专利名称：含有与治疗性物质连接的非天然链间二硫键的t细胞受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有与治疗性物质结合的非天然链间二硫键的T细胞受体(TCR)。
背景技术：
本文公开的新型TCR治疗剂组合可用于治疗自身免疫疾病、器官排异、移植物抗宿主病(GVHD)和癌症。本文公开的TCR治疗剂组合中的TCR部分是靶向部分。
发明简述本发明首次制备了可利用的与治疗性物质结合的二聚体TCR(dTCR)或单链TCR(scTCR)，所述物质选自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD44抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD45RB抗体、抗-CD45RO抗体、抗-Thy1.2抗体、抗淋巴细胞球蛋白、抗-αβTCR抗体、抗-γδTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-TCR Vβ8抗体、抗-CD16抗体、抗-CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗体、抗-CD40L抗体、抗-ICAM-1抗体、ICAM-I、抗-Mac抗体、抗-LFA-1抗体、抗-IFN-γ抗体、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗-IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗体、IL-12拮抗剂(p40)、抗-IL-1抗体、IL-1拮抗剂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、抗-GAD抗体、病毒蛋白和肽、细菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神经酰胺、降钙素、烟酰胺、抗-氧化剂(维生素E、丙丁酚类似物、丙丁酚+地夫可特(deflazacoert)或氨基胍)、抗-炎性药物(己酮可可碱或咯利普兰(Rolipram))、免疫调节剂(罗喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍乱毒素B、钒酸盐或维生素D3类似物、小分子CD80抑制剂、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗体)、狼疮独特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制剂、硅石、神经节苷脂、抗无唾液酸(Antiasialo)GM-1抗体、透明质酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I类MHC抗体、或抗-II类MHC抗体、环孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脱氧精胍菌素(Deoxyspergualin)、PE38假单胞菌外毒素或上述任何物质的功能性变体或片段；其中所述TCR包含由对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成的第一区段，该氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，该氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；该第一和第二链之间有一个二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物；和以所述scTCR为例，其还含有连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列，或反之亦然，该接头序列的长度和该二硫键的位置应使得所述第一和第二区段的可变区序列的彼此定向基本上如同天然αβT细胞受体的那样。
发明详述本发明提供与治疗性物质结合的二聚体TCR(dTCR)或单链TCR(scTCR)，所述物质选自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD44抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD45RB抗体、抗-CD45RO抗体、抗-Thy1.2抗体、抗淋巴细胞球蛋白、抗-αβTCR抗体、抗-γδTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-TCR Vβ8抗体、抗-CD16抗体、抗-CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗体、抗-CD40L抗体、抗-ICAM-1抗体、ICAM-I、抗-Mac抗体、抗-LFA-1抗体、抗-IFN-γ抗体、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗-IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗体、IL-12拮抗剂(p40)、抗-IL-1抗体、IL-1拮抗剂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、抗-GAD抗体、病毒蛋白和肽、细菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神经酰胺、降钙素、烟酰胺、抗-氧化剂(维生素E、丙丁酚类似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性药物(己酮可可碱或咯利普兰)、免疫调节剂(罗喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍乱毒素B、钒酸盐或维生素D3类似物、小分子CD80抑制剂、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗体)、狼疮独特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制剂、硅石、神经节苷脂、抗无唾液酸GM-1抗体、透明质酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I类MHC抗体、或抗-II类MHC抗体、环孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脱氧精胍菌素、PE38假单胞菌外毒素或上述任何物质的功能性变体或片段；其中所述TCR包含由对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成的第一区段，该氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，该氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；该第一和第二链之间有一个二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物；和以所述scTCR为例，其还含有连接所述第一区段C末端与所述第二区段N末端的接头序列，或反之亦然，该接头序列的长度和该二硫键的位置应使得所述第一和第二区段的可变区序列的彼此定向基本上如同天然αβT细胞受体的那样。
本文所用的术语“与治疗性物质结合的二聚体TCR(dTCR)或单链TCR(scTCR)”应理解为表示TCR与治疗性物质共价或以其它方式连接。所述治疗性物质可以直接与TCR相连，也可经接头部分间接相连。
本文所用的术语“功能性变体”应理解为表示所公开治疗性物质的具有相同治疗作用的类似物。例如，本领域技术人员知道与本文公开的物质相比，可以产生在其化学结构或氨基酸序列中掺入微小改变但不会改变该物质的治疗作用的治疗剂。这种普通的变体包括在本发明范围内。
功能性抗体片段和变体适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于以下。
抗体片段本领域技术人员已知可能产生基本上保留了亲代抗体相同结合特性的某给定抗体的片段。下文提供了这种片段的细节微小抗体(minibody)-这些构建物由具有截除了Fc部分的抗体组成。因此，它们保留了其所衍生抗体的完整结合结构域。
Fab片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白重链的一部分共价相连的一条免疫球蛋白轻链。例如，Fab片段包含一个抗原结合位点。Fab片段定义为用木瓜蛋白酶处理而释放的IgG的一部分。这种片段一般可经重组DNA技术产生。(Reeves等，(2000)，《免疫学讲稿》(Lecture Notes on Immunology)，(第四版)，BlackwellScience出版)F(ab’)2片段-这些(构建物)包含一种抗体的二个抗原结合位点和绞链区。F(ab’)2片段定义为用胃蛋白酶处理而释放的IgG的一部分。这种片段一般可经重组DNA技术产生。(Reeves等，(2000)，《免疫学讲稿》(Lecture Notes on Immunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)Fv片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白轻(链)可变区共价相连的免疫球蛋白重(链)可变区。已产生了许多Fv设计。这些(构建物)包括通过引入二硫键来增强两结构域之间缔合的dsFv。或者，可利用肽接头将两个结构域结合在一起成为一条多肽而形成scFv。也已产生了含有免疫球蛋白重链或轻链的可变区，并与相应的免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区相结合的Fv构建物。Fv也可多聚化而形成双抗体或三抗体(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。
NanobodiesTM-由Ablynx(比利时)投入市场的这些构建物包含衍生自骆驼(camelid)(例如，骆驼或美洲驼)抗体的一个合成的免疫球蛋白重(链)可变区。
结构域抗体-由Domantis(比利时)投入市场的这些构建物包含亲和力成熟的一个免疫球蛋白重(链)可变区或免疫球蛋白轻(链)可变区。
抗体变体和类似物本发明所定义的抗体功能特性是它们能特异性结合靶配体。本领域技术人员已知可工程改造许多其它蛋白质的这种结合特性。适用于本发明组合物和方法的抗体变体和同类物的例子包括但不限于以下。
基于蛋白质支架的结合多肽-该结合构建物家族包括含天然结合环的蛋白质的突变类似物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市场的基于衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的IgG结合结构域之一的三螺旋基序Affibodies抗体。另一例子是由EvoGenix(澳大利亚)投入市场的基于移植了类似于抗体结合环结构域CTLA-4胞外结构域的Evibodies抗体。最后一个例子是由RegeneronPharmaceuticals(US)投入市场的在抗体支架中嫁接有细胞因子受体结构域的Cytokine Traps。(Nygren等，(2000)Current Opinion in Structural biology，7 463-469)是利用支架经工程改造在蛋白质中加入新型结合位点的综述。该综述提及以下蛋白质作为支架来源CP1锌指(结构)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z结构域(蛋白A同类物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和细胞色素b562。其它蛋白质支架研究报道采用了纤连蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和锚蛋白重复(序列)。
本领域技术人员已知可以产生能与某给定蛋白配体不同部分结合的抗体或其片段，变体或类似物。例如，可制备针对形成此(CD3)复合物的多肽链(即，γ、δ、ε、ζ和ηCD3链)之一的抗-CD3抗体。能与εCD3链结合的抗体是本发明组合物和方法所用的优选抗-CD3抗体。
本发明另一方面提供与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，所述物质选自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD44抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD45RB抗体、抗-CD45RO抗体、抗-Thy1.2抗体、抗淋巴细胞球蛋白、抗-αβTCR抗体、抗-γδTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-TCR Vβ8抗体、抗-CD16抗体、抗-CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗体、抗-CD40L抗体、抗-ICAM-1抗体、ICAM-1、抗-Mac抗体、抗-LFA-1抗体、抗-IFN-γ抗体、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗-IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2白喉(Diptheria)-毒素蛋白、抗-IL-12抗体、IL-12拮抗剂(p40)、抗-IL-1抗体、IL-1拮抗剂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、抗-GAD抗体、病毒蛋白和肽、细菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神经酰胺、降钙素、烟酰胺、抗-氧化剂(维生素E、丙丁酚类似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性药物(己酮可可碱或咯利普兰)、免疫调节剂(罗喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍乱毒素B、钒酸盐或维生素D3类似物、小分子CD80抑制剂、雄激素、IGF-1、免疫操控物(Immunomanipulation)(天然抗体)、狼疮独特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制剂、硅石、神经节苷脂、抗无唾液酸GM-1抗体、透明质酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I类MHC抗体、或抗-II类MHC抗体、环孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脱氧精胍菌素、或上述任何物质的功能性变体或片段“抗-T细胞”抗体本发明的一组优选的免疫调节剂是能与只由T细胞或天然杀伤(NK)细胞呈递的表位结合的抗体或其功能性片段或变体/类似物。以下是能特异性靶向这些细胞的抗体抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-αβTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-γδTCR抗体、抗-TCR Vβ8抗体和抗-CD28抗体。
本领域技术人员知道大多数以上抗体所靶向的T细胞和/或NK细胞特定亚组。只有抗-CD3抗体靶向所有的NK细胞和T细胞。
与可溶性TCR相连而形成本发明双功能组合物的这种抗体可导致T细胞和/或NK细胞定位于表达可溶性TCR同源肽-MHC配体的细胞。不想受理论的束缚，这些抗体与T细胞或NK细胞结合可激活这些细胞。
本发明另一方面提供与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，所述治疗性物质选自IL-10、IL-4或IL-3或它们的功能性变体或片段。
本发明一方面提供组织特异性的dTCR或scTCR。在该方面的一个实施方案中，所述dTCR或scTCR对在自身免疫疾病、器官排异或移植物抗宿主病(GVHD)中作为自身反应性T细胞靶标的组织具有特异性。在该方面的特定实施方案中，所述dTCR或scTCR是胰岛细胞特异性的。T细胞克隆NY8.3(Santamaria等，J.Immunology，(1995)，154 2494-2503和Nagata等，(1995)，J Immunology，1522042-2050)和G9C8(Wong等，J Exp Med，(1996)，183 67-76)是胰岛细胞特异性小鼠T细胞克隆的例子。NY8.3 T细胞克隆是小鼠H2-KdMHC呈递的葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)衍生肽的特异性克隆，G9C8 T细胞克隆是小鼠H2-KdMHC呈递的胰岛素衍生肽的特异性克隆。
本发明另一方面提供与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，所述治疗性物质选自IL-15、IL-21、IL-23、PE38假单胞菌外毒素、IFN-γ或抗-CD3抗体或它们的功能性变体或片段。
在本发明的一方面，与治疗性物质结合的TCR是dTCR。在本发明的其它方面，与治疗性物质结合的TCR是scTCR。
有两类接头是本发明TCR与治疗性物质结合优选的接头。通过聚亚烷基二醇链与治疗性物质结合的本发明TCR是该方面的实施方案之一。肽接头是另一类TCR接头。关于它们在形成TCR多聚体中的应用，下文详细讨论了这两类接头。本文的实施例6提供了可用于连接TCR和治疗性物质的两种肽接头实例。本领域技术人员已知各种肽接头适合于连接TCRβ链与所需的治疗性物质。以下是可用于此目的的接头序列的其它例子ggcggtccg-其编码Gly-Gly-Pro接头。
cccggg-其编码包含Xma1限制性酶切位点的Pro-Gly接头。
如上所述，本文所述TCR治疗性物质组合中的TCR部分是靶向部分。本发明TCR能靶向TCR配体，例如肽-MHC或CD1-抗原复合物。例如，如果与该配体的特异性天然TCR相比，这些TCR对该TCR配体的亲和力较高和/或解离速率较慢是理想的。待批申请WO 2004/044004的发明人详述了与该配体的特异性天然TCR相比，对该TCR配体的亲和力较高和/或解离速率较慢的TCR的制备方法。此TCR对TCR配体的亲和力(KD)最好高于1μM和/或解离速率(kOFF)最好低于1×10-3S-1。更优选该TCR对TCR配体的亲和力(KD)高于10nM和/或解离速率(kOFF)低于1×10-4S-1。最优选该TCR对TCR配体的亲和力(KD)高于1nM和/或解离速率(kOFF)低于1×10-5S-1。
可采用任何已知的方法检测亲和力(KD)和/或解离速率(koff)。优选方法是实施例3所述的表面等离振子共振(Biacore)方法。
就广义而言，本发明TCR可以如WO 04/033685和WO 03/020763所述为单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)形式。
合适的scTCR形式包含由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，所述氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。
或者，第一区段可由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，第二区段可由对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，所述氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合。
更具体地说，第一区段可由对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，此氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；第二区段可由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成，此氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合；和在第一和第二链之间可以存在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键。
在以上scTCR形式中，接头序列可连接第一区段C末端和第二区段N末端，其序列如式-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO1)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ IDNO2)所示，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。
本发明TCR的合适dTCR形式含有第一多肽和第二多肽，其中第一多肽中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端融合；第二多肽中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端融合；该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键相连。
所述第一多肽可含有与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端融合的TCRα链可变区序列，而第二多肽的序列对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端融合，该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间的二硫键相连。(“TRAC”等术语在本文根据《T细胞受体手册》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8命名)。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式可含有对应于人αβTCR胞外恒定区和可变区序列的氨基酸序列，和可连接所述恒定区序列的氨基酸残基且在天然TCR中没有等价物的二硫键。此二硫键位于与天然TCR中相对应的其β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸残基的半胱氨酸残基之间，例如在取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间。对于TCRα链，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRAC*01外显子1中的以下残基，对于TCRβ链，是TRBC1*01或TRBC2*01外显子1中的以下残基
除了以上提及的非天然二硫键外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对应于天然TCR中通过二硫键连接的那些残基的残基之间含有二硫键。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式的序列最好不含对应于天然TCR的跨膜或细胞质序列。
本发明的一个实施方案提供与治疗性物质结合的TCR，其中所述治疗性物质是PE38外毒素。
PE38外毒素是假单胞菌外毒素的截短形式。该天然多肽是由结构域IA、II、IB和III构成的66kDa蛋白质。PE38衍生物由结构域II、结构域IB的氨基酸380-399和结构域III构成。本领域技术人员明白本发明可利用假单胞菌外毒素的其它截短形式(例如PE40)。本发明所用PE38的优选变体在其结构域III中含有突变，因而C-末端氨基酸是KDEL。以前(研究)显示这些C-末端突变提高了假单胞菌外毒素的毒性。(Kreitman等，(1995)，J Biochem，307 29-37)。
在一优选的实施方案中，与PE38外毒素结合的所述TCR含有(SEQ ID NO73)和(SEQ ID NO71)所示氨基酸序列。(分别见图29b和28b)PEG化的TCR单体在一具体实施方案中，本发明与治疗性物质结合的TCR还与至少一条聚亚烷基二醇链结合。本领域技术人员已知许多方法可引起这种结合。在一优选的实施方案中，该聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在另一实施方案中，本发明该方面的聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。
多价TCR复合物本发明一方面提供含有与治疗性物质结合的至少两个TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方案中，至少两个TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这种多价TCR复合物可经非肽聚合物链或肽接头序列相连。该复合物最好是水溶性的，因而应照此选择接头部分。此外，接头部分最好能与TCR分子上所明确的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方案所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列在不位于TCR可变区序列中的各TCR氨基酸残基之间延伸。
由于本发明复合物可用于医疗，接头部分应考虑它们的药学适用性，例如它们的免疫原性来选择。
在诸如抗体片段连接领域已知符合以上理想标准的接头部分的例子。
两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。其中TCR通过聚亚烷基二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方案。
第一类是亲水性聚合物，例如聚亚烷基二醇。该类聚合物中最常用的是结构如下式所示的聚乙二醇或PEG。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而，其它聚合物依据其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇及乙二醇和丙二醇的共聚物。
这种聚合物可用于处理或偶联治疗性物质，特别是多肽或蛋白质治疗剂来有益地改变该治疗剂的PK分布状况。据信，PEG分子能在该治疗剂周围形成“外壳”而在空间上阻碍治疗剂与免疫系统反应并减少其蛋白酶降解从而改善了PEG-治疗剂偶联物的PK分布状况。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用亲水性聚合物的大小可根据TCR复合物预期的治疗应用具体选择。因此，例如当需要该产品离开循环(系统)透过组织时，如用于治疗肿瘤时，宜利用5KDa量级的低分子量聚合物。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇的化学和生物学应用ACS手册》(Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACSBooks)，Washington，D.C.。
所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。
该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或在骨架支链处含有化学反应活性基团从而能使该聚合物与TCR中的靶位点相连。如下所示，这种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者如下所示在亲水性聚合物和反应活性化学(基团)之间可有一间隔基团/部分反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)反应活性化学(基团)-间隔基团-亲水性聚合物-间隔基团-反应活性化学(基团)用于形成上述类型构建物的间隔基团可以是无反应活性的、化学稳定的、链状的任何有机部分。这种间隔基团包括但不限于以下基团-(CH2)n-，其中n＝2到5-(CH2)3NHCO(CH2)2本发明多价TCR复合物中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与连接了治疗性物质的TCR连接点之间，提供了该方面的另一实施方案。
本发明多价TCR复合物中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位，提供了该方面的另一实施方案。
可利用各种偶联化学(试剂)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽治疗剂。选择最合适的偶联化学(试剂)主要取决于所需的偶联位点。例如，以下偶联化学(试剂)(来源Nektar分子工程目录2003(Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003))已用于连接PEG分子的一个或多个末端N-马来酰亚胺、乙烯砜、苯并三唑碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)、琥珀酰亚胺丁酸酯、硫代酸酯、乙醛、丙烯酸酯、生物素和伯胺。
如上所述，非PEG聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适接头。例如，可以利用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。
肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用是在TCR分子上产生用于连接的简单接头或多聚化结构域。以前曾用生物素/链霉亲和素系统产生用于体外结合研究的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于治疗剂中不理想。
本发明TCR复合物中TCR通过衍生自人多聚化结构域的肽接头相连提供了该方面的另一实施方案。有许多含多聚化结构域的人蛋白可用于产生多价TCR复合物。例如，与单体scFV片段相比，利用p53四聚化结构域所产生的scFv抗体片段四聚体已显示其血清持久存留时间增加和解离速率显著降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可能用于该类应用的四聚化结构域。
本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将药物前体转化为药物的酶相连。这使得药物前体只在需要的部位转变为药物(即，通过sTCR靶向)。
治疗性应用本发明也提供将治疗性物质递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价TCR复合物是给定的肽-MHC复合物特异性的。
具体地说，可利用本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物将治疗性物质递送至能呈递具体抗原的细胞所在部位。这可用于许多情况，例如抵御肿瘤或自身免疫疾病时。治疗性物质的递送应可在局部施加其作用而非只对与其结合的细胞起作用。
因此，一种具体方案设想将免疫刺激分子与肿瘤抗原特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连。对于癌症治疗，定位于肿瘤或转移(肿瘤)的邻近可提高毒素或免疫刺激剂的效果。或者，可利用本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物将免疫抑制剂递送至能呈递自身免疫疾病相关特定抗原的细胞所在部位。例如，可利用胰岛细胞特异性TCR将免疫抑制剂(如IL-10、IL-4或IL-13或它们的功能性变体或片段)递送至糖尿病患者的胰岛细胞。
对于疫苗递送，可将疫苗抗原定位于抗原呈递细胞附近，从而可提高抗原的效力。
预计给予患者干扰素(IFN)，例如IFN-γ，然后和/或同时给予和治疗性物质结合的TCR可提高靶细胞上肽-MHC的表达水平。这对于治疗癌症特别有益。
本发明的其它实施方案提供含有与治疗性物质结合的TCR或其多价TCR复合物及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明也提供一种治疗癌症的方法，包括给予患这种癌症的对象有效量的与治疗性物质结合的TCR或其多价TCR复合物。在一相关实施方案中，本发明提供与治疗性物质结合的TCR或其多价TCR复合物在制备治疗癌症的组合物中的应用。IL-15、IL-21或抗-CD3抗体或它们的功能性变体或片段是用于治疗癌症的特别优选的治疗剂。
本发明也提供一种治疗自身免疫疾病、器官排异或GVHD的方法，包括给予患这种自身免疫疾病、器官排异或GVHD的对象有效量的与治疗性物质结合的TCR或其多价TCR复合物。在一相关实施方案中，本发明提供与治疗性物质结合的TCR或其多价TCR复合物在制备治疗自身免疫疾病、器官排异或GVHD的组合物中的应用。IL-10、IL-4或IL-13或它们的功能性变体或片段是用于治疗自身免疫疾病、器官排异或GVHD的特别优选的治疗剂。在另一相关实施方案中，本发明的dTCR或scTCR是组织特异性的。在其它相关的实施方案中，所述dTCR或scTCR是自身免疫疾病、器官排异或移植物抗宿主病(GVHD)中自身反应性T细胞的靶位组织特异性的。在一特定实施方案中，本发明提供治疗糖尿病的方法，其中所述dTCR或scTCR是胰岛细胞特异性的。
可从本发明方法获益的癌症包括白血病、头、颈(癌)、肺(癌)、乳腺(癌)、结肠(癌)、子宫颈(癌)、肝(癌)、胰腺(癌)、卵巢(癌)和睾丸(癌)。
可从本发明方法获益的自身免疫疾病包括以下急性播散性脑脊髓炎、肾上腺机能不全、过敏性脉管炎和肉芽肿(Allergic angiitis and granulomatosis)、淀粉样变性病(Amylodosis)、强直性脊柱炎、哮喘、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性脱发、自身免疫性慢性活动性肝炎、自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune haemolytic anaemia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少(Autoimmune Neutrogena)、自身免疫性血小板减少性紫癜、贝塞病、小脑变性、慢性活动性肝炎、慢性炎性脱髓鞘多神经根神经疾病(Chronic inflammatory demyelinatingpolyradiculoneuropathy)、具有单克隆γ-球蛋白病的慢性神经病、经典的结节性多动脉炎、先天性肾上腺增生、寒冷病(Cryopathies)、疱疹样皮炎、糖尿病、伊-朗综合征、脑脊髓炎、后天性大疱性表皮松解、结节性红斑、谷蛋白敏感性肠病、
古德帕斯彻综合征、格-巴综合征、桥本甲状腺炎、甲状腺功能亢进、特发性血色素沉着、特发性膜性肾小球肾炎、中枢神经系统的分离性血管炎、川崎病、轻微变化肾病、混杂型血管炎(Miscellaneous vasculitides)、混合型结缔组织病、具有传导阻滞的多病灶运动原神经病(Multifocal motor neuropathy withconduction block)、多发性硬化症、重症肌无力、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(Opsoclonus-myoclonus syndrome)、类天疱疮(Pemphigoid)、天疱疮(Pemphigus)、恶性贫血、多发性肌炎/皮肌炎、感染后关节炎、原发性胆管硬化、银屑病、反应性关节炎、莱特病、视网膜病、类风湿性关节炎、硬化性胆管炎、斯耶格伦综合征、
僵体综合征、亚急性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、全身形坏死性血管炎、全身性硬化症(硬皮病)、高安动脉炎、颞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、I型和II型自身免疫性多腺体综合征、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、韦格纳肉芽肿病本发明的治疗性组合物通常可作为包含药学上可接受的载体的灭菌药物组合物的一部分提供。该药物组合物可采取任何合适的形式(取决于将其给予患者所需方法)。该药物组合物可以单位剂型提供，通常装在密封的容器中，可作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒中通常(虽然不是必需的)装有使用说明书。该试剂盒可装有多个所述单位剂型。
该药物组合物可采用任何合适的途径给予，例如胃肠外、透皮或吸入，优选胃肠外(包括皮下、肌肉内，或最优选静脉内)途径。可通过药学领域已知的任何方法，例如在无菌条件下混合活性成分与运载体或赋形剂来制备这种组合物。
取决于所治疗的疾病或病症、所治疗个体的年龄和身体状况等，本发明物质的剂量范围很广，医师可最终确定所用的合适剂量。
其它方面与治疗性物质结合的scTCR或dTCR(其中TCR优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构成)可以基本纯形式、或作为纯化或分离的制剂提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。
本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面一样。本文提及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入本文。
实施例以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
参考以下附图
图1a和1b分别显示了可溶性A6 TCR的α和β链的核酸序列，所述核酸序列经突变而引入了一个半胱氨酸密码子。阴影表示引入的半胱氨酸密码子；图2a显示了A6 TCRα链的胞外氨基酸序列，其包含用于产生新型链间二硫键的T48→C突变(下划线)；图2b显示了A6 TCRβ链的胞外氨基酸序列，其包含用于产生新型链间二硫键的S57→C突变(下划线)；图3a显示了A6 TCRα链序列，其包含突变的新型半胱氨酸残基以掺入BamH1限制性位点。阴影表示为形成BamH1限制性位点而引入的突变；图3b和3c显示了经突变含有形成非天然二硫键的额外半胱氨酸残基的JM22TCRα和β链的DNA序列；图4a和4b分别显示了从图3b和3c所示DNA序列产生的JM22 TCRα和β链胞外氨基酸序列；图5a和5b分别显示了可溶性AH-1.23 TCR的α和β链的DNA序列，该序列经突变而引入了一个新的半胱氨酸密码子(以阴影表示)；图6a和6b分别显示了从图5b和5c所示DNA序列产生的AH-1.23 TCRα和β链胞外氨基酸序列；图7a-成熟的人IL-10的DNA序列；图7b-成熟的人IL-10的氨基酸序列；图8a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Pro-Gly接头的DNA序列如下划线所示；图8b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Pro-Gly接头如下划线所示；图9a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；
图9b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图10a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；图10b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-10相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图11a-成熟的人IL-4的DNA序列；图11b-成熟的人IL-4的氨基酸序列；图12a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头与参与形成成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Pro-Gly接头的DNA序列如下划线所示；图12b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头参与形成与成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Pro-Gly接头如下划线所示；图13a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；图13b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图14a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；图14b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-4相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图15a-成熟的人IL-13的DNA序列；图15b-成熟的人IL-13的氨基酸序列；图16a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Pro-Gly接头的DNA序列如下划线所示；图16b-含有非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Pro-Gly接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Pro-Gly接头如下划线所示；图17a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；图17b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图18a-含有一个非天然半胱氨酸的AH1.23 TCRβ链的DNA序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。编码Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头的DNA序列如下划线所示；
图18b-含有一个非天然半胱氨酸密码子的AH1.23 TCRβ链的氨基酸序列，该半胱氨酸经Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头参与形成与成熟的人IL-13相连的新型链间键。引入的半胱氨酸以阴影表示。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro接头如下划线所示；图19详述了pEX821质粒的DNA序列；图20提供pEX821载体的质粒图，其DNA序列见图19；图21详述了pEX954质粒的DNA序列；图22提供pEX954载体的质粒图，其DNA序列见图21；图23a详述了编码高亲和力c61 NY-ESO MTCRβ链的DNA序列，图23b详述了图23a所示DNA序列编码的氨基酸序列；图24a详述了编码C末端经肽接头与IL-18相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图24b详述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接头如下划线所示；图25a详述了编码C末端经肽接头与高亲和力c61 NY-ESO MTCRβ链相连的IL-18原蛋白的DNA序列。此原-IL-18 DNA经改变而编码了因子X的一个切割位点。图25b详述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接头如下划线所示；图26a详述了编码C末端经肽接头与IL-10相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图26b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示；图27a详述了编码C末端经肽接头与IL-13相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图27b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示；图28a详述了编码C末端经肽接头与PE38外毒素的“KDEL”变体相连的高亲和力c61 NY-ESO MTCRβ链的DNA序列。图28b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示；图29a详述了编码高亲和力c58 NY-ESO MTCRα链的DNA序列，图29b详述了图29a所示DNA序列编码的氨基酸序列。
实施例1-引物设计及A6 TAX TCRα和β链的诱变为将TRAC*01外显子1的A6 Tax苏氨酸48突变为半胱氨酸，设计了以下引物(突变以小写显示)5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT(SEQ ID NO3)5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G(SEQ ID NO4)为将TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的A6 Tax丝氨酸57突变为半胱氨酸，设计了以下引物(突变以小写字母显示)5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC(SEQ ID NO5)5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G(SEQ ID NO6)PCR诱变如下所示，分别利用上述α-链引物和β-链引物突变含有A6 Tax TCRα或β链基因的表达质粒。将100ng质粒和5μl 10mM dNTP、25μl 10×Pfu-缓冲液(Stratagene)、10单位Pfu聚合酶(Stratagene)混合，用H2O将终体积调节至240μl。向48μL此混合物中加入引物稀释至终浓度为0.2μM，最终反应体积为50μL。经95℃，30秒的初始变性步骤后，反应混合物用Hybaid PCR快速PCR仪进行变性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分钟)，15轮。然后37℃用10单位DpnI限制性酶(New England Biolabs)消化产物5小时。将10μl消化的反应(产物)转化入感受态XL1-Blue细菌中，细菌在37℃生长18小时。挑出一个菌落，在5ml TYP+氨苄青霉素(16g/l Bacto-胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/l氨苄青霉素)中生长过夜。按照生产商的使用说明书用Qiagen小制备柱纯化质粒DNA，自动测序验证序列。图1a和2a及图1b和2b分别显示了α链和β链突变的核酸序列和氨基酸序列。
实施例2-可溶性TCR表达、重折叠和纯化将分别含有突变的α-链和β-链的表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)菌株BL21pLysS中，37℃用TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基培养氨苄西林抗性单个菌落至OD600为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用BeckmanJ-6B离心机以4000rpm离心30分钟收集细胞。细胞沉淀重悬于含有50mMTris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH 8.0的缓冲液中。冻融过夜后，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬细胞进行1分钟爆发性超声波处理，共约10分钟。用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心30分钟回收包涵体沉淀物。然后用洗涤剂洗涤3次除去细胞碎片和膜组分。每次将包涵体在Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)中匀浆，然后用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心沉淀15分钟。然后用以下缓冲液进行类似洗涤以除去洗涤剂和盐50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分为30mg等份，-70℃冷冻。用6M胍-HCl溶解并用Bradford染料结合试验(PerBio)定量测定包涵体的蛋白产量。
可溶性TCR的变性从冷冻储备物中融解30mg溶解的TCRβ链包涵体和60mg溶解的TCRα链包涵体。用6M胍溶液将包涵体稀释至终浓度为5mg/ml，加入DTT(2 M储备液)至终浓度为10mM。混合物在37℃培育30分钟。
可溶性TCR的重折叠1L重折叠缓冲液在5℃±3℃剧烈搅拌。加入氧化还原对试剂(2-巯基乙胺和胱胺)至终浓度分别为6.6mM和3.7mM，约5分钟后加入变性的TCR链。5℃±3℃搅拌约5小时±15分钟以重折叠此蛋白质。
透析重折叠的可溶性TCR重折叠的TCR以Spectrapor 1膜(Spectrum；产品号.132670)用10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小时。然后将透析缓冲液更换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，继续在5℃±3℃透析20-22小时。
实施例3-与特异性pMHC结合的sTCR的Biacore表面等离振子共振特征鉴定用表面等离振子共振生物传感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR与其肽-MHC配体的结合情况。制备以半定向方式固定在链霉亲和素包被的结合表面上的单pMHC复合物(描述于下文)有助于该项分析，从而有效地测试了可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定在不同的流动小室上)的结合情况。手动注入HLA复合物可以容易地操控固定的I类分子的精确水平。
这种固定的复合物能同时结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注射入溶液相。即使在低浓度(至少40μg/ml)也能获得TCR的特异性结合，暗示TCR较稳定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，观察到sTCR的pMHC结合特性在质量和数量上相似。这对控制可溶性(TCR)种类的部分活性很重要，也提示生物素化pMHC复合物的生物学活性与非生物素化复合物的相同。
在体外重折叠细菌表达的含组成型亚基蛋白和合成肽的包涵体中的生物素化I类HLA-A2-肽复合物，纯化后进行体外酶(催化)生物素化(O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15)。表达的HLA-重链含有取代了合适构建物中该蛋白质的跨膜和胞质结构域的C-末端生物素化标签。包涵体表达水平约为75mg/升细菌培养物。HLA轻链或β2-微球蛋白也在大肠杆菌中以约500mg/升细菌培养液的水平表达为合适构建物的包涵体。
裂解大肠杆菌，将包涵体纯化至约80％纯。包涵体的蛋白质用6M胍-HCl、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA变性，通过在＜5℃时将变性蛋白质以一次脉冲加入重折叠缓冲液中，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度在0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml肽(例如，tax11-19)中重折叠。重折叠在4℃至少进行1小时方完成。
用10倍体积的10mM Tris pH 8.1透析更换缓冲液。为充分降低该溶液的离子强度，缓冲液需要更换两次。然后将蛋白质溶液通过1.5μm乙酸纤维素滤膜过滤，加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上(床体积8ml)。用0-500mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白质。HLA-A2-肽复合物大约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，各组分冷藏于冰上。
用以相同缓冲液预平衡的Pharmacia快速脱盐柱将生物素化标记的HLA复合物的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白质的组分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化试剂1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15纯化)。然后将混合物在室温培育过夜。
采用凝胶过滤层析纯化生物素化的HLA复合物。用已过滤的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加入1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5ml/分钟洗脱。生物素化的HLA复合物作为单峰洗脱约15ml。合并含有蛋白质的组分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白质浓度，生物素化的HLA复合物分为等份试样保存在-20℃。采用标准的胺偶联方法固定链霉亲和素。
在BIAcore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含有新型链间键的A6 Tax sTCR与其配体/MHC复合物或不相关的HLA-肽组合(上述产物)之间的相互作用。SPR可检测小流动室中传感器表面附近的折射指数变化，此变化以反应单位(RU)表示，该原理可用于检测受体配体相互作用并分析它们的亲和力和动力学参数。通过交联在β2m上的生物素和链霉亲和素(二者用化学方法交联于流动小室的活化表面)之间的结合作用将各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中来制备探针流动小室。然后使sTCR以恒定流速流过不同流动小室的表面，再测定这样做时的SPR反应来进行该试验。首先使sTCR以5μl每分钟的恒定流速流过两个不同的表面来验证此相互作用的特异性；一个表面用约5000RU的特异性肽-HLA复合物包被，第二个用约5000RU的非特异性肽-HLA复合物包被。可用恒定流速和不同的浓度注入sTCR来与肽-HLA复合物相比以确定背景共振。从用特异性肽-HLA复合物获得的数值中减去这些对照的检测值计算出以解离常数Kd表示的结合亲和力(Price和Dwek，《生物化学家的物理化学原理与问题》(Principles andProblems in Physical Chemistry for Biochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，牛津)。
获得的Kd值(1.8μM)接近不含新型二硫键的A6 Tax sTCR与pMHC之间相互作用所报道的值(0.91μM-Ding等，1999，Immunity，1145-56)。
实施例4-制备含有新型二硫键的可溶性JM22 TCR实施例1制备的可溶性A6 TCR的β链含有适合用作连接位点的天然序列BglII限制性位点(AAGCTT)。
如下所详述，进行PCR诱变将BamH1限制性位点(GGATCC)引入可溶性A6TCR的α链新型半胱氨酸密码子的5’处。实施例1所述序列用作此诱变的模板。使用以下引物BamHI5’-ATATCCAGAACCCgGAtCCTGCCGTGTA-3’(SEQ ID NO7)5’-TACACGGCAGGAaTCcGGGTTCTGGATAT-3’(SEQ ID NO8)将100ng质粒和5μl 10mM dNTP、25μl 10×Pfu-缓冲液(Stratagene)、10单位Pfu聚合酶(Stratagene)混合，用H2O将终体积调节至240μl。向48μL此混合物中加入引物稀释至终浓度为0.2μM，最终反应体积为50μL。经95℃，30秒的初始变性步骤后，反应混合物用Hybaid PCR快速PCR仪进行的变性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分钟)，共15轮。然后在37℃用10单位DpnI限制性酶(New England Biolabs)消化产物5小时。将10μl消化反应(产物)转化入感受态XL1-Blue细菌中，细菌在37℃生长18小时。挑出一个菌落，在5ml TYP+氨苄青霉素(16g/l Bacto-胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨苄青霉素)中生长过夜。按照生产商的使用说明书用Qiagen小制备柱纯化质粒DNA，自动测序验证此序列。引入α链的突变是“沉默”突变，因而此链的氨基酸序列与图2a详述的相比无变化。图3a显示了该突变的α链的DNA序列。
为产生掺入了新型二硫键的可溶性JM22 TCR，将含有α链BamH1和β链BglII限制性位点的A6 TCR质粒用作模板。使用了以下引物|NdeI|5’-GGAGATATACATATGCAACTACTAGAACAA-3’(SEQ ID NO9)5’-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3’(SEQ ID NO10)|BamHI||Nde1|5’-GGAGATATACATATGGTGGATGGTGGAATC-3’(SEQ ID NO11)5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’(SEQ ID NO12)|BglII|如下所示，通过PCR克隆获得JM22 TCRα和β-链构建物。利用上述引物和含有JM22 TCR链的模板进行PCR反应。用相关的限制性酶限制性消化该PCR产物，将其克隆入pGMT7获得表达质粒。自动DNA测序验证该质粒插入物的序列。图3b和3c分别显示了JM22 TCR的突变α和β链的DNA序列，图4a和4b显示了得到的氨基酸序列。
如实施例1和2所述表达、共同折叠和纯化各TCR链。
如实施例3所述进行JM22 TCR与pMHC结合的Biacore分析。HLA-flu复合物的这种二硫键连接的TCR经测定其Kd为7.9±0.51μM。
实施例5-制备含有新型链间二硫键的可溶性AH-1.23 TCR按照已知的技术从Hill Gaston(Medical School，Addenbrooke’s Hospital，剑桥)提供的T细胞分离得到编码AH-1.23 TCR的cDNA。用逆转录酶处理该HiRNA得到编码NY-ESO TCR的cDNA。
如实施例4所述，为产生掺入了新型二硫键的可溶性AH-1.23 TCR，将含有α链BamHI和β链BglII限制性位点的TCR质粒用作框架。使用了以下引物|NdeI|5’-GGGAAGCTTACATATGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGG-3’(SEQ IDNO13)5’-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3’(SEQ ID NO14)|BamHI||NdeI|5’-TTGGAATTCACATATGGGCGTCATGCAGAACCCAAGACAC-3(SEQ IDNO15)5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’(SEQ ID NO16)|BglII|如下所示，进行PCR克隆获得AH-1.23 TCRα和β-链构建物。利用上述引物和含有AH-1.23 TCR链的模板进行PCR反应。用相关的限制性酶限制性消化PCR产物，将其克隆入pGMT7获得表达质粒。通过自动DNA测序验证该质粒插入物的序列。图5a和5b分别显示了AH1.23 TCR的突变α和β链的DNA序列，图6a和6b显示了得到的氨基酸序列。
如实施例2所述表达、共同折叠和纯化各TCR链。
实施例6-制备可溶性AH-1.23 TCR-IL-10融合蛋白然后可制备包含图7a所详述的成熟人IL-10 DNA序列和位于IL-10 DNA序列5’端的许多DNA延伸段之-的合成基因。此5’端DNA延伸段是用于连接IL-10DNA与编码AH1.23 TCRβ链的接头序列。
接头序列cccggg-其编码含有Xma1限制性酶切位点的Pro-Gly接头ggatccggcggtccg-(SEQ ID NO17)其编码含有BamHI限制性酶切位点的Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO18)接头。
ggatccggtgggggcggaagtggaggcagcggtggatccggcggtccg-(SEQ ID NO19)其编码含有两个BamH1限制性酶切位点的Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)接头。
然后将上述合成基因之一亚克隆入如实施例5所述制备的含AH1.23 TCRβ链的pGMT7质粒中，从而形成编码TCRβ链-接头-IL-10融合蛋白的DNA序列。
图8a和8b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Pro-Gly-IL-10融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图9a和9b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO18)-IL-10融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图10a和10b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-10融合体的DNA序列和氨基酸序列。
然后采用实施例2详述的方法使这些AH1.23 TCRβ链-接头-IL-10融合蛋白与AH1.23 TCRα链重折叠从而产生完整的可溶性AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白。
以上详述的方法描述了制备TCRβ链的C-末端连接有IL-10单体的可溶性αβTCR。常见的IL-10是同源二聚体形式。因此，使与可溶性AH1.23 TCR相连的IL-10多肽二聚化可能有益。这可用许多方法实现。例如，可将单链形式的成熟人IL-10同源二聚体与TCRβ融合，然后与TCRα链一起重折叠。或者，可在溶液中将成熟形式的人IL-10加入按照上述形成的TCRβ链-IL-10融合蛋白，然后与可溶性TCRα链一起重折叠，或者加入重折叠的αβTCR-IL-10融合蛋白。或者，可采用本实施例所述方法将其它IL-10分子加入TCRα链形成融合蛋白来产生TCRβ链-IL-10融合蛋白。然后可采用实施例2所述方法使两种TCR链-IL-10融合蛋白一起重折叠。最后，可通过IL-10多肽的同源二聚化形成含有两个TCR(各含一个与TCRβ链相连的IL-10多肽)的复合物。这将导致以下类型的复合物
αβTCR-IL-10同源二聚体-αβTCR。
实施例7-制备可溶性AH-1.23 TCR-IL-4和AH-1.23 TCR-IL-13融合蛋白也可采用实施例6所述方法制备含有与其它多肽相连的可溶性AH-1.23 TCR的融合蛋白。
可构建包含图11a所详述的成熟人IL-4 DNA序列和实施例6所列举的5’端DNA延伸序列之一的合成基因，将其亚克隆入如实施例5所述制备的含AH1.23TCRβ链的pGMT7质粒中，从而形成编码TCRβ链-接头-IL-4融合蛋白的DNA序列。
图12a和12b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Pro-Gly-IL-4融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图13a和13b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-(SEQ ID NO18)-IL-4融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图14a和14b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-4融合体的DNA序列和氨基酸序列。
可构建包含图15a所详述的成熟人IL-13 DNA序列和实施例6所列举的5’端DNA延伸序列之一的合成基因，将其亚克隆入如实施例5所述制备的含AH1.23TCRβ链的pGMT7质粒中，从而形成编码TCRβ链-接头-IL-4融合蛋白的DNA序列。
图16a和16b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Pro-Gly-IL-13融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图17a和17b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-(SEQ ID NO18)-IL-13融合体的DNA序列和氨基酸序列。
图18a和18b分别详述了AH1.23 TCRβ链-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO20)-IL-13融合体的DNA序列和氨基酸序列。
然后采用实施例2详述的方法使这些AH1.23 TCRβ链-接头-干扰素融合蛋白与AH1.23 TCRα链重折叠从而产生完整的可溶性AH1.23 TCR-干扰素融合蛋白。
实施例10-评估AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白导致肥大细胞增殖能力的胸苷掺入试验在IL-4存在下将对人IL-10起反应能增殖的5×106个D36小鼠肥大细胞系的细胞培养在RPMI 1640培养基中。如实施例9所述制备一系列AH1.23TCR-IL-10融合蛋白(0、0.01、0.1、0.5和1μM)，将IL-4加入上述培养基。(Schlaak等，(1994)，J Immunological Methods，168 49-54)然后，在96孔板的1×105个上述培养细胞中加入1.85MBq/ml的H3胸苷。37℃，5％CO2下再培育这些培养物8小时。利用细胞收获机(cell-harvester)收集细胞，利用Top Countβ计数器检测掺入细胞的胸苷水平。
与不存在融合蛋白时所见相比，AH1.23 TCR-IL-10融合蛋白存在时掺入D36细胞的胸苷减少，表明该融合蛋白的IL-10部分有活性，能导致D36肥大细胞增殖。
实施例11-制备高亲和力NY-ESO MTCR-治疗性物质融合蛋白合成含有图23a详述的编码可溶性高亲和力c61 NY-ESO TCRβ链的DNA序列的合成基因，其经编码肽接头的DNA序列与编码许多免疫调节剂的DNA相连。
有许多公司提供合适的DNA服务，例如Geneart(德国)。
图24a详述了编码C末端经肽接头与IL-18相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图24b详述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接头如下划线所示。
图25a详述了编码C末端经肽接头与高亲和力c61 NY-ESO MTCRβ链相连的IL-18原蛋白的DNA序列。原-IL-18 DNA序列经改变以编码有助于翻译后除去该原序列内一些氨基酸的因子X切割位点。图25b详述了此融合蛋白的的氨基酸序列，肽接头如下划线所示。
图26a详述了编码C末端经肽接头与IL-10相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图26b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示。
图27a详述了编码C末端经肽接头与IL-13相连的高亲和力c61 NY-ESOMTCRβ链的DNA序列。图27b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示。
图28a详述了编码C末端经肽接头与PE38外毒素的“KDEL”变体相连的高亲和力c61 NY-ESO MTCRβ链的DNA序列。图28b详述了此融合蛋白的氨基酸序列，肽接头如下划线所示。
可将以上c61 NY-ESO TCRβ链的DNA序列连接入pEX821载体。(此载体的DNA序列和质粒图分别见图19和20)然后基本上按照实施例2所述的方法制备二硫键连接的αβTCR-治疗性物质。简言之，合成图29a详述的编码高亲和力c61 NY-ESO MTCRα链的DNA序列，将其连接入pEX954载体。(此载体的DNA序列和质粒图分别见图21和22)然后在c61 NY-ESO TCRα链存在下重折叠上述TCRβ链融合蛋白。
图29a详述了编码高亲和力c58 NY-ESO MTCRα链的DNA序列，图29b详述了图29a所示DNA序列编码的氨基酸序列。
实施例12-MTCR-PE-38融合蛋白的细胞毒性试验将1×10-6个所需靶细胞(例如SK-MEL肿瘤细胞或J82 cells)悬浮在10mlRPMI培养基+10％胎牛血清(FCS)中。如果需要，37℃用10μM相关肽脉冲此靶细胞2小时。然后用RPMI+10％FCS洗涤样品三次，各次洗涤间1200rpm离心5分钟。然后重新计数洗涤的细胞并重悬于合适体积的RPMI+10％FCS培养基中得到2×105个细胞/ml的最终细胞密度。
用RPMI培养基+10％FCS将如实施例11所述制备的MTCR-PE38融合蛋白稀释至2×10-6M终浓度得到工作标准品。然后利用此工作标准品制备一系列连续稀释液。
在微滴定板孔中制备实验和对照样品在实验样品孔中注入50μl培养基配制的mTCR-PE38和50μl培养基配制的细胞。为在96孔平底白色不透明孔板(Nunc 136101)中得到100μl的总体积。利用以上制备的mTCR-PE38连续稀释液在这些孔中提供一系列mTCR-PE38浓度。
利用100μl细胞(只有细胞的对照)或100μl mTCR-PE38和培养基(只有效应细胞的对照)制备对照样品孔。
然后在37℃，5％CO2培育实验和对照样品48或96小时。然后按照生产商的使用说明书采用CellTiter-Glo发光试验(Promega目录号G7572)评估各孔中存留的活细胞数目。
结果图30a和30b显示1G4 MTCR-PE38融合蛋白可杀伤NY-ESO+SK-MEL 37和Mel 624肿瘤细胞系。
从图30a提供的数据计算出1G4 MTCR-PE38融合蛋白分别以5.9×10-9和1×10-8M培育48小时后对SK-MEL 37和Mel 624肿瘤细胞系效力的EC50值。
从图30b提供的数据计算出1G4 MTCR-PE38融合蛋白分别以5.7×10-9和2.1×10-8M培育96小时后对SK-MEL 37和Mel 624肿瘤细胞系效力的EC50值。
图30a和30b提供的结果均证明与用未受脉冲的J82靶细胞观察到的相比，用相关SLLMWITQC NY-ESO肽脉冲J82靶细胞导致NY-ESO TCR-PE38构建物更有效地杀伤这些细胞。
权利要求
1.一种与治疗性物质结合的二聚体TCR(dTCR)或单链TCR(scTCR)，其中所述物质选自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD44抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD45RB抗体、抗-CD45RO抗体、抗-Thy 1.2抗体、抗淋巴细胞球蛋白、抗-αβTCR抗体、抗-γδTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-TCR Vβ8抗体、抗-CD16抗体、抗-CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗体、抗-CD40L抗体、抗-ICAM-1抗体、ICAM-I、抗-Mac抗体、抗-LFA-1抗体、抗-IFN-γ抗体、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗-IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2白喉-毒素蛋白、抗-IL-12抗体、IL-12拮抗剂(p40)、抗-IL-1抗体、IL-1拮抗剂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、抗-GAD抗体、病毒蛋白和肽、细菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神经酰胺、降钙素、烟酰胺、抗-氧化剂(维生素E、丙丁酚类似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性药物(己酮可可碱或咯利普兰)、免疫调节剂(利诺胺、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍乱毒素B、钒酸盐或维生素D3类似物、小分子CD80抑制剂、雄激素、IGF-1、免疫操控物(天然抗体)、狼疮独特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制剂、硅石、神经节苷脂、抗无唾液酸GM-1抗体、透明质酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I类MHC抗体、或抗-II类MHC抗体、环孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脱氧精胍菌素、PE38假单胞菌外毒素，其中所述TCR包含由对应于TCRα可变区序列的氨基酸序列构成的第一区段，该氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由对应于TCRβ可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，该氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；该第一和第二链之间有一个二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物；并且，在所述scTCR还含有连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列的情况下，或反之亦然的情况下，该接头序列的长度和该二硫键的位置使所述第一和第二区段的可变区序列的彼此定向基本上如天然αβT细胞受体的那样。
2.如权利要求1所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治疗性物质选自IL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、淋巴毒素、TNFα、抗-CD2抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD44抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD45RB抗体、抗-CD45RO抗体、抗-Thy 1.2抗体、抗淋巴细胞球蛋白、抗-αβTCR抗体、抗-γδTCR抗体、抗-CD49a抗体、抗-CD49b抗体、抗-CD49c抗体、抗-CD49d抗体、抗-CD49e抗体、抗-CD49f抗体、抗-TCR Vβ8抗体、抗-CD16抗体、抗-CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗-B7.2抗体、抗-CD40L抗体、抗-ICAM-1抗体、ICAM-1、抗-Mac抗体、抗-LFA-1抗体、抗-IFN-γ抗体、IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗-IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2白喉-毒素蛋白、抗-IL-12抗体、IL-12拮抗剂(p40)、抗-IL-1抗体、IL-1拮抗剂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、抗-GAD抗体、病毒蛋白和肽、细菌蛋白或肽、A-半乳糖基-神经酰胺、降钙素、烟酰胺、抗-氧化剂(维生素E、丙丁酚类似物、丙丁酚+地夫可特或氨基胍)、抗-炎性药物(己酮可可碱或咯利普兰)、免疫调节剂(罗喹美克、Ling-zhi-8、D-葡聚糖、多功能蛋白14、腈美克松、霍乱毒素B、钒酸盐或维生素D3类似物、小分子CD80抑制剂、雄激素、IGF-1、免疫操控物(天然抗体)、狼疮独特型、脂多糖)、硫苷脂、蜂毒、Kampo制剂、硅石、神经节苷脂、抗无唾液酸GM-1抗体、透明质酸酶、伴刀豆球蛋白A、抗-I类MHC抗体、或抗-II类MHC抗体、环孢菌素、FK-506、硫唑嘌呤、雷帕霉素或脱氧精胍菌素。
3.如权利要求1所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治疗性物质是IL-10、IL-4或IL-13之一。
4.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR是组织特异性的。
5.如权利要求4所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR对自身免疫疾病、器官排异或移植物抗宿主病(GVHD)中自身反应性T细胞的靶位组织具有组织特异性。
6.如权利要求4或5所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR是胰岛细胞特异性的。
7.如权利要求1所述的与治疗性物质结合的dTCR或scTCR，其特征在于，所述治疗性物质选自IL-15、IL-21、IL-23、PE38假单胞菌外毒素、IFN-γ或抗-CD3抗体之一。
8.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的dTCR。
9.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的scTCR。
10.如权利要求9所述的与治疗性物质结合的scTCR，其特征在于，所述接头序列连接所述第一区段的C末端和所述第二区段的N末端。
11.如权利要求9所述的与治疗性物质结合的scTCR，其特征在于，所述接头序列如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。
12.如权利要求8所述的与治疗性物质结合的dTCR，其特征在于，所述dTCR含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列N末端融合；和第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列N末端融合；该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价物的一个二硫键连接。
13.如权利要求8所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述TCR是dTCR，其含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列N末端融合，第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列N末端融合，该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间的一个二硫键相连。
14.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR的氨基酸序列对应于人αβTCR的胞外恒定区和可变区序列。
15.如权利要求14所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，一个在天然TCR中没有等价物的二硫键连接所述恒定区序列的氨基酸残基。
16.如权利要求15所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述二硫键位于对应于天然TCR中所含β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸残基的半胱氨酸残基之间。
17.如权利要求15所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述二硫键位于取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间。
18.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR在与天然TCR中二硫键所连接残基相对应的残基之间含有一个二硫键。
19.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR不含对应于天然TCR的跨膜或细胞质序列的序列。
20.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述治疗性物质是PE38外毒素。
21.如权利要求20所述的与PE38外毒素结合的TCR，其特征在于，其含有(SEQ ID NO73)和(SEQ ID NO71)所示氨基酸序列。
22.如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。
23.如权利要求22所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。
24.如权利要求22或23所述的与治疗性物质结合的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单元。
25.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如以上任一项权利要求所述的与治疗性物质结合的TCR。
26.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR，所述至少两个TCR通过非肽聚合物链或肽接头序列相连。
27.如权利要求26所述的多价TCR复合物，其特征在于，所述聚合物链或肽接头序列在与治疗性物质或其功能性变体或片段结合的各TCR的氨基酸残基之间延伸，但不位于TCR的可变区序列中。
28.如权利要求26或27所述的多价TCR复合物，其特征在于，所述与治疗性物质结合的TCR通过聚亚烷基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头相连。
29.如权利要求28所述的多价TCR复合物，其特征在于，在聚亚烷基二醇链和其与复合物中连接了治疗性物质的TCR的连接点之间具有二价亚烷基间隔基团。
30.如权利要求28或权利要求29所述的多价TCR复合物，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单元。
31.一种药物组合物，其含有如权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR或如权利要求25-30中任一项所述的其多价复合物，以及药学上可接受的载体。
32.一种治疗癌症的方法，其包括给予患有所述癌症的对象有效量的如权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR或如权利要求25-30中任一项所述的其多价复合物，其中所述治疗性物质选自权利要求2所定义的那些。
33.权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR或如权利要求25-30中任一项所述的其多价复合物在制备癌症治疗组合物中的用途，其中所述治疗性物质选自权利要求2所定义的那些。
34.一种治疗癌症的方法，其包括给予患有所述癌症的对象有效量的如权利要求20或21所述的融合蛋白。
35.权利要求20或21所述的融合蛋白在制备癌症治疗组合物中的用途。
36.一种治疗自身免疫疾病、器官排异或GVHD的方法，其包括给予罹患自身免疫疾病、器官排异或GVHD的对象如权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR或如权利要求25-30中任一项所述的多其价复合物，其中所述治疗性物质选自权利要求3所定义的那些。
37.权利要求1-24中任一项所述的与治疗性物质结合的TCR在制备用于治疗自身免疫疾病、器官排异或GVHD的组合物中的用途，其中所述治疗性物质选自权利要求3所定义的那些。
全文摘要
本发明提供与所选治疗性物质结合的二聚体TCR(dTCR)或单链TCR(scTCR)，其中所述TCR包含由对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成的第一区段，该氨基酸序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，该氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端融合；该第一和第二链之间有一二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物；和以所述scTCR为例，还含有连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列，或反之亦然，该接头序列的长度和该二硫键的位置应使所述第一和第二区段可变区序列的彼此定向基本上如同天然αβT细胞受体的那样。
文档编号A61P37/02GK101061138SQ200580039381
公开日2007年10月24日 申请日期2005年9月29日 优先权日2004年10月1日
发明者B·K·雅各布森, T·B·安德森 申请人:阿维德克斯有限公司