专利名称：一种海洋链霉菌属菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物领域，具体设计一种由海洋链霉菌属菌株(Str印tomyces sp. HH-1)制备的抗细菌群体感应活性提取物及其应用。
背景技术：
群体感应(Quorum Sensing，QS)是细菌根据自身细胞密度变化进行自我协调的 一种群体行为。细菌利用信号分子，或称为自诱导物(autoinducers，Al)作为相互交流的 “语言”，细菌在繁殖过程中不断将信号分子分泌到胞外，并检测其浓度从而感知其群体密 度的变化；当其密度达到某个阈值时，就会启动某些基因的表达。群体感应系统广泛存在于 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，控制着包括生物被膜形成、毒素产生、致病基因表达、胞 外多糖生成等一系列的细菌行为和表型，对病原菌致病过程起决定性的作用。大量文献表 明缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低，因此，通过干扰细菌群体感应系统来 控制病原菌致病是一个非常有效的策略，并且以细菌的群体感应系统为靶标筛选的抗菌药 物，与那些传统的抗生素药物的作用机制完全不同，只抑制细菌群体感应调控的致病行为， 不影响细菌的生长，理论上不会产生细菌耐药性。目前，人们利用不同的筛选模型，发现了 furanone (J EMBO, 2003，22 (15) 3803-3815.)、4-NP0(J Bacteriol,2005,187(5) 1799-1814)、solenopsinA(Infect Dis, 2008，198(8) 1198-1201)等化合物具有细菌群体感应抑制作用。QSIS2筛选模型(J Bacteriol, 2005,187(5) :1799_1814)是利用受铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 群体感应系统(Nature，2000，406 :959_964)调节的下游基因IasB的启动子，和蔗糖致死 基因SacB为报告基因构建而成；在有蔗糖底物存在的情况下，信号分子3-氧十二烷酰高 丝氨酸内酯(3-OXO-C12-HSL)和IasR受体蛋白结合，启动IasB启动子下游致死基因SacB 的表达，若存在群体感应抑制因子如阳性对照物C30 (furanone)，致死作用则会得到补救； 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)是一种革兰氏阴性细菌，当自身细菌细胞密度的 增加达到一定临界浓度时，向环境中释放的信号分子己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)能与 胞内转录调节蛋白CviR结合，启动紫色菌素等群体感应相关基因的表达；所以紫色杆菌 常作为一种简便、直观的群体感应抑制因子筛选模式菌株(Microbiology，1997，143 (12) 3703-3711)。海洋微生物是生物活性物质的巨大宝库。特殊的海洋环境赋予海洋微生物以新的 活性，高盐度、高压力、低温及特殊的光照等复杂海洋生态环境可能使海洋微生物在物种、 基因组成和生态功能上具有更大的多样性，产生不同于陆地来源的特殊产物。本发明是从 海洋软体动物体内分离内共生放线菌，利用QSIS2筛选模型和TTC活菌染色的方法得到一 株具有细菌群体感应抑制活性的链霉菌HH-I，并且其发酵液提取物能够抑制紫色杆菌群体 感应系统调控的紫色菌素的产量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种由海洋Sti^ptomyces sp. HH-I发酵制备的提取物，该提取物具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统的 活性，并且能够降低致病菌毒力因子的产生，减弱致病菌的耐药性。本发明所述的活性提取物的获得方法主要有海洋Str印tomyces sp. HH-I分离 与提取物的制备两个步骤。取活化后的海洋Sti^ptomyces sp. HH-1，接种到发酵培养基 中进行发酵培养，发酵结束后用等体积乙酸乙酯萃取3次，将萃取液过滤，真空低温浓缩至 干，得到褐色浸膏，称取适量褐色浸膏用甲醇溶解后用于生物活性测定。本发明所涉及的海洋Sti^ptomyces sp. HH-I制备的提取物具有抑制铜绿假单胞 菌和紫色杆菌感染的作用；该提取物在0-200mg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的生 长；但能显著降低紫色杆菌紫色菌素的生成，且该提取物的群体感应抑制作用呈浓度依赖 性；该提取物在0-500mg/mL的范围内对筛选模型QSIS2的生长不产生影响。本发明与现有技术相比，具有海洋Sti^ptomyces sp. HH-I菌株发酵培养条件简 单，其制取提取物的工艺过程简单易控，产量高，制备的提取物抑制细菌群体感应作用明显 等优点。
图1为本发明的活性提取物的活性筛选图。图2为本发明的提取物对筛选模型QSIS2生长曲线测试图。图3为本发明的提取物对紫色杆菌CV026生长曲线测试图。图4为本发明不同浓度的提取物对紫色杆菌紫色菌素产量的测定图。
具体实施例方式下面通过实例并结合附图对本发明做进一步的说明。实施例1 海洋放线菌的分离培养样品采集2009年1月从胶州湾不同地区采集野生海洋软体动物海虹、蛤蜊、海蛎 子，存放于无菌瓶中。放线菌分离和斜面保存培养基Solublestarch 20g ；KNO3Ig ;K2HP040. 5g ； MgSO4O. 5g ；FeSO4·7Η20 0. Olg ；agar 20g ；sea salts 33. 3g ；distilled water IOOOmL ；pH 7. 2 7. 4，121°C，1. OlXlO5Pa灭菌20min备用，分离培养基临用前加终浓度为50mg/L的 放线菌酮和25mg/L的萘啶酮酸。放线菌发酵培养基Glucose IOg ；soluble starch IOg ；yeast extract IOg ； peptonelOg ；K2HPO4O. 5g ；NaCl 0. 5g ；MgSO4O. 5g ；beefextract 0. 3g ；CaC032g ；sea salts 33. 3g ；distilledwater IOOOmL ；pH 7. 2 7. 4，121°C, 1. OlXlO5Pa 灭菌 20min 备用。海洋放线菌的分离方法用无菌海水浸泡样品，75%酒精表面消毒，去掉贝壳取软 体，再次用75%酒精表面消毒，无菌海水冲洗3次，粉碎研磨，梯度稀释，涂布到分离培养基 平板上，在28°C培养6 10d，将菌落挑出划线分离纯化，观察和排重。发酵工艺将海洋放线菌平板活化后，挑取适量菌丝块接种到内装150mL上述液 体培养基的三角瓶中，温度28°C、转速140rpm，震荡培养10天。发酵结束后，将发酵物菌丝体与上清混合液超声破碎，加入等体积乙酸乙酯，室温搅拌过夜，BOOOrpm离心取上清液，再 加入等体积乙酸乙酯重复萃取2次，将总萃取液真空低温浓缩至干，得到褐色浸膏，褐色浸 膏提取物干燥后用甲醇溶解成lOOmg/mL储液，用0. 22 μ M滤膜过滤后于4°C保存备用。实施例2 海洋Sti^ptomyces sp. HH-I提取物活性测试一.提取物群体感应抑制活性测试筛选模型所用培养基为LB 培养基Tryptone IOg ；yeast extract 5g ；NaCl IOg ； distilledwater IOOOmL ；固体 LB 培养基加入 15g agar ；pH 7. 0，121°C，1. 01 X IO5Pa 灭菌 20min备用。铜绿假单胞菌群体感应抑制因子(QSI)筛选模型QSIS2是由Thomas Bovbjerg Rasmussen等(JBacteriol，2005，187 (5) :1799_1814)构建的，该筛选模型是利用铜绿假单 胞菌受QS系统调节的致病相关基因IasB的启动子域作为报道基因的启动子，以果聚糖转 移酶基因sacB(致死基因)为报道基因构建的，当向培养基中加入蔗糖时，由于sacB基因 的表达，菌体的生长会受到抑制，而当QSI存在时，sacB基因的表达受到抑制，保护菌体的 生长，从而能够以菌体生长的变化来有效地筛选出群体感应系统的抑制物。紫色菌素在紫 色杆菌中是受群体感应严谨调控的(Microbiology，1997，143 (12) 3703-3711)，紫色杆菌 CV026为信号分子缺失菌株，在加入信号分子C6-HSL后，能够启动群体感应调控的紫色菌 素的产生，若有群体感应抑制因子的存在，则能抑制紫色菌素的产生，在琼脂板上表现出浑 浊但不透明的圆圈。筛选模型QSIS2平板筛选方法13. 5mL融化的固体LB培养基冷却至40°C，加入 1. 5mL 60%的蔗糖，150 μ L过夜培养的QSIS2菌液、6 μ L 500 μ mol/L的信号分子3-氧 十二烷酰高丝氨酸内酯3-ΟΧΟ-α2-!Β ，75μ 5% (w/v)的活菌染色剂红四氮唑TTC和 24 μ L 50mg/mL的庆大霉素，混勻后倒平板。待平板凝固后，用打孔器打孔，每个孔内分别加 3μ L不同浓度的提取物，然后37°C培养箱培养，观察加样孔周围菌圈生长情况，若提取物 具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有细菌生长圈出现，菌圈直径越大即为活性越强， 检测结果如图所示Ia所示与阳性对照C30(6. 35 μ g)相比，0. 45mg、0. 3mg、0. 15mg提取物 呈现阳性结果，且成浓度依赖性。紫色杆菌平板筛选方法15mL融化的固体LB培养基冷却至40°C，加入150 μ L过 夜培养的紫色杆菌CV026菌液、15 μ L 500 μ mol/L的信号分子己酰高丝氨酸内酯C6-HSL 和15yL 20mg/mL的卡那霉素，混勻后倒平板。待平板凝固后，用打孔器打孔，每个孔内 加3 μ L提取物，于30°C培养箱培养，若该提取物为群体感应抑制因子，则能抑制紫色菌 素的产生，在琼脂板上表现出浑浊但不透明的圆圈，筛选结果如图Ib所示与阳性对照 C30(6. 35 μ g)相比，0. 45mg、0. 3mg、0. 15mg提取物呈现阳性结果，且成浓度依赖性。二 .不同浓度提取物对QSIS2生长影响挑取筛选模型菌株QSIS2于新鲜LB培养基中，37°C、140rpm培养至对数期；用新 鲜LB将培养至对数期的菌液稀释至0D_ ^ 0. 05，分装6组，每组3个平行；每组分别加 入终浓度提取物终浓度 0mg/mL，50mg/mL, 100mg/mL, 200mg/mL, 300mg/mL, 400mg/mL, 37 °C、 140rpm摇床培养；每隔1_2小时分别测各管0D_直至对数后期；以培养时间Time(h)为横 坐标，以600nm处的吸光度为纵坐标，绘制菌株QSIS2在海洋Str印tomyces sp. HH-I提取 物作用下的生长曲线，从生长曲线(图2)可以看出，该提取物在0-400mg/mL浓度范围内不 抑制筛选模型QSIS2的生长。
三.不同浓度的提取物对紫色杆菌CV026生长的影响挑取紫色杆菌CV026于新鲜LB培养基中，30°C、140rpm培养至对数期；用新鲜LB 将培养至对数期的菌液稀释至OD6tltl ^ 0. 05，分装5组，每组3个平行；每组分别加入提取 物至终浓度 Omg/mL，50mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL, 37 °C、140rpm 摇床培养；每隔 1-2小时分别测各管0D_直至对数后期；以培养时间Time(h)为横坐标，以600nm处的光 吸光度为纵坐标，绘制紫色杆菌CV026在该提取物作用下的生长曲线(图3)，该提取物在 0-200mg/mL浓度范围内对紫色杆菌CV026的生长不产生影响。四.不同浓度的提取物对紫色杆菌紫色菌素产量测试挑取紫色杆菌CV026于新鲜LB培养基中，30°C、140rpm培养至对数期；用新鲜LB 将培养至对数期的菌液稀释至OD6tltl为0. 05，分装5组，每组3个平行；每组中加入信号分 子(C6HSL)至终浓度为500η μ mol/L，提取物的终浓度分别为Omg/mL、50mg/mL、100mg/mL、 150mg/mL，200mg/mL，30°C、140rpm振荡培养12h。紫色菌素定量吸取ImL上述培养好的 菌液于1. 5mL Eppendorf管，HOOOrpm离心lOmin，使紫色菌素和菌体充分沉淀。去掉上 清液，加ImL DMSO于Eppendorf管，涡旋，充分振荡使紫色菌素溶解于DMSO。HOOOrpm再 离心lOmin，沉淀菌体及碎屑。吸取上清测定OD585处的光吸收，浓度为50mg/mL、100mg/mL、 150mg/mL，200mg/mL该提取物分别对紫色杆菌紫色菌素降低量达25 %、47 %、65 %、82 % (图 4)。
权利要求
一株来源于从海洋软体动物体体内的具有细菌群体感应抑制活性的海洋Streptomycessp.HH 1，由该菌株发酵制备的提取物经铜绿假单胞菌筛选模型QSIS2和紫色杆菌模式菌株CV026筛选呈现阳性结果。
2.根据权利要求1该提取物在0-400mg/mL的范围内对铜绿假单胞菌筛选模型QSIS2 的生长不产生影响，提取物在0-200mg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的生长；但能 显著降低紫色杆菌紫色菌素的生成，且该提取物的群体感应抑制作用呈浓度依赖性，随着 浓度逐渐增加，其抑制作用逐渐增强，该提取物可用于防治紫色杆菌疾病感染方面上的研 允。
3.根据权利要求2由该海洋Str印tomyces sp. HH-I发酵提取物中分离出的抑制细菌 群体感应的有效成分可用于医药领域新型抗菌药物的研发。
全文摘要
本发明涉及一种海洋链霉菌属菌株及其应用。从海洋软体动物体内分离内共生放线菌菌株，通过铜绿假单胞菌筛选模型QSIS2和紫色杆菌模式菌株CV026进行筛选，最终得到了一株具有细菌群体感应抑制活性的海洋Streptomyces sp.HH-1。本发明首次证明了由该株链霉菌属菌株发酵制备的提取物对铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统具有双重抑制作用，并且在有效浓度范围内对筛选模型QSIS2和紫色杆菌CV026的生长不产生抑制作用。该提取物能显著降低紫色杆菌紫色菌素的产量，减弱致病菌的耐药性。本发明制备原料易获得，菌株发酵培养条件简单，化合物制取的工艺过程易控，产量高等优点，由该海洋Streptomyces sp.HH-1发酵提取物中分离出的抑制细菌群体感应的有效成分可用于医药领域新型抗菌药物的研发。
文档编号A61P31/04GK101974456SQ201010295829
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者于文功, 宫倩红, 尹守亮, 王清池 申请人:中国海洋大学