile Trp Val His His Pro Trp Ala Phe Gly Asp Ala Gly Cys130 135 140cgc ggc tac tac ttc ctg cgc gac gcc tgc acc tac gcc acg gcc ctc 843Arg Gly Tyr Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Cys Thr Tyr Ala Thr Ala Leu145 150 155aac gtg gcc agc ctg agt gtg gag cgc tac ctg gcc atc tgc cac ccc 891Asn Val Ala Ser Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys His Pro160 165 170ttc aag gcc aag acc ctc atg tcc cga agc cgc acc aag aag ttc atc 939Phe Lys Ala Lys Thr Leu Met Ser Arg Ser Arg Thr Lys Lys Phe Ile175 180 185agc gcc atc tgg ctc gcc tcg gcc ctg ctg acg gtg cct atg ctg ttc 987Ser Ala Ile Trp Leu Ala Ser Ala Leu Leu Thr Val Pro Met Leu Phe190 195 200 205acc atg ggc gag cag aac cgc agc gcc gac ggc cag cac gcc ggc ggc1035Thr Met Gly Glu Gln Asn Arg Ser Ala Asp Gly Gln His Ala Gly Gly210 215 220ctg gtg tgc acc ccc acc atc cac act gcc acc gtc aag gtc gtc ata1083Leu Val Cys Thr Pro Thr Ile His Thr Ala Thr Val Lys Val Val Ile225 230 235cag gtc aac acc ttc atg tcc ttc ata ttc ccc atg gtg gtc atc tcg1131Gln Val Asn Thr Phe Met Ser Phe Ile Phe Pro Met Val Val Ile Ser240 245 250gtc ctg aac acc atc atc gcc aac aag ctg acc gtc atg gta cgc cag1179Val Leu Asn Thr Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Val Met Val Arg Gln255 260 265gcg gcc gag cag ggc caa gtg tgc acg gtc ggg ggc gag cac agc aca1227Ala Ala Glu Gln Gly Gln Val Cys Thr Val Gly Gly Glu His Ser Thr270 275 280 285ttc agc atg gcc atc gag cct ggc agg gtc cag gcc ctg cgg cac ggc1275Phe Ser Met Ala Ile Glu Pro Gly Arg Val Gln Ala Leu Arg His Gly290 295 300gtg cgc gtc cta cgt gca gtg gtc atc gcc ttt gtg gtc tgc tgg ctg1323Val Arg Val Leu Arg Ala Val Val Ile Ala Phe Val Val Cys Trp Leu305 310 315ccc tac cac gtg cgg cgc ctc atg ttc tgc tac atc tcg gat gag cag1371Pro Tyr His Val Arg Arg Leu Met Phe Cys Tyr Ile Ser Asp Glu Gln320 325 330tgg act ccg ttc ctc tat gac ttc tac cac tac ttc tac atg gtg acc1419Trp Thr Pro Phe Leu Tyr Asp Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr335 340 345
aac gca ctc ttc tac gtc agc tcc acc atc aac ccc atc ctg tac aac1467Asn Ala Leu Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Asn Pro Ile Leu Tyr Asn350 355 360 365ctc gtc tct gcc aac ttc cgc cac atc ttc ctg gcc aca ctg gcc tgc1515Leu Val Ser Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Leu Ala Thr Leu Ala Cys370 375 380ctc tgc ccg gtg tgg cgg cgc agg agg aag agg cca gcc ttc tcg agg1563Leu Cys Pro Val Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Pro Ala Phe Ser Arg385 390 395aag gcc gac agc gtg tcc agc aac cac acc ctc tcc agc aat gcc acc1611Lys Ala Asp Ser Val Ser Ser Asn His Thr Leu Ser Ser Asn Ala Thr400 405 410cgc gag acg ctg tac tag gctgtgcgcc ccggaacgtg tccaggagga 1659Arg Glu Thr Leu Tyr415gcctggccat gggtccttgc ccccgacaga cagagcagcc cccacccggg agccttgatg1719ggggtcaggc agaggccagc ctgcactgga gtctgaggcc tgggaccccc ccctcccacc1779ccctaaccca tgtttctcat tagtgtctcc cgggcctgtc cccaactcct ccccacccct1839cccccatctc ctctttgaaa gccagaacaa gagagcgctc ctctcccaga taggaaaagg1899gcctctaaca aggagaaatt agtgtgcggc aaaaggcagt tttctttgtt ctcagactaa1959tggatggttc cagagaagga aatgaaatgt gctgggtggg gccgggcctc cggcggcccg20l9gctgctgttc ccatgtccac atctctgagg cctgcacccc ctctgtctag ctcggggagt2079ccagccccag tcccgcaggc tccgtggctt tgggcctcac gtgcagaccc tgccatgcag2139acccatgccc ccctccccca ggcagctcca agaaagctcc ctgactcgcc ccttcaggcc2199tggcaagctg ggggcccatc gccgtgggga gtccctccca ccaccctcgc cgcaggcagc2259tgcagccccc agaggggacc acaagcccaa aaaggacaaa aatgggctgg cctggaatgg2319cccagacccc agcctcccct cctccctccc atcctcaccc aggccaaggc ccaggggctc2379tgccaggaca ccacatggga gggggctcag gcctcagcct caagatcttc agctgtggcc2439tctcgggctc ggcagaaggg acgccggatc aggggcctgg tctccagcac ctgcccgagt2499ggccgtggcc aggatggggt gcgcattccg tgtgctttgc ttgtagctgt gcaggctgag2559gtctggagcc aggcccagag ctggcttcag ggtggggcct tgagaagggg aatgtgggac2619aggggcgatg gtgcctggtc tctgagtaag atgccaggtc ccaggaactc aggcttcagg2679tgagaaggag cggtgtgtcc aggcaccgct ggccggcagc cctgggctga ggcacagact2739catttgtcac cttctggcgg cggcagccct ggccccggcc tccaagcagt tgaaaaagct2799ggcgcctcct tggtctctag gatccaggct ccacagagca catgactagc caggcccctg2859
gcttaagaag gtcgcctaag cctaagagaa gacagtccca ggagaagctg gccgggacca 2919gccaggagct gggagccaca ggaagcaaaa gtcagccttt tcttcaaggg atttccctgt 2979ctcagagcag cctttgcccc agggaaatgg gctctgggct ggctgcctgc accggccatg 3039tcgacccagg acccggacac ctggtcttgg gctgtgttca gccactttgc cttctctgga 3099ctcagtttcc ccgtctgaga aatgagagtc gaatgctaca gtatctgcag tcgcttggat 3159ctggctgttg agttgacggg ttccttgaac cccacaaaat ccctctccaa ccacaggacc 3219cttcggctca ccaagaacgg ggcccagggg agtcaggcct attcgctgca cttcctgcca 3279aactttgccc ccacaagcct ggtcatcagc caggcagccc tcccagtgcc caagggccac 3339caaccccagg gaaacagggc cagcacagag gggccttcct cccccacaga gctcccatga 3399catagtctgc tctgggcgga agagctttgc tgccagccag ggatgtccag aggtcggtgc 3459agcccctatc cctgctcagg agtgggctca gagtctagca aatgctaagg cccctcaggc 3519tgggctctga acgaggacct ggactcagag ccagacaggg cagcctcaga cccttctctg 3579gggctcctgg accttgggcc ataatttctg agcctcggtt tccccatcta aggaacagat 3639gtggtcgttc cgccctctca gctggatgag actgtcctgg aggatccacc ccggaacaga 3699cagaacggtg tctctcagga tggtgctctg agagagggca gagtggatgc cccactgccc 3759tagaccctcg gtagacgtgg ggtctctggg gcggggtctg tggctgtgac tgaagtcggc 3819tttcccgttg atgtcttgat gctcctatct gtgcacttac cgtaggtagg gacacgtgtc 3879catgcaccac agacacaccc acgacacctg atctcgtatc actagcttgc ggccaggtca 3939tgatgtggcc ccggaagctg gccctgcgtg ccatgagtgc gtcggtcatg gagtccggag 3999cccctgagcc ggcccctggt gacggcacag ccctcacagc tcaaacgccc acccccactc 4059ccaccatctg caggtggtga aaacaaaccc cgtgtatctc tcaataaagg tggccgaagg 4119gcctcgatgt gg 4131<210>6<211>418<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Arg Leu Asn Ser Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala1 5 10 15Asp Pro Phe Gln Arg Ala Gln Ala Gly Leu Glu Glu Ala Leu Leu Ala20 25 30
Pro Gly Phe Gly Asn Ala Ser Gly Asn Ala Ser Glu Arg Val Leu Ala35 40 45Ala Pro Ser Ser Glu Leu Asp Val Asn Thr Asp Ile Tyr Ser Lys Val50 55 60Leu Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Leu Phe Val Val Gly Thr Val Gly65 70 75 80Asn Thr Val Thr Ala Phe Thr Leu Ala Arg Lys Lys Ser Leu Gln Ser85 90 95Leu Gln Ser Thr Val His Tyr His Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ser Asp100 105 110Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Met Pro Val Glu Leu Tyr Asn Phe Ile115 120 125Trp Val His His Pro Trp Ala Phe Gly Asp Ala Gly Cys Arg Gly Tyr130 135 140Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Cys Thr Tyr Ala Thr Ala Leu Asn Val Ala145 150 155 160Ser Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Ala165 170 175Lys Thr Leu Met Ser Arg Ser Arg Thr Lys Lys Phe Ile Ser Ala Ile180 185 190Trp Leu Ala Ser Ala Leu Leu Thr Val Pro Met Leu Phe Thr Met Gly195 200 205Glu Gln Asn Arg Ser Ala Asp Gly Gln His Ala Gly Gly Leu Val Cys210 215 220Thr Pro Thr Ile His Thr Ala Thr Val Lys Val Val Ile Gln Val Asn225 230 235 240Thr Phe Met Ser Phe Ile Phe Pro Met Val Val Ile Ser Val Leu Asn245 250 255Thr Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Val Met Val Arg Gln Ala Ala Glu260 265 270Gln Gly Gln Val Cys Thr Val Gly Gly Glu His Ser Thr Phe Ser Met275 280 285Ala Ile Glu Pro Gly Arg Val Gln Ala Leu Arg His Gly Val Arg Val290 295 300Leu Arg Ala Val Val Ile Ala Phe Val Val Cys Trp Leu Pro Tyr His305 310 315 320Val Arg Arg Leu Met Phe Cys Tyr Ile Ser Asp Glu Gln Trp Thr Pro325 330 335Phe Leu Tyr Asp Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr Asn Ala Leu340 345 350
Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Asn Pro Ile Leu Tyr Asn Leu Val Ser355 360 365Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Leu Ala Thr Leu Ala Cys Leu Cys Pro370 375 380Val Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Pro Ala Phe Ser Arg Lys Ala Asp385 390 395 400Ser Val Ser Ser Asn His Thr Leu Ser Ser Asn Ala Thr Arg Glu Thr405 410 415Leu Tyr<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>7taaatggctt caggagactt cag 23<210>8<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>8ggttttaaat gcagctccta tgtg 24<210>9<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>9ctgaacagtg ggtatcttcc tta 23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>10gatggctctt gacttagagg ttc 23<210>11<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>11tgaagagatt cagagtggac ga 22<210>12<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>12actgagaaca ttgacaacac agg 23<210>13<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>13aagagggaca gggacaagta gt 22<210>14<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>14atgccactgt tactgcttca g21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>15ggctcttaca actcatgtac cca 23<210>16<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>16tgatacagag acatgaagtg agca 24<210>17<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>18gaatcccaga agtctgaaca 20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>19acggtcctct acagtctca 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>20cacagggaga ggatagga18<210>21<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>21agtgggctca gagtctagca aat 23<210>22<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>22tattgagaga tacacggggt ttg 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>23tgagccctga acaccagaga g21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>24aaagccagat gagcgcttct a21<210>25<211>22<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>25tcttcagcat gatgtgttgt gt 22<210>26<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>28caagtcagtg tacaggtaag c21<210>29<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>29gaagcagcac gacttcttc 19<210>30<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>30cgtacgcgga atacttcga 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>31gcgcgctttg taggattcg 19<210>32<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>32gttagtgtac gaactggag 19<210>33<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>33gtgtctctgt tggagatct 19<210>34<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>34gaaggcagtt gaccaacac 19<210>35
<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>35cctctacctg tccagcatg 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>36gttcatcagc gccatctgg 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>37ggtcgtcata caggtcaac 19<210>38<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>38ggaattccat gtggaacgcg acgcccagcg aa32<210>39<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>39cgcggatccg cgtgtattaa tactagattc tgtccaggcc40
<210>40<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>40ggaattccat gtggaacgcg acgcccagcg aa32<210>41<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>41cgcggatccg cggagagaag ggagaaggca caggga36<210>42<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>42ggaattccat gcgcctcaac agctccgcgc cgggaa36<210>43<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>43cgcggatccg cggtacagcg tctcgcgggt ggcattgct 39<210>44<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>H1RNA基因启动子区域PCR的人工合成的引物序列<400>44tggtagccaa gtgcaggtta ta 22
<210>45<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>H1RNA基因启动子区域PCR的人工合成的引物序列<400>45ccaaagggtt tctgcagttt ca 22<210>46<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>pcDNA3.1H1RNA基因片段PCR的人工合成的引物序列<400>46tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>47<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>pcDNA3.1H1RNA基因片段PCR的人工合成的引物序列<400>47ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca29<210>48<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>连接的DNA PCR的人工合成的引物序列<400>48tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac47<210>49<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>连接的DNA PCR的人工合成的引物序列<400>49tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34
<210>50<211>5085<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的载体序列<400>50gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctggat60ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcggcttgg tagccaagtg caggttatag 120ggagctgaag ggaagggggt cacagtaggt ggcatcgttc ctttctgact gcccgccccc 180cgcatgccgt cccgcgatat tgagctccga acctctcgcc ctgccgccgc cggtgctccg 240tcgccgccgc gccgccatgg aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg 300cgggcccagt gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc 360tgtgagggac aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa 420tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac 480tctttccctt tttgggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaacg aaaccgggcc gggcgcggtg 540gttcacgcct ataatcccag cactttggga ggccgaggcg ggcggatcac aaggtcagga 600ggtcgagacc atccaggcta acacggtgaa accccccccc atctctacta aaaaaaaaaa 660atacaaaaaa ttagccatta gccgggcgtg gtggcgggcg cctataatcc cagctacttg 720ggaggctgaa gcagaatggc gtgaacccgg gaggcggacg ttgcagtgag ccgagatcgc 780gccgactgca ttccagcctg ggcgacagag cgagtctcaa aaaaaaaacc gagtggaatg 840tgaaaagctc cgtgaaactg cagaaaccca agccgaattc tgcagatatc catcacactg 900gcggccgctc gagtgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc 960cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 1020ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 1080ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 1140tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 1200cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 1260tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 1320ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 1380attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 1440
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg1500ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc1560gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca1620tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt1680ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc1740ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga1800acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga1860ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg1920gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga1980ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt2040tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct2100gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct2160gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg2220agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca2280ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga2340tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt2400ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt2460ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct2520ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt2580cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca2640cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg2700gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc2760aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca2820aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct2880tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg2940tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata3000aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca3060ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc3120gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg3180cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta3240
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc3300aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag3360catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac3420caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc3480ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt3540aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc3600gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga3660cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta3720ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta3780tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga3840tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc3900agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg3960aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag4020atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg4080tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt4140tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca4200tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca4260gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc4320tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt4380ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg4440gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc4500aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg4560ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga4620tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga4680ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta4740aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg4800ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact4860ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata4920agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt4980
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 5040ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 5085<210>51<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
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Lys Asp Gln Ala Arg Gln Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly Phe Gln Leu130 135 140Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val Ala Tyr Ile Pro Asp Glu Met Ala Ala145 150 155 160Gln Gln Asn Pro Leu Gln Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gln165 170 175Arg Gly Ser Ser Arg Gln Gly Ser Pro Gly Ser Val Ser Lys Gln Lys180 185 190Pro Cys Asp Leu Pro195<210>98<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
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cctatatccc tgatgaaatg gccgcccagc aaaacccctt gcagcagccc cgaggtcgcc 780gggggcttgg gcagaggggc tcctcaaggc aggggtctcc aggatccgta tccaagcaga 840aaccatgtga tttgcctctg cgcctgctgg ttcccaccca atttgttgga gccatcatag 900gaaaagaagg tgccaccatt cggaacatca ccaaacagac ccagtctaaa atcgatgtcc 960accgtaaaga aaatgcgggg gctgctgaga agtcgattac tatcctctct actcctgaag1020gcacctctgc ggcttgtaag tctattctgg agattatgca taaggaagct caagatataa1080aattcacaga agagatcccc ttgaagattt tagctcataa taactttgtt ggacgtctta1140ttggtaaaga aggaagaaat cttaaaaaaa ttgagcaaga cacagacact aaaatcacga1200tatctccatt gcaggaattg acgctgtata atccagaacg cactattaca gttaaaggca1260atgttgagac atgtgccaaa gctgaggagg agatcatgaa gaaaatcagg gagtcttatg1320aaaatgatat tgcttctatg aatcttcaag cacatttaat tcctggatta aatctgaacg1380ccttgggtct gttcccaccc acttcaggga tgccacctcc cacctcaggg cccccttcag1440ccatgactcc tccctacccg cagtttgagc aatcagaaac ggagactgtt catctgttta1500tcccagctct atcagtcggt gccatcatcg gcaagcaggg ccagcacatc aagcagcttt1560ctcgctttgc tggagcttca attaagattg ctccagcgga agcaccagat gctaaagtga1620ggatggtgat tatcactgga ccaccagagg ctcagttcaa ggctcaggga agaatttatg1680gaaaaattaa agaagaaaac tttgttagtc ctaaagaaga ggtgaaactt gaagctcata1740tcagagtgcc atcctttgct gctggcagag ttattggaaa aggaggcaaa acggtgaatg1800aacttcagaa tttgtcaagt gcagaagttg ttgtccctcg tgaccagaca cctgatgaga1860atgaccaagt ggttgtcaaa ataactggtc acttctatgc ttgccaggtt gcccagagaa1920aaattcagga aattctgact caggtaaagc agcaccaaca acagaaggct ctgcaaagtg1980gaccacctca gtcaagacgg aagtaaaggc tcaggaaaca gcccaccaca gaggcagatg2040ccaaaccaaa gacagattgc ttaaccaaca gatgggcgct gaccccctat ccagaatcac2100atgcacaagt ttttacctag ccagttgttt ctgaggacca ggcaactttt gaactcctgt2160ctctgtgaga atgtatactt tatgctctct gaaatgtatg acacccagct ttaaaacaaa2220caaacaaaca aacaaaaaaa gggtggggga gggagggaaa gagaagagct ctgcacttcc2280ctttgttgta gtctcacagt ataacagata ttctaattct tcttaatatt cccccataat2340gccagaaatt ggcttaatga tgctttcact aaattcatca aatagattgc tcctaaatcc2400aattgttaaa attggatcag aataattatc acaggaactt aaatgttaag ccattagcat2460
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aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa cgg gag acc tgt gca gat 772Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp155 160 165ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc cta tcc aac atc cag 820Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln170 175 180 185tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc tcc cgc agc atc aag 868Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys190 195 200caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg gag cag cga cag gtt 916Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val205 210 215aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc tgg cag aac tct gtg 964Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val220 225 230tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg ata caa ttc gcc atc1012Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile235 240 245aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa gac atc tat acg tgg1060Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp250 255 260 265att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att gcc aag cca ggc tgg1108Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp270 275 280aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac gac atg ttt gtc cgg1156Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg285 290 295gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg acc att cac ccc agt1204Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser300 305 310gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt aag cag cag aaa cga1252Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe Lys Gln Gln Lys Arg315 320 325ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc aaa acc gaa ctc ccc1300Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro330 335 340 345ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta cca cgg gtc agc tca1348Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser350 355 360tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag tca ctg gtg ttg cag1396Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln365 370 375ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct tcc ctc atg agc tca1444Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser
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Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp620 625 630ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat ctc agc acc act ccc ttg2212Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu635 640 645caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa agg ctc ctc agt tca gaa2260Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu650 655 660 665ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac tct tct ccc tca gat2308Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp670 675 680ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca cag gtt tct ggc ctt2356Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu685 690 695gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg gtc ctg gac aca atg aat2404Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn700 705 710gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc ttt cct ggc ctg gac2452Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp715 720 725gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg tcc cag ttt att cct2500Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro730 735 740 745gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt gctcaagctg tccaccatcc2552Glu Leu Glncgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg aggacagcag gcagggactg 2612ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa gtagcagtca caccctagcc 2672actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct ctgctgtccc tgccaggagc 2732tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt aggaaccccc cagcctgttt 2792ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt gcagggtggt ccgtgtaaat 2852agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa gcttatttcc ttagatcatt 2912atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt ttcaattgac ttctgttcct 2972tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg gtttcttcca ggctgaggta 3032cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt ggatctgctt gccagagtcc 3092tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca gctttcctgc aagaagaaat 3152cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa tttggggtgg gaggatggat 3212gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt agatgtttct ctgataatgt 3272
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<223>siRNA的靶序列<400>108gcagcagaaa cgaccgaat 19<210>109<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>109tcccgcagca gaaacgaccg aatttcaaga gaattcggtc gtttctgctg c 51<210>110<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>110aaaagcagca gaaacgaccg aattctcttg aaattcggtc gtttctgctg c 51<210>111<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的发夹结构siRNA序列<400>111gcagcagaaa cgaccgaatt tcaagagaat tcggtcgttt ctgctgc47<210>112<211>2931<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(146)..(751)<400>112agggggagcg gagggaggtg tttctgtcag ttccggctgt ttgttcggga agtggatccg 60ccgctgccgg agcagcccga agggagctgc ggatcgcgag gccagtaccg accccgcccg 120cccgcgcgca ccgcccccgc ccgcc atg gcc cgg gac tac gac cac ctc ttc172Met Ala Arg Asp Tyr Asp His Leu Phe1 5aag ctg ctc atc atc ggc gac agc ggt gtg ggc aag agc agt tta ctg220Lys Leu Leu Ile Ile Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Ser Ser Leu Leu10 15 20 25ttg cgt ttt gca gac aac act ttc tca ggc agc tac atc acc acg atc268Leu Arg Phe Ala Asp Asn Thr Phe Ser Gly Ser Tyr Ile Thr Thr Ile30 35 40gga gtg gat ttc aag atc cgg acc gtg gag atc aac ggg gag aag gtg316Gly Val Asp Phe Lys Ile Arg Thr Val Glu Ile Asn Gly Glu Lys Val45 50 55
aag ctg cag atc tgg gac aca gcg ggg cag gag cgc ttc cgc acc atc364Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile60 65 70acc tcc acg tat tat cgg ggg acc cac ggg gtc att gtg gtt tac gac412Thr Ser Thr Tyr Tyr Arg Gly Thr His Gly Val Ile Val Val Tyr Asp75 80 85gtc acc agt gcc gag tcc ttt gtc aac gtc aag cgg tgg ctt cac gaa460Val Thr Ser Ala Glu Ser Phe Val Asn Val Lys Arg Trp Leu His Glu90 95 100 105atc aac cag aac tgt gat gat gtg tgc cga ata tta gtg ggt aat aag508Ile Asn Gln Asn Cys Asp Asp Val Cys Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys110 115 120aat gac gac cct gag cgg aag gtg gtg gag acg gaa gat gcc tac aaa556Asn Asp Asp Pro Glu Arg Lys Val Val Glu Thr Glu Asp Ala Tyr Lys125 130 135ttc gcc ggg cag atg ggc atc cag ttg ttc gag acc agc gcc aag gag604Phe Ala Gly Gln Met Gly Ile Gln Leu Phe Glu Thr Ser Ala Lys Glu140 145 150aat gtc aac gtg gaa gag atg ttc aac tgc atc acg gag ctg gtc ctc652Asn Val Asn Val Glu Glu Met Phe Asn Cys Ile Thr Glu Leu Val Leu155 160 165cga gca aag aaa gac aac ctg gca aaa cag cag cag caa caa cag aac700Arg Ala Lys Lys Asp Asn Leu Ala Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn170 175 180 185gat gtg gtg aag ctc acg aag aac agt aaa cga aag aaa cgc tgc tgc748Asp Val Val Lys Leu Thr Lys Asn Ser Lys Arg Lys Lys Arg Cys Cys190 195 200taa tggcacccag tccactgcag agactgcact gcggtccctc ccccagcccg 801aggcccacgg aggttcctcg ggggacagtc tcagtttcgt gccgttattt aaagaattct 861ctccatgttt ttgtatcggg aggtgccatc ggcacttcct cccccgccct cctcgagtgc 921caagaaggtg ttggaccagc ccgcccttcc ctactggtgc cccctcctcc ccggccaagg 981cgcctggacc tggcgaggac gctgcccgcc gagcggactg attcgcagag tctgtacata 1041gtgtatattg ctctacccgg ccgcacacca cgtcctgctc tggcttttgc cttcttgatg 1101ccagcctgct gcaacagacc ctccccgcgc ccctccccag cccatcttac tgcaagcagc 1161gtcctgagga gacagcggca cgttctagct gcgtctgcgg ccagcccgtg ccagtggagt 1221gggctccgcg ttgctcattc tctccgacag gttgtcagcc tctgtccccg ctgcacaggg 1281tcttgcccct tctccggggc ctgtgccagc tcccttccct ccccgttgtc ctgtccccac 1341agccattctg ggagctgggg aacctggtct caaggcaggc cctgcagttc cacagaggtg 1401
gcaggtcttg ccctttggcc aacagatttc ttgtcctgcc ttctagatgc ctctgagctc 1461caaacccagg gcagccatgg cttctcattt acaccaacag gtttcagttc caacagaaag 1521gtcggggtag gttcgtgcag agatggggct ggcagggggg ctatgggagg attattttaa 1581cagatcaaga aaatgaagcc aaatcaagtg aattaaattc ctcacaatta ttttctttcc 1641ctgaggtttg attggcacag cagcaaaagt tgaggccacc ccacttgtgt ccactgtttt 1701tagaaaaaaa tgaatggctt cctgccattg tggggctgga ctcttgggct ttcttggtgg 1761gagcggagaa ggggcctccc acccttgtcc gagttgcctc ccactggagg tcaggagtct 1821acactgcagc ctcgggcact gtggggagtg catgcctggg gcctctgggt ggggaccatg 1881gacaggccct ggtcactgtc ctaacctttg tcaggacaaa ggtagcaaga ggatttcctg 1941gcgggtggga aggaatggct ggggcggcca gttttgacac gccccagtgc cctggagaac 2001aaccagggtc atctgcactt gatgactgct ccccgacccc cagcccggac acctcattcc 2061cctcccacta cagggatcaa gtgacctggg aagaaccgag tttaacacca ggatgtgttt 2121ccttagattt cctttcctag gcgatttcca gggagagccc tgattggaca atcacatcac 2181agatcacact gcagtttcca tgttagcact gtggatgggt ttttaatcaa taaaaactgg 2241gggtttcttc tcaccgactc tccacttgcc caaactgcca aaagctggtg attctgggac 2301aggccttcac tttggagcca cgggatgggg tgggggagcc ccatgggcct gggaaggagg 2361gtgctgtgga gggggctgca gggctgacca gcaggcagcc tcatctggtc gggggcgggg 2421gcggcaggag cagaagcggg gtctccgtcc ttgggactgt cctggttggc cacgggccct 2481gaggatgcac ggtgcctggg gctcctgtgc cggtgggcgg ggggcatgct ggcctctgag 2541cgatcaggcg aggccagcga gggtgtgctt gcaaattcaa gcaataagag gggggttcct 2601gggggcttcc agcccaggct agaagccccc atggcttctg gcagctggac atcagcccca 2661ggtattgggg tgattttggt catgacagtg tgcctgtccc actgttacac gcatgaatgg 2721gggttatggg gtgggggtgg ggactcaggg ctggaccgac gtcctagtgg acctgatgtg 2781aaattcctgt caaacaaaca ccacttttca atggtttgct aggagtattt ctgtattgaa 2841agtttctaat tatgcttttt aaaaaaatac taaaaataaa ggttcaagct gccaaaaaaa 2901aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2931<210>113<211>201<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>113
Met Ala Arg Asp Tyr Asp His Leu Phe Lys Leu Leu Ile Ile Gly Asp1 5 10 15Ser Gly Val Gly Lys Ser Ser Leu Leu Leu Arg Phe Ala Asp Asn Thr20 25 30Phe Ser Gly Ser Tyr Ile Thr Thr Ile Gly Val Asp Phe Lys Ile Arg35 40 45Thr Val Glu Ile Asn Gly Glu Lys Val Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr50 55 60Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr Arg Gly65 70 75 80Thr His Gly Val Ile Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Ala Glu Ser Phe85 90 95Val Asn Val Lys Arg Trp Leu His Glu Ile Asn Gln Asn Cys Asp Asp100 105 110Val Cys Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Asn Asp Asp Pro Glu Arg Lys115 120 125Val Val Glu Thr Glu Asp Ala Tyr Lys Phe Ala Gly Gln Met Gly Ile130 135 140Gln Leu Phe Glu Thr Ser Ala Lys Glu Asn Val Asn Val Glu Glu Met145 150 155 160Phe Asn Cys Ile Thr Glu Leu Val Leu Arg Ala Lys Lys Asp Asn Leu165 170 175Ala Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn Asp Val Val Lys Leu Thr Lys180 185 190Asn Ser Lys Arg Lys Lys Arg Cys Cys195 200<210>114<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>114gagatgttca actgcatca 19<210>115<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>115tcccgagatg ttcaactgca tcattcaaga gatgatgcag ttgaacatct c 51<210>116<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>116aaaagagatg ttcaactgca tcatctcttg aatgatgcag ttgaacatct c 51<210>117<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的发夹结构siRNA序列<400>117gagatgttca actgcatcat tcaagagatg atgcagttga acatctc47<210>118<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>118aaaaagggga tgcctagaac tc 22<210>119<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>119ctttcagcac gtcaaggaca t21<210>120<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>120acacctacga aggtacacat gac 23<210>121<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>121gctatttcag ggtaaatgga gtc 23<210>122<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>122cagagatgga ggatgtcaat aac 23<210>123<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>123catagcagct ttaaagagac acg 23<210>124<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>124ccaccataac agtggagtgg g21<210>125<211>24<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>125cagttacagg tgtatgactg ggag 24<210>126<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>126ctgaatacaa cttcctgttt gcc 23<210>127<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列<400>127gaccacagaa ttaccaaaac tgc 2权利要求
1.诊断受试者中非小细胞肺癌(NSCLC)或发生非小细胞肺癌的易感性的方法，包含测定源自受试者的生物学样品中非小细胞肺癌-相关基因的表达水平，其中所述表达水平相比所述基因正常对照水平的提高表明所述受试者患有NSCLC或处于发生NSCLC的风险中，其中所述NSCLC-相关基因选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种。
2.权利要求1的方法，其中所述提高为大于所述正常对照水平至少10％。
3.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括测定多个NSCLC-相关基因的表达水平。
4.权利要求1的方法，其中所述表达水平通过选自下列的任何一项方法测定(1)检测NSCLC-相关基因的mRNA；(2)检测由NSCLC-相关基因编码的蛋白质；和(3)检测由NSCLC-相关基因编码的蛋白质的生物学活性。
5.权利要求1的方法，其中所述表达水平通过检测NSCLC-相关基因探针与所述患者来源的生物学样品的基因转录本的杂交而测定。
6.权利要求5的方法，其中所述杂交步骤在DNA阵列上进行。
7.权利要求1的方法，其中所述生物学样品包括痰液或血液。
8.NSCLC的参照表达分布型，包括选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的两个或更多个基因的基因表达模式。
9.包括两种或多种检测试剂的试剂盒，所述检测试剂检测选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的一个或多个基因的表达。
10.包括两种或多种多核苷酸的阵列，所述多核苷酸结合选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1中的一个或多个基因。
11.鉴定抑制NSCLC-相关基因表达水平的化合物的方法，包括步骤(1)将表达所述NSCLC-相关基因的检测细胞与检测化合物接触；(2)检测所述NSCLC-相关基因的表达水平；和(3)确定相比所述基因的正常对照水平抑制所述表达水平的化合物，作为所述NSCLC-相关基因的抑制剂其中所述NSCLC-相关基因选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种。
12.权利要求11的方法，其中所述检测细胞为NSCLC细胞。
13.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将检测化合物与选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的多肽接触；(2)检测多肽和检测化合物之间的结合活性；和(3)选择结合该多肽的化合物。
14.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将检测化合物与由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和(c)与缺少该检测化合物时检测的生物学活性相比，选择抑制选自KIF11、GHSR1b、NTSR1，或FOXM1中的一种或多种的多肽生物学活性的化合物。
15.权利要求14的方法，其中所述生物学活性为细胞增殖活性。
16.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将检测化合物与表达一个或多个标志基因的细胞接触，其中一个或多个标记基因选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1；和(2)选择降低选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1的一个或多个标记基因表达水平的化合物。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞为NSCLC细胞。
18.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将检测化合物与其中已导入载体的细胞接触，该载体包括一个或多个标记基因的转录调控区和以及在所述转录调控区调控下表达的报告基因，其中所述一个或多个标记基因选自KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1；(2)测量所述报告基因的活性；和(3)相比对照，选择降低所述报告基因表达水平的化合物。
19.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将KIF11多肽或其功能等同物与KOC1多肽或其功能等同物在检测化合物存在时接触；(2)检测所述多肽之间的结合；和(3)选择抑制所述多肽之间结合的检测化合物。
20.权利要求19的方法，其中所述KIF11多肽的功能等同物包括KOC1结合结构域的氨基酸序列。
21.权利要求19的方法，其中所述KOC1多肽的功能等同物包括KIF11结合结构域的氨基酸序列。
22.测量多肽的RNA转运活性的方法，所述方法包括步骤a.将选自i.包括SEQ ID NO2(KIF11)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO2至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；或iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；中的一种或多种多肽与所转运的RNA在能形成RNA转运蛋白的条件下接触；b.检测转运的RNA的水平；和c.通过将步骤(b)的转运的RNA的水平与RNA转运活性相关而测量RNA的转运活性。
23.权利要求22的方法，其中能形成RNA转运蛋白的条件在KOC1多肽或其功能等同物存在下提供。
24.权利要求23的方法，其中KOC1多肽的功能等同物为选自下列中的一种或多种的多肽i.包括SEQ ID NO104(KOC1)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO105氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO105至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；或iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO104的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；
25.鉴定调节RNA转运活性的试剂的方法，所述方法包括步骤a.将试剂与选自i.包括SEQ ID NO2(KIF11)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO2至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；或iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；中的一种或多种的多肽与所转运的RNA在能形成RNA转运蛋白的条件下接触；b.检测转运的RNA的水平；和c.将转运的RNA的水平与缺少所述试剂的对照水平比较，其中转运的RNA的水平相比对照水平的提高或降低表明所述检测化合物调节RNA转运活性。
26.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将KOC1多肽或其功能等同物与RNA在检测化合物存在时接触；(2)检测多肽和RNA之间的结合；和(3)选择抑制多肽和RNA之间结合的检测化合物。
27.权利要求26的方法，其中所述KOC1多肽的功能等同物包括RRM结构域或KH结构域中一个或两者的氨基酸序列。
28.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括步骤(1)将GHSR1b或NTSR1多肽或其功能等同物与NMU在检测化合物存在时接触；(2)检测多肽和NMU之间的结合；和(3)选择抑制多肽和NMU之间结合的检测化合物。
29.权利要求28的方法，其中所述多肽在活细胞表面上表达。
30.权利要求29的方法，其中所述多肽和NMU之间的结合通过选自下列的任何一项方法检测(1)检测细胞中钙或cAMP的浓度；(2)检测多肽的活化；(3)检测多肽和G蛋白之间的相互作用；(4)检测磷脂酶C或其下游途径的活化；(5)检测引起一些激酶包括Raf、MEK、ERKs和蛋白激酶D(PKD)的蛋白激酶级联的活化；(6)检测酪氨酸激酶Src/Tec/Bmx-家族成员的活化；(7)检测Ras和Rho家族成员的活化，MAP家族JNK成员中成员的调节或肌动蛋白细胞骨架的重构；(8)检测通过多肽活化介导的任何信号复合物的活化；(9)检测多肽的亚细胞定位的变化，包括多肽的配体-诱导的内在化/内吞；(10)检测多肽下游任何转录因子的活化或其下游基因的活化；和(11)检测细胞增殖、转化或任何其他的致癌表型。
31.用于检测检测化合物调节RNA转运活性的试剂盒，所述试剂盒包括表达a至d组分的分离的细胞，以及支持所述细胞生长的培养基a.选自下列中一种或多种的多肽i.包括SEQ ID NO2(KIF11)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO2至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；或iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO2的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；b.选自下列中的一种或多种的多肽i.包括SEQ ID NO104(KOC1)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO105氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO105至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；和iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO104的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQID NO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；和c.所要转运的RNA；和d.DCTN1
32.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的试剂盒，所述试剂盒至少包括下列成分a.选自下列中的一种或多种的多肽i.包括SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的多肽；ii.包括其中一个或多个氨基酸经取代、缺失或插入的SEQ IDNO105氨基酸序列的多肽，并且所述多肽具有与由SEQ ID NO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；iii.包括具有与SEQ ID NO105至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽；或iv.由在严谨条件下杂交至由SEQ ID NO104的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由SEQID NO105的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性；v.至少包括SEQ ID NO105的两个KH结构域和一个或多个RRM结构域的多肽；和b.与所述多肽结合的RNA。
33.权利要求32的试剂盒，其中所述RNA为选自列于表2的基因中的一种或多种的mRNA。
34.筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的试剂盒，所述试剂盒包括组分aGHSR1b或NTSR1多肽，或其功能等同物bNMUc用于检测所述多肽和NMU之间结合的试剂。
35.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，包括给予所述受试者反义组合物，所述组合物包括与选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的基因的编码序列互补的核苷酸序列。
36.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，包括给予所述受试者包括siRNA的siRNA组合物，其中所述组合物降低选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的基因的表达。
37.权利要求36的方法，其中所述siRNA为包括选自SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的核苷酸序列作为靶序列的有义链。
38.权利要求37的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’其中[A]为对应于选自SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的序列的核糖核苷酸序列；[B]为由3个至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；以及[A’]为与[A]互补的核糖核苷酸序列。
39.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，包括给予所述受试者药学有效量的抗体或其片段的步骤，所述抗体或其片段结合由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的基因编码的多肽。
40.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，包括给予所述受试者一种疫苗，所述疫苗包含由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的基因编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码所述多肽的多核苷酸。
41.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，所述方法包括给予通过权利要求13至23以及28至34的任何一项的方法获得的化合物，或通过权利要求27的方法鉴定的试剂的步骤。
42.治疗或预防受试者中NSCLC的方法，所述方法包括给予具有显性负性作用的KOC1突变体，或编码所述突变体的多核苷酸的步骤。
43.权利要求42的方法，其中所述KOC1突变体包括缺乏位于KOC1C-末端的至少一个KH结构域的氨基酸序列。
44.包括有义链和反义链的双-链分子，其中有义链包括对应于KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中反义链包括与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双-链分子，并且其中所述双-链分子当导入表达KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1基因的细胞时，抑制所述基因的表达。
45.权利要求44的双-链分子，其中所述KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列包括来自选自SEQ ID NO1、3、5或106中的一种或多种的核苷酸序列的至少约10个连续的核苷酸。
46.权利要求45的双-链分子，其中所述KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列包括来自选自SEQ ID NO1、3、5或106中的一种或多种的核苷酸序列的约19个至25个连续的核苷酸。
47.权利要求46的双-链分子，其中所述KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1靶序列选自SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的核苷酸序列。
48.权利要求44的双-链分子，其中所述双-链分子为包括经单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链的单个核糖核苷酸转录本。
49.权利要求44的双-链分子，其中所述双-链分子为小于约100个核苷酸长度的寡核苷酸。
50.权利要求49的双-链分子，其中所述双-链分子为小于约75个核苷酸长度的寡核苷酸。
51.权利要求50的双-链分子，其中所述双-链分子为小于约50个核苷酸长度的寡核苷酸。
52.权利要求51的双-链分子，其中所述双-链分子为小于约25个核苷酸长度的寡核苷酸。
53.权利要求52的双-链多核苷酸，其中所述双链分子为约19个和约25个核苷酸长度之间的寡核苷酸。
54.编码权利要求44的双-链分子的载体。
55.权利要求54的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录本并且包括有义链和反义链。
56.权利要求55的载体，其中所述转录本进一步包括连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
57.包括包含有义链核酸和反义链核酸组合的多核苷酸的载体，其中所述有义链核酸包括选自SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的核苷酸序列，并且所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成。
58.权利要求57的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’其中[A]为选自SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的序列的核苷酸序列；[B]为由3个至23个核苷酸组成的核苷酸序列；以及[A’]为与[A]互补的核苷酸序列。
59.用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包括药学有效量的针对选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种基因的反义多核苷酸。
60.用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包括药学有效量的针对选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种基因的siRNA。
61.权利要求60的组合物，其中所述siRNA包括包含SEQ ID NO32、33、34、35、36、37或108中的一种或多种的核苷酸序列作为靶序列的有义链。
62.用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包括药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合由选自KIF11、GHSR1b、NTSR1或FOXM1中的一种或多种的基因编码的多肽。
63.治疗或预防受试者中NSCLC的组合物，所述组合物包括作为活性组分的药学有效量的通过权利要求13至23以及28至34任何一项的方法选择的化合物或通过权利要求27的方法鉴定的试剂，以及药学可接受载体。
64.治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包括作为活性组分的具有显性负性作用的药学有效量的KOC1突变体或编码所述突变体的多核苷酸，以及药学可接受载体。
65.权利要求64的组合物，其中所述的KOC1突变体包括缺乏位于KOC1C-末端的至少一个KH结构域的氨基酸序列。
66.预测NSCLC预后的方法，其中所述方法包括步骤a.检测KIF11或KOC1中一个或两者在收集自将预测其NSCLC预后的受试者的样本中的表达水平，和b.当检测到KIF11或KOC1中一个或两者表达水平提高时表明不良的预后。
67.权利要求66的方法，其中表达水平通过选自下列的任何一项方法检测(a)检测编码SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的mRNA，(b)检测包括SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的蛋白质，和(c)检测包括SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性。
68.用于预测NSCLC预后的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自下列的任何一种组分(a)用于检测编码SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的mRNA的试剂，(b)用于检测包括SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的蛋白质的试剂，和(c)用于检测包括SEQ ID NO2(KIF11)或SEQ ID NO105(KOC1)的氨基酸序列的蛋白质生物学活性的试剂。
全文摘要
公开了利用差异表达的基因KIF11、GHSR1b、NTSR1和FOXM1检测非小细胞肺癌(NSCLC)的方法。还公开了基于KOC1和KIF11，或NMU和GHSR1b或NTSR1之间的相互作用鉴定用于治疗和预防NSCLC的化合物的方法。
文档编号A61K31/731GK1977052SQ200580016560
公开日2007年6月6日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月23日
发明者中村佑辅, 醍醐弥太郎, 中鹤修一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司