台阶式插管的制作方法

专利名称：：台阶式插管的制作方法和977，以及安装在轮轴975和977上以绕形成大约120°角的轴线转动的滚轮979和981。轨道942和944安装在壁946上，且使显示器20a和滑行组件955和971可大体接纳于其间。更具体地说，当轮子979和981接纳在沟槽949中时，上轮963和965之间的间隔与轨道942对准。可以构想其他的显示器安装配置以在轨道上支承显示器20a在第一和第二空间之间移动。请再次参加图45，在第一位置，显示器20a位于欢迎空间938内，并可用于在与会者到达以出席空间940内的会议时欢迎与会者并可提供有关所要进行的会议的信息。在与会者已到达并在空间940内的会议开始之前，显示器20a可沿着轨道942和944移动穿过开口934并进入会议空间940，如图45中虚线所示并标示为20a'。现请参见图47和48，图中示出了另一实施例，其中显示屏安装在支承结构上以两个不同空间之间移动以供在这两个独立空间中使用。这里，显示器20a不是如上相对图45和46所述地安装在轨道上以在两个空间之间移动，而是安装在门960的内侧表面上。门960铰接地安装在由分隔壁952所形成的开口954内以在图47所示的打开位置和图48所示的关闭位置之间转动，所述分隔壁952将欢迎空间960与会议空间964分隔开。这里，当门960处于图47所示的打开位置时，在与会者到达以出席会议时，同样可经由显示器20a来欢迎与会者，并可向与会者提供有关所要召开的会议的信息。一旦所有的与会者已到达以出席会议，门960可以如图48所示地关闭，并可经由显示器20a在会议空间964内呈现信息。现请参见图49至52，图中示出了用于显示器的支承结构使显示器能在两个不同的空间中使用的再一实施例970。这里，壁972将第一空间974与第二空间976分开，且在第一空间974和第二空间976之间形成开口978。开口978的尺寸构造成接纳显示器20a，以使当显示器20a沿墙972对齐时，基本上封住开口978。请具体参见图52，在本实施例中，立柱980和982从包括显示器20a的一部分的壳体的上端和下端向上和向下延伸，并接纳在由安装在开口978中的框架构件999所形成的枢转孔993和997或凹进部内。当这样地安装时，显示器地送递小体积材料的插管设计。
发明内容本发明通过提供减小或消除被送递材料的回流和/或损失的插管设计解决了这些和其他问题。在一个方面中，本发明涉及用于将试剂送递到动物中的目标组织的插管。在一些实施方式中目标组织是中枢神经系统(例如脑)。在一些实施方式中试剂是生物活性剂。在一个实施方式中，插管包括外部台阶设计(extemalstepdesign),其中与待送递的材料接触的插管的直径在沿其长度的限定点逐步减小。在一个方面中，本发明包括台阶式插管，所述台阶式插管具有外径，远端，近端，和在近端和远端之间延伸的管腔，所述台阶式插管包括两个或以上的同轴布置的管段(segment),每个管段具有限定插管的外径的外径，其中管段的外径是不同的。在某些实施方式中，外径具有台阶配置(stepconfiguration),而与材料接触的内表面并不具有台阶配置。在这里所述的任一实施方式中，直径的减小可以沿着由近到远的方向(即，在插管的近端的台阶具有最大直径，在远端的台阶具有最小直径)。沿着外径可以有任何数量的台阶，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO甚至更多。在这里所述的任一实施方式中，从台阶到台阶的台阶直径可以增加相同的量(即，相邻台阶之间的直径差一致)。备选地，在这里所述的任一实施方式中，台阶的直径差可以沿着插管的长度从台阶到台阶变化。另外，这里所述的任一实施方式中，台阶之间的距离可以是相同的或者它可以变化。在一个实施方式中，插管具有下面在例1中和参考图3A和/或3B所述的结构和尺寸。这里所述的插管可以由任何材料制造，包括金属，金属合金，聚合物或它们的组合。在某些实施方式中，插管包括不锈钢外表，所述不锈钢外表带有接触待送递产品的非不锈钢表面。例如，插管的管腔的表面(其与待送递的材料接触)可以由不锈钢上的聚合物涂层组成。备选地，插管进一步可以包括延伸通过插管的管腔的一个或多个管，例如包在插管的不锈钢外套筒中的熔融石英管，使得在使用中产品接触熔融石英管的内表面而不是不锈钢。如上所述，与待送递的材料接触的表面可以具有或不具有台阶配置。在又一实施方式中，如图3A和3B中所示的插管从下述材料被构造。在这里所述的任一插管中，插管可以包括两种或以上的材料。在某些实施方式中，不锈钢插管围绕熔融石英管，其中待送递的材料所接触的表面是硅石英。在其他实施方式中，不锈钢外表围绕熔融石英内表面，其中待送递的材料所接触的表面是熔融石英。在优选的实施方式中插管具有如例1中所述和图3A和3B中所示的结构，尺寸并且由例1中所述和图3A和3B中所示的材料制造。在另一方面中，本发明包括插管组件(cannulaassembly),所述插管组件包括这里所述的任一插管和包括将通过插管送递的一种或多种材料的储器，所述储器可操作地连接到插管的管腔。所述一种或多种材料(例如可能是治疗配方)在这里也被称为"一种或多种产品"。在某些实施方式中，储器包括注射器。进一步地，在这里所述的任一系统或组件中，插管和/或储器可以可操作地联接到一个或多个泵(例如注射器泵)。在某些实施方式中，插管通过延伸通过插管的管腔的管可操作地联接到一个或多个泵。在某些实施方式中，这里所述的系统进一步包括立体定向架(stereotacticframe)(例如参见图5)。这些系统所送递的材料可以包括一种或多种生物活性剂(例如AAV载体，蛋白，药物等)，染料，示踪剂，标记物，造影剂或它们的组合。此外，所述系统可以用于送递到身体的任何部分，最优选地送递到动物的脑。在一个实施方式中，本发明提供了一种具有减小的滞留体积的插管。在另一方面中，本发明包括将一种或多种材料送递到受试对象中的目标区域的方法，所述方法包括以下步骤将这里所述的插管或插管组件定位在受试对象的目标区域中；和将一种或多种材料通过插管送递到目标区域。在某些实施方式中，目标区域在中枢神经系统例如脑中。鉴于这里的公开，本领域的普通技术人员将容易想到本发明的这些和其他实施方式。图1是包括这里所述的台阶式插管2的典型系统的总视图。也显示了通过FEPVI级管3内部的熔融石英管1，3联接到插管2的注射器4，和注射器泵5。注射器泵5通过路厄(Luer)压縮接头6连接到管3。图2是包括这里所述的典型台阶式插管10的另一典型系统的侧视图。也显示了注射器泵16和注射器15，所述注射器通过延伸通过FEP(特氟纶)管13的管腔和插管10的熔融石英管12在路厄(Luer)压縮接头14联接到插管10。图3A描绘了显示包含在这里所述的典型注射针子组件(sub-assembly)(INSA)的组装中的典型步骤的侧视图。图3B-1至3B-6是描绘包含在这里所述的典型注射针组件(INA)的组装中的各种步骤的侧视图。图4描绘了带有附连注射器的典型Medfusion2010i注射器泵的总视图。图5是这里所述的典型插管的总视图，所述插管附连到用于将产品投递到人类受试对象的立体定向框架。图6是这里所述的另一典型插管的总视图。图7的画面A-D描绘了在用于例2所述的实验中的猴子的全(组织)包埋的脑截面中芳香左旋氨基酸脱羧酶(AADC)的免疫组织化学染色的结果。显示了输注后5.5周时通过输注部位的脑冠状截面。画面A，B，C禾[lD代表在例2中分析的四个不同猴脑[MR15102M(A)，MR15109M(B)，R23700M(C)和R211101M(D)]。所有左脑半球接受变速输注，所有右脑半球接受非变速输注。黑箭头指示壳核区域。图8的画面A和B描绘了在输注后5.5周时用于例2所述的实验中的猴脑的壳核内AADC的免疫组织化学染色的高倍放大图像。在图8A中显示了来自接受变速输注的脑半球的典型截面，在图8B中显示了来自接受非变速输注的脑半球的典型截面。标度条代表100pm。图9的画面A和B用5倍放大描绘了在用于例2的实验中的代表动物R211101M的壳核内的苏木精和伊红(H&E)染色截面。动物R211101M在右脑半球(图9A)中使用非变速输注程序和在左脑半球(图9B)中使用变速输注程序接受AAV-hAADC-2的双侧CED。图像示出了邻近插管轨迹的区域，并且在中尾壳核水平被拍摄。标度条代表楊(im。具体实施方式本发明涉及用于将材料(例如包括潜在治疗剂的配方)送递到动物的目标组织例如脑的新式插管。这里所述的插管大大减小或消除了送递期间的材料回流。这样的材料在这里通常被称为"产品"。更具体而言，本发明允许产品送递到受试对象的脑中的明确限定的位置，并且沿着针迹的产品回流最小，滞留体积最小，在插管的内表面的产品损失最小。在本发明的一个实施方式中，插管具有台阶设计，其中插管的直径在沿其长度的限定点逐步减小(从近侧到远侧区域)。因而，在优选的实施方式中，最小的插管直径在插管的最远侧部分。如上所述，该台阶设计减小了沿着针迹的产品回流。在一个实施方式中插管的外表面包括外径不同的五个管段，形成四个台阶，在另一实施方式中它具有下述的结构和尺寸。如图3A和3B所示的实施方式中那样，插管的表面可以是平滑的。图1显示了包括带有不锈钢外表的台阶式插管2的典型系统的总视图。熔融石英管1，3延伸通过插管2的管腔并且通过注射器4上的针座和/或钝头针6将插管2联接到注射器4。注射器4也附连到计算机化注射器泵5。插管包括用于减小或消除待送递的材料回流的装置，例如延伸通过台阶式插管的管腔并且与待送递的材料接触的管(例如熔融石英)。图1中描绘的典型实施方式显示了总共具有四个"台阶"的插管2。显而易见的是最靠近插管的远端的台阶是首先进入目标组织的那些台阶，因此进入目标组织(例如脑)的台阶数量将取决于达到受试动物中的所述目标所需的穿透深度。关于送递到脑，考虑到正被处理的动物的大小和正作为目标的脑内的位置，操作者可以容易地确定合适的穿透深度。如图1所示，沿着插管的长度，插管2的外径以从近端到远端的方向在每一个台阶处减少。如此处使用的，近端指临近从其施予产品的注射器4的点，而远端指临近产品递送的最后末点的点(例如目标组织)。图1描绘了一个典型的实施方式，其中邻接最近侧台阶的两个最近侧管段具有近似相同的长度，而四个最远侧管段具有彼此之间和与两个最近侧管段之间不同的长度。因而，将显而易见台阶之间的一些、所有管段可以具有与其他管段相同的长度或者没有管段与其他管段的长度相同。在下表中显示了可以用于插管和/或包括插管的系统的各种部件的材料的非限定性例子部件(参考图1)部分来源组分产品接触在插管的远乂而的官1在尖端的熔融石英Polymicro硅石英和聚酰亚胺涂层是；仅仅在硅部分插管223G-15G的钢管Ranfac不锈钢否将插管2连接到注射器4的管3*熔融石英管Polymicro硅石英和聚酰亚胺涂层是；仅仅在硅部分注射器4注射器BDUSPVII级聚丙烯是泵5泵Medfusion多种材料否路厄接头6路厄针座/钝头针(来自23Gxl附)BD(USPVII级聚丙烯)和不锈钢是接头**胶接接头Locktight氰基丙烯酸酯是承FEPVI级管内的熔融石英。FEP管并不具有产品接触**1和2之间；2禾Q3之间；3禾口6之间图2显示了类似于图1中所示的典型系统的总视图。图2中所示的实施方式包括带有熔融石英管12的台阶式不锈钢插管10，所述熔融石英管穿过不锈钢插管的管腔并且延伸超出插管的远端10。在图2中也显示了覆盖熔融石英管12的管(FEP)13，以及路厄压縮接头14和在熔融石英管12和FEP管13之间的1英寸的不锈钢(23ga)。路厄压缩接头14连接到注射器15，所述注射器转而连接到泵16。在下表中阐述了可以用于制造例如图2中所示的实施方式的典型材料和这些材料的典型商业来源<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如图所示，在某些实施方式中，管延伸通过插管的管腔并且待送递的一种或多种产品通过该管被送递。在包含管的实施方式中，管可以与插管的远端齐平。备选地，在优选的实施方式中，管从插管的远端延伸。在这样的实施方式中，管的延伸量取决于应用而变化。通常，管将从插管延伸大约1mm至大约1cm(或者它们之间的任何长度)，更优选地大约1mm至大约50mm(或者它们之间的任何长度)，甚至更优选地大约lmm至大约25mm(或者它们之间的任何长度，包括但不限于lmm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、llmm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm)。在一个优选的实施方式中，管延伸超出其远端大约10mm。如图中所示，延伸通过插管的管可以在一个或多个区域中具有一个以上的涂层或围绕材料，例如用以保护管免于与待送递的产品接触。因而，在某些实施方式中，管(例如FEP(特氟纶)管)保护延伸超出不锈钢插管的近端的熔融石英管部分。熔融石英管可以通过任何合适的装置连接到注射器，包括但不限于路厄压縮接头，并且注射器由注射器泵(人工的，电子的和/或计算机化的)驱动。显而易见的是注射器的尺寸可以由操作者选择以送递合适量的一种或多种产品。因而，可以使用lmL，2.5mL，5mL，甚至更大的注射器。在某些实施方式中，路厄压縮接头包括在熔融石英(内)管和FEP(外)管之间的1英寸不锈钢23G间隔物。可选的间隔物在路厄压縮接头提供机械刚性并且当使用Loctit浐粘合剂将套圈粘合就位时帮助密封内外管之间的间隙。该间隙必须被填充以当产品正被投递到受试对象时防止其进入内外管之间的空间。优选地，间隔物的近端仅仅代表这里所述的系统和插管的不锈钢产品接触表面。需要吋通过应用Loctit^粘合剂或其他涂层以覆盖间隔物的另外暴露端可以消除该极小的不锈钢产品接触表面，从而提供绝对不与产品接触的不锈钢系统。备选地间隔物可以由不同材料组成。图3A描绘了制造这里所述的台阶式插管的选定典型步骤。也参见例1。特别地，减小回流的台阶设计插管可以以箭头所示的顺序(从顶部到底部)进行组装，即通过加入直径递增的部件(20，22，24，26，28，30)。因而，如例1中所述，各种长度的管段接合在一起以形成台阶设计。当插管由两个或以上的构件制造时，接头应当不允许材料从插管泄漏到目标组织中，反之亦然(从目标组织泄漏到插管中)。因此，接头优选被密封。可以用各种方式密封接头，包括但不限于焊接(例如激光焊接)，粘合剂，密封剂，加热(例如对于热塑聚合物)和它们的组合。显而易见的是，密封的性质将取决于用于制造插管的材料，例如焊接可以用于不锈钢插管，而加热可以用于热塑聚合物。这里所述的台阶设计插管也可以形成单一整体构件，例如通过如这里所述注射模塑台阶式插管。图3B1-6描绘了这里所述的典型台阶式插管的组装。如例1中所述，通过去除针套32和通过插管35插入内管部件40直到它从插管的末端延伸来制备图3A中所示的台阶式插管35(图3B-1)。任何材料可以用于内管部件40，包括但不限于熔融石英管。作为管的备选，显而易见的是钢制插管35的内部可以涂有与待送递的产品接触的一种或多种材料，由此减小送递期间到钢制插管的产品损失。涂布不锈钢材料的各种技术是已知的并且可以被使用。任选地，可以将粘合剂放置在管40上使得管被固定到针头。可以使用任何合适的粘合剂，例如Loctit^粘合齐!j。优选地，粘合剂的粘结强度至少大约为41bs，更优选地至少大约为51bs。在图3B所示的实施方式中，针套32可以被放回并且预先被截长度的管31(例如FEP管)在通过插管35的熔融石英管40上延伸(图3B-2)。外管31的长度可以由标示确定并且在长度上可以从IO英寸变化到5码(或者它们之间的任何值)。因而，在某些实施方式中，外管覆盖内管的全长并且可以延伸超过内管。备选地，在其他实施方式中，外管31并不在内管40的长度上完全延伸(图3B-2)。任何合适的粘合剂可以用于将外管31固定到组件，例如在外管31的末端。粘合剂的粘结强度优选地至少大约为5lbs。如图3B-3中所示，一个或多个间隔部件47可以插入到内和/或外管40、31上。间隔物47可以由任何材料制造，包括金属，金属合金，聚合物和它们的组合。在某些实施方式中，间隔物47包括不锈钢。间隔物47可以具有任何长度，尽管它优选地延伸并不超过针头。任选地，可以包括一个部件以帮助密封组件的部件，例如一段长度的PVC收縮管49。对于间隔和PVC管部件的典型尺寸参见例1。随后，组件可以安装在允许它方便地联接到产品送递储器的一个或多个部件。例如，如图3B-4中所示，适当尺寸的阴路厄压縮接头50在一段长度的外管31上滑动并且将套圈51放置在外管31上，优选地使得它与外管31的末端齐平。可以任选地将粘合剂应用到一个或多个部件(例如在将套圈安装到所述末端上之前和/或在密封内管、间隔物、外管和套圈之间的接头之前应用到外管的所述末端的外部)。例如通过在管上划线并且折断或截断它和安装在路厄压縮接头50内部的套圈51，可以去除从套圈51延伸的内管40的长度(图3B-5)。可以加热收縮管49以密封接头。最后，可以将阳路厄压縮接头55组装和安装到阴路厄压缩接头50和套圈51上。如上所述，这里所述的台阶式插管可以由生理可接受的各种材料制造，包括但不限于金属，金属合金，聚合物，有机纤维，无机纤维和/或它们的组合。在优选的实施方式中，插管包括不锈钢(例如316SS或304SS)。任选地，产品接触表面(例如管或涂层)可以延伸通过插管的管腔。各种材料也可以用于任选的产品接触表面，包括但不限于金属，金属合金，聚合物，有机纤维，无机纤维和/或它们的组合。优选地，产品接触表面不是不锈钢。在这样的实施方式中，外插管必须仍然由与目标组织可生理相容的材料制造，但是由于没有产品接触，因此它不需要与生物活性剂或产品配方相容。类似地，与管材料是否与生物活性剂或产品配方相容无关，在这样的实施方式中图中所示的FEP(特氟纶)管可以用其他管替换。因而，在一个实施方式中，插管的产品接触表面包括或由熔融石英组成(例如硅石英和聚酰亚胺涂层)(Polymicro，Phoenix，Arizona)。与其中所述产品暴露于不锈钢的现有技术的插管相比熔融石英用于产品接触表面大大减小了产品损失。的确，尽管59±14。％的腺伴随病毒载体从用产品预冲洗的现有技术的注射设备回收(recovery),但是即使在没有预冲洗的情况下也有101±6%从包括本发明的插管的设备回收。参见例2。本领域的技术人员将认识到除了熔融石英之外的材料可以用在本发明的插管中，只要这样的材料具有所述生物活性剂的低表面相关损失的性质。由其他材料制造的管可以用于替换熔融石英管，或者备选地插管的管腔可以涂有一种物质以获得实质相同的结果。将使用的任选材料可以取决于生物活性剂的性质而变化，并且可以由实验决定。由于表面积与体积的比率增加，因此使用具有小内径(ID)的管例如ID为100pm的熔融石英管可以期望减小而不是增加样本的回收。或许令人惊奇的是，使用小ID熔融石英管并不导致被送递产品例如AAV载体的巨大损失。不想受到理论限制，当使用更小的ID管保持给定送递速度(单位时间送递的产品体积)恒定时导致的线性流率增加可以解释所述结果。另外，AAV似乎对于熔融石英的表面具有很小的亲合力，这可以解释低损失。用于例1中的熔融石英管的小ID具有减小系统的滞留体积的附加优点。例如，ID为lOOjim的熔融石英管的四英尺长的管段具有小于的管腔体积。这样的小体积减小了样本消耗并且由于送递系统的滞留体积而显著减小了样本的浪费。当生物活性剂难以获得和/或价格昂贵时，例如许多重组蛋白或基因治疗载体，产品浪费的减少是特别有用的。图4描绘了可以与这里所述的插管组合使用的典型注射器泵的总视图。在图4中显示了注射器鞍座60，注射器夹62，注射器夹槽(保持器)64，离合杠杆66，注射器驱动器68，注射器柱塞保持器70，液晶显示器72和通/断开关74。在带有这里所述的插管的系统中有用的注射器泵在商业上可获得，例如名称为Medfbsion2010KMedex，Inc.，Carlsbad,California)。图5描绘了包括这里所述的附连到立体定向架72的插管70的系统的总视图。插管70也可以附连到注射器泵，例如通过管74。立体定向架在商业上可获得，例如Lexell立体定向架(RanfacCorp.，Avon，Mass.)。在这里所述的任一系统中，产品接触部分可以包括硅石英(插管中的熔融石英管)，USPVII级聚丙烯(注射器和路厄针座)，氰基丙烯酸酯(胶接接头)，和不锈钢(23G间隔物)。典型地，这里所述的系统能够将产品送递到脑并且与使用先前所述的系统相比远远更少地暴露于不锈钢，其中产品沿着插管全长的一些或全部与不锈钢接触。如本发明的设备和系统中所提供的产品暴露于不锈钢的减少减小了损失。例如，如图1的系统中所配置的图3B-6中所示的插管具有几乎全部包括熔融石英管和USPVII级聚丙烯注射器的产品接触表面。仅有的其他接触表面是熔融石英管的近端和注射器的路厄针座之间的胶接接头，在所述位置产品接触氰基丙烯酸酯胶粘剂和不锈钢间隔物的近端的横截面表面。在该系统中很少暴露于钢。本发明的插管也可以组合台阶设计和内部熔融石英产品接触表面以提供回流减少、试剂的表面相关损失减少和滞留体积减小的改进插管。本发明的插管可以使用本领域中已知的技术进行消毒，例如通过标准环氧乙烷。已消毒插管可以任选地被单独包装在Tyvd^袋中。可以使用本发明的插管进行送递的试剂包括可以在目标组织中具有预期作用的任何材料。例如，治疗药物，蛋白，质粒或基因治疗载体可以被送递到受试对象的脑中。也可以加入非治疗剂，例如用于成像、诊断或研究目的的染料，示踪剂，造影剂和标记物。例如，描述了逆转录病毒基因治疗系统。例如参见美国专利No.5,219，740;Miller禾口Rosman函rec—腦(1989)7:980:990;Miller,A.D.，if聰awG膨T77er卿(1990)l:5-14;Scarpa等人，肠/ogy(簡)180:849-852;Burns等人，/Voc.jVa".Jcac/.Sc〖'.(1993)90:8033-8037和Boris-Lawrie和Temin，Cwk(9;/".Deve/o;(1993)3:102-109。也描述了许多腺病毒载体。例如参见美国专利Nos.6，048,551，6,306,652，Parks，R丄，Clin.Genet.(2000)58:1-11;Tsai等人，Curr.Opin.Mol.Ther.(2000)2:515-523。另外，各种腺伴随病毒(AAV)载体系统已被开发用于基因送递。AAV载体可以使用本领域中公知的技术容易地被构造。例如参见美国专利Nos.5，173,414和5,139,941;国际公开Nos.W092/01070(公开于1992年1月23日)和WO93/03769(公开于1993年3月4日)；Lebkowski等人，Afo/ec.Ce〃.Ao/.(1988)8:3988-3996;Vincent等人，Kacc/"es90(1990)(ColdSpringHarborLaboratoryPress);Carter,B.J.，Cw/re/^Qp/w'ow/"(1992)3:533-539;Muzyczka，N.，Cwre"/r—cs/"Mt'craZ/。/.朋(i/w扁朋/.(1992)158:97-129;Kotin，R.M.，i/w應wGeweT7zer，(1994)5:793-謝；Shelling禾QSmith,G麼T7zer，(1994)1:165-169和Zhou等人，J(1994)179:1867-1875。本发明的插管可以用作向CNS投药的常规增强送递(CED)系统的一部分。例如，其全部公开内容被结合于此以作参考的美国专利No.6,309,634描述了基因治疗的方法，其中试剂通过CED被送递到中枢神经系统的区域。使用CED，重组体载体可以被送递到在CNS的大面积上的许多细胞。而且，被送递载体在CNS细胞(例如神经胶质细胞)中有效地表达转基因。本发明的插管可以与送递重组体载体的任何常规增强送递设备一同使用。在一个实施方式中，所述设备是渗透泵或输注泵。渗透和输注泵两者都可以在商业上从各种供应商获得，例如Alzet公司(Cuperino，California),Hamilton公司或Alza有限公司(PaloAlto，California)。本发明的插管也可以用于直接注射或其他不是CED的输注方法。产品可以以各种流速被送递到目标组织，包括但不限于0.2，0.5,0.7，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0，10，15或20(il/min。参考图1A和2A中所示的实施方式，由于在这样高的流速下过大的反压，因此使用ID为100|im的四英尺熔融石英管难以获得10-20|_il/min以上的流速。然而这并不代表在相对较低流速下优选执行的常规增强送递方法的严重限制。由于泵缺少足够慢的设置，因此使用图1A和2A中所示的系统难以获得低于0.2^/min的流速，但是本领域的技术人员将能够使用不同的泵和/或注射器配置获得这样低的送递速度。在整个送递过程中流速可以增加、减小或保持稳定，因此当产品被送递到目标组织时产品的压力可以增加、减小或保持稳定。在优选的实施方式中，在整个送递过程中流速可以保持基本恒定，而不是"斜线上升"到稳定水平。典型地，重组体载体通过CED设备如下被送递。将本发明的改进插管插入到选定受试对象的CNS组织中。立体定向图和定位设备例如可以从ASIInstruments,Warren，MI获得。也可以通过使用由CT和/或MRI成像获得的解剖图进行定位以帮助将注射设备引导到选定目标。例2-5公开了使用本发明的插管将编码hAADC的基因送递到人、大鼠和非人类灵长类动物的脑。hAADC基因的送递在帕金森氏症(PD)的治疗中可能是有帮助的。PD的部分特征在于黑质中的多巴胺能神经元逐渐损失和壳核中的多巴胺严重减少(Hor，^evWcz^975^Ato7Tmf.Dn^^6w化i饥Mo"o^Ser.(3):13-21)。AADC是多巴胺生物合成途径中的一种酶，其将左旋多巴转换成多巴胺。以前的研究表明编码人类AADC的cDNA转移到大鼠或非人类灵长类动物壳核可以减少PD的动物模型中的有效左旋多巴剂量，由此将纹状体多巴胺获得到正常水平(Bankiewicz等人(2000)五x/.7Vewra/.，164(1):2-14;Sanchez-Pernaute等人(2001)Mo/.J7^r.，4(4):324-30)。在人类PD患者中，期望该治疗降低左旋多巴要求和延长观察到药物的有益临床效果的持续时间。例2与附表和附图一起提供了使用本发明的插管(临床设备B)将基因送递到灵长类动物的脑的实验方案(protocol)和实验结果。将编码hAADC(AAV-hAADC-2)的rAAV病毒体输注到四只正常恒河猴的壳核中并且通过免疫组织化学确定AADC表达的分布。检验两个输注实验方案变速程序(从0.2pL/min逐步慢速增加到lpL/min)，和在l^L/min的恒定速度下的非变速输注。在输注后5.5周的初步端点进行输注程序的安全评价和转基因表达的评估。载体输注后的临床观察表明在研究期间没有行为异常。用变速或非变速输注程序未观察到总体病症的差异。组织病理学在两个组中是相当的，仅仅发现响应插管放置和载体输注沿着针迹出现轻微局部炎性组织反应。另外，AADC免疫组织化学证明载体分布于整个壳核，用两种输注程序在免疫染色的体积中没有明显差异。对抗AAV2载体的血清抗体水平在输注后出现微小增加。以下例子仅仅被提供用来举例说明本发明的实施方式，而不是限定或限制本发明。例l组装和包装程序A.典型插管#1如下生产一种典型的台阶式插管(例如如图3A和3B中所示)。将不锈钢管段截成一定长度并且使用LasagNd:YAG或NeodiniumYAG(钇铝石榴石)激光器(一种波长范围在454nm的紫外激光器)进行焊接。检验23G和19G管段之间的焊接无渗漏并且检验所有焊接接头耐受IOlbs的最小牵引力。23G和19G管段之间的焊接应当是无渗漏的以防止可能向上回流到针头外部的任何产品渗漏到插管的管腔中。由于相同的原因，熔融石英管的暴露远端和插管的钢管部分之间的胶接接头应当是液密的。当激光步骤完成之后钝化和用超声清洁针头。将熔融石英管截断并且用氰基丙烯酸酯胶粘剂组装到不锈钢插管。将BD针座附连到管的远端以完成组装。在包装之前，将塑料针套放置在插管的近端上以保护尖端，然后将整个组件包装在预先标记的丁7^乂@袋中进行消毒。通过在管的芯管段20(9.67英寸长，23RW截断，0.0250/0.0255OD,0.0125/0.0140ID，0.006壁厚)上滑动不锈钢管的连续管段组装注射针子组件(INSA)。参见图3A。用英寸提供涉及内径(ID)，外径(OD)和管壁厚("壁厚")的所有尺寸，并且成对值X/Y代表最小和最大允许误差。现在参考图3A，将管段22(8.28英寸长，19RW截断，0.0415/0.0425OD,0.0255/0.0285ID，0.0075壁厚)放置在芯管段20上以留下0.390英寸(10mm)延伸超出管段22的远端的芯管段。将管段24(6.31英寸长，17RW截断，0.0575/0.05850D，0.0405/0.0435ID，0.008壁厚)放置在管段20和22上以留下1.970英寸的延伸超出管段24的远端的管段22。将管段26(6.31英寸长，15RW截断，0.0715/0.0725OD,0.0595/0.0615ID，0.006壁厚)放置在管段20、22、24上以留下1.970英寸的延伸超出管段26的远端的管段22。将管段28(6.31英寸长，0.086/0.087OD,0.0735/0.0750ID，0.006壁厚)放置在管段20、22、24、26上以留下1.970英寸的延伸超出管段28的远端的管段22。将管段30(1.58英寸长，O,磨O.llOOD，0.0880/0.0895ID，0.010壁厚)放置在管段20、22、24、26、28上以留下7.090英寸的延伸超出管段30的远端的管段20。所有部件用激光焊接就位。使管段20和22之间的远侧焊缝100%气密，并且检验管段1的内部以保证没有阻塞(例如使用0.012英寸直径的丝线或套位针(gagepin))。所有的焊接接头必须耐受10磅的最小牵引力。一旦被组装，如下钝化和用超声清洁INSA:用Oakite铝清洁10分钟，用去离子水喷射清洗7分钟，在酒精中用超声清洗，风干。将针套32(9.0英寸长，0.156OD,0.104/0.108ID，0.025壁厚)放置在组装管段20、22、24、26、28、30上以留下0.8英寸的延伸超出组装管段的近端的管段30。如下检查INSAs无酸和清洁溶液的痕迹去除针套32，浸泡在酒精浴中，放回针套32，通过针套7的远端吹风，检査管段20的近端的液体流出物，重复直到所有流出物看上去是清洁的。检査INSA的远端以保证它是直的。图3B示出了如这里所述的典型注射针组件的组装。如图3B-1中所示，如上所述从INSA35去除针套32，通过INSA35的23G芯管15拧入一段长度的熔融石英管40，从近端开始，直到延伸超出INSA35的远端大约2英寸。将Loctit^粘合剂(Loctite⑧Prism⑧4011粘合剂，低粘度)应用到暴露的熔融石英管40，然后縮回熔融石英管直到大约1英寸保留在INSA的远端之外，同时旋转INSA以均匀地分布粘合剂。粘合剂粘结的粘结强度至少为5磅。修剪暴露熔融石英管使得保留0.3卯英寸(10mm)从INSA的远端延伸，并且放回针套32。准备48英寸长的FEP(特氟纶)管(1A60D，0.030ID)31，两端浸入Loctit^引物(Loctite7701引物)中并且风干。通过FEP管拧入熔融石英管40的近端。将Loctit^粘合剂应用到INSA的近端。在INSA的针端上快速地推动FEP管31的远端。粘合剂粘结的粘结强度至少为4磅。如图3B-3中所示，将23G不锈钢间隔物47(1英寸长，23RW)放置在熔融石英管40上。将Loctit浐粘合剂应用到熔融石英管40的外部和间隔物47的外部，并且将间隔物47插入到FEP管31的近端直到近端齐平。在FEP管31的近端上滑动0.5英寸长的PVC收縮管49的管段((U25ID)。如图3B-4中所示，然后在FEP管31的近端上滑动1/16阴路厄压缩接头50并且在FEP管31的近端之上大约1英寸放置套圈51。将Loctit^粘合剂应用到FEP管31的外部并且推动套圈51以将套圈的近端放置成与FEP管31的近端齐平。应用Loctite⑧粘合剂以密封熔融石英管40，间隔物47，FEP管31和套圈51之间的接头。划线和折断延伸超出套圈51的近侧剩余熔融石英管40。如图3B-5中所示，将套圈51妥贴地安置在路厄压縮接头50中(3磅的最小牵引力)，然后在INSA35的近端和FEP管31之间的接头上热收縮热收縮管49。检验组件的漏气，并且将阳路厄帽55加入到压縮接头50。(图3B-6)。组装的INA然后可以被包装和密封到带有标签的Tyvd^袋(4x23英寸)中，并且放置在标记盒中进行存储和运输。尽管管31由特氟纶FEP制造，本领域的技术人员将认识到可以使用任何合适的管材料，或者管可以完全被省略。FEP管31作为熔融石英管40的保护装置被包括，用于帮助保证系统的操作者可见很薄的熔融石英管。这些功能都不是必要的。另外，由于FEP管并不接触材料，因此可以不考虑生物相容性而使用其他材料的管。如这里所述生产的成品插管包括五层不锈钢管，其长度超过6.31英寸(例如所述长度包括管元件28)，内径为0.0125-0.0140英寸，外径为0.086-0.087英寸。该插管沿着该管段具有相当大的刚性，这防止当插管插入到目标组织(例如脑)中时挠曲。另外，第六层钢管30在1.58英寸的管段上为插管增加了更大的强度，这防止当插管在使用期间安装到立体定向架中时被压碎或变形，如图5中所示。B.典型插管#2类似于例1A中所述的插管生产另一种插管。如图6中所示，插管80由在台阶设计中通过激光焊接熔融在一起的四层304外科钢组成，终止于30号管。钢插管(首尾大约24.6cm，包括针尖)与lOOpm内径的熔融石英82成直线，所述熔融石英也通过延伸超出钢lcm形成送递设备的尖端。覆盖有特氟纶管84的大约1.2米(122cm)的附加熔融石英82连接到路厄针座86。熔融石英和特氟纶管之间的1英寸的30号钢间隔物88用医用级氰基丙烯酸酯胶粘剂密封和附连到路厄针座。例2将编码AADC的重组体病毒载体送递到灵长类动物的脑如下制备编码人类AADC(AAV-hAADC-2)的重组体AAV载体并且将其送递到恒河猴的壳核。重组体载体生产通过三重转染实验方案生成重组体AAV2(Matsushita等人(1998)rAw，5(7):938-45)。简单地说，当来自HEK293工作细胞库的细胞通过在包含10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM的一次性培养器具中的一系列扩张之后，细胞与三种质粒(pAAV-hAADC-2，pHLP19和pladno5)共转染。rAAV-hAADC-2载体克隆与前述相同(Sanftner等人(2004)Mo/.T7ze。9(3):403-9)。在美国专利Nos.5,139,941;5,622,856;6，001，650和6,004,797中更完整地描述了质粒pHLP19和pladeno5，上述专利的全部公开内容被结合于此以作参考。在合适的转染时间之后，用无血清培养基替换包含转染试剂的培养基并且进一步培育细胞以允许载体生产。细胞被采集，通过离心分离被浓縮，并且通过冷冻/解冻法被溶解以释放AAV-hAADC-2载体。当离心分离以去除细胞碎片之后，溶解物用Benzonas^氯化钙进行处理，并且用聚乙二醇进行沉淀。通过在氯化铯中进行两轮等密度梯度超速离心纯化载体。浓縮AAV-hAADC-2，并且用包含5%山梨醇的无菌缓冲盐水(PBS)进行透析。加入Poloxamer188(0.001%)，材料进行消毒过滤(0.22pm)，并且在-70。C冷冻存储。通过SDS-PAGE评估载体纯度。用在该研究中的纯化rAAV2载体通过SDS-PAGE凝胶的银染色仅仅显示了VP1，VP2，和VP3。滴定度由载体基因组的实时Q-PCR分析确定。手术程序在手术前在每个猴子上执行磁共振成像(MRI)以识别立体定位坐标(stereotaxiccoordinates)(基于壳核的解剖结构)。在每个脑半球中以两个部位作为目标，一个部位居中于前壳核(rostralputamen)中，另一个部位在尾壳核中。成年恒河猴(n二4)用氯胺酮(Ketaset,10mg/kg，肌内注射)禾卩Valium(0.5mg/kg，静脉注射)进行固定，进行插管并且供手术备用。以2mL/kg/hr的速度静脉送递等渗流体。引入5^v/v异氟烷(Aerane,OmedaPPD，Inc.，Liberty,NewJersey)的麻醉剂，然后在手术期间保持在r^-3^v/v。将动物的头放置在MRI相容立体定向架中。在程序期间用循环水毯保持核心温度，同时连续监视心电图，心率，氧饱和度和体温。在颅骨中用牙钻制造钻孔以暴露恰好在目标部位之上的硬膜区域。通过CED输注AAV-hAADC-2(Lieberman等人(1995)，82(6):1021隱9;Bankiewicz等人(2000)￡平脸"ra/.，164(1):2-14)。每个猴子总共接收在四个部位上散布的3xl0"vg的200nL(每个部位50pL，每个脑半球两个部位)。手动地将输注插管引导到每个脑半球中的壳核，并且动物接收AAV-hAADC-2(1.5x10'2vg/mL)的双侧输注(即顺序输注到两个脑半球中的前和尾部位)，在脑左半球的输注速度为0.2pL/min(10min)，0.5(iL/min(10min)，0.8(iL/min(10min)禾卩ljiL/min(35min)，在脑右半球的恒定速度为1^L/min(50min)。每个动物的实际立体定位坐标为MR15101M前壳核AP:18，ML:士10.5，DV:20，尾壳核AP:15，ML:±13，DV:20，R211101M前壳核AP:24，ML:±12.5，DV:20，尾壳核AP:21，ML:士13.5，DV:20，MR15109M前壳核AP:12，ML:土13，DV:20，尾壳核AP:15，ML:±12，DV:20，R23700M前壳核AP:21，ML:士13.5，DV:21，尾壳核AP:24，ML:士12.5，DV:20。在输注之后大约10分钟，去除插管，闭合伤口部位，并且监视猴子从麻醉恢复然后返回到它的居住笼子中以进行继续观察。组织学和免疫组织化学为了组织学研究，通过心内盐水输注之后用10%的中性缓沖福尔马林(NBF)灌注动物。然后取出脑并且在脑模具中切片成冠状切块(coronalblocks)(8-10mm)。通过浸入到10X的NBF固定剂中固定收集的脑切块。在固定后2-3天将组织切块转移到上升浓度的PBS/蔗糖溶液(10、20和30%)中3-5天时间以上。在异戊垸浴中冷冻脑，在干冰上冷却并且在恒冷器上连续切割成40pm厚的冠状切片。每个第十个切片用苏木精和伊红(H&E)溶液(RichardAllenScientific,Kalamazoo,MI)染色供组织病理分析。在自由浮动切片上用AADC特异的一抗(Chemicon，Temecula，CA，1:1,500)执行免疫组织化学。在3%的过氧化氢中孵育切片30分钟以猝灭内源性过氧化物酶。当用10%的正常山羊血清阻滞非特异性结合之后，在室温下在一抗中孵育切片过夜，然后在室温下使用生物素化抗兔IgG抗体(VectorLaboratories,Burlingame，CA，1:300)和抗生蛋白链菌素共轭辣根过氧化物酶(VectorLaboratories,1:300)各1小时。用3-3，-二氨基联苯胺(DAB，VectorLaboratories)和过氧化氢显示复合物。将切片固定至USuperfrostPlus⑧玻片上(BrainResearchLaboratories,Newton,MA)，干燥，在上升乙醇系列中脱水，在二甲苯中清洁，用Cytoseal-XYL(Richard-AllenScientific,Kalamazoo,MI)固定。hAADC免疫染色的前-后分布由公式(nx10x40pm)确定，其中n是带有hAADC阳性细胞的切片的数目，404m是切片的厚度，并且检査每个第十个切片。在系列切片(每个第十个)中评估分布的体积，在配备摄像机和Stereoinvestigator体视软件的Zeiss显微镜(Microbrightfidd，Williston，VT)上在63X的放大倍数下使用基于光学分馏器—光学剥离器设计的立体方法染色AADC。每组的CEE〈5X。结果被报告为平均值士SD。史蒂顿特t检验用于测量统计意义。实时定量PCR用在该研究中的载体AAV-hAADC-2包含人类AADC目标cDNA。实时Q-PCR引物和探针与AADC基因的外显子2和3退火，从而生成在载体序列中不存在的内含子，由此最小化基因组DNA的扩增。用包含插入载体的线性化质粒DNA标准化实时Q-PCR并且如先前所述量化载体基因组(Sommer等人(2003)Mo/.77zw，7(l):122-8)。中和AAV抗体滴定在基于细胞的测定中体外确定血清或血浆的中和抗体(NAb)滴定度。在将混合物加入到96孔板中的即将融合的HEK-293细胞之前在37。C用试验血清孵育编码(3-半乳糖苷酶报告基因(AAV2-LacZ)的限定数目的AAV2载体颗粒lh。对照(100%)AAV2转导被定义为当存在初次接受试验的小鼠血清(NMS)的情况下用AAV2-LacZ转导之后24h在培养中测量的(3-半乳糖苷酶活性。进行NMS中试验血清的半对数系列稀释以确定导致(3-半乳糖苷酶表达的50%或更高抑制的试验血清的最高稀释。每个稀释系列重复三次检验。在每次测定中操作被完善定义的AAV2中和滴定度的参考血浆并且阴性对照(仅仅NMS)用于确定测定背景。NAb的滴定度被定义为保持50%抑制水平的两种稀释，例如1:100-1:316。桥接ELISA用AAV2颗粒包被滴定板(96孔)，然后用试验样本(血清或血浆)孵育。冲洗板，然后用生物素化AAV2颗粒进行孵育，然后用HRP共轭抗生蛋白链菌素进行检测。生物素化AAV2颗粒仅仅可以由在两个AAV2颗粒之间形成桥接的多价抗体俘获。该测定中很低的非特异背景信号允许检验试验颗粒的不稀释或低稀释，并且测定具有比经典ELISA更高的灵敏度，其中试验样本中的一抗由酶联二抗检测。桥接测定允许不同物种和种类的抗体之间的直接滴定比较。用识别AAV2的已知数量的纯化单克隆的小鼠抗体"A20"使测定标准化(Grimm等人，1998)。该测定的量化限度大约为15ng/mL抗AAV2抗体。NAb滴定度为1:100的人样本包含l-10pg/mL的A20等效抗体。通过该测定受到重复试验的65个人样本的平均中间测定变率为23%。实验设计重组体AAV2载体有效地转导脑组织，但是当存在高中和抗体(NAb)滴定度01:1200)的情况下转导水平显著下降(Sanftner等人(2004)iWo/.77^:，9(3):403-9)。所以，选择NAb滴定度^1:100的四只公恒河猴用于AAV2输注(表1)。在送递AAV2之前执行MRI扫描以确定用于载体投递的立体定向坐标。在每个脑半球中(3.0xl0"vg/脑)用50|il1.5xl0"vg的AAV-hAADC-2输液(7.5x10g/部位)双侧车俞注动物。0.2}aL/min(10min)，0.5|iL/min(10min)，0.8(iL/min(10min)和l|iL/min(35min)的上升输注速度(变速)用于脑左半球，而50minlpL/min的恒定速度用于脑右半球。监视动物5.5周，时间间隔满足hAADC表达变得相对稳定。初步端点包括由免疫组织化学确定的AADC表达和由临床观察和组织病理学确定的安全评估。另外，检验在基线和在研究结束时收集的血清样本是否存在抗AAV的中和和全抗体。表l抗AAV血清抗体(NAB)滴定度和桥接ELISA数据<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>输注设备发展和载体回收供人使用的一种原型(prototype)输注设备("临床设备A"，或CDA)由25cm的不锈钢插管组成，所述插管被制造成安装标准Leksdf立体定向架。CDA插管由四层台阶式医用级不锈钢管组成以提供刚性和最小化内部滞留体积。钢制CDA插管通过1.2米的Teflor^管连接到注射器。在高达lpL/min的流速进行载体回收研究表明90%的载体产品吸附到设备(表2)，尽管0.01%的泊洛沙姆(Poloxamer)188作为表面活性剂包括在产品配方中。用载体冲洗设备1小时提高了随后的回收，但是载体损失仍然接近40%。载体吸收的进一步检验包括检验台阶式不锈钢插管，其中产品在2^L/min流速下接触不同管材料。(例子1A和1B)。对于包括与AAV载体接触的熔融石英，Tygon,和硅树脂管的插管，观察到优质的载体回收。诸如钢，特氟纶(PTFE和FEP)和聚酰亚胺这样的其他材料结合相当数量的载体。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>仅仅在低流速下观察到大量载体损失。例如，在特氟纶管中，载体损失与线性流速成反比。在1^1/min的速度下损失百分之九十的载体(4mm/min通过1.2米的管)，而在100pL/min以上的流速下在相同的管中可以获得可接受的载体回收(>80%)。为了最大化线性流速和消除载体与特氟纶和钢表面的所有接触，临床设备的整个芯部顺内径为100pm的熔融石英排列(line)(例子1B，图6)。在该设备中("临床设备B"，或CDB)，钢插管围绕熔融石英以提供刚性，并且熔融石英延伸超出钢插管的尖端10mm(图6)。靠近针尖的两个外部台阶被包括以最小化沿着针迹的潜在回流。1.2米的附加熔融石英将CDB插管连接到路厄针座并且仅仅由特氟纶管覆盖以提供保护。CDB按照cGMP制造和组装并且最终由环氧乙烷气体消毒。用临床前和临床设备通过模仿输注评价载体的定量回收。对于临床前设备，将400|iL的载体溶液从远端抽吸到一段长度的特氟纶管中，然后将特氟纶管耦合到7cm的插管，所述插管由被一件4cm的27号(27-gauge)钢管围绕的熔融石英组成。当在lOOpL/min的速度下充注插管之后，在收集载体供回收测定之前进行附加的20pL冲洗。用可编程注射泵在从0.2到1.(VL/min的流速下(变速程序)从两个设备收集四个样本。如表2中所示，在这些条件下从临床前设备的平均载体回收为63±16%(士SD)。对于临床设备，将AAV-hAADC-2载体稀释到5xlO"vg/mL，装载到注射器中并且附连到设备。在充注之后，在8pL/min的速度下用500pL的载体溶液冲洗临床设备A(62.5min)，而在4pL/min的速度下用50pL的载体溶液冲洗临床设备B(12.5min)。在从0.2到LOpL/min的流速下从每种设备的三个组收集两个50pL的顺序等分试样。通过实时定量PCR(Q-PCR)确定每个样本中的载体浓度。在一小时的延长冲洗之后临床设备A的回收仅仅为60±15%，而临床设备B观察到载体的完全回收(101±6%)。通过确定传染滴定度确认载体样本从临床设备B回收的能力(参见Zhen等人(2004)/7wm.772a，15(7):709-715)。未观察到比活度(感染单位/vg)的显著减小。体内hAADC表达的免疫组织化学和量化在AAV-hAADC-2输注后5.5周在每个脑半球上执行hAADC表达的免疫组织化学分析以确定在用临床设备B进行变速和非变速输注之后载体分布是否不同。所有猴子在壳核内呈现hAADC表达。用明视场显微镜检查系列切片的hAADC阳性细胞。确定所有动物的hAADC转基因阳性细胞的分布体积和前-后(A-P)散布。图7在通过输注部位的横截面中显示了hAADC转基因的免疫组织化学染色。图像是来自动物MR15102M(A)，MR15109M(B)，R23700M(C)和R211101M(D)的整体切片。从尾部视角定向切片，脑右半球在图像的右侧，脑左半球在图像的左侧。在所有动物中，将转基因表达定位到壳核。如图7B中所示除了与输注轨迹成直线的区域之外在皮层区域中未检测到hAADC表达。在左右脑半球的比较中发现AADC阳性细胞数量或hAADC染色强度无差异。来自接收变速输注的脑左半球(图8A)和接收非变速输注的脑右半球(图8B)的代表动物中的壳核的输注部位的高倍放大图像示出了中间脊神经元(spinyneurons)中的hAADC转基因表达。在所有的(8/8)输注脑半球中可以看到hAADC表达免疫组织化学染色。用变速(脑左半球)或非变速(脑右半球)输注程序投递AAV-hAADC-2导致AAV-hAADC-2的良好表达和类似分布的壳核覆盖。用抗hAADC抗体染色的系列切片中hAADC分布的估计体积的量化用Stereoinvestigator体视软件(Microbrightfield，Williston，VT)执行。独立地确定四个AAV处理非人类灵长类动物的每个脑半球的前-后(A-P)分布，从前到尾分布的一维测量，和hAADC免疫染色的体积(表3)。左或右脑半球的平均A-P分布和平均体积均基于四个脑半球。脑左半球(变速送递)的平均A-P分布为9,600|im±2,422|im(SD)并且平均体积为238mm3±121mm3。脑右半球(非变速送递)的平均A-P分布为9，606pm士2，037(im并且平均体积为284mm3±55mm3。通过不成对史蒂顿特t检验发现在变速或非变速之间平均体积或平均A-P分布没有显著差异(对于A-P分布比较P^0.9973，对于散布体积比较P二0.5187)。非变速输注并不导致沿着插管轨迹的载体回流或转基因衍生hAADC分布的减小。回流的缺乏可能部分是由于插管的多台阶式设计。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>组织病理学在所有动物上执行H&E染色的系列切片的组织病理分析以确定插管放置和用变速或非变速送递进行AAV-hAADC-2输注的效果。图9在5X的放大倍数下显示了来自代表动物R211101M的壳核中的H&E染色的切片。动物R211101M通过脑右半球(画面A)中的非变速输注程序和脑左半球(画面B)中的变速输注程序接收AAV-hAADC-2的双侧CED。图像示出了邻近在中间尾壳核层(level)的插管轨迹的区域。无视治疗条件，所有H&E染色的切片由神经病理学家(neuropathologist)(PathologyAssociatesInc.)复查。用轻度血管周套袖(perivascularcuffing)在壳核中看到一些单核细胞渗滤。两个壳核都包含少许渗滤血管和轻度血管周渗滤。左右脑半球的组织病理外观是类似的，在输注部位有轻微的炎性组织反应。中和抗体的发展在输注载体之前和在尸检时收集的血清样本中确定抗体(NAb)和全抗体对AAV衣壳的滴定度。通过双侧输注AAV-hAADC-2之后所有动物中的桥接ELISA检测抗AAV抗体水平的轻微上升(表l)。在表l中显示了两个NAb测定的结果。用抗AAV2小鼠单克隆抗体使桥接ELISA标准化。显示了处理后样本的两个结果的平均值并且显示了处理前样本的单一结果。在处理前具有最高血清中和抗体滴定度(1:10-1:100)的动物(R23700M)在处理后第42天抗体增加到1:31-1:316。与其他动物相比该动物具有类似的hAADC转基因分布，因而没有与更高滴定度相关联的载体散布的明显抑制。临床观察每天评价猴子的临床体征，食物消耗，和体重。手术后的每日临床观察表明动物很好地忍受CED程序而且并不显示行为变化。没有AAV-hAADC-2处理相关的临床体征或体重变化。在处理后期间进行的观察类似于在经历类似手术过程的实验室恒河猴中通常观察到的那些现象。结果检验本发明的插管的实施方式以评估其将rAAV载体有效送递到灵长类动物脑的能力，灵长类动物的脑可以用作送递治疗rAAV载体以治疗人类患者中的帕金森氏症的模型。被设计成检验载体送递的模拟输注证实可以用这里所述的插管送递实质100%的预期剂量，优选地避免了载体与特氟纶或钢表面接触。通过变速(输注速度分段增加)和非变速(恒定速度)输注程序的比较执行AAV-hAADC-2立体定向投递到四个非人类灵长类动物的壳核中。hAADC的表达可由免疫组织化学检测并且广泛地分布在壳核中。转基因衍生hAADC的体积的体视量化证明在接收两个输注程序的脑半球中具有类似分布。此外，恒定流速并不导致沿着针迹的过度载体沉淀。组织病理分析表明位于插管插入轨迹的区域的仅仅轻微的炎性反应，不建议安全关注。在左右壳核(即变速和非变速输注)之间细胞渗滤或发炎的程度没有明显差异。在手术和壳核内输注之后未在任何动物中发现异常临床观察。除了设备和输注参数之外，将AAV媒介基因有效送递到任何部分的另一重要考虑是抗AAV抗体产生的潜在中和。在人类中存在范围很广的预先存在的AAV中和抗体滴定度(Blacklow等人(1968)J.Ato/.Q^cer/""，40(2):319-27)，其具有不利地影响基因治疗技术的功效的可能性。任何AAV媒介基因治疗方法必须预见到这样的障碍。例如，在利用SCID小鼠的模型系统中，其中可以在各种水平建立人类AAV2中和抗体滴定度，观察到在静脉内投递之后滴定度<1:10显著影响AAV因子IX的肝转导(Scallan等人(2004)^men'c朋5bcZe(yo/777erap_y，Minneapolis,画，Abstract#753S286)。由于CNS的免疫优先状态，因此假设AAV2送递到壳核不太受到循环抗体中和。实际上，在用AAV2进行系统预免疫然后进行纹状体内输注的大鼠中进行的研究证实仅仅当Nab滴定度超过1:1200时才明显观察到来自中和的保护和转导减少(Sanftner等人(2004)Mo/,772",9(3):403-9)。这里所述的实验利用预先存在的NAb滴定度范围从1:1到1:100的动物以便排除作为混淆变量的中和抗体，并且这些滴定度对壳核中的hAADC表达没有显著影响。而且，输注后滴定度在载体投递后仅仅稍微上升，由此用当前的设备和输注条件确认良好靶向和极小破坏的基因送递。这些结果也暗示了AAV2的重复纹状体内输注到人类患者中是可行的。总而言之，AAV-hAADC-2通过本发明的输注设备(临床设备B)非变速输注到猴子壳核是很有耐受性的。转基因(hAADC)表达和在壳核中的分布与更复杂和耗时的变速上升流动条件是相当的。假设神经变性疾病和其他CNS病症的基因治疗是扩展领域(Tinsley和Eriksson(2004)ActaNeurol.Scand.，109(1):1-8)，本结果暗示了临床设备B的设计代表该领域的方法学的重要进步。本发明的设备和输注参数可能应用于AAV2纹状体送递到PD患者中，并且也应用于靶向不同解剖部位，送递各种治疗药物或基因治疗剂，并且处理各种CNS临床指标。例子想要用于举例说明本发明而不是通过它们的细节限制本发明的权利要求的范围。尽管描述了本发明的优选例举实施方式，本领域的技术人员显而易见的是可以在其中进行各种变化和改进而不脱离本发明，并且想要在后附权利要求中涵盖落入本发明的实际精神和范围内的所有这样的变化和修改。这里引用的所有出版物、专利和专利申请出版物被全文结合于此以作参考。权利要求1.一种台阶式插管，其具有外径，远端，近端和在近端和远端之间延伸的管腔，所述台阶式插管包括两个或以上的同轴布置的管段，每个管段具有限定该插管的外径的外径，其中该管段的外径是不同的。2.根据权利要求l所述的台阶式插管，其包括两个，三个，四个，五个或六个同轴布置的管段。3.根据权利要求1或2所述的台阶式插管，其中该管段的外径从该插管的近端到远端减小。4.根据权利要求l-3任何之一所述的台阶式插管，其中该插管的内径是恒定的。5.根据权利要求l-4任何之一所述的台阶式插管，其进一步包括延伸通过该插管的管腔的一个或以上的管状部件。6.根据权利要求5所述的台阶式插管，其中至少一个管状部件包括熔融石英管。7.根据权利要求6所述的台阶式插管，其进一步包括围绕该熔融石英管布置的FEP管。8.根据权利要求l-7任何之一所述的台阶式插管，其中一个或以上的管段包括不锈钢。9.根据权利要求8所述的台阶式插管，其中该一个或以上的不锈钢管段的管腔涂有一种或多种聚合物。10.根据权利要求l-9任何之一所述的台阶式插管，其包括五个不锈钢管段。11.一种插管组件，其包括根据权利要求l-10任何之一所述的插管；和包括将通过该插管送递的一种或多种材料的储器，所述储器可操作地连接到该插管的管腔。12.根据权利要求ll所述的插管组件，其中该储器包括注射器。13.根据权利要求11和12所述的插管组件，其进一步包括可操作地联接到该注射器的泵。14.根据权利要求13所述的插管组件，其中该泵是可编程的。15.根据权利要求11-14任何之一所述的插管组件，其中该储器可操作地联接到延伸通过该插管的管腔的管。16.将一种或多种材料送递到受试对象的目标区域的方法，所述方法包括以下步骤将根据权利要求l-10任何之一所述的插管或根据权利要求11_15之一所述的插管组件定位在受试对象的目标区域中；和将一种或多种材料通过该插管送递到目标区域。17.根据权利要求16所述的方法，其中该目标区域在中枢神经系统中。18.根据权利要求17所述的方法，其中该目标区域在脑中。19.根据权利要求16-18任何之一所述的方法，其中该材料选自下列组成的组生物活性剂、染料、示踪剂、标记物、造影剂或它们的组合。20.根据权利要求19所述的方法，其中该生物活性剂是AAV载体。21.—种台阶式插管，其具有外径，远端，近端，和在近端和远端之间延伸的管腔，所述台阶式插管包括两个或以上的同轴布置的管段，每个管段具有限定该插管的外径的外径，其中该管段的外径是不同的；禾口延伸通过该插管的管腔的一个或以上的管状部件。22.—种台阶式插管，其具有外径，远端，近端和在近端和远端之间延伸的管腔，所述台阶式插管包括两个或以上的同轴布置的管段，每个管段具有限定插管的外径的外径，其中该管段的外径是不同的；和延伸通过该插管的管腔的一个或以上的管状部件，其中至少一个管状部件包括熔融石英。23.根据权利要求l所述的台阶式插管，其进一步包括布置在所述管腔中的装置，其用于减小通过所述插管送递到目标区域的材料的损失。24.根据权利要求23所述的台阶式插管，其中所述装置包括熔融石英。全文摘要在这里描述了具有台阶式外部的插管。也描述了制造和使用这些插管的方法，例如将一种或多种材料送递到动物的中枢神经系统。文档编号A61M25/06GK101123919SQ200580040404公开日2008年2月13日申请日期2005年10月5日优先权日2004年10月5日发明者J·M·萨默,K·班克维茨申请人:建新公司;加利福尼亚大学董事会