专利名称：用于治疗癌症的无机硒化合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及将硒酸盐或其药学上可接受的盐(尤其是超营养量)用于抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法和组合物。本发明也涉及硒酸盐或其药学上可接受的盐与激素消除疗法(hormone ablation therapy)、细胞生长抑制剂或细胞毒剂中至少一种联用，以抑制肿瘤细胞的生长或增殖。在某些实施方式中，本发明方法可用于治疗或预防癌症，尤其是Akt信号传导途径激活的癌症，如前列腺癌。此外，本发明涉及硒酸盐或其药学上可接受的盐与激素消除疗法和任选的细胞生长抑制剂或细胞毒剂联合用于治疗激素依赖性癌症的方法和组合物。
背景技术：
人们对硒化合物用作癌症预防剂很感兴趣。跨越过去二十年的研究记录了它们在乳腺(Ip，C.1981，Cancer Res.414386-4390)、结肠(Reddy等，1981，Cancer Res.475901-5904)、肺和前列腺(Clark等，1996，Jama 2761957-1963)的肿瘤中的癌症预防作用。目前正在进行用有机硒代甲硫氨酸预防前列腺癌的II期和III期临床试验(Nelson等，1999，同上)。
一般可将用于化学预防研究的硒化合物分为无机和有机硒形式。无机硒化合物的典型形式亚硒酸钠(Na2SeO3)相对有毒，引起单链和双链断裂的DNA损伤，而典型的有机硒实体硒代甲硫氨酸(SeMet)相对无毒且没有DNA损伤性(Lu等，1995，同上；Sinha等，1996，同上；Stewart等，1999，同上)。
通过一系列复杂的中间体，将食物中硒的主要组分有机硒代甲硫氨酸掺入细胞含硒蛋白质，如硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶中(Allan等，1999，Annu.Rev.Nutr.191-16)。由于这些含有硒代半胱氨酸的含硒酶，如抗氧化剂谷胱甘肽(glutathionine)过氧化物酶和氧化还原调节性硫氧还蛋白参与了细胞对诱变氧化应激的反应，所以长期以来有人认为，超营养水平的硒摄取能通过促进细胞还原环境提高抗癌的细胞活性(Allan等，1999，同上)。
然而，越来越清晰的是，硒化合物的抗肿瘤作用特性取决于给予该元素时的化学形式(IP，C.1998，J.Nutr.1281845-1854)。甲基亚硒酸形式的有机硒在DU 145前列腺癌细胞中诱导G1期阻滞，以及DNA片段化和胱冬酶介导的PARP切割，DNA片段化和PARP切割是凋亡的两个标志(Jiang等，2001，Cancer Res.613062-3070)。
相反，亚硒酸盐诱导S期阻滞和凋亡性DNA片段化，这个过程依赖胱冬酶功能(Jiang等，2002，Mol.Cancer Ther.11059-1066)。也报道了无机硒化合物的差异，其中亚硒酸盐和硒酸盐通过不同机制抑制淋巴细胞生长(Spyrou等，1996，Cancer Res.564407-4412)。这些差异可部分解释为体外细胞培养和体内研究之间代谢和生物利用度的差异(Dong等，2003，Cancer Res.6352-59)。
激素依赖性癌症包括具有激素受体的肿瘤细胞，激素的存在促进了这些肿瘤细胞的生长和增殖。用手术或化学性的激素消除疗法在激素依赖性肿瘤如前列腺、睾丸、甲状腺、乳腺、卵巢和子宫癌中使肿瘤细胞的生长和增殖中止至少一段时间。
前列腺癌是人类男性中高发性癌症，晚期前列腺癌患者的治疗一般包括药物或手术去势(Huggins，C.和Hodges，CV.1941，Cancer Res.1293-297)。高达80％的患者出现平均持续12-18个月的暂时反应，然后无论睾丸酮的去势水平如何肿瘤继续生长(Petrylak，D.P.1999，Urology 5430-35)。一旦确立雄激素非依赖性生长，平均预期寿命为9-12个月。虽然传统化疗可改善疼痛评分和提高生活质量，但它没有产生任何显著的存活益处。
转变为雄激素非依赖性生长的分子机制还不完全为人所知。雄激素受体信号途径的改变可能起到作用，包括受体表达上调、混杂配体结合以及其它生长信号转导级联反应导致的配体非依赖性受体转移活化(Feldman，BJ.和Feldman，D.2001，Nat.Rev.Cancer 134-45)。
随之而来的是，前列腺癌细胞获得了保护其不经受诱导细胞死亡的许多机制，这部分解释了它们的化疗抗性(Gurumurthy等，2001，Cancer Metastasis Rev.20225-243)。PI3K/Akt途径在其中的作用逐渐为人所知。Akt是响应于膜受体刺激的PI3K磷酸化活化的丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt进而调节参与凋亡控制的几种蛋白质，包括Forkhead(FKHR)转录因子、Bad、胱冬酶9、GSK-3β和mTOR的活性(Vivanco，I.和Sawyers，CL.2002，Nat.Rev.Cancer 2289-501)。Akt活性过高在雄激素非依赖性前列腺癌中很常见，Akt活性过高常常是使PI3K失活的磷酸酶PTEN机能减退的结果，足以引起雄激素非依赖性生长(Whang等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA955246-5250)。
肿瘤细胞的放疗抗性也与PI3K/Akt途径上调有关(Soderlund等，2005，Int.J.Oncol.，2625-32；Zhan等，2004，Histol.Histopathol，19915-923；Tanno等，2004，Cancer Res.，643486-3490；Li等，2004，Oncogene，234594-4602；McKenna等，2003，Genes Chromosomes Cancer，28330-338；Liang等，2003，Mol.Cancer Ther.2353-360)。
Clark等(1996，同上)发表文章后，对含硒化合物临床上用作化学预防剂的兴趣广泛流行。这些结果刺激了采用超营养硒代甲硫氨酸作为前列腺癌化学预防剂的许多人类临床试验(Meuillet等，2004，J.Cell Biochem.91443-458)。然而，假如与前列腺癌的长自然史相比介入时间相对较短，可能与预防正常前列腺上皮转化为肿瘤相比，硒更可能抑制恶性细胞的生长(Corcoran等，2004，J.Urol.171907-910)。逐渐累积的证据证明，硒的抗癌活性不涉及元素本身，而是取决于其化学形式(Menter等，2000，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.91171-1182；Jiang等，2002，同上；Kim等，2003，Biochem.Pharmacol.662301-2311)。此活性的机制仍然未知。
然而，已经注意到，根据所给予的硒化合物，人前列腺肿瘤细胞的体内肿瘤进展有显著差异。例如，与有机硒代甲硫氨酸、甲基硒代半胱氨酸或硒化酵母相比，无机硒酸钠显著降低了肿瘤进展(Corcoran等，2004，同上)。此外，发现某些硒化合物，如亚硒酸钠在某些应用剂量下对细胞有毒性(Jiang等，2002，同上)。
因此，需要鉴定用于治疗或预防癌症生长的硒化合物的合适形式。具体说，需要理解各种硒化合物对癌细胞选择性作用的根本分子机制，以设计出更多有效治疗方案。
发明概述本发明部分以以下发现为基础与其它硒化合物相比，特定类型的无机硒化合物，即硒酸盐显著抑制肿瘤细胞增殖，包括激素非依赖性肿瘤细胞和激素依赖性肿瘤细胞的增殖，尤其是以高剂量或超营养量使用时。也发现，硒酸盐和其药学上可接受的盐对Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞、尤其是前列腺肿瘤细胞有抑制作用，并且在与细胞生长抑制剂、细胞毒剂和任选与射线增敏剂一起给予的放疗中至少一种联用时，对肿瘤细胞生长有强效协同抑制作用。而且，已发现硒酸盐和其药学上可接受的盐与激素消除疗法以及细胞生长抑制剂、细胞毒剂和任选与射线增敏剂一起给予的放疗中任选一种或多种联用时，对激素依赖性肿瘤细胞生长有抑制作用。
因此，在一个方面，本发明提供了抑制Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞的生长或增殖的方法。这些方法通常包括将所述肿瘤细胞暴露于抑制Akt信号传导途径激活量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，激活Akt信号传导途径包括激活选自下组的至少一个成员Akt、mTOR、GSK-3β和FKHR。在这种类型的示范性实施例中，激活Akt信号传导途径包括磷酸化Akt(如磷酸化Akt的Thr 308和Ser 473残基)。在其它实施方式中，激活Akt信号传导途径包括使PTEN失活。在一些实施方式中，Akt信号传导途径被过度激活。在一些实施方式中，接触肿瘤细胞的硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是超营养量。肿瘤细胞合适地选自口腔鳞状上皮细胞癌、甲状腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、纤维肉瘤、卵巢癌、子宫或子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、结肠癌、黑色素瘤、急性白血病和脑癌(如星形细胞瘤和胶质细胞瘤)。在特定实施方式中，所述肿瘤细胞是前列腺癌细胞，包括激素非依赖性前列腺癌细胞。
另一方面，本发明提供了治疗对象的癌症，尤其是激素非依赖性癌症或激素依赖性癌症的方法。这些方法通常包括给予对象治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，治疗有效量是超营养量。在特定实施方式中，所述癌症是前列腺癌，尤其是激素非依赖性或激素依赖性前列腺癌。因此，在相关方面，本发明提供了治疗前列腺癌，尤其是激素非依赖性或激素依赖性前列腺癌的方法，该方法包括给予需要治疗的对象治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。
又一方面，本发明提供了抑制肿瘤细胞激素依赖性生长的方法，该方法包括将肿瘤细胞暴露于抑制激素依赖性肿瘤细胞生长量的硒酸盐或其药学上可接受的盐和激素消除疗法。
又一方面，本发明提供了治疗对象的激素依赖性癌症的方法，该方法包括与激素消除疗法联合给予治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。激素依赖性癌症合适地选自雄激素依赖性癌症或雌激素依赖性癌症。在某些实施方式中，激素依赖性癌症是雄激素依赖性癌症如前列腺癌。在一些实施方式中，激素依赖性癌症选自前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌或垂体癌。
另一方面，本发明提供了硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造治疗Akt信号传导途径被激活的癌症的药物中的应用。
又一方面，本发明提供了硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造治疗Akt信号传导途径被激活的癌症的药物中的应用，其中所述癌症是以下癌症以外的癌症PC-3前列腺癌、3B6淋巴瘤、BL41淋巴瘤和HTB123/DU4473乳房肿瘤。
又一方面，本发明提供了硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造治疗激素依赖性癌症的药物中的应用，其中所述硒酸盐或其药学上可接受的盐的制剂可用于与激素消除疗法联合给药。
又一方面，本发明提供了治疗或预防癌症的药物组合物。该组合物一般包含超营养量的硒酸盐或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体。
在上述方法和应用的一些实施方式中，所述硒酸盐或其药学上可接受的盐与细胞生长抑制剂、细胞毒剂或任选与射线增敏剂一起给予的放疗中的至少一种联合给予。在其它实施方式中，将硒酸盐与至少一种细胞生长抑制剂或细胞毒剂配制到组合物中。在其它实施方式中，将硒酸盐以及与放疗联用的射线增敏剂配制到组合物中。
附图简要说明
图1是显示在常位(orthotopic)小鼠模型中硒酸钠抑制前列腺肿瘤细胞增殖的图解和照片。将1×106PC-3细胞注射到6周龄雄性BALB/c裸小鼠的背外侧前列腺中。然后，每组10只动物接受饮用水中的5ppm硒酸钠(NaSe)或未治疗(对照)5周。然后挑选动物。(A)图1(A)用图解说明，接受硒酸钠的小鼠中，含有肿瘤的前列腺重量降低。(B)图1(B)用图解说明接受硒酸钠的小鼠中肿瘤体积(用游标卡尺测量)稍有减小(但不显著)。(C)然后放大探查肾静脉水平头侧(cephadally)的腹膜后腔，对大于0.5mm的淋巴结(L.N.数量)进行计数。图1(C)说明接受硒酸钠的小鼠中大于0.5mm的淋巴结数量降低。结果是平均值+/-SE。图1(A)和1(C)中与对照相比的p＜0.05。(D)图1(D)提供了前列腺肿瘤样品中BrdU和Tunel阳性细胞核的编绘。结果代表未治疗(对照)和硒酸钠(NaSe)组中4个肿瘤样品的每个高倍镜视野中平均值+/-SE。(E)图1(E)提供了未治疗(对照)和硒酸钠(NaSe)前列腺肿瘤组织样品中BrdU阳性核的代表性免疫组织样品，×100倍放大。
图2是显示硒酸钠通过诱导G1细胞周期阻断抑制前列腺癌细胞增殖的图解和照片。(A)将2×105PC-3细胞接种到六孔板中，孵育16小时。然后加入所示浓度的硒酸钠，继续孵育至所示时间点。然后收获和合并未贴壁和贴壁的细胞部分，用台盼蓝排斥试验对活细胞总数进行计数。图1(A)用图解说明，不同浓度的硒酸钠对活细胞数的影响。(B)将2.5×104PC-3细胞接种于24孔板中，16小时后接触0.05、0.1或0.25mM硒酸钠36小时，然后加入BrdU/FrdU增殖细胞标记试剂(Roche)，再孵育16小时。对细胞进行洗涤、固定和BrdU/FrdU核掺入染色，用DAPI鉴定细胞核。结果见图2(B)。(C)将2×105PC-3细胞接种于T25培养瓶中，孵育16小时。然后洗涤细胞，并用无血清培养基再孵育48小时。然后用含有0.0、0.1、0.25或0.5mM硒酸钠的新鲜血清(FCS，10％)再刺激细胞24或48小时。然后收获细胞，固定并用碘化丙锭染色，进行FACS分析。三次独立试验中细胞周期G1和G2/M期的细胞的平均百分数图见图2(D)。(E)用MTT试验评价细胞增殖。将1×104PC-3细胞接种到96孔板中，孵育16小时。然后加入所示浓度的硒酸钠或硒代甲硫氨酸，73小时后，用MTT试验测定细胞增殖指数。结果见图2(E)。在所有结果中，所示值代表至少三次独立试验的平均值+S.D.。
图3是显示硒酸钠诱导细胞周期抑制蛋白上调和视网膜母细胞瘤蛋白去磷酸化的图解。(A)将7.5×105PC-3细胞接种于6cm平皿中，16小时后，用0.5mM硒酸钠处理异步生长细胞所示时间，然后用ELB缓冲液裂解细胞，在12％SDS-PAGE凝胶上分离相同量的全细胞裂解物(75μg)，用所示第一抗体检测膜。结果见图3(A)。(B)将5×105PC-3细胞接种于6孔板中，孵育10小时，洗涤，血清饥饿16小时，然后用硒酸钠(0.5mM)处理所示时间。用ELB缓冲液裂解细胞，将全细胞裂解物(75μg)加载到10％SDS-PAGE凝胶上，用所示抗体检测膜。结果见图3(B)。(C)将2×105PC-3细胞接种于6孔板中(孵育16小时后用硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM)或硒代甲硫氨酸(SeMet，0.5mM)处理)所示时间，在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物(75μg)，用所示抗体检测膜。结果见图3(C)。
图4是显示硒酸钠、而非硒代甲硫氨酸在PTEN缺陷型PC-3细胞中抑制Akt慢性激活的图解。(A)血清饥饿PC-3细胞16小时，然后加入硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM)孵育所示时间，将全细胞裂解物(75μg)加载到10％SDS-PAGE凝胶上，用磷酸化特异性Akt抗体和全Akt抗体检测膜。结果见图4(A)。(B)用磷酸化特异性PDK1抗体和βIII微管蛋白抗体检测来自(A)的相同裂解物(75μg)，βIII微管蛋白抗体的检测结果作为加样对照。结果见图4(B)。(C)血清饥饿PC-3细胞16小时，然后单独或组合加入硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM，10分钟)或LY294002(50μM，1小时)，然后裂解细胞，在10％SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物(75μg)，用磷酸化特异性Akt抗体和全Akt抗体检测膜。结果见图4(C)。(D)血清饥饿PC-3细胞16小时，然后用硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM)或硒代甲硫氨酸(SeMet，0.5mM)处理所示不同时间，然后在10％SDS-PAGE凝胶上分离等量的全细胞裂解物(75μg)，用磷酸化特异性Akt抗体和全Akt抗体检测膜。结果见图4(D)。
图5是显示硒酸钠、而非硒代甲硫氨酸诱导Forkhead转录因子的核转运和PI3K细胞存活途径效应物蛋白活性的下调的图解和照片。(A)用GFP-Forkhead表达构建物(GFP-FKHR，0.8μg)与Lipofectamine 2000试剂转染PC-3细胞，24小时后，血清饥饿1 6小时，然后用硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM)或硒代甲硫氨酸(SeMet，0.5mM)处理3小时，或用LY294002(10μM)处理1小时。然后固定细胞，观察核和胞质GFP荧光状态。DAPI染色显示细胞核。结果见图5(A)。(B)图5(B)提供了用图解描述了(A)中结果的平均值+S.D.。一式三份地进行所有试验，各处理中至少对70个转染细胞评分。(C)，(D)血清饥饿PC-3细胞16小时，然后用硒酸钠(Na2SeO4，0.5mM)处理所示时间，在SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物((C)75μg，(D)100μg)，用所示抗体检测膜，βIII微管蛋白用作(C)的加样对照。用所示浓度的硒酸钠(Na2SeO4)，包括或不包括LY294002(10μM)处理异步生长的PC-3细胞72小时。然后用MTT试验获得细胞的增殖指数。结果是至少三次独立试验的平均值+S.D.。
图6是显示用单独或与泰素(taxol)(紫杉醇)联用的硒酸盐形式的硒治疗小鼠前列腺肿瘤的体内结果的图解和照片。治疗包括对照(对照组)、硒(硒酸钠)和泰素(紫杉醇)。用不含紫杉醇的紫杉醇增溶运载体克列莫佛和乙醇治疗对照组。该图Y轴表示前列腺瘤重(mg)。该图代表平均值±SD。
图7是显示单独用泰素(紫杉醇)治疗或用泰素与硒酸钠联合治疗的前列腺肿瘤的组织切片的照片。硒酸钠和紫杉醇起协同作用，以减小前列腺肿瘤大小。图7显示单用紫杉醇治疗的动物(泰素)比较硒酸钠和紫杉醇联合治疗的动物(泰素+硒酸盐)的肿瘤切片的照片。肿瘤切片用HE染色。这两张照片是在相同的放大倍数下拍摄的，可以直接比较。
图8是显示单独用泰素(紫杉醇)(T)或与硒酸钠联用(S+T)治疗小鼠前列腺肿瘤的体内结果的照片。该图Y轴表示前列腺肿瘤体积(mm3)。该图代表平均值±SD。
图9是描述用台盼蓝排斥法测定5μM或50μM硒酸钠或亚硒酸钠处理24小时、48小时、72小时和96小时后的细胞毒作用的照片。用台盼蓝排斥法测定亚硒酸盐和硒酸盐细胞毒性。结果表示三次独立试验的平均值±SD。Y轴表示各样品中与总细胞数相比活细胞的百分数，X轴表示处理。
图10是显示1μg/mL或10μg/mL泰素(紫杉醇)或硒酸钠500μM(等效于19mg/kg剂量)或亚硒酸钠500μM(等效于18mg/kg剂量)处理所示时间对PC-3细胞的作用的照片。在SDS-PAGE凝胶上分离处理的细胞裂解物，然后进行印迹，用所示抗体检测。显示亚硒酸盐会诱导DNA损伤而硒酸盐和紫杉醇不能。将处理的PC-3细胞的全细胞裂解物转移到PVDF膜上，并用磷酸化特异性组蛋白H2A.X抗体(PH2A.X)检测，然后去除膜上的抗体，用β-微管蛋白抗体再检测，作为加样对照(微管蛋白)。
图11是显示不同硒化合物对Akt活化的影响的图解。处理对照；硒酸钠(ATE)；亚硒酸(Sel acid)；亚硒酸钠(ITE)；二氧化硒(SeO2)；硫化硒(SeS2)；甲基硒代半胱氨酸(MSC)；和硒代半胱氨酸(SeC)。y轴上描述了与总Akt蛋白水平相关的相对活性Akt信号强度。该图标明，仅硒酸钠(ATE)能抑制Akt活化，使磷酸化Akt水平降低到对照水平以下。相反，亚硒酸(Sel acid)、亚硒酸钠(ITE)、二氧化硒(SeO2)、硫化硒(SeS2)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、硒代半胱氨酸(SeC)都将Akt活化诱导到对照水平以上。
图12是显示高剂量亚硒酸钠和硒酸钠对Akt活化的影响的照片。与相似剂量的硒酸钠(ATE)相比，亚硒酸钠(ITE)500μM不能抑制Akt活化。在SDS-PAGE凝胶上运行处理的PC-3细胞裂解物，进行印迹，并用磷酸化特异性Akt抗体(ser 408)P-Akt抗体检测。
图13是显示用1、10、100ng/mL和1μg/mL、10μg/mL泰素(紫杉醇)或100μM、250μM或500μM(等效于4-19mg/kg剂量)硒酸钠(ATE)或100μM、250μM或500μM(等效于3.6-18mg/kg剂量)亚硒酸钠(ITE)处理PC-3细胞16小时的结果的照片。在SDS-PAGE凝胶上运行处理的细胞裂解物，进行印迹，并用针对切割好的PARP蛋白和β-微管蛋白(对照)的特异性抗体检测。显示泰素和硒酸盐能诱导促调亡PARP蛋白切割，而亚硒酸盐不能。亚硒酸盐在其细胞毒性(剂量)以下也能诱导细胞β-微管蛋白显著降解。
图14是用硒酸钠(50μM)处理3天后，在存在或不存在雄激素的情况下亲本LNCaP细胞生长的抑制百分数的图解和照片。将5×104人前列腺癌雄激素敏感性LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后用50μM硒酸钠或无硒酸盐(对照)处理。加入硒酸盐72小时后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图15是用硒酸钠(50μM)处理3天后，在存在或不存在雄激素的情况下CSSLNCaP细胞系生长的抑制百分数的图解。将5×104人前列腺癌雄激素非依赖性CSSLNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用50μM硒酸钠或无硒酸盐(对照)处理。加入硒酸钠72小时后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图16是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理后，在雄激素存在下培养亲本LNCaP(正常血清，NS LNCaP)细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人前列腺癌雄激素敏感性NS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用硒酸钠(5μM)、LY294002(10μM)处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图17是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理后，在没有雄激素(活性碳去除(雄激素)的血清(charcoal stripped serum)，CSS)的情况下培养亲本NS LNCaP细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人前列腺癌敏感性NS LNCaP细胞接种于6-孔板，8小时后，用5μM硒酸钠、10μM LY294002处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图18是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理后，在雄激素存在下(正常血清，NS)培养雄激素非依赖性LNCaP(CSS LNCap)细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人前列腺癌雄激素非依赖性CSS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠、10μM LY294002处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图19是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理后，在没有雄激素的情况下(活性碳去除(雄激素)的血清，CSS)培养雄激素非依赖性LNCaP(CSS LNCaP)细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人前列腺癌雄激素非依赖性CSS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠、10μM LY294002处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图20是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理或不处理(对照)后，在雄激素存在下(正常血清，NS)培养Q293细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人肾上皮Q293细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠、10μM LY294002处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
图21是用硒酸钠(5μM)或LY294002(10μM)处理后，在没有雄激素的情况下(活性碳去除(雄激素)的血清，CSS)培养Q293细胞的细胞增殖的时程图解。将1×105人肾上皮Q293细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠、10μM LY294002处理或不处理(对照)。加入硒酸盐或LY294002后3天、5天和9天时收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞数。
发明详述1.定义除非另有说明，本文所用所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解相同的含义。虽然与本文所述相似或等效的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。出于本发明目的，下面定义了术语。
本文所用冠词“一个”和“一种”指该冠词的一种或一种以上(即至少一种)语法对象。例如，“一种元件”指一种元件或一种以上元件。
本文所用术语“约”指与参比量、水平、值、尺寸、大小或用量相比，变化至多为30％、20％或10％的量、水平、值、尺寸、大小或用量。
在提到治疗或预防癌症或抑制肿瘤细胞生长时，本文所用术语“抑制Akt信号传导途径激活量”指给予一定量或一系列剂量的硒酸盐，它能有效拮抗Akt信号传导途径，包括通过防止或降低Akt或该途径上游成员的表达，或通过降低Akt基因或该途径上游基因成员的表达产物的水平或功能活性，或通过防止或降低Akt的磷酸化来防止或降低Akt的活化。该量因待处理个体的健康和身体条件、待处理个体的分类学组别、组合物制剂、医学状况评价和其它相关因素而不同。预计该量应落入可通过常规试验测定的相对宽的范围内。在特定实施方式中，Akt信号传导途径激活-抑制量是硒酸盐的超营养量。
“雄激素”指刺激雄性性征发育的激素。雄激素的非限制性例子包括睾酮、雄烯二酮、二氢表雄甾酮和二氢睾酮。
术语“雄激素依赖性癌症”或“雄激素依赖性肿瘤细胞”指细胞存活、生长和/或增殖依赖雄激素的癌症或肿瘤细胞。“雄激素依赖性癌症”一般由雄激素(如睾酮或其它雄激素)过度累积、雄激素受体对雄激素的敏感性增加或雄激素刺激的转录增强产生，通常会因雄激素刺激降低获得益处。
“雄激素非依赖性癌症”或“雄激素非依赖性肿瘤细胞”指对存在或不存在雄激素不敏感的癌症或肿瘤细胞。
“Akt信号传导途径被激活的癌症”和“Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞”指关键细胞存活途径PTEN/PI3K/Akt途径失调的癌症和肿瘤细胞。如果不希望受限于任何一个理论或操作方式，认为各种营养信号诱导的磷酸肌醇3-激酶I3K活化导致磷酸化脂质产物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)和磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PIP2)在膜下累积(Vanhaesebroeck等，2001，Annu.Rev.Biochem.70535；Cantley等，2002，Science，2961655)。膜下微环境中这些磷脂的浓度增加进而导致磷酸肌醇依赖性激酶(PDK-1和PDK-2)的累积，导致丝氨酸/苏氨酸激酶Akt活化。肿瘤抑制蛋白PTEN通常作为重要的PI3K负调节物，其作用方式是用作将PIP3转变回PIP2的脂质磷酸酶。PTEN的失活或PTEN功能缺失导致Akt信号传导途径慢性激活。Akt被活化或PTEN被失活的肿瘤细胞包括各种类型的肿瘤细胞，包括上皮癌(carcinoma)。例如，Akt被活化或PTEN被失活的癌症包括但不限于口腔鳞状细胞癌、甲状腺癌、垂体癌、肝细胞癌(包括肝细胞上皮癌)、前列腺癌(包括前列腺上皮癌)、睾丸癌、纤维肉瘤、卵巢癌(包括卵巢上皮癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、胰腺癌(包括胰腺上皮癌)、胃癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞上皮癌、结肠癌、黑色素瘤、急性白血病和脑癌(如星形细胞瘤和成胶质细胞瘤)。在一些实施方式中，癌症是造血系统肿瘤，包括造血系统来源的增生/肿瘤细胞的疾病，如淋巴瘤和淋巴细胞性白血病。淋巴瘤的非限制性例子包括T细胞淋巴瘤(包括外周血T细胞淋巴瘤、成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)；皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)；大颗粒淋巴细胞性白血病(LGF)；B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。淋巴细胞性白血病的说明性例子包括分化不良的急性白血病，如急性原巨核细胞性白血病；髓细胞疾病，包括但不限于急性前髓细胞性白血病(APML)、急性成髓细胞性白血病(AML)和慢性髓细胞性白血病(CML)；淋巴细胞恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性白血病(ALL)(包括B细胞ALL和T细胞ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和Waldenstrom′s巨球蛋白血症(WM)。
术语“Akt途径被过度激活的癌症”、“Akt被过度激活的癌症”等指不仅Akt过度表达、而且通过磷酸化Thr 308和Ser 473残基正向提高了Akt的激酶活性的癌症。例如Akt同种型Akt3，在原发性乳腺癌和前列腺癌细胞系中，Akt3 mRNA的表达水平比正常细胞高约2-4倍，但Akt3激酶活性升高了约20-60倍(Nakatani等，1999，J.Biol.Chem.27421528)。耐药性或顽固肿瘤或癌症中Akt常常被过度激活。Akt被过度激活或组成性激活的癌症的例子包括但不限于雄激素非依赖性前列腺癌和雌激素受体缺陷型乳腺癌。
本文所用术语“上皮癌”指在覆盖或内衬于器官如皮肤、子宫、肺、乳腺或前列腺的上皮细胞发生的癌症形式。上皮癌可以(但不一定)直接侵入邻近器官或可转移至远端部位，如肝、淋巴结或骨。
在本说明书和所附权利要求书中，除非文中另有要求，术语“包含”和其变体如单数形式和复数形式应被理解为包括所述整数或步骤或者一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或者其它整数或步骤组。
本文所用术语“细胞生长抑制剂”指可抑制细胞增殖或细胞分裂而不必杀死细胞的物质。细胞生长抑制剂能适当地抑制癌细胞增殖。
本文所用术语“细胞毒剂”或“细胞毒疗法”指对细胞有害并最终引起细胞死亡的物质或疗法。在一些实施方式中，细胞毒剂对迅速分裂的细胞如癌细胞有害，并引起癌细胞死亡，尤其是在不引起非癌细胞损伤或对非癌细胞损伤较小的情况下引起癌细胞死亡。细胞毒疗法的例子是放疗。
本文所用术语“耐药性”和“难治性”指对通常用于治疗癌症或杀伤肿瘤细胞的治疗不反应或部分不反应的癌症或肿瘤细胞。
术语“激素消除”和“激素消除疗法”指耗尽癌细胞存活和生长可能需要的激素。可通过手术摘除产生激素的器官如睾丸或卵巢实现激素消除，或者可用干扰激素生物合成或分泌的化合物、拮抗或阻断激素受体或以某种方式防止激素行使其生物作用的化合物以化学方式实现激素消除。例如，可通过5-α还原酶抑制剂如非那雄胺阻断睾酮转变为活性更高的二氢睾酮。
术语“激素依赖性癌症”或“激素依赖性肿瘤细胞”指其存活、生长和/或增殖依赖激素存在的癌症或肿瘤细胞。激素依赖性癌症包括但不限于前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌和垂体癌。
在提到治疗或预防癌症或抑制肿瘤细胞时，本文所用术语“抑制激素依赖性肿瘤细胞生长量”指给予一定量或一系列剂量的硒酸盐，它能有效抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或增殖，或者引起肿瘤细胞死亡。该量因待处理个体的健康和身体条件、待处理个体的分类学组别、组合物制剂、医学状况评价和其它相关因素而不同。预计该量应落入可通过常规试验测定的相对宽的范围内。在特定实施方式中，激素依赖性肿瘤细胞生长-抑制量是硒酸盐的超营养量。
本文所用术语“联合”指治疗癌症或使肿瘤细胞接触至少两种物质，以使它们对癌症或肿瘤细胞的作用的至少一部分同时发生。给予至少两种物质可以在一种组合物中同时给予，或可在单独的组合物中同时或依次给予各物质。
术语“抑制肿瘤细胞生长”指肿瘤细胞生长被中止或降低以及细胞增殖或细胞分裂被中止或降低。这也称为细胞生长抑制。可根据重量或体积或细胞数或细胞代谢活性即MTT试验测定肿瘤细胞生长。
“药学上可接受的运载体”指局部或全身给药时可安全应用的固体或液体填充剂、稀释剂或包胶物质。
提到硒酸盐时本文所用术语“药学上可接受的盐”指给予人和动物时在毒理上安全的金属离子盐。例如，合适的硒酸金属离子盐包括但不限于钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐、镍盐和锌盐。优选的硒酸盐是钠盐Na2SeO4。
本文所用术语“放疗”指用高能辐射处理或接触癌症或癌细胞如肿瘤细胞。硒酸盐或其药学上可接受的盐可提高放疗的有效性。而且，还可通过给予射线增敏剂使放疗增强。射线增敏剂的示范性例子包括但不限于乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑、氟乐舒(fluosol)、米索硝唑、尼莫唑、替莫泊芬和替拉扎明。
本文中术语“对象”或“个体”或“患者”可互换使用，指需要预防或治疗的任何对象，具体是脊椎动物对象，更具体是哺乳动物对象。属于本发明范围的合适的脊椎动物包括但不限于灵长动物、禽类、家畜(如猪、绵羊、牛、马、驴)、实验动物(如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(如猫和犬)和捕获的野生动物(如狐狸、鹿、澳洲野狗)。优选对象是需要治疗或预防Akt信号传导途径被激活的癌症或激素依赖性癌症，尤其是前列腺癌的人。然而，应理解，上述术语不暗示出现症状。
本文所用术语“超营养”指大于大家认为的营养需求量的量。在成人中，硒的食物容许量推荐为55μg/天。孕妇和哺乳期妇女的推荐日容许量为60-70μg/天。硒的超营养量向对象提供推荐日容许量以上的硒。例如，硒的超营养量可以是0.15mg/kg-20.0mg/kg、0.1mg/kg-14mg/kg、0.1mg/kg-13mg/kg、0.1mg/kg-12mg/kg、0.1mg/kg-10mg/kg、0.1mg/kg-9mg/kg、0.1mg/kg-8mg/kg、0.1mg/kg-7mg/kg、0.1mg/kg-6mg/kg、0.15mg/kg-5mg/kg、0.15mg/kg-4mg/kg、0.15mg/kg-3mg/kg、0.15mg/kg-2mg/kg、0.15mg/kg-1mg/kg，尤其是0.1mg/kg-14mg/kg，更尤其是0.15mg/kg-5mg/kg。
提到治疗或预防癌症或抑制肿瘤细胞生长时，本文所用术语“治疗有效量”指在单一剂量中或作为系列剂量的一部分给予一定量的硒酸盐或其药学上可接受的盐，它能有效抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或增殖，或引起癌症或肿瘤细胞死亡。有效量因待处理个体的健康和身体条件、待处理个体的分类学组别、组合物制剂、医学状况评价和其它相关因素而不同。预计该量应落入可通过常规试验测定的相对宽的范围内。在特定实施方式中，治疗有效量是超营养量。
2.抑制肿瘤细胞生长和增殖以及治疗癌症的方法本发明部分以以下测定结果为基础与其它硒形式如亚硒酸盐不同，硒酸盐能有效抑制Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞生长或增殖。因此，在一个方面，本发明提供了抑制Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞生长或增殖的方法，所述方法通常包括使所述肿瘤细胞接触抑制Akt信号传导途径激活量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。合适地，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是超营养量，通常约为0.015mg/kg-20.0mg/kg，通常约为0.1m/kg-14mg/kg，更通常约为0.15mg/kg-5mg/kg。
本发明可用于有效对抗各种类型的肿瘤细胞和癌症，包括示范性例子上皮癌，Akt被激活或PTEN被失活的癌症包括但不限于口腔鳞状细胞癌、甲状腺癌、垂体癌、肝细胞癌(包括肝细胞上皮癌)、前列腺癌(包括前列腺上皮癌)、睾丸癌、纤维肉瘤、卵巢癌(包括卵巢上皮癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、胰腺癌(包括胰腺上皮癌)、胃癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞上皮癌、结肠癌、黑色素瘤、急性白血病和脑癌(如星形细胞瘤和成胶质细胞瘤)。在一些实施方式中，癌症是造血系统肿瘤，包括造血系统来源的增生/肿瘤细胞的疾病，如淋巴瘤和淋巴细胞性白血病。淋巴瘤的非限制性例子包括T细胞淋巴瘤(包括外周血T细胞淋巴瘤、成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)；皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)；大颗粒淋巴细胞性白血病(LGF)；B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。淋巴细胞性白血病的说明性例子包括分化不良的急性白血病，如急性原巨核细胞性白血病；髓细胞疾病，包括但不限于急性前髓细胞白血病(APML)、急性成髓细胞性白血病(AML)和慢性髓细胞性白血病(CML)；淋巴细胞恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性白血病(ALL)(包括B细胞ALL和T细胞ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、多毛细胞白血病(HLL)和Waldenstrom′s巨球蛋白血症(WM)。在特定实施方式中，所述肿瘤细胞是前列腺癌或上皮癌细胞。因此，在相关方面，本发明提供了治疗Akt被激活的癌症的方法，所述方法通常包括给予需要的对象Akt信号传导途径激活-抑制量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是超营养量，如上述广泛定义。在一些实施方式中，癌症是前列腺癌，尤其是耐药性前列腺癌或雄激素非依赖性前列腺癌。
在一些实施方式中，肿瘤细胞或癌症是耐药性的。在一些实施方式中，肿瘤细胞或癌症具有过度激活的Akt途径(如雄激素-非依赖性前列腺癌和雌激素受体缺陷型乳腺癌)。
在某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐与至少一种细胞生长抑制剂或细胞毒剂联合给药。细胞生长抑制剂的非限制性例子选自(1)微管稳定剂，例如但不限于紫杉烷、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素(epothilones)和劳力利得(laulimalides)；(2)激酶抑制剂，其说明性例子包括易瑞沙、格列卫、它赛瓦TM、(盐酸埃罗替尼)、BAY-43-9006、分离的激酶域受体酪氨酸激酶亚基的抑制剂(如PTK787/ZK 222584和SU11248)；(3)受体激酶靶向抗体，包括但不限于曲妥珠单抗(贺赛汀)、西妥昔单抗(艾比特斯)、贝伐单抗(阿瓦斯丁TM)、利妥昔单抗(ritusan)、帕妥珠单抗(奥密塔克(Omnitarg)TM)；(4)mTOR途径抑制剂，其说明性例子包括雷帕霉素和CCI-778；(5)Apo2L/Trail抗血管新生类药，例如但不限于内皮抑制素、风车子阻生素(combrestatin)、血管抑制素、血小板反应蛋白和血管内皮生长抑制剂(VEGI)；(6)抗肿瘤免疫治疗疫苗，其代表性例子包括活化的T细胞、非特异性免疫加强剂(即干扰素、白介素)；(7)抗生素类细胞毒剂，例如但不限于多柔比星、博来霉素、放线菌素d、道诺霉素、表柔比星、丝裂霉素和米托蒽醌(mitozantrone)；(8)烷化剂，其说明性例子包括美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、福莫司汀、白消安、替莫唑胺和塞替派；(9)激素类抗肿瘤药，其非限制性例子包括尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、阿那曲唑、依西美坦、他莫昔芬、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氨鲁米特、醋酸亮丙瑞林、柠檬酸托瑞米芬、来曲唑、氟他胺、醋酸甲地孕酮和醋酸戈舍瑞林；(10)性激素，例如但不限于醋酸环丙孕酮和醋酸甲羟孕酮；(11)抗代谢药，其说明性例子包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、拓扑替康、羟基脲、硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤、左旋门冬酰胺酶、雷替曲塞和Capicitabine；(12)同化激素类药，例如但不限于诺龙；(13)肾上腺类固醇激素，其说明性例子包括醋酸甲泼尼龙、地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙和氯泼尼松；(14)肿瘤药，例如但不限于伊立替康、卡铂、顺铂、奥沙利铂、依托泊甙和达卡巴嗪；和(15)拓扑异构酶抑制剂，其说明性例子包括拓扑替康和伊立替康。
在一些实施方式中，细胞生长抑制剂是核酸分子，合适的是反义或siRNA重组核酸分子。在其它实施方式中，细胞生长抑制剂是肽或多肽。在其它实施方式中，细胞生长抑制剂是小分子。细胞生长抑制剂可以是经适当修饰以增加其摄取或递送的细胞毒剂。这种修饰的细胞毒剂的非限制性例子包括但不限于PEG化或清蛋白标记的细胞毒药物。
在特定实施方式中，细胞生长抑制剂是微管稳定剂，尤其是紫杉烷，优选紫杉醇。
在一些实施方式中，细胞毒剂选自蒽环霉素类如黄胆素、多柔比星、表柔比星、道诺霉素和米托蒽醌，CMF药如环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶或其它细胞毒剂，如顺铂、卡铂、博来霉素、拓扑替康、伊立替康、美法仑、苯丁酸氮芥、长春新碱、长春碱和丝裂霉素-C。
本发明也公开了以下发现硒酸盐和其药学上可接受的盐与激素消除疗法和任选的细胞生长抑制剂或细胞毒剂联用时对激素依赖性肿瘤细胞生长有抑制作用。因此，本发明另一方面提供了治疗对象的激素依赖性癌症的方法，所述方法通常包括与激素消除疗法联合给予治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。合适地，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是硒酸盐的超营养量，如上述广泛定义。在一些实施方式中，激素依赖性癌症选自前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、甲状腺癌或垂体癌，尤其是前列腺癌或乳腺癌。
激素消除疗法可以是使癌症或肿瘤细胞失去癌症或肿瘤细胞存活、生长和/或增殖所需的激素的任何疗法。可通过手术摘除产生激素的器官如睾丸或卵巢实现激素消除疗法。或者，可用干扰激素生物合成或分泌的化合物、拮抗或阻断激素受体或以某种方式防止激素行使其生物作用的化合物以化学方式实现激素消除。化学激素消除疗法的说明性药物包括GnRH激动剂或拮抗剂如西曲瑞克；干扰雄激素受体的药物，包括非类固醇药物如比卡鲁胺和类固醇药物如环丙孕酮；以及干扰类固醇生物合成的药物如酮康唑。适合与硒酸盐或其药学上可接受的盐联用，作为前列腺癌的激素消除疗法的化学药物包括但不限于非类固醇类抗雄激素如尼鲁米特、比卡鲁胺和氟他胺；GnRH激动剂如醋酸戈舍瑞林、亮丙瑞林和曲普瑞林(triptorelin)；5-α还原酶抑制剂如非那雄胺；和醋酸环丙孕酮。适合与硒酸盐或其药学上可接受的盐联用，作为乳腺癌的激素消除疗法的化学药物包括但不限于芳香酶抑制剂如阿那曲唑；依西美坦、他莫昔芬、氨鲁米特、柠檬酸托瑞米芬、来曲唑、醋酸甲地孕酮和醋酸戈舍瑞林。适合与硒酸盐或其药学上可接受的盐联用，作为卵巢和子宫癌(包括子宫内膜癌)的激素消除疗法的化学药物包括但不限于孕激素类如醋酸甲地孕酮，左炔诺孕酮(levonorgestrol)和炔诺孕酮(norgestrol)。
在一些实施方式中，治疗激素依赖性癌症的方法还包括给予如上所述的细胞生长抑制剂或细胞毒剂。优选的细胞生长抑制剂是微管稳定剂，尤其是紫杉烷，更尤其是紫杉醇。
本发明的某些实施方式涉及治疗对象的癌症的方法，所述方法通常包括给予对象治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。为了实施这些方法，负责该对象的人可确定在该对象的具体情况和环境下硒酸盐或其药学上可接受的盐的有效剂型。硒酸盐的治疗有效量是有效治疗或预防癌症，包括预防引起症状(如癌细胞增殖)，控制这些症状和/或治疗与癌症相关的现有症状(如疼痛、体液累积(fluid build-up)、尿潴留、恶心、消化不良、胀气(gas)、食欲、大便习惯改变和体重降低)的量。在一些实施方式中，治疗有效是硒酸盐或其药学上可接受的盐的超营养量。在特定实施方式中，硒酸盐适合为盐形式，硒酸钠(Na2SeO4)。
下面讨论用于本发明方法的给药方式、硒酸盐给予量和硒酸盐剂型。通过与合适对照相比测定说明病程的一种或多种诊断参数，确定是否治疗了癌症。在人对象的情况下，“合适对照”可以是治疗前的个体，或可以是用安慰剂治疗的人(如年龄匹配的或类似的对照)。根据本发明，癌症治疗包括但不限于(i)在倾向于发生癌症但还未诊断出患有癌症的对象中预防癌症，因此，该治疗包括癌症的预防性治疗；(ii)抑制肿瘤发生，即阻止癌症发生；或(iii)缓解由癌症引起的症状。
本发明方法适用于治疗诊断患有癌症的个体、怀疑患有癌症的个体、已知易于发生癌症和认为可能发生癌症的个体、或认为之前治疗的癌症可能复发的个体。
在上述方法的特定实施方式中，所述癌症是前列腺癌，尤其是耐药性或雄激素非依赖性前列腺癌，所述治疗还任选地包括给予如上所述的细胞生长抑制剂(如微管稳定剂如紫杉醇)或细胞毒剂。
在其它实施方式中，前列腺癌是雄激素敏感性前列腺癌，所述治疗任选地与激素消除疗法和/或上述细胞生长抑制剂或细胞毒剂或放疗(任选与射线增敏剂一起使用)联用。合适地，所述激素消除疗法选自手术去势、非那斯提(finesteride)、尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、比卡鲁胺(Bicolutamide)、醋酸亮丙瑞林、氟他胺和醋酸戈舍瑞林。所述细胞生长抑制剂优选微管稳定剂，尤其是紫杉烷，更尤其是紫杉醇。
用本发明方法治疗的示范性对象是脊椎动物，尤其是哺乳动物。在某些实施方式中，所述对象选自人、绵羊、牛、马、猪、犬和猫。优选对象是人。
可按照抗癌药物递送领域已知的任何技术配制硒酸盐或药学上可接受的盐。当然，可通过许多方式给予硒酸盐或其药学上可接受的盐，只要记住所有制剂都不会适合每条给药途径。可给予固体或液体形式的硒酸盐或其药学上可接受的盐。该应用可以是口服、直肠、经鼻、局部(包括含服和舌下)或吸入。硒酸盐或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的常规佐剂、运载体和/或稀释剂一起给药。
固体应用形式包括片剂、胶囊、粉末剂、丸剂、锭剂、栓剂和颗粒给药形式。它们还可包含运载体或添加剂，如调味剂、染料、稀释剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、持久剂(lasting agent)和/或封装材料。液体给药形式包括溶液、悬液和乳液。它们可与上述添加剂一起提供。
如果硒酸盐或其药学上可接受的盐的溶液和悬液具有易于使用的合适粘度，则可以注射。如果需要，可用设计用于灌注的设备灌注对注射而言粘度过高的悬液。通常通过胃肠道外途径或肠途径给予缓释形式。胃肠道外给药是用于实施本发明的硒酸盐或其药学上可接受的盐的另一种给药形式。“胃肠道外”包括适用于注射以及经鼻、阴道、直肠和含服给药的剂型。
给予硒酸盐或其药学上可接受的盐可包括口服延时剂型。缓释胶囊或片剂或者作为水基溶液形式的口服剂型优选每天给药一次至每天给药三次。硒酸盐或其药学上可接受的盐可每天、连续、每周一次或每周三次静脉内给药。
给予硒酸盐或其药学上可接受的盐可包括每天给药，优选以缓释胶囊或片剂形式每天给药一次，或作为水溶液每天给药一次。
硒酸盐或其药学上可接受的盐与至少一种细胞生长抑制剂或细胞毒剂的组合可以固体或液体形式在单一制剂或组合物中或者在分离的制剂或组合物中给药。在一些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐和细胞生长抑制剂或细胞毒剂作为单一片剂或胶囊或者分离的片剂或胶囊口服给药。在其它实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐和细胞生长抑制剂或细胞毒剂在单一组合物或分离组合物中静脉内给药。
本发明方法可与其它已知癌症治疗联用，例如但不限于手术、化疗和放疗。在一些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐与放疗联用，放疗例如但不限于适形外照射(conformal external beam)放疗(在4-8周内分次给予50-100Grey)、单次或多次高剂量率的近距治疗(brachytherapy)、永久组织间隙近距疗法(permanentinterstitial brachytherapy)、全身同位素法(如锶89)。在一些实施方式中，放疗可与射线增敏剂联用。射线增敏剂的说明性例子包括但不限于乙丙昔罗，依他硝唑，氟乐舒(fluosol)，米索硝唑，尼莫唑，替莫泊芬和替拉扎明。在其它实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐与肿瘤切除术联用。
本发明也提供了治疗或预防癌症的药物组合物，通常包含超营养量，合适的是约0.5mg-1.0g硒酸盐或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量约为5.0mg-700mg。在说明性实施例中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量约为7.5mg-250mg，特别是50mg-200mg，例如单日剂量100-150mg。所述药物组合物可用于治疗Akt被激活或过度激活的癌症或激素依赖性癌症。在一些实施方式中，所述药物组合物可用于治疗前列腺癌，尤其是耐药性或雄激素非依赖性前列腺癌。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种细胞生长抑制剂或细胞毒剂。在其它实施方式中，所述药物组合物还包含化学激素消除剂。在其它实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种细胞生长抑制剂和/或细胞毒剂和化学激素消除剂。在其它实施方式中，所述药物组合物还包含与放疗一起使用的射线增敏剂。
本发明药物组合物可包含非免疫原性和与硒酸盐生物相容，以及能够生物吸收、生物降解、作为完整分子被清除的任何其它组分。该制剂可以是即用形式，或者可以是需要在给药前加入载体的无菌粉末或液体。如果需要无菌，那么可以在无菌条件下制备该制剂，该混合物的单个组分可以无菌，或者在临用前将该制剂过滤除菌。这种溶液也可含有合适的药学上可接受的运载体，例如但不限于缓冲液、盐、赋形剂、防腐剂等。
在一些实施方式中，缓释口服制剂可用于以本发明方法给予硒酸盐或其药学上可接受的盐。这些制剂通常包含溶解度降低的硒酸盐或其药学上可接受的盐，以延迟其吸收到血流中。此外，这些制剂可包含也可用于延迟硒酸盐或其药学上可接受的盐的吸收的其它组分，例如药物、运载体等。微囊化、聚合物捕获系统和渗透泵(可以或不可以被生物侵蚀)也可用于延迟或控制硒酸盐或其药学上可接受的盐从胶囊或基质中扩散。
硒酸盐或其药学上可接受的盐可单独使用或作为另一药物的一部分使用。因此，本发明也考虑到包含硒酸盐或其药学上可接受的盐的药物用于治疗Akt被激活的癌症或用于治疗激素依赖性癌症，其中根据与激素消除疗法联合给药来配制药物。
为了使本发明的特性更易于理解和产生实际效果，下面参照非限制性实施例描述了本发明的具体优选实施方式。
实施例实施例1通过抑制蛋白激酶B/AKT的激活用硒酸钠抑制前列腺肿瘤进展材料和方法细胞培养细胞培养实验包括获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)的PC-3细胞系。通常用补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌药混合物(Invitrogen)的RPMI 1641(Invitrogen)培养细胞。在37℃、5％CO2中维持细胞。用蒸馏水将硒酸钠和硒代甲硫氨酸(Sigma)制备成10mM母液，过滤除菌，然后用培养基稀释用于体外实验。
动物实验动物实验包括采用BALB/c裸小鼠。在实验第一天，用腹膜内注射氯胺酮100mg/kg和甲苯噻嗪20mg/kg麻醉6周龄的BALB/c裸小鼠。在放大镜下，将存活率大于95％的1×106PC-3细胞注射入背外侧前列腺，基本上如Corcoran，N.M.，Naidovska，M.，和Costello，A.J.(2004)，J.Urol，171907-910所述。
在实验第三天，将所有小鼠换成D19101极限硒饮食，测定的硒含量为0.07ppm(Research Diets Inc.，New Brunswick，New Jersey，USA)。然后随机分配小鼠，使其接受含有5ppm硒(硒酸钠)的饮用水或未补充硒的水。补充5周后，挑出小鼠杀死(culled)，将含有肿瘤的前列腺称重，并用游标卡尺测量。然后放大探查肾静脉水平头侧的腹膜后腔，鉴定大于0.5mm的淋巴结。
按照厂商说明用原位TUNEL细胞死亡检测试剂盒(Roche Applied Science)测定组织样品中的凋亡程度。在高倍镜(x400)下从在相邻切片的H&E染色显示没有坏死的区域随机选择10个视野对染成褐色的细胞数进行计数。
通过体内BrdU掺入测定肿瘤细胞增殖速率。处死前2小时，用50mg/kgBrdU(Sigma)腹膜内注射小鼠。切出5μm切片，用纯甲醇在4℃固定10分钟。用PBS使切片再水化，在2N HCl中37℃孵育1小时以使DNA变性。通过将玻片浸入0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中和酸。3×PBS洗涤后，将浓度为5μg/mL溴脱氧尿苷(BrdU)的单克隆抗体(Roche Applied Science)与样品一起室温孵育1小时，该抗体是用0.1％BSA的PBS溶液稀释的，然后4℃过夜。用PBS洗涤样品3次，与生物素化连接免疫球蛋白混合物(DAKO Corporation)孵育1小时。用PBS洗涤3次后，将样品与链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(BD Biosciences)一起孵育，用DAB(Enhanced LiquidSubstrate System，Sigma)显示出免疫染色。在高倍镜(x400)下随机选择10个视野，对染成褐色的细胞进行计数。
PC-3生长曲线通过使2×105PC-3细胞贴壁过夜来分析PC-3生长曲线。16小时后，更换培养基，以在血清存在下包含所示浓度的硒酸钠，使细胞生长到特定时间点。然后收获上清和细胞，合并并通过台盼蓝排斥试验评价活细胞。一式三份地进行试验。
BrdU掺入试验和免疫荧光通过接种2.5×103个PC-3细胞和使其贴壁过夜进行BrdU掺入试验和免疫荧光。16小时后，更换培养基，以在血清存在下包含所示浓度的硒酸钠。36小时后，更换新鲜的含硒酸钠的培养基，加入1μL/mL细胞增殖标记试剂(BrdU/FrdU，AmershamBiosciences)。再孵育细胞16小时，然后用PBS洗涤3次，在4％PFA中室温固定10分钟。
小鼠单克隆抗-BrdU和抗体用作第一抗体，抗小鼠488 Alexa用作第二抗体。通过对每一定数量的DAPI阳性细胞中核染成绿色的细胞进行计数确定掺入BrdU的细胞的百分数。每个盖玻片上计数100个DAPI阳性细胞，一式三份地进行试验。
细胞周期阻断水平的测定细胞周期阻断水平的测定包括接种通过血清饥饿48小时同步化的5×105个PC-3细胞，然后以所示浓度将硒酸钠加入新鲜的含血清培养基。使细胞生长到所示时间点，然后收获，用PBS洗涤，用冰冷的70％乙醇固定15分钟。用PBS洗涤细胞，重悬于含有40μg/mL碘化丙锭(Sigma)和100μg/L RNA酶的PBS中。每次读数产生DNA直方图，测定存在于G1和G2/M峰中的细胞比例。结果获自三次独立试验。
MTT生长试验MTT生长试验包括在96孔板中每孔接种1×103个PC-3细胞，并使细胞贴壁过夜。16小时时，用含有所示浓度的硒酸钠或硒代甲硫氨酸的新鲜培养基替换培养基。在测定PI3K抑制对硒酸钠生长抑制的额外作用的试验中，加入LY294002(Promega，威斯康星州麦迪逊，USA)与硒酸钠，使LY294002浓度为50μM。此试验的对照接受等体积LY294002稀释剂(DMSO)。然后，按照厂商说明(Sigma)进行MTT生长试验。
抗体和免疫印迹除非另有说明，以下抗体获自Cell Signaling Technology(Beverly，MA，USA)抗-p27KIP1(bd Pharmingen)、抗-p21CIP1、抗-细胞周期蛋白d1、抗-细胞周期蛋白d3、抗-CDK4、抗-CDK6、抗-磷酸化rb(Ser807/811)、抗-RB、抗-磷酸化Akt(Ser473)、抗-磷酸化Akt(Thre308)、抗-Akt、抗-磷酸化PDK1(Ser241)、抗-磷酸化PDK1(Tyr373/376)、抗-磷酸化GSK-3β、抗-磷酸化mTOR(Ser2448)、抗-mTOR、抗-βIII微管蛋白(Promega)。
为了测定硒酸钠对细胞周期调节蛋白的影响，用0.5 mM硒酸钠处理5×105个PC-3细胞所示时间。为了测定硒酸盐对视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化的影响，使2×105个细胞贴壁过夜，然后血清饥饿24小时，再用0.5mM硒酸钠处理所示时间。为了测定硒酸盐对参与PI3K/Akt信号转导级联反应的蛋白质磷酸化的影响，使5×105个PC-3细胞贴壁10小时。血清饥饿细胞16小时，然后用0.5mM硒酸钠处理所示时间。用ELB(250mM NaCl、50mM HEPES pH 7.0、5mM EDTA、0.5mM DTT、0.2％TX100、20mM氟化钠、2mM过钒酸钠、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))裂解细胞。4℃离心裂解物15分钟。用BCA系统(Sigma)测定蛋白浓度，将等量蛋白质加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶各泳道中。将蛋白质转移到PVDF(Millipore)膜上，通过SuperSignal West Dura(Pierce)用偶联于辣根过氧化物酶(HRP)和化学发光基团的抗-小鼠或抗-兔第二抗体检测。用Restore Western印迹洗提缓冲液(Pierce)洗提膜。
细胞转染和免疫荧光转染前一天，将5×105个PC-3细胞接种于24孔板中，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)以0.8μg pcDNA3-GFP-FKHRwt构建物(由波士顿Dana-Farber Institute的Bill Sellers博士友情馈赠)瞬时转染。用0.2％Triton X-100通透细胞，用DAPI染核内容物。将盖玻片装在荧光封闭介质(DAKO)上。用Leica落射荧光显微镜测定双荧光细胞中绿色荧光的细胞分布。
统计学分析除非另有说明，数据表示为平均值+SE。用Student′s检验分析组间差异(图IA-D)，假定p＜0.05时有显著性。通过用于Windows的SPSS 9.05(SPSS，Chicago，Illinois)软件进行所有统计学分析。
结果结果表明，硒酸钠在常位小鼠模型中抑制了前列腺癌细胞增殖。硒酸钠治疗的动物与对照组的比较如下含肿瘤前列腺的平均重量的比较如图1A所示，平均肿瘤体积的比较如图1B所示。也评价了淋巴结转移的平均数量。通过前列腺重量指数评价证明，与对照相比，硒酸钠能显著抑制原代肿瘤生长，而两组之间的肿瘤体积差异恰好不能达到显著性。与对照组相比，硒酸钠组的腹膜后淋巴结的数量显著减少(图1C)。
可能由于对肿瘤细胞增殖的抑制作用或通过肿瘤细胞凋亡增加产生硒酸钠引起的肿瘤生长抑制。为了区别这两种机制，将核苷酸类似物BrdU掺入增殖细胞，用Tunel试验分析对照和硒酸钠处理的前列腺上的凋亡标记物。与对照相比，硒酸钠显著损伤了BrdU掺入前列腺肿瘤(图1D、E)，但这两组之间的凋亡没有显著性差异(图1D)。这些结果表明，硒酸钠用于阻止肿瘤细胞增殖，而非增加肿瘤细胞死亡。
该结果也表明，硒酸钠能将前列腺癌细胞阻滞在细胞周期的G1期。为了阐明硒酸钠在体内对肿瘤进展是否有抑制作用，是否会导致体外肿瘤细胞生长抑制，接种人前列腺癌PC-3细胞，培养16小时。然后在存在或不存在浓度增加的硒酸钠的情况下孵育细胞。孵育24、48和72小时后，对总细胞数进行计数。如图2A所示，在72小时中，在不存在硒酸钠的情况下培养的PC-3细胞数均一增加。相反，在硒酸钠存在下PC-3细胞数以剂量依赖性方式显著减少。在0.01和0.1mM剂量之间，细胞数增加速率受阻，而在较高剂量0.25和0.5mM下，完全阻断了细胞数的增加。这些结果提示，硒酸钠干扰了细胞周期进程，PC-3细胞的接种基本如上所述，硒酸钠浓度范围为0.05-0.25mM，处理54小时。然后用免疫荧光显微术测定荧光核苷酸类似物BrdU/FrdU掺入正在通过G1/S期的细胞中。接触0.25mM硒酸钠54小时的细胞的典型图片见图2B。通过评价BrdU/FrdU阳性核说明，接触此剂量的硒酸钠严重阻碍了PC-3细胞的G1/S进程。
还用流式细胞术分析存在或不存在浓度逐渐增加的硒酸钠的情况下的细胞周期分布。细胞周期的典型直方图见图2C，平均百分数值见图2D。用0.25和0.5mM硒酸钠处理PC-3细胞24小时将G1期的细胞群百分数从对照组的55％提高到硒酸钠处理组的69-70％(图2D)。相反，在浓度逐渐增加的硒酸钠的存在下孵育能使G2/M期细胞百分数从对照的28％降低到19％和24％。硒酸钠处理48小时以上能以剂量和时间依赖性方式提高G1期细胞的百分数，而药物处理能降低G2/M期的PC-3细胞的百分数。
存在痕量硒元素不能完全解释硒的癌症化学预防作用，越来越清楚的是，硒化合物本身对于这种活性很重要(Corcoran等，2004，同上；Kim等，2003，同上)。用MTT试验作为增殖指数的量度比较了无机硒酸钠与有机硒代甲硫氨酸对PC-3细胞增殖的影响。如图2E所示，剂量为0.25和0.5mM的硒酸钠在72小时中显著降低了PC-3细胞增殖，而相同剂量的硒代甲硫氨酸降低细胞增殖的效果较差。观察到最低剂量0.01mM的硒酸钠能使细胞数稍有增加，该结果可重现(图2E)。总之，这些数据表明，硒酸钠通过防止细胞周期从G1进入S期抑制细胞增殖。
结果也说明，硒酸钠，而非硒代甲硫氨酸诱导细胞周期抑制蛋白上调。主要由细胞周期蛋白D/cdk4/cdk6激酶复合物的连续激活(其调节Rb磷酸化和E2F转录因子释放)调节细胞通过G1期进行增殖的有序过程。为了测定硒酸钠处理对关键细胞周期调节蛋白的影响，基本如前所述地处理PC-3细胞，其中用0.5mM硒酸钠处理不同时间，最长24小时。然后用免疫印迹试验分离和分析细胞总蛋白中是否存在细胞周期蛋白D1、D3cdk4和cdk6。细胞周期蛋白D1的表达水平从14小时起显著降低，而cdk4水平的峰值出现在6小时处，然后以时间依赖性方式降低，直到24小时处(图3A)。CDK抑制剂如p27KIP1和p21CIP1/WAF1是细胞周期进程的重要负调节物。这些分子在G1期通过结合于细胞周期蛋白D/CDK复合物阻断CDK激酶活性，防止Rb基因家族成员磷酸化和从G1向S期转变。为了测定硒酸钠对这些细胞周期抑制剂的影响，如上所述分析同一PC-3细胞裂解物中p27KIP1和p21CIP1的表达水平。用硒酸钠处理以时间依赖性方式提高了p27KIP1水平，直到24小时时水平下降，同时p21CIP1水平显著增加，峰值出现在6小时时，随后下降(图3A)。也观察到在相同条件下用硒酸钠处理的PC-3细胞中Rb磷酸化(ser807/811)水平以时间依赖性方式显著降低(图3B)。在PC-3细胞中比较了无机与有机硒化合物对细胞周期抑制蛋白p27KIP1水平的影响。如图3C所示，硒代甲硫氨酸在分析时间内对p27KIP1水平的影响很小，而与对照(0小时)和硒代甲硫氨酸水平相比，硒酸钠显著提高了p27KIP1总蛋白水平(图3C)。这些数据表明了细胞周期蛋白D1水平和Rb磷酸化水平下降以及细胞周期抑制蛋白p27KIP1和p21CIP1/WAF1的伴随增加，它们可能在调节无机硒化合物诱导的G1期阻滞中起重要作用，有机硒不能诱导这些作用。
现有结果也表明，硒酸钠，而非硒代甲硫氨酸，有效抑制蛋白激酶B/Akt激活。因为缺失肿瘤抑制蛋白PTEN而缺少对PI3K细胞存活途径的调节是人类肿瘤形成(Vivanco，I.和Sawyers，CL.2002，同上)，尤其是前列腺肿瘤(Visakorpi，1999，Ann.Chir.Gynaecol.，8811-16；Li等，1997，Science，2751943-1947)的共同特征。通过效应物激酶Akt，PI3K途径通过防止细胞周期蛋白D1降解和负调节细胞周期抑制蛋白质p27KIP1和p21WAF1/CIP1的表达对调节细胞增殖有重要作用(Graff等，2002，J.Biol.Chem.，27524500-24505)。PC-3细胞已不表达PTEN，具有组成性活化的PDK途径活性(Chakraborty等，2001，Cancer Res.，617255-7263，Beresford等，2001，J.InterferonCytokine Res.，21313-322)，尤其是Akt的激酶活性。
为了测定硒酸钠可否干扰PI3K途径的活性，用硒酸钠(0.5mM)将PC-3细胞处理不同时间。用活化特异性抗体测定全细胞裂解物中Akt的磷酸化状态。如图4A所示，在接触无机硒化合物10分钟内，硒酸钠诱导Akt在Ser473和Thr308的磷酸化瞬时增加。这种增加后，Akt在延长时间中显著失活，而细胞总Akt(全Akt)水平基本保持不变(图3A)。PDK1将细胞膜上Akt的Thr308位点磷酸化(Vanhaesebroeck，B.和Alessi，D.R.2000，Biochem.J.，346 Pt3561-576)。为了确定硒酸钠是否用于下调Akt上游的PDK1活性，用磷酸化特异性PDK1 ser241和tyr373/376抗体分析PDK1的磷酸化状态。如图4B所示，PC-3细胞接触0.5mM硒酸钠长达6小时后，对PDK1的磷酸化状态没有影响，这表明硒酸钠不通过阻断PDK1激酶活性抑制Akt活化。为了确定硒酸钠引起的Akt活化瞬时增加是否依赖于PI3K途径的上游组件，用硒酸钠(0.5mM)处理PC-3细胞10分钟，之前经过或不经过PI3K抑制剂LY294002(50μM)的预处理(1小时)。如图4C所示，经磷酸化特异性抗体评价，硒酸钠处理10分钟增加了Akt活化。然而，这种增加被LY294002预处理完全阻断，这表明硒酸钠诱导的Akt磷酸化瞬时增加需要PI3K途径的上游组件。
通过用0.5mM硒酸钠或硒代甲硫氨酸处理细胞不同时间并评价Ser473的Akt磷酸化，比较无机硒化合物对PC-3细胞中Akt活化的影响。如图4D所示，硒代甲硫氨酸能够在所有测定时间上影响Akt磷酸化，而硒酸钠确实能抑制Akt活化。
结果也表明，硒酸钠抑制了细胞存活PI3K途径的下游效应物。PTEN肿瘤抑制蛋白下游的PI3K信号通路潜在效应物包括Akt激酶的许多底物，如BAD，胱冬酶9，IKKα以及Forkhead转录因子FKHR、FKHRL1和AFX(Biggs等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，967421-7426；Brunet等，1999，Cell，96857-868；Cardone等，1998，Science，2821318-1321；Datta等，1997，Cell，91231-241；Kops等，1999，Nature，398630-634；Ozes等，1999，Nature，40182-85；Tang等，1999，J.Biol.Chem.，27416741-16746)。
在无PTEN细胞中，Forkhead转录因子家族成员失调和失活，异常定位于胞质，在胞质中它们不能激活转录(Nakamura等，2000，Mol.Cell.Biol，208969-8982)。在这种细胞中再引入PTEN功能，能诱导FKHR易位至核，最终引起无PTEN细胞的G1期阻滞(Nakamura等，2000，同上)。因此，硒酸钠抑制无PTEN PC-3细胞中的Akt活化应该类似地诱导FKHR从胞质再定位至核。用GFP-FKHR表达构建物转染的PC-3细胞用LY294002(50μM，1小时)或硒酸钠(0.5mM，3小时)或硒代甲硫氨酸(0.5mM，3小时)处理，观察这些处理对荧光Forkhead蛋白的细胞定位的影响。如图5A和B所示，GFP-FKHR融合蛋白定位于未处理对照PC-3细胞的胞质中。LY294002或硒酸钠的处理明显诱导GFP-FKHR融合蛋白从胞质再定位至核。然而，硒代甲硫氨酸不能诱导GFP-FKHR从胞质再定位至核。这些结果证实了在通过抑制Akt关键底物蛋白FKHR的活化阻断Akt信号转导中不同硒化合物之间的选择性。
Akt的两个更下游的效应物/底物是糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)(Moule等，1997，J.Biol.Chem.，2727713-7719；Van Weeren等，1998，J.Biol.Chem.，27313150-13156)和雷帕霉素的哺乳动物靶点mTOR蛋白(Nave等，1999，Biochem.J.，344 Pt2427-431；Sekulic等，2000，Cancer Res.，603504-3513)。
为了确定硒酸钠是否也可影响这些Akt底物的活化，用硒酸钠(0.5mM)处理PC-3细胞不同时间，并用GSK-3β和mTOR的磷酸化特异性抗体检测全细胞裂解物。如图5C和5D所示，硒酸钠诱导mTOR和GAK-3β磷酸化状态降低。
讨论上述结果显示了补充高剂量硒酸钠对激素难治性前列腺癌的影响。硒酸钠显示出能通过诱导G1阻滞以剂量和时间依赖性方式抑制PC-3细胞增殖，但不增加凋亡水平。G1阻滞伴随着细胞周期抑制蛋白p27KIP1和p21CIP1/WAF1表达增加和细胞周期蛋白D1表达降低。Rb的磷酸化也被硒酸盐抑制。与硒代甲硫氨酸相反，硒酸盐显著降低了PI3K效应物Akt的活性水平。PI3K/Akt途径关键下游效应物mTOR、GSK-3β和FKHR转录因子的活化也被硒酸盐，而非硒代甲硫氨酸抑制。这些结果证明无机硒酸盐对PI3K/Akt途径的特异性抑制效果，提示这种化合物可用于治疗癌症，尤其是PBK/Akt途径过度激活引起的癌症，如无PTEN肿瘤。
本研究中也阐述了硒酸钠与硒代甲硫氨酸的抗肿瘤发生作用涉及的分子机制。无机硒酸钠能通过阻止细胞增殖抑制体内肿瘤进展，而对凋亡没有任何影响。用硒酸钠观察到PC-3细胞体外增殖的剂量和时间依赖性降低，硒酸钠能够通过诱导G1期阻滞而不提高流式细胞术观察到的凋亡细胞比例抑制这些细胞的S期进程。
细胞周期进程受CDK控制，CDK抑制剂能抑制CDK的活性。假定G1-S期转变的进程受G1细胞周期蛋白和CDK活性的控制。细胞周期蛋白如cdk1刺激G1细胞周期进程(Baldin等，1993，Genes Dev.，7812-821)，而Rb似乎是将细胞周期过程与基因调节偶联起来的关键下游靶点(Weintraub等，1995，Nature，375812-815)。Rb被cdk4/cdk6/细胞周期蛋白D复合物磷酸化，破坏了Rb/E2F复合物，允许E2F激活DNA合成和细胞周期进程所需的基因(Harbour等，1999，Cell，98859-869)。
本实施例结果表明，随着Rb在Ser807/811的磷酸化，细胞周期蛋白D1水平降低，而cdk6和cdk4水平保持相对不变。这些结果证明，高剂量硒酸盐能通过特异性干扰关键细胞周期进程蛋白的水平和活化诱导PC-3细胞G1期阻滞。已证明，接触高剂量硒酸盐后p27KIP1水平升高，但高剂量硒代甲硫氨酸无此效果。p27KIP1水平升高是血清耗尽(Coats等，1996，Science，272877-880)或接触抑制(Polyak等，1994，Cell 7859-66)后许多正常细胞G1期阻滞的标志和必需事件。p27KIP1起到作为细胞周期进程负调节物的核心作用，因此该蛋白水平提高能为观察到的硒酸盐诱导G1期阻滞提供基本原因。P21CIPI表达也通过抑制细胞周期蛋白/CDK复合物和抑制DNA合成导致G1期阻滞(Johnson，G.G.和Walker，CL.1999，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.39295-3 12)。
PI3K途径在关于增殖和存活的许多细胞功能中起到核心作用，此途径因为缺失PTEN肿瘤抑制蛋白而失调是前列腺恶性肿瘤中的共同事件(Whang等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 955246-5250)。诱导细胞周期蛋白D1表达需要激活PBK途径(Muise-Helmericks等，1998，J.Biol.Chem.27329864-29872)，最近报道用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制此途径会导致DU145和PC-3前列腺癌细胞的G1期阻滞(Gao等，2003，Biochem.Biophys.Res.Commun.3101124-1132)。PI3K途径的主要下游效应物是蛋白激酶B/Akt。在缺少PTEN的前列腺肿瘤如PC-3细胞中，Akt组成性活化。本实施例结果表明，高剂量硒酸盐而非硒代甲硫氨酸，可显著降低这些细胞中存在的活化Akt水平，这是在活化Akt水平上的特异性效果，因为没有检测到被认为能直接诱导PI3K下游Akt活化的PDK1激活改变(Vivanco，I.和Sawyers，CL.2003，同上)。这些结果说明，硒酸盐可通过一种至今仍未良好表征的磷酸酶促进Akt去磷酸化。
有趣的是，硒酸盐对Akt活化的影响似乎遵循两种不同的作用方式。首先，硒酸盐诱导Akt磷酸化增加。这种增加是PI3K依赖性的，因为它被LY294002预处理抑制。这种瞬时增加后，长期、深入地抑制了Akt活化，这种抑制不包括Akt上游组件，因为LY294002没有增强高剂量硒酸钠的增殖抑制。硒酸钠也能阻止下游Akt效应物mTOR和GSK-3β以及FKHR转录因子的活化，与集中在关键PI3K效应物激酶Akt上的硒酸盐的抑制作用一致。
甲基亚硒酸在处理24小时内也通过胱冬酶介导通路诱导DU-145细胞的G1期阻滞以及凋亡(Jiang等，2001，同上)。低至3μM的剂量就能诱导G1期阻滞，但不会伴随凋亡或Akt磷酸化水平降低(Jiang等，2002，同上)。然而，较高剂量(5μM)导致Akt激活剂量依赖性下降，也启动了胱冬酶介导的凋亡。用LY294003抑制PI3K途径不能诱导DU-145细胞凋亡，这表明甲基亚硒酸诱导的PI3K途径阻断不参与凋亡诱导(Jiang等，2002，同上)。低剂量甲基亚硒酸能不依赖Akt抑制和凋亡地诱导G1期阻滞，但在高剂量下能阻断Akt和诱导凋亡，这与现有结果形成鲜明对比。硒酸钠通过Akt水平特异性抑制PI3K途径诱导G1期阻滞，而不诱导凋亡。因此，与其它硒化合物相比，应该更关注硒酸盐的抗增殖作用。
根据现有发现，已知Akt的慢性激活与体内癌症模型的化疗抗性相关(Tanaka等，2000，Oncogene，195406-5412)，提供了在肿瘤模型的联合治疗中将硒酸盐与化疗药一起使用的吸引人的机制。
实施例2由于硒酸钠与紫杉醇的协同作用降低前列腺肿瘤生长材料和方法将1×106个前列腺肿瘤PC-3细胞注射入裸小鼠的前列腺。3天后，将5 ppm硒酸钠形式的硒通过饮用水给予接受硒酸盐的小鼠。将用10％克列莫佛EL/25％乙醇/65％PBS溶液配制的10mg/kg紫杉醇腹膜内给予接受紫杉醇的动物，每周一次。每组采用10只动物。注射5周后，处死动物，取出前列腺，解剖去除附连物，称重肿瘤。探查腹膜后腔的淋巴结病变，切除直径大于0.5mm的淋巴结。然后以50微米为一层对肿瘤进行多层切片，用标准的体积公式(a+b2/2)从数字化的图像计算肿瘤体积。
结果图6表明硒酸盐与紫杉醇协同作用以降低前列腺肿瘤重量。对照组接受紫杉醇增溶运载体克列莫佛和乙醇，但不接受紫杉醇。已知克列莫佛具有一些抗肿瘤作用，这可能是与此实验中的对照相比，单用硒酸盐的抗肿瘤作用没有降低的原因。图6所示结果说明，硒酸盐和紫杉醇协同作用降低肿瘤重量的效果大于单独使用硒酸盐和紫杉醇的效果之和。硒酸盐抑制了关键的细胞存活途径PI3K/Akt途径。在大部分人肿瘤中该途径上调，该途径的过度激活与发生对化疗药的化疗抗性高度相关。
本实施例结果表明，与单独治疗相比，用硒酸盐和紫杉醇联合疗法在体内共同治疗前列腺肿瘤比各自单独使用可诱导较强的抗肿瘤作用。硒酸盐可干扰肿瘤细胞诱导对化疗药紫杉醇的化疗抗性的能力。因此，在裸小鼠中通过将PC-3细胞注射入动物的前列腺诱导前列腺肿瘤，随后用单独或组合的硒酸盐或紫杉醇处理动物或5周，然后分析肿瘤。如图6所示，联合疗法对于减小瘤重有显著的协同作用，这种作用大于单独治疗的作用之和。对照组接受紫杉醇增溶运载体克列莫佛EL和乙醇，但没有紫杉醇。已知克列莫佛EL具有抗肿瘤作用，这可能是与此实验中的对照相比，单用硒酸盐的抗肿瘤作用没有降低的原因。在体内观察到的协同作用比体外观察到的大。这支持了以下观点硒酸盐对血管内皮细胞有抗血管新生作用，对肿瘤细胞本身的生长也有抑制作用，所以仅在体内可以观察到这种联合作用产生的协同效应。
图7显示了肿瘤的组织切片。可以观察到，与单用紫杉醇相比，硒酸盐与紫杉醇具有显著降低肿瘤大小和体积的协同作用。在图8所示肿瘤体积图中也明显看出硒酸盐和紫杉醇的这种显著协同作用。
测量单用紫杉醇治疗和联合疗法治疗的动物的肿瘤体积，以确定药物对前列腺肿瘤生长的影响。联合疗法对于降低肿瘤大小有显著作用，如图7所示，联合疗法也对肿瘤体积有显著影响(图8)。这种效果有统计学显著性(P＜0.05)。
因此，图6-8所示体内数据证明，硒酸盐与紫杉醇具有降低前列腺肿瘤重量和体积的协同作用。这种作用大于单独药物的作用之和，从而证明这两种化合物的协同作用。这支持以下发现硒酸盐对血管内皮细胞有抗血管新生作用，也对肿瘤细胞生长有抑制作用，所以仅在体内可以观察到这种联合作用产生的协同效应。单用硒酸盐对降低肿瘤微血管密度的作用大于对肿瘤体积的作用，这表明它具有直接抗血管新生作用。
实施例3硒酸盐和亚硒酸盐之间的比较测试材料和方法细胞毒件用5μM或50μM硒酸钠或亚硒酸钠处理后的细胞毒性涉及通过台盼蓝排斥法测定细胞毒性。将5×103人前列腺癌PC-3细胞接种于24孔板中，8小时后用5μM或50μM硒酸盐或亚硒酸盐处理。5μM或50μM的剂量范围等价于0.1mg/kg-1.25mg/kg。加入硒酸盐或亚硒酸盐24、48、72和96小时后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞百分数。结果见图9，其中描述了三次独立实验的平均值和SD。图9显示出，硒酸盐是细胞抑制性物质，而相似浓度的亚硒酸盐是细胞毒性物质。因此，亚硒酸盐不适用于动物联合疗法。
为了区分硒酸盐和亚硒酸盐的相对细胞毒性作用，用两种不同浓度5μM或50μM的硒酸盐(等价于0.2-1.9mg/kg的剂量)或5μM或50μM的亚硒酸盐(等价于0.18-1.8mg/kg的剂量)处理人前列腺癌细胞PC-3。然后，在施加处理后24小时-96小时依次收获组织培养孔中的所有细胞。然后用台盼蓝排斥试验测定活细胞百分数。硒酸盐在所有时间点以及较低浓度和较高浓度下对这些细胞没有细胞毒性。硒酸盐处理样品中的活细胞百分数等价于对照未处理样品(图9)。在所有时间点上维持这种作用，在许多时间点上达到统计学显著性(参见星号标记的时间点，图9)。硒酸盐显示出细胞抑制作用，而亚硒酸盐具有细胞毒作用。
细胞遗传毒性将5×105个PC-3细胞接种于6孔板中，24小时后，用1μg/mL或10μg/mL紫杉醇或500μM(19mg/kg)硒酸盐或500μM(18mg/kg)亚硒酸盐处理细胞所示时间。用PBS洗涤细胞，用ELB裂解缓冲液裂解，在SDS-PAGE凝胶上运行全细胞裂解物，印迹并用所示抗体进行检测。组蛋白H2A.X的磷酸化在DNA损伤发生的数分钟内发生，一般通过DNA双链或单链断裂，它是DNA损伤中非常灵敏的读数。
为了确定硒酸盐、亚硒酸盐和紫杉烷、紫杉醇在诱导DNA损伤方面的差异，用这些化合物处理PC-3细胞，处理时间逐渐增加，然后裂解。用磷酸化特异性抗体检测蛋白质提取物中组蛋白H2A.X的磷酸化。结果见图10。图10表明，亚硒酸盐有遗传毒性，诱导DNA链断裂，而硒酸盐和紫杉醇没有这种作用。根据对组蛋白H2A.X磷酸化的评价，即使是高浓度(500μM；等价于19mg/kg剂量)的硒酸盐，以及浓度逐渐增加的紫杉醇都不能诱导DNA损伤。相反，相同浓度(500μM；等价于18mg/kg剂量)的亚硒酸盐在处理30分钟内诱导DNA损伤，无论此处理的总体毒性作用如何，正如通过相同样品中β-微管蛋白水平伴随性降低所说明的那样(图10)，这种作用随时间增加。
Akt的活化将5×105个PC-3细胞接种于6孔板中，24小时后，血清饥饿细胞16小时，然后用125μM(等价于4-9mg/kg的剂量范围)所示硒化合物处理6小时。然后用PBS洗涤细胞PBS，用ELB裂解缓冲液裂解，在SDS-PAGE凝胶上运行全细胞裂解物，印迹，首先用活化特异性Akt抗体(Ser408)进行检测，然后洗提印迹，用总Akt特异性抗体(全Akt)再检测，作为加样对照。扫描发色膜上的信号强度，将活性Akt的强度与总Akt水平作图。
为了比较不同硒化合物对Akt活化状态的影响，用图11所示7种不同硒化合物处理PC-3细胞。图11说明，仅硒酸钠(ATE)能抑制Akt活化，使磷酸化Akt的水平降低到对照水平以下。相反，亚硒酸(Sel acid)、亚硒酸钠(ITE)、二氧化硒(SeO2)、硫化硒(SeS2)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、硒代半胱氨酸(SeC)都将Akt活化诱导到对照水平以上。
为了测定高剂量亚硒酸盐的作用，将5×105个PC-3细胞接种于6孔板中，24小时后，血清饥饿细胞16小时，然后用500μM(等价于18-19mg/kg的剂量范围)亚硒酸钠或硒酸钠处理1小时。然后用PBS洗涤细胞，用ELB裂解缓冲液裂解，在SDS-PAGE凝胶上运行全细胞裂解物，印迹，首先用活化特异性Akt抗体(Ser408)进行检测。
图12表明，与相似的高剂量硒酸钠(ATE)相比，即使是500 μM高剂量的亚硒酸钠(ITE)，也无法抑制Akt活化。为了测定高剂量水平的亚硒酸盐是否能像硒酸盐那样抑制Akt活化水平，用500μM(18-19mg/kg)硒酸钠或亚硒酸钠处理PC-3细胞1小时，用磷酸化特异性抗体测定Akt的活化。选择这个时间是因为500μM(18mg/kg)亚硒酸盐在这个时间点上不诱导总蛋白降解。如图12所示，与对照未处理细胞相比，硒酸盐抑制了Akt活化，而亚硒酸盐不能抑制Akt活化。
凋亡将5×105个PC-3细胞接种于6孔板中，24小时后，用1、10、100ng/mL和1μg/mL、101μg/mL的紫杉醇或100μM、250μM或500μM(等价于4-19mg/kg)的硒酸钠或100μM、250μM或500μM(等价于3.6-18mg/kg)的亚硒酸钠处理细胞16小时。然后用PBS洗涤细胞，用ELB裂解缓冲液裂解，在SDS-PAGE凝胶上运行全细胞裂解物，印迹并用抗-切割PARP(PARP)和抗-β-微管蛋白(微管蛋白)特异性抗体检测。
诱导遗传毒性损伤的药物通过p53依赖性机制引发凋亡程序，正如用硒酸盐证明的那样(Jiang，C.等，2004 Mol.Can.Ther.3877)。微管稳定剂如紫杉醇通过固有凋亡途径诱导凋亡。为了区分硒酸盐和亚硒酸盐的促凋亡机制，用浓度逐渐增加的这些化合物处理PC-3细胞16小时，并分析凋亡标志蛋白——切割的PARP的水平。图13说明，硒酸盐和亚硒酸盐通过不同机制诱导凋亡。紫杉醇和硒酸盐诱导促调亡PARP蛋白切割，而亚硒酸盐没有这种作用。亚硒酸盐细胞毒性的机制是诱导细胞微管蛋白显著降解。因此，硒酸盐和亚硒酸盐似乎通过不同机制诱导凋亡，正如从它们对PARP和微管蛋白的作用所了解的那样，全部数据显示各种硒化合物对Akt途径的作用明显不同。
实施例4将5×104个人前列腺癌雄激素敏感型LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用50μM硒酸钠处理或不处理(对照)。加入该化合物72小时后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图14所示，在处理72小时后，硒酸盐与雄激素消除法协同作用，以降低亲本LNCaP细胞增殖。
实施例5将5×104个人前列腺癌雄激素非依赖型CSS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用50μM硒酸盐处理或不处理(对照)。加入硒酸钠72小时后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图15所示，在处理72小时后，硒酸盐与雄激素消除法协同作用，以降低CSSLNCaP细胞增殖。与亲本LNCaP细胞相比，雄激素非依赖型细胞对硒酸盐治疗更敏感。
实施例6将1×105个人前列腺癌雄激素敏感型NS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入硒酸钠或LY294002所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图16所示，仅5μM的硒酸盐处理9天后，就能显著降低(p＜0.95)雄激素敏感型NS LNCaP细胞增殖。
实施例7将1×105个人前列腺癌雄激素敏感型NS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入化合物所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图17所示，处理9天后，仅5μM的硒酸盐与雄激素消除法协同作用，显著降低(p＜0.95)雄激素敏感型NS LNCaP细胞增殖。
实施例 8将1×105个人前列腺癌雄激素非依赖型CSS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入硒酸钠或LY294002所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图18所示，处理9天后，仅5μM的硒酸盐能显著降低(p＜0.95)雄激素非依赖型CSS LNCaP细胞增殖，即使存在睾酮。
实施例9将1×105个人前列腺癌雄激素非依赖型CSS LNCaP细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入硒酸钠或LY294002所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图19所示，处理9天后，仅5μM的硒酸盐与雄激素消除法协同作用，显著降低(p＜0.95)雄激素敏感型CSS LNCaP细胞增殖。
实施例10将1×105个人肾上皮Q293细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入硒酸钠或LY294002所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图20所示，处理9天后，5μM硒酸盐不能显著影响Q293细胞增殖，而PI3K抑制剂LY294002能够显著影响增殖(p＜0.95)。因此，硒酸盐抑制作用是细胞特异性的。
实施例11将1×105个人肾上皮Q293细胞接种于6孔板中，8小时后，用5μM硒酸钠或10μM LY294002处理。加入硒酸钠或LY294002所示时间后收获细胞，用台盼蓝染色评价活细胞计数。
如图21所示，处理9天后，5μM硒酸盐不能显著影响Q293细胞增殖，即使与雄激素消除法联用(用CSS培养基培养)，而PI3K抑制剂LY294002能够显著影响增殖(p＜0.95)。因此，硒酸盐抑制作用是细胞特异性的。
实施例4-11的材料和方法细胞培养亲本雄激素敏感型LNCaP细胞系获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)，通常用补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌药混合物(Invitrogen)的RPMI 1641(Invitrogen)培养。在37℃、5％CO2中维持细胞。为了选择雄激素非依赖型LNCaP细胞，用含有5％去除了所有可检测的痕量睾酮的活性碳去除血清(CSS)(Invitrogen)的RPMI 1641(Invitrogen)培养LNCaP 6-8周，获得现在能够在没有睾酮的情况下自由增殖的LNCaP细胞系。这些细胞称为CSS LNCaP。
Q293细胞是人肾上皮细胞系，用含有5％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌药混合物(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)常规培养。
用蒸馏水将硒酸钠配制成10mM母液，在用体外实验的培养基稀释前过滤除菌。将PI3K抑制剂LY294002溶解于DMSO，形成50mM母液，用体外实验的细胞培养基稀释。
细胞生长曲线使5×104(图1-2)和1×105个之间的LNCaP、CSS LNCaP或Q293细胞贴壁过夜。数小时后，交换培养基以在正常血清或活性碳去除血清(CSS)存在下包含硒酸钠或LY294002(如图所示)，使其生长到所示时间点。收获上清和细胞，混合，用台盼蓝排斥试验评价活细胞。一式三份地进行实验。
统计学分析除非另有说明数据表示为平均值±SE。用成对t检验分析治疗和对照组之间的差异，假定p＜0.05时具有显著性。星号代表与响应对照值显著不同的值。以用于Windows的SPSS 9.05(SPSS，Chicago，Illinois)软件进行统计学分析。
将本文引用的每个专利、专利申请和发表物以全文纳入本文作参考。
不应认为本文对任何参考文献的引用承认了该参考文献可作为本申请的“现有技术”而获得。
整个说明书的目的是描述本发明的优选实施方式，而不是将本发明限定于任何一个具体实施方式
或特定的特征组合。因此，本领域技术人员应理解，根据本公开，可在不背离本发明范围的情况下对所述具体实施方式
进行各种修改和改变。所附权利要求书的范围旨在包括所有这些修改和改变。
权利要求
1.一种抑制Akt信号传导途径被激活的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞接触抑制Akt信号传导途径激活量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞是Akt活性过高的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞是前列腺肿瘤细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞的生长是雄激素非依赖性或化疗抗性的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐或其药学上可接受的盐的抑制Akt信号传导途径激活量约为0.015mg/kg-20.0mg/kg。
6.如权利要求1所述的方法，还包括使所述肿瘤细胞接触细胞生长抑制剂或细胞毒剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞生长抑制剂是微管稳定剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微管稳定剂是紫杉醇。
9.如权利要求1所述的方法，还包括使所述肿瘤细胞接触放疗，任选与射线增敏剂一起使用。
10.一种治疗Akt信号传导途径被激活的癌症的方法，所述方法包括给予需要治疗的对象抑制Akt信号传导途径激活量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述癌症是Akt活性过高的癌症。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是雄激素非依赖性前列腺癌或化疗抗性前列腺癌。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抑制硒酸盐的Akt信号传导途径激活量是超营养量。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抑制硒酸盐的Akt信号传导途径激活量约为0.015mg/kg-20.0mg/kg。
16.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐是硒酸钠形式。
17.如权利要求10所述的方法，还包括给予细胞生长抑制剂或细胞毒剂。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞生长抑制剂是微管稳定剂。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微管稳定剂是紫杉醇。
20.如权利要求10所述的方法，还包括给予放疗，任选与射线增敏剂联合给予。
21.一种治疗对象的激素依赖性癌症的方法，所述方法包括联合施用治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐与激素消除疗法。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐或其药学上可接受的盐的治疗有效量是超营养量。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐或其药学上可接受的盐的治疗有效量约为0.015mg/kg-20mg/kg。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐是硒酸钠形式。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述激素依赖性癌症选自雄激素依赖性癌症或雌激素依赖性癌症。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述激素依赖性癌症选自前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌或垂体癌。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述激素依赖性癌症是雄激素依赖性前列腺癌。
28.如权利要求21所述的方法，还包括给予细胞生长抑制剂或细胞毒剂。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述细胞生长抑制剂是微管稳定剂。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述微管稳定剂是紫杉醇。
31.如权利要求21所述的方法，还包括给予放疗，任选与射线增敏剂一起施用。
32.一种治疗对象的前列腺癌的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌或化疗抗性前列腺癌。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述治疗有效量是超营养量。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐或其药学上可接受的盐的治疗有效量约为0.015mg/kg-20.0mg/kg。
36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述硒酸盐是硒酸钠形式。
37.如权利要求32所述的方法，还包括给予细胞生长抑制剂或细胞毒剂。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述细胞生长抑制剂是微管稳定剂。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述微管稳定剂是紫杉醇。
40.如权利要求32所述的方法，还包括给予放疗，任选地与射线增敏剂联用。
41.硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造用于治疗Akt信号传导途径被激活的癌症的药物中的应用。
42.硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造用于治疗Akt信号传导途径被激活的癌症的药物中的应用，其中，所述癌症是除PC-3前列腺癌、3B6淋巴瘤、BL41淋巴瘤或HTB123/DU 4475乳房肿瘤以外的癌症。
43.硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造用于治疗激素依赖性癌症的药物中的应用，其中根据与激素消除疗法联用配制所述药物。
全文摘要
本发明公开了硒酸盐或其药学上可接受的盐(尤其是超营养量的)在抑制肿瘤细胞的生长或增殖的方法和组合物中的应用。本发明也公开了硒酸盐或其药学上可接受的盐与激素消除疗法和细胞生长抑制剂或细胞毒剂中一种或两种联合用于抑制肿瘤细胞的生长或增殖。在某些实施方式中，本发明方法可用于治疗或预防癌症，尤其是Akt信号传导途径被激活的癌症，如前列腺癌。此外，本发明公开了硒酸盐或其药学上可接受的盐与激素－消除疗法和任选的细胞生长抑制剂或细胞毒剂联合用于治疗激素依赖性癌症的方法和组合物。
文档编号A61P35/00GK101087616SQ200580039343
公开日2007年12月12日 申请日期2005年1月31日 优先权日2004年9月21日
发明者N·科尔科兰, C·霍文斯, A·柯斯特洛 申请人:维拉科治疗学控股有限公司