专利名称：Hsp60的肽和apl型衍生物及药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及60kDa的人热休克蛋白(缩写为hHsp60)，以及源自其的变异性肽配体(altered peptde ligands，缩写为APL)。本发明还涉及含有这样的肽的药物组合物，其用于治疗类风湿性关节炎(RA)。
背景技术：
RA是一种病因学未知的自身免疫疾病，该疾病影响世界上大约1％的人口。其为一种特征在于关节的慢性炎症的综合征，尽管也可以观察到全身性的表现。这种疾病开始是滑膜的炎症并常常引起相邻软骨和骨的侵蚀性破坏，这导致80％的患者中度身体无力和导致早的死亡(Moctezuma，J.F.(2002)Manifestaciones articulares de laArtritis Reumatide.Revista Mexicana de Reumatolog ía17211-219)。RA可以在任何年龄出现，不区分种族或人种群，但是其开始的最大发生率出现在25和55岁之间。在患有RA的人中，女性超过男性，比例为3∶1(Emery，P.(2002)Early referralrecommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritisevidence based development of to clinical guide.Ann Rheum Dis.61290-297)。
RA的原因未知。其为一种与遗传、环境、免疫学和激素因素的存在有关的疾病。某些基因在免疫系统中发挥作用，与倾向于形成RA相关。同时，一些具有RA的人不具有这些基因，并且其他具有这些基因的人从未形成该疾病。因此，有人提出遗传背景是重要的但不是决定性的。
在自身免疫疾病的模型中，具有与自身抗原相似的结构的微生物抗原可以引起对自身抗原的交叉应答，产生耐受机制的改变并永久保持自身免疫应答。通常来说，由感染性因子产生的在组织中的损伤和局部坏死可以揭示出自身抗原隐蔽表位，其能够激活自身反应性T细胞(Albert，L.J.(1999)Mechanisms of DiseaseMolecular Mimicryand autoimmunity.N Engl J Med 3412068-2074)。
在耐受和免疫/自身免疫之间的T淋巴细胞转变阶段在不同水平上受到调节。该转变中的两个重要参数是抗原呈递细胞(缩写为APC)的成熟状态和由免疫系统所检测到的自身抗原的水平(Ohashi，P.S.(2002)Making and breaking tolerance.Current Opinion inImmmunology 14744-759)。
当前试图解释自身免疫疾病发展的一种假说认为当自身的肽递呈至它们时，在缺乏先天免疫系统的信号或危险信号时APC保持相对不成熟并诱导自身反应性T细胞的耐受(Steiman，R.M.(2000)Theinduction of tolerance by dendritic cells that have capturedapoptotic cells.J Exp Med.191411-416)。外周耐受的诱导也与自身抗原的浓度相关(Kurts，C.(1999)CD8 T cell ignorance ortolerance to islet antigens depends on antigen dose.PNAS9612703-12707)。由于它们表达水平的增加而引起的自身抗原递呈的增加，使得它们被自身反应性无知T细胞检测到。如果自身抗原的水平在缺少促进APC成熟的事件时增加，则对这些抗原的耐受得到保持，否则，这发生在存在促炎信号或其他促进APC成熟的事件时，则无知T细胞的激活打破了这种耐受，并且发展出了自身免疫疾病(Janeway，C.A.(2002)Innate immune recognition.Annu RevImmunol.20197-216)。
已经成为研究RA起因的目标的感染性因子尤其是EB病毒、逆转录病毒、丙型肝炎病毒、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(缩写为Mt)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。
RA发病机理的特征是引起软骨和骨的进行性破坏的不同类型细胞的协同作用。
在正常情况下，在炎性细胞因子如TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-16、IL-17、IL-1和IFNγ与抗炎细胞因子如IL-4、IL-11、IL-13和IL-1或TNFα的拮抗剂之间存在平衡。然而，在RA中这种平衡移向有利于炎性细胞因子(Arend，W.P.(2001)Cytokine imbalance inthe pathogenesis of rheumatoid arthritisThe role ofinterleukin-1 receiving antagonist.Semin Arthritis Rheum30(2)1-6)。
外源性抗原或自身抗原的识别有可能是一系列引起RA患者关节破坏的事件的原因。这种现象引起了与不同细胞因子的刺激相协作的T CD4+淋巴细胞的激活，诱导它们分化为细胞Th1，结果释放了促炎细胞因子(IL-2和INFγ)(Simón，A.J.(2001)Biological therapyin Rheumatoid Arthritis.Magazine of Clinical Investigation53(5)452-459)。许多研究者一致认为关节的慢性炎症由浸润滑膜的这些激活的T细胞诱导。这些细胞因子对巨噬细胞的作用引起了大量的TNFα和IL-1的产生。这引起了一系列局部的和全身性的作用，调控在内皮细胞中粘附分子的表达(LFA1，ICAM-1)，其募集其他细胞至炎症位点。它们也刺激巨噬细胞、成纤维细胞、软骨细胞和破骨细胞释放其他炎症介质，如IL-15和IL-8。TNFα和IL-1刺激滑膜的增殖，这导致血管翳的形成，它们也可以诱导B淋巴细胞分化成产生可能参与关节破坏的抗体的细胞。它们也抑制由Th2细胞产生的抗炎细胞因子(IL-4和IL-14)的产生，并刺激肝细胞释放IL-6。IL-6促进急性阶段的蛋白质的产生，所述蛋白质参与强化免疫应答(Forre，O.(2000)New possibilities of treatment in AR.Scand J Rheumatol29(2)73-84)。
自身抗原中涉及RA发病机理的是Hsp60，其为一种属于Hsp家族的蛋白质，Hsp是具有异常进化保守性的免疫原性蛋白。针对陌生Hsp的免疫应答是抵御细菌感染的重要机制。针对这些蛋白质的抗体在健康的人中和在患有自身免疫疾病的患者中可以是丰富的，并且它们可以与自身抗原交叉反应(Chen，W.(1999)Human 60-kDa Heat-ShockProteinTo Danger Signal to the Innate Immune System.J Immunol.1623212-3219)。
Mt的Hsp65与哺乳动物的Hsp60同源。这暗示，Hsp60可以在RA患者中被识别为自身抗原。当比较骨关节炎患者与RA患者时，在这些RA患者的滑液中B淋巴细胞对分枝杆菌的Hsp65的增殖应答增加。该应答的强度与滑液炎症相关联。与其他炎性疾病相比，这种应答对于RA不是特异性的(Life，P.(1993)Responses to Gram negativeenteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens withjuvenile chronic arthritisrecognition of heat shock proteinhsp60.J Rheumatol.201388-1396)。
对于免疫系统，Hsp的浓度是一种可能的危险信号，所述Hsp从死亡细胞释放，并且可以诱导炎性应答并开始APC的成熟。Hsp是细胞内蛋白，其不在细胞膜中表达，不分泌，从而Hsp是构成危险信号的有吸引力的候选分子(Van den Berg，WB.(1998)Jointinflammation and cartilage destruction may occur uncoupled.Springer Semin Immunopathol.20149-164)。
已经提出了数种使用Hsp60或其衍生肽的制剂，其用于治疗一些自身免疫病理学状态。例如在专利EP0262710中，提出使用Mt的Hsp60的数种肽来治疗和诊断自身免疫疾病，特别是关节炎疾病。本发明基于这样的事实先前感染数种细菌可以在遗传易感的人中引发自身免疫疾病的产生，例如RA患者可以显示出对微生物抗原的高度反应性。
在专利EPO322990中，相同的这些发明人提出了Mt的Hsp60的其他肽的用途，用于与前面的专利相同的目的。
在专利申请WO9610039中，他们打算使用Mt的Hsp60的肽来诊断和治疗自身免疫关节炎。
在专利申请WO9711966中，作者打算使用hHsp60的非保守区的肽，所述hHsp60与可以在RA患者的T细胞中引起耐受的细菌的Hsp60不一致。
专利申请WO0143691提出了由hHsp60的肽和它们的变体特异地组成的药物制剂用于预防炎性疾病例如RA的用途。
在专利US6180103中，作者打算使用称为p277的Hsp60的肽及其类似物来诊断和预防I型糖尿病。
专利US5993803保护了Hsp60、肽p227和这种蛋白质的一组衍生肽用于减轻器官移植过程中自身免疫应答的严重度的用途。
近来已经考虑到，动脉粥样硬化表现出一系列与自身免疫过程相似的特征。在专利申请WO0072023中，作者提出了使用含有蛋白质Hsp60的制剂来治疗和诊断动脉粥样硬化和冠心病的方法。
在专利申请WO02057795中，保护了一种新的方法，所述方法使用Hsp家族的蛋白质和来自病原体如病毒和细菌的蛋白质来诊断和治疗骨质疏松症。
目前，RA还不能治愈。当前的治疗方法集中在减轻病痛、减少炎症、延缓关节损害和改善患者的功能和安康。
近来已经详细描述了免疫调节药物，它们阻断在RA中参与炎症应答的开始和保持的细胞因子，目的是终止或减缓该疾病的发展。对于这种类型的疗法，存在两种类型的药物阻断肿瘤坏死因子(缩写为TNFα)的作用的药物和抑制白细胞介素1(IL-1)的作用的药物。
尽管结果是所述的抗-TNFα和抗-IL-1疗法有疗效，但感染百分数较高。许多用这些药物治疗的患者产生了严重的感染，在一些情况中(包括其他自身免疫疾病、瘤形成等)甚至是致命的。此外，它们是十分昂贵的药物(Breshinan，B.(1998)Treatment of rheumatoidarthritis with recombinant human anti-interleukin-1 antagonist.Arthritis Reum.412196-2204)。
已经提出口服耐受性(oral tolerance)作为形成针对某些抗原的外周耐受性的方法。取决于抗原施用的剂量和频率，这可以通过主动抑制(active suppression)、无变应性或克隆缺失的机制进行诱导。该方法可以诱导调节性T细胞，所述T细胞由抗原以特异性方式激活，但是独立地行使其作用(主动抑制)。为了发生调控作用，不必施用假定致病的抗原，而是在炎症病灶中能诱导主动抑制的任何其他抗原，从而抑制所述致病性效应细胞的活性。II型胶原(缩写为CII)是在这方面更常使用的自身抗原。在RA患者中使用鸡和牛CII进行的研究的结果给出了矛盾的结果(Trentham，D.E.(1993)Effects oforal administration of type II collagen in rheumatoid arthritis.Science 2611727-1730；Sieper，J.(1996)Oral type II collagentreatment in early rheumatoid arthritisto double-blind，placebo-controlled，randomize trial.Arthritis Rheum.3941-51)。
专利US6153200打算使用Hsp70(属于Hsp家族的蛋白质)的肽来诱导RA患者中对口服途径的耐受。
已经提出用于诱导耐受的另一种变化形式是通过APL肽，基于这样的事实如果对于某种抗原性肽的特异性T CD4+淋巴细胞识别由感受态APC呈递的该抗原，则T细胞被激活。然而，如果相同的T细胞首先被不同形式的所述抗原(其中与TcR的接触位点之一被稍微改变)激活，这可以导致所述T细胞的部分激活或甚至是失活。这种抗原称为APL。APL类似于在与TcR或与MHC接触的重要位置有一个或数个置换的免疫原性肽，其干扰对于T细胞的完全激活所必需的事件的级联。
在概念上来说，除了其他效果以外，可以将APL设计成具有与免疫原性肽(激动剂)相似的特性，以增加T细胞对于特定抗原的应答。这种效果在病理学状态如传染性疾病下是有利的。也可以将肽设计成具有对于免疫原性肽的拮抗剂特性，所述特性可以有利于控制自身免疫疾病，因为它们可以作为TcR的拮抗剂(M.De Magistris(1992)Antigen analog-major complex histocompatibility complexes actas antagonist of the T cell receptor.Cell 68625-634)、部分激动剂或诱导介导主动抑制的调节性T细胞群(Evavold，B.D.(1991)Separation of IL-4production from Thcell proliferationby an altered T cell ligand.Science 2521308-1310)而阻断T细胞应答。
在试验上操纵肽配体的内在性质的能力使得能够适当改变免疫细胞应答的性质、过程和效力。
直至现在，已经在人中进行了使用APL型肽的两个临床试验以治疗自身免疫疾病。在这两个测定法中，所述的肽源自髓鞘碱性蛋白的位置83-93的表位。其中一个试验包括142位多发性硬化症患者，并由于9％的患者产生了超敏反应而暂停了(Ludwig Kapposi(2000)Induction of non-encephalitogenic type 2 T helper-cellautoimmune response in multiple sclerosis after administrationof an altered peptide ligand in to placebo controlled，randomized phase II trial.Nature Medicine 101176-1182)。
另一个试验包括25位患者并且也中断了，因为在三名患者中观察到疾病的恶化(Bibiana Bielekova(2000)Encephalitogenicpotential of the myelin basic protein peptide(amino acids 83-99)in multiple sclerosisResults of to phase II clinical trialwith an altered peptide ligand.Nature Medicine 61167-1175)。该工作的主要作者分析了决定这些阴性结果的因素，并认为在APL的位点上进行的改变可能引起了对于HLA的新的联合基序(像当APL结合至在患者I中存在的DRB1*0404的情形时所发生的)，APL-HLA复合物也可以刺激在负选择中没有除去的T细胞，所述T细胞可由天然的自身抗原交叉活化。在该试验中，在药物制剂中使用高浓度的APL，其可以与自身抗原高度相似地刺激T细胞并诱导不规则的T细胞应答。(Bibiana Bielekova and Roland Martin(2001)Antigen-specificimmunomodulation via altered peptide tying.J Mol Med.79552-556)。
对于开展这两个临床试验，作者先前没有分析患者的T细胞对APL的体外应答。他们也没有考虑由受治疗的患者所表达的HLA分子的类型。
治疗自身免疫疾病的主要挑战是发展可以特异性地去除致病性T细胞而不影响其他不相关T细胞的治疗策略。因此，治疗研究应该寻找一种安全的、特异的且有效的方式来停止高级自身免疫过程。
与先前的现有技术相比较，本发明提出使用hHsp60的肽及其APL型衍生肽的用途，它们以特异性的方式诱导了RA过程的抑制性分子机制。
发明概述本发明解决了先前提到的问题，提供了形成T细胞表位的60kDa人热休克蛋白的肽，以在类风湿性关节炎患者中诱导外周耐受机制，特别是引起无变应性的机制或由调节性T细胞克隆介导的机制，并且所述肽具有以下序列E18-12MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG(SEQ.ID.NO2)F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA(SEQ.ID.NO3)。
专利申请WO9711966旨在人和Mt的Hsp60的肽的用途，基于这样的事实它们可以在T细胞中诱导耐受，并用于预防RA。这些作者通过施用这些肽给小鼠(事先用pristine诱导了关节炎)证实了对该疾病的某些改善。与该申请相反，我们证明，我们的肽诱导了主动抑制机制，其以十分有效的方式诱导了外周耐受，证实了在关节炎的两个动物模型中以及在使用患者的单核细胞的“离体”测定法中IL-10显著增加。
众所周知，在佐剂诱导的关节炎(AIA)模型中基本的T细胞应答是针对Hsp60的。在这种模型中，我们检验出，我们的hHsp60的衍生肽发挥出十分显著的治疗性保护作用，产生了IL-10的增加和TNFα水平的降低。我们还在胶原诱导的关节炎(CIA)的动物模型中检验出了由这些肽所发挥出的相同治疗效果，在所述CIA动物模型中主要的应答是针对II型胶原的。
这些事实表明，我们的肽的治疗能力是独立于诱导剂的，并且可以在炎症位点处介导主动抑制机制，所述主动抑制机制可以扩展至在关节中存在的其他自身抗原，所述其他自身抗原逐渐地有助于在RA过程中发生的免疫病理过程。这些结果增强了使用我们的制剂来治疗RA的治疗可能性。
根据本发明，这些肽特别可用于设计肽E18-12(SEQ.ID.NO1)和E18-3(SEQ.ID.NO2)的APL型衍生变体，所述变体在与人MHC分子的接触位点处进行修饰，以及用于设计肽F19-6(SEQ.ID.NO3)的APL型衍生物，所述衍生物在与大鼠MHC分子的接触位点处进行修饰。各个氨基酸序列是MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)1 2 34 56 7在下列位置处进行置换位置1置换为A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，位置4置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO2)1 2 3 45 6 7 8在下列位置处进行置换
位置1置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；IIDPTKVVRTALLDAA(F19-6)(SEQ.ID.NO3)12在位置1处置换为H，在位置2处置换为E。
在一个特别的实施方案中，APL型衍生肽具有选自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO4、SEQ.ID.NO5、SEQ.ID.NO6、SEQ.ID.NO7、SEQ.ID.NO8、SEQ.ID.NO9、SEQ.ID.NO10、SEQ.ID.NO11、SEQ.ID.NO12、SEQ.ID.NO13、SEQ.ID.NO14、SEQ.ID.NO15、SEQ.ID.NO16、SEQ.ID.NO17、SEQ.ID.NO18、SEQ.ID.NO19、SEQ.ID.NO20和SEQ.ID.NO21。
本发明的肽可以通过常规的肽合成方法来产生。每种具有特定肽的组合物可以通过其在如于随后将要叙述的实施例中描述的那些试验中所诱导的免疫应答的水平和质量来检验。
在上面和在实施例中所描述的所有序列是有用的，并且还可以用作设计和合成具有改良性质的衍生肽的基础。
本发明还包括药物组合物，其包含一种或多种先前列举的肽和任选地包括可药用载体或赋形剂。
将药物制剂施用给患者将会根据由特定患者所表达的II类HLA分子。
施用药物组合物的方式将取决于这些制剂在“离体”测试中诱导的细胞因子模式。含有诱导调控性应答的APL肽的药物制剂将通过皮内或皮下途径进行施用。含有诱导TH1应答的原始肽的药物制剂将能够通过口服途径进行施用。
本发明药物组合物中的肽的量是在宿主中产生有效免疫应答的量。有效量是当施用时诱导分子机制的量，所述分子机制显著减小RA的炎症征兆特征并终止该疾病过程的关节损伤特征。施用给宿主的药物组合物的量还可以根据数种因素而变化，所述因素通常包括使用的肽、ACR得分(American College of Rheumatology，缩写为ACR)、II型HLA、诊断有该疾病的时间、年龄、性别、一般健康状况以及免疫应答水平。
本发明还涉及治疗RA的方法，所述方法包括向患者施用有效量的先前提及的肽或药物组合物。
附图简述部分地，结果在下列图中用图表显示
图1在AIA模型中，通过皮内途径用F19-6和F19-7治疗的大鼠中关节炎的临床征兆的评价。
图2诱导疾病后第15天，在AIA模型中，大鼠单核细胞中由F19-6和F19-7肽引起的TNFα水平的调节。
图3诱导疾病后第15天，在AIA模型中，大鼠单核细胞中由F19-6和F19-7肽引起的IL-10水平的调节。
图4未经治疗的患病动物的关节切片的光学显微镜图。IS关节内空间，EC软骨的侵蚀，P血管翳。用苏木精-曙红染色。
图5通过皮内途径用F19-7肽治疗的动物的关节切片的光学显微镜图。IS关节内空间。用苏木精-曙红染色。
图6诱导疾病后第21天，在CIA模型中，大鼠单核细胞中由F19-6和F19-7肽引起的TNFα水平的调节。
图7诱导疾病后第21天，在CIA模型中，大鼠单核细胞中由F19-6和F19-7肽引起的IL-10水平的调节。
图8RA患者的单核细胞中F19-6和F19-7肽对TNFα水平的调节。
图9RA患者的单核细胞中E18-3和E18-12肽对TNFα水平的调节。
图10RA患者的单核细胞中E18-3和E18-12肽对IL-10水平的调节。
图11RA患者的单核细胞中由E18-3和E18-12肽和它们的APL引起的IL-10水平的调节。
图12RA患者的单核细胞中由E18-3和E18-12肽和它们的APL引起的TNFα水平的调节。
图13由E18-3和E18-12肽和它们的APL引起的IL-10和TNFα水平的比率。
图14在AIA模型中，通过皮内途径用E18-12和E18-12APL1肽治疗的大鼠中关节炎的临床征兆的评价。
特别的实施方案/实施例的详细描述实施例1由人HLA呈递的hHsp60的肽选择的hHsp60的肽是通过下列所使用的程序被报道为人T细胞表位的那些肽SYFPEITHI(Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann，Niels Nikolaus Emmerich，Oskar Alexander Bachor and StefanStevanovic.1999.Immunogenetics 50213-219.SYFPEITHIMHC配体和肽基序的数据库(访问网址http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/))和ProPred(Singh，H.and Raghava，G.P.S.2001.ProPredPrediction of HLA-DR bindingsites.Bioinformatics，17(12)1236-37)。
相应于这些肽的序列显示于表1中。
表1.由人HLA呈递的hHsp60肽的序列
实施例2Lewis大鼠的hHsp60表位肽从hHsp60的序列开始，根据在数据库SYFPEITHI(Hans-GeorgRammensee，Jutta Bachmann，Niels Nikolaus Emmerich，OskarAlexander Bachor，Stefan Stevanovic.1999.Immunogenetics50213-219.SYFPEITHIMHC配体和肽基序的数据库(访问网址http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/))中描述的序列基序，我们选择了与大鼠RT1.B1的MHC-II分子结合的肽。
设计了分析所有9个氨基酸的肽的程序来搜索满足所述基序的那些肽。我们还包括了变体，其中在所述位置之一不包括被描述为锚点或优选的残基。
相应于于这些肽(F19-6)之一的序列显示于表2中。
表2.对于大鼠而选取的hHsp60肽的序列
实施例3在参与结合MHC的氨基酸中具有修饰的APL的设计从在实施例1和2中所选择的肽开始，我们修饰了参与结合特定MHC的位置(位置1、3、4、6、8或9)，试图增加所述肽对HLA分子的亲和力。如果选择肽用于使用结合基序的方法(SYFPEITHI)，则在这些位置的每一个位置处搜索可以是锚点残基的最佳残基，或者如果所述肽的选择是使用另一类型的算法(ProPred)来进行的，则搜索能增加肽作为MHC配体的得分的残基。
作为这些分析的结果，肽E18-12在位置1-7处用下面指定的每一个氨基酸置换MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(E18-12)1 2 34 56 7在下列位置处进行置换位置1置换为A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，
位置4置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y。
肽E18-3在位置1-8处用下面指定的每一个氨基酸置换SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (E18-3)1 2 3 45 6 7 8在下列位置处进行置换位置1置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。
肽F19-6在位置1和2处用如下指定的氨基酸置换IIDPTKVVRTALLDAA(F19-6)12在位置1处置换为H，在位置2处置换为E。
这两个置换导致产生了肽F19-7IIDPTHVVRTELLDAA(F19-7)(SEQ.ID.NO4)。
实施例4Lewis大鼠中由佐剂和胶原诱导关节炎雌性近交Lewis大鼠(RT1.B1 MHC)用于该试验，由NationalCenter for the Production of Laboratory Animals(CENPALAB，Cuba)提供。随机选择大鼠，重量大约为101-120g，以及5-8周大。
所使用的疾病诱导剂之一是不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma，USA)中的Mt(H37Ra，Difco，England)。关节炎的另一种诱导剂是IFA中的牛II型胶原。
在该实施例中，使用两种诱导剂来通过针对两种不同自身抗原的免疫应答而在大鼠中引起关节炎。众所周知，在用Mt作为疾病诱导剂的关节炎动物模型中，T细胞的基本应答是针对Hsp60的(Anderton，SM(1995)Activation of T cells recognizing self 60-kD heatshock protein can protecta gainst experimental arthritis.J.Exp.Med.181943-952)。在使用胶原作为诱导剂的模型中，产生了显著的抗体应答以及T细胞克隆以对抗这种抗原(M Griffiths(1988)Immunogenetics of collagen-induced arthritis in rats.Inten.Rev.Immunology 41-15)。
我们开发这两种动物模型的基本目标是在两种模型中评价我们的肽，目的是证明这些肽的保护性效果是独立的还是依赖于大鼠中用作关节炎诱导剂的自身抗原。
实施例5临床征兆的评价根据以下为该目的而准备的平均水平来评估每只大鼠所呈现的与关节炎发展相关的炎症级别0分正常的爪；1分踝或腕轻微但不确定的发红，或者限于个别趾的明显发红和炎症，与受影响的趾的数目无关；
2分踝和腕的中度发红和炎症；3分整个爪(包括趾)的严重发红和炎症；4分涉及多个关节的爪的最大炎症和变形。
根据所述确立的打分系统对四个爪分别进行评价，每个爪可以得到多达4分。因此，每只大鼠可以最多得到16分。
在诱导疾病后每5天进行目视评估。
关节炎征兆的临床评价证明，在相应于没有诱导疾病的健康对照组(组IV)的动物和相应于诱导了疾病但没有用肽治疗的患病对照组(组III)的动物之间存在有显著的统计学差别，如在图1中所显示的。
实施例6肽合成所述的肽在注射器中通过Fmoc/tBu策略合成。使用的树脂是Fmoc-AM-MBHA(0.54mmol/g)，在机械搅拌下连续进行合成方案。在用TFA处理后，冻干所述的肽并通过HPLC和质谱法进行表征。
实施例7肽的皮内施用将动物分成4组，每组12只大鼠。在三组动物(组I-组III)中诱导疾病，并将两组用肽治疗，和一组作为疾病诱导的对照。在用Mt诱导疾病后12、17和22天，用肽治疗的两组动物中每只大鼠接受在100μL体积的PBS中的200μg肽。
将分成四组的动物以以下方式进行处理●组I用肽F19-6治疗的动物●组II用肽F19-7治疗的动物●组III不用肽治疗的动物(疾病诱导对照)●组IV没有诱导疾病并且没有用肽治疗的动物(阴性对照)。
诱导后第15、21、28和35天，每组处死三只动物，取出脾脏并从关节取得样品以用于组织病理学分析。
如图1中所显示的，与关节炎发展相关的征兆逐渐开始。在相应于疾病发展的对照组的组III动物中，从诱导关节炎后第10天开始，炎症过程的发展变得明显，其开始为下关节轻微发红并扩展至关节的其他地方直至在一些大鼠中变得严重。
在该图中，很明显，肽F19-6(相应于hHsp60的原始表位)及其变体APL F19-7的施用在用这两种肽治疗的动物中引起关节炎临床征兆的明显减轻。在用肽F19-6和F19-7治疗的组和作为疾病阳性对照的组之间获得了统计学上显著的差异(P＜0.05)。
在该测定法中获得的结果证实，肽F19-6和F19-7在受治疗的动物中发挥了保护作用，因为有可能在大鼠中观察到疾病几乎完全缓解。
实施例8mRNA分离将分离自大鼠脾脏的单核细胞孵育大约20小时。随后，弃去上清液，并且将1mL试剂TRI REAGENT TM(SIGMA，USA)加入至每个孔中并将其置于室温下5分钟。随后，按照供应商建议的方案进行mRNA的分离。
实施例9RNA的逆转录为了获得互补DNA，使用了Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmmer，USA)系统。使用了1mg相应于每个样品的mRNA，并如供应商所建议的连续进行所述方案。
反应体系在循环变温器(thermocycler)(Minicycler，MJResearch，USA)中根据以下要素进行孵育第一个循环，在42℃下1小时，随后在95℃下5分钟以及在4℃下5分钟。
实施例10聚合酶链式反应对细胞因子TNFα和IL-10以及编码酶GAP-DH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，缩写为GAP-DH)的组成型基因进行聚合酶链式反应(PCR)。
对于每个反应，在供应商建议的终体积为25μL的缓冲液(KCl 50mM、Tris-HCl 10mM，pH 9.0、0.1％Triton X-100和MgCl21.5mM)中，使用10pmol每种引物、5mL DNA模板、0.25mL DNA热稳定聚合酶(Taq-Pol)(Perkin-Elmmer，USA)。
关于GAP-DH的反应体系在循环变温器(Minicycler，MJResearch，U.S)中根据以下程序进行孵育第一个循环，94℃(变性温度)下3分钟、94℃下1分钟、58℃(杂交温度)下1分钟和72℃(延伸温度)下1分钟，随后35个循环，每个循环为94℃下1分钟、58℃下1分钟和72℃下1分钟。最后是72℃下3分钟的延伸步骤。
对于细胞因子，继续先前的要点，仅在杂交温度上不同。对于IL-10，杂交温度是54℃，对于TNFα，杂交温度是64℃。
实施例11通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物PCR的结果通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。获取电泳图像并用Molecular Program Analyst(BioRad)进行分析。对于每种细胞因子，结果表示为mRNA的相对水平。
实施例12每种细胞因子的mRNA相对水平的统计分析为了测定受治疗动物组之间的细胞因子模式的差异(根据每种细胞因子的mRNA的相对水平)，使用Kruskal-Wallis和Student-Newman-Keuls检验(Statistical package Sigma Stat v 21997，GraphPad Software，Inc).
统计分析证明，诱导疾病后第15天，与疾病对照组相比，所述的肽显著减少了TNFα的水平。
这些结果显示在图2中，其中GI相应于用F19-6肽治疗的动物，GII代表用F19-7肽治疗的大鼠组，GIII代表未受治疗的患病组，GIV包括健康的动物。很明显地证明，用肽治疗引起了该细胞因子的相对水平的降低，所述细胞因子主要负责诱导动物中的炎症过程。对于细胞因子TNFα的情况，在用所述肽治疗的组之间和在用作疾病阳性对照的组中存在有在统计学上显著的差异。在用所述肽治疗的不同组之间以及在它们与用作疾病阴性对照的组之间均没有显示出显著差异。该结果表明，这两种肽的施用引起了TNFα水平的降低，几乎直到如健康动物中一样的这种细胞因子的正常水平。
为了测定用于该研究的肽是否可以刺激抗炎细胞因子如IL-10的产生，评价了相应于这种细胞因子的mRNA的相对水平。
IL-10参与了通过T细胞介导的应答来诱导外周耐受。IL-10直接调节T细胞以抑制IL-2、IL-5和TNFα的产生。
图3显示了在诱导疾病后第15天，不同治疗组中IL-10表达水平的定量测量。在该图中，GI相应于用F19-6肽治疗的动物，GII代表用F19-7肽治疗的大鼠组，GIII代表未受治疗的患病动物组，GIV包括健康的动物。
用这些肽治疗动物引起了IL-10的相对表达水平的增加。我们在用两种肽治疗的组之间没有获得统计学上显著的差异，但是这些组与构成阳性对照和阴性对照的动物之间存在着差异。从这些结果我们可以推断，所述肽作用的在于引起涉及所述疾病的发病机理的T细胞的功能表型发生变化，增加抗炎细胞因子如IL-10的产生水平，并减少促炎细胞因子如TNFα的产生水平。
实施例13组织病理学分析为了证实在该动物模型的动物中观测到的临床征兆和分析两种肽恢复或减缓由Mt产生的破坏性过程的能力，我们对每组的动物关节进行病理学分析。
通过CIGB的病理学组分析了相应于关节的切片。
将关节在10％福尔马林的中性缓冲液中固定并脱钙。组织在乙醇梯度中脱水，包埋在石蜡中，并切成5μm的切片。随后，将样品安放在载玻片上，并且用苏木精-曙红混合物染色并在光学显微镜中观察。
组织学分析的结果显示于表3中。
表3.组I至组IV的动物关节的组织学分析的总结
在表3中，P代表血管翳；EC软骨侵蚀；IM骨髓浸润；HO破骨细胞过度增生；G肉芽肿病反应；PMN多形核细胞。
在包括于第15天处死的那些动物的组III的动物中，明显存在引起软骨侵蚀和骨髓浸润的血管翳。此外，观察到用Mt诱导时的典型的肉芽肿病反应，并且常常观察到破骨细胞的过度增生，所述的破骨细胞是对骨物质具有巨大破坏力的巨大细胞。这些组织学结果再现了在RA患者中出现的关节改变的特征性征兆，并证明我们已经开发出了合适的动物模型来评价药理学候选物。
图4A相应于组III动物的关节。我们可以观察到存在侵入整个关节内空间之中的血管翳，其朝向软骨延伸，在那里显现出侵蚀，以及朝着骨髓侵入。图4B显示了相应于骨髓的区域的放大图，其中清晰观察到了血管翳为富含吞噬细胞的肉芽组织。
如图5中显示的，在通过皮内途径用F19-7肽进行的治疗(组II)中，在第15天处死的动物没有表现出组织学改变，只是存在多形核细胞和丰富的疤痕组织；这与组III的特征在于存在严重的组织学征兆的其余动物相反。
如表3中显示的，用F19-6和F19-7肽治疗的动物组在第一次检测的过程中几乎没有显示出组织学异样。在用F19-7肽治疗的动物中显现出对关节炎发展的更大的保护作用。在该治疗组中所涉及的大鼠中的一半(6只)没有表现出任何组织学征兆，这与用F19-6治疗的动物组相一致，其中仅有两只大鼠没有表现出组织病理学损害。在用F19-6和F19-7肽治疗的组中，在诱导关节炎后第15和21天没有观察到血管翳的存在，这表明这些肽的施用引起了关节炎发展过程中炎症反应的特征性细胞事件的出现的延迟。重要的是，在诱导关节炎后35天处死的用F19-7肽治疗的动物中，仅一只大鼠显现出该疾病发展的特征性组织学异样。这些结果表明，除了延迟了该疾病的临床表现之外，用该肽治疗动物引起了关节炎的组织病理学征兆的几乎完全的缓解，显示了F19-7APL相对于含有原始表位的肽F19-6的治疗优越性。
实施例14.使用来自用II型胶原诱导了关节炎的大鼠的单核细胞，对由F19-6和F19-7肽诱导的细胞因子模式进行体外评价在该测定法中使用了其中用在IFA中的牛II型胶原诱导了关节炎的患病大鼠。取出每只受分析大鼠的脾脏，并分离出单核细胞。
将从脾脏分离出的单核细胞在24孔平板(Costar，USA)中于1.5mL RPMI 1640中进行培养。该测定法一式三份地进行，总共3×106细胞/孔用浓度为5mg/mL的F19-6和F19-7肽培养24小时，并在37℃下和在5％CO2的潮湿气氛中进行孵育。没有用所述肽进行培养的细胞用作阴性对照。
随后，分离mRNA并以与先前实施例中所描述的相同的方式进行核酸的逆转录和PCR。如实施例12中所描述的，反应产物的分析通过琼脂糖凝胶电泳来进行。为了根据每个样品的mRNA的相对水平来测定细胞因子模式的差异，如实施例13中的描述采用统计检验。
在图6中显示了，相应于诱导疾病后第21天，没有用肽培养的细胞和在体外用F19-6和F19-7肽刺激的细胞的TNFα水平。字母A代表没有用肽培养的细胞的TNFα水平，字母B代表当细胞用F19-6肽刺激时该细胞因子的值，字母C相应于当细胞用F19-7肽刺激时TNFα的水平。在该图中，CII代表其中用II型胶原诱导了关节炎的动物组，对照表示健康的动物组。
图7显示了，相应于诱导疾病后第21天，没有用肽培养的细胞和在体外用F19-6和F19-7肽刺激的细胞的IL-10水平，字母A代表没有用肽培养的细胞的IL-10水平，字母B代表当细胞用F19-6肽刺激时该细胞因子的值，字母C相应于当细胞用F19-7肽刺激时IL-10的水平。在该图中，CII代表其中用II型胶原诱导了RA的动物组，对照表示健康的动物组。
如在这两辐图中观察到的，F19-6和F19-7肽在体外减少了TNFα的水平，但是对于IL-10，仅F19-7肽显著增加了IL-10水平。
这些结果表明，在其中用胶原诱导了关节炎的动物模型中，F19-7肽能调控所述细胞因子的模式以调节表型。因此我们可以确认，这种源于hHsp60的肽的体外免疫调节作用可以延伸至关节炎的动物模型，在该动物模型中参与所述疾病发展的诱导剂不是Mt或相关的自身抗原。
这些结果说明，F19-7可以诱导对结构相关的抗原的耐受性，能在炎症位点处介导体内主动抑制。
根据这些结果我们可以认为，F19-7肽在动物中引起针对由Mt或II型胶原诱导的关节炎的保护作用，所述保护作用是由产生IL-10的调节性T细胞介导的。该效果可以扩展至存在于关节中的其他自身抗原，所述其他自身抗原逐渐地有助于在RA过程中发生的免疫病理过程。
实施例15对于F19-6和F19-7肽，在RA患者中的细胞因子测量使用RA患者的血液进行了测量细胞因子TNFα、IFNδ和IL-10的测定法。hHsp60的肽增加或减少参与所述疾病的发病机理的不同细胞因子的潜力在本测定法中进行了评价。
从10mL在1×PBS中作1/2稀释的每位患者的血液开始，将5mL该稀释液加入至在15mL的离心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，所述离心管以1200rpm离心30分钟。提取相应于单核细胞的环。随后，细胞用15mL 1×PBS洗涤两次，并在每次洗涤后将它们在900rpm下离心。最后，将细胞粒状沉淀重悬浮于含有10％胎牛血清并补充有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(全部从Gibco BRL获得)的RPMI 1640中。
以800μL的体积，将获得的单核细胞以106个细胞/孔的数目接种在24孔平板(Costar)中。随后，加入浓度为0.5μg/mL-100μg/mL的hHsp60的肽以便获知对于调控所述细胞因子水平来说每种肽的最佳浓度。1％植物凝集素(PHA)用作细胞刺激的阳性对照，而单独的RPMI 1640用作基底细胞生长的对照。
将细胞培养24小时，随后取出每孔的上清液，作1/2稀释，并根据供应商的建议通过使用特异性试剂盒(Quantikine，R&D Systems)来测定细胞因子的浓度。
RA患者的单核细胞中由F19-6和F19-7肽调控的TNFα水平显示于图8中。在该图中，字母A代表没有用肽进行体外培养的细胞；而B相应于在体外用F19-6肽刺激的细胞，C代表在体外用F19-7肽刺激的细胞。在该图中，当用肽刺激的细胞所分泌的细胞因子水平相对于未经刺激的细胞存在统计学上显著的差异时，在相应细胞因子的水平的柱中标示不同的字母。
如在图8中观察到的，在标为P19和P21的患者中，与未经刺激的细胞相比，F19-6和F19-7肽显著地降低了TNFα的水平，尽管在患者P19中该细胞因子水平的降低比用F19-7肽时更显著。
在标为P13的患者中，F19-6肽增加了TNFα的水平，然而，当用F19-7肽刺激该患者的单核细胞时该细胞因子的水平显著降低。这些结果表明，F19-7肽，尽管将它设计为由大鼠的MHC呈递，但它们可以降低该细胞因子的水平，所述细胞因子主要负责RA的特征性炎症过程，因而该肽是治疗该疾病的潜在治疗候选物。
实施例16对于E18-12和E18-3肽，在RA患者中细胞因子的测量使用RA患者的血液进行了测量细胞因子TNFα、IFNδ和IL-10的测定法。hHsp60的肽增加或减少参与所述疾病的发病机理的不同细胞因子的潜力在这些测定法中进行了评价。
从每位患者抽取10mL血液，将血液在1×PBS中作1/2稀释。将5mL该稀释液加入至在15mL的离心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，并以1200rpm离心30分钟。提取相应于单核细胞的环。随后，细胞用15mL 1×PBS洗涤两次，并在每次洗涤后将它们在900rpm下离心。最后，将沉淀物重悬浮于含有10％胎牛血清并补充有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mML-谷氨酰胺(全部从Gibco BRL获得)的RPMI 1640培养基中。
以800μL的体积，将获得的单核细胞以106个细胞/孔的数目接种在24孔平板(Costar)中。然后，加入浓度为0.5μg/mL-100μg/mL的hHsp60的肽以便获知对于调控所述细胞因子水平来说每种肽的最佳浓度。1％植物凝集素(PHA)用作细胞刺激的阳性对照，而单独的RPMI 1640用作基底细胞生长的对照。
将细胞培养24小时，随后取出每孔的上清液，作1/2稀释，并根据供应商的建议通过使用特异性试剂盒(Quantikine，R&D Systems)来测定细胞因子的浓度。
RA患者的单核细胞中由E18-3和E18-12肽调控的TNFα水平显示于图9中。以P4、P5和P16表示的患者表达DR 0306分子，标识为P7、P8和P12的患者表达DR 0303分子，而P9患者表现出DR0506基因型，和患者P10具有基因型DR 0204。在该图中，字母A代表没有用肽进行体外培养的细胞；而B相应于在体外用E18-3肽刺激的细胞，C代表在体外用E18-12肽刺激的细胞。
在该图中，当用肽刺激的细胞所分泌的细胞因子水平相对于未经刺激的细胞存在统计学上显著的差异时，在相应细胞因子的水平的柱中标示不同的字母。
如在图9中观察到的，在用E18-12和E18-3肽刺激的患者单核细胞中TNFα合成的诱导取决于这些患者表达的II型HLA分子。在表达基因型DR 0306的患者P4、P5和P6中，与没有用肽刺激的细胞相比，观察到TNFα浓度的统计学上显著的增加。
在基因型DR 0506的患者P9和患者P10 DR 0204中发生了相同的效果。
当用我们的肽刺激单核细胞时，在表现DR 0303基因型的患者P7、P8和P12中没有观察到TNFα水平的任何差异。
E18-3和E18-12肽对IL-10水平的调节显示于图9中，其中字母A表示没有用肽进行体外培养的细胞，而B相应于在体外用E18-3肽刺激的细胞，C表示在体外用E18-12肽刺激的细胞。
在IL-10的情况下，如在图10中观察到的，在患者P9和P10中该细胞因子显著减少，但是在其余患者中没有显著改变。
从这些观察结果我们可以推断，E18-12和E18-3肽在外周单核细胞中诱导了TH1表型。
原始肽(E18-12或E18-3)的治疗性变体可以通过口服途径施用，因而它们将诱导有助于显著促进减少炎症的耐受机制。
实施例17由衍生型APL肽诱导的RA患者中的细胞因子测量从前面的结果，我们决定使用生物信息学工具在与HLA分子的接触位点处修饰这些相应于T细胞表位的原始肽，从而经修饰的APL型肽将能够将细胞因子的模式改变为调节性表型。此外，在每种这些肽中进行的修饰符合对于大多数由患者表达的HLA分子所报道的肽结合基序，所述修饰在理论上将促进每种肽与不同HLA分子的相互作用。
使用RA患者的血液进行了测量细胞因子TNFα和IL-10的测定法。从hHsp60衍生的APL型肽增加或减少参与所述疾病的发病机理的不同细胞因子的潜力在这些测试中进行评价。此外，在该评价中将原始肽(E18-3，E18-12)包括在内作为试验对照。
在这些测试中评价的APL肽如下MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO5)MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO6)MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO7)MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK(SEQ.ID.NO8)MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO9)MGPKGRTVIILQSLGSPKVTK(SEQ.ID.NO10)MGPKGRTVIILQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO11)MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO12)MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO13)SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO14)
SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO15)SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO16)SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO17)SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA(SEQ.ID.NO18)SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA(SEQ.ID.NO19)SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA(SEQ.ID.NO20)SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA(SEQ.ID.NO21)。
从每位患者抽取10mL血液并在1×PBS中作1/2稀释。将5mL该稀释液加入至在15mL的离心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，并以1200rpm离心30分钟。提取相应于单核细胞的环。随后，细胞用15mL 1×PBS洗涤两次，并在每次洗涤后将它们在900rpm下离心。最后，将沉淀物重悬浮于含有10％胎牛血清并补充有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(全部从Gibco BRL获得)的RPMI 1640培养基中。
以800μL的体积，将获得的单核细胞以106个细胞/孔的数目在24孔平板(Costar)中进行培养。细胞用浓度为40μg/mL的肽[E18-3、E18-12、E18-3APL1(SEQ.ID.NO18)、E18-3APL2(SEQ.ID.NO21)、E18-12APL1(SEQ.ID.NO5)、E18-12APL3(SEQ.ID.NO12)]进行刺激，一式三份。RPMI 1640用作基底细胞生长的对照。
将细胞培养24小时，随后取出每孔的上清液，作1/2稀释，并根据供应商的建议通过使用特异性试剂盒(Quantikine，R&D Systems)来测定细胞因子的浓度。
在图11中显示了由原始肽(E18-12和E18-3)和一组APL型肽(E18-3APL1(SEQ.ID.NO18)；E18-3APL2(SEQ.ID.NO21)；E18-12APL1(SEQ.ID.NO5)；E18-12APL3(SEQ.ID.NO12))引起的IL-10的水平。在该图中，字母表明了统计学上显著的差异(我们仅指单独地每位患者中不同肽和对照细胞之间的统计学显著性)。此外，患者P4和P6的细胞没有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。显然，在所有患者中，相对于未经刺激的细胞，肽E18-3APL1十分显著地增加了IL-10的水平。在一些患者(如P2和P4)中由该肽引起的增加比由未经刺激的细胞产生的量高大约9倍，并且在患者如P1、P3和P5中高大约5倍。此外，由于在患者P1、P4和P6中IL-10水平的显著增加，用E18-12APL1获得了相似的结果。另一方面，与代表阴性对照的细胞相比较，原始肽或肽E18-3APL2和E18-12APL3都没有引起IL-10水平的增加。
在图12中显示了同一组患者中由不同肽引起的TNFα水平。在该图中，字母表示统计学上显著的差异(我们仅指单独地每位患者中不同肽和对照细胞之间的统计学显著性)。此外，患者P4和P6的细胞没有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。如可作出评价的，所有患者都没有以相同的强度对不同肽的刺激作出应答，尽管众所周知该应答是相当均一的。另一方面，更多地增加TNFα产量的肽是E18-12APL1，主要是在患者P4和P5中，然而与阴性对照相比患者P1、P2和P3显示了稍微的增加。此外，肽E18-3APL1在多数患者中具有相似的行为。在肽E18-3APL1的情况下，患者P2、P4和P5的细胞显示了TNFα水平较多的增加，尽管较不显著。在该测试中，我们获得了与前面使用原始肽的评价相似的结果。前面的结果表明，肽或其APL都没有在患者的单核细胞中引起TNFα表达的降低。
这些结果可能是矛盾的，因为此类增加IL-10产生的APL促进了TNFα水平的增加。在图13中显示了由原始肽和它们的APL所引起的IL-10和TNFα的水平的比率。在该图中，字母表示统计学上显著的差异(我们仅指单独地每位患者中不同肽和对照细胞之间的统计学显著性)。此外，患者P4和P6的细胞没有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。明显的是，IL-10的增加相对于TNFα水平来说要高得多，因为在6位患者的4位中用E18-3APL1刺激的细胞显示了高于1的指数，这表明IL-10的水平超过了TNFα的水平。此外，在所有患者中，相对于构成阴性对照的细胞，在用肽E18-3APL1刺激的细胞中IL-10的水平要高得多，显示了统计学上显著的差异。在E18-12APL1的情况下，相对于阴性对照的差异不是那么显著。所以，尽管E18-3APL1增加了TNFα的水平，但净主要效果是IL-10水平的增加，这可以理解为使应答偏向于有利于免疫抑制性细胞因子的方向。
该研究的结果是非常有前景的，因为它暗示这两种APL可以施用给患者并且可以诱导能分泌IL-10的调节性T细胞的亚群，其介导全身水平的主动抑制。通过分析这些结果我们可以得出的另一部分结论是，这些APL几乎在所有经研究的患者中展示了均一的行为，而不依赖于他们具有的基因型。这些结果非常令人鼓舞，因为它将使得这些APL的施用在所有患者中具有相同的效果，而不考虑在他们所具有的HLA-II分子类型方面存在的差异。
根据我们的试验结果，本发明的基本优势是含有相应于T细胞表位的人热休克蛋白Hsp60的免疫调节肽或这些肽的APL型变体的药物组合物的用途，所述药物组合物可有效地用于治疗RA患者，诱导特异性的免疫应答，所述免疫应答旨在沉默涉及该疾病的免疫病理机制的自身反应性T细胞克隆。
我们在本发明中提出的治疗是合理的并可以扩展至大量的患者，并且其也可以与目前用于该疾病的疗法相组合地使用。
实施例18在其中用Mt诱导了关节炎的动物模型中，APL型衍生肽的治疗效果的评价将动物分成12组，每组8只大鼠。在11组动物(组I-组XI)中诱导疾病，其中10组用肽治疗，1组保留用作疾病诱导的对照。在用Mt诱导疾病后12、14、16、18、20、22、24、26天，用肽治疗的动物组中每只大鼠接受在100μL体积的PBS中的50μg肽。
将分成12组的动物以以下方式进行处理 组I接受肽E18-12(SEQ.ID.NO1) 组II接受相应于SEQ.ID.NO5的肽 组III接受相应于SEQ.ID.NO8的肽
组IV接受相应于SEQ.ID.NO12的肽 组V接受相应于SEQ.ID.NO13的肽 组VI接受肽E18-3(SEQ.ID.NO2) 组VII接受相应于SEQ.ID.NO14的肽 组VIII接受相应于SEQ.ID.NO15的肽 组IX接受相应于SEQ.ID.NO16的肽 组X接受相应于SEQ.ID.NO17的肽 组XI不接受肽(疾病诱导的对照) 组XII没有诱导疾病或施用任何肽(阴性对照)。
诱导后第21和35天，每组处死数只动物，取出脾脏并从关节取得样品以用于组织病理学分析。
在用APL型肽治疗的动物组中，与未经治疗的动物组和用E18-12和E18-3治疗的组相比较，临床改善明显。
这些结果得到了组织病理学分析和细胞因子测量的证实，证明在所有情况中APL型衍生肽优于原始肽。
在图14中，我们显示了属于这种动物模型的四组动物中该疾病的演变图。在本情况中，所述的组是组I(用E18-12治疗的动物)、组II(用E18-12APL1 SEQ.ID.NO5治疗的动物)、组XI(疾病诱导的对照)和组XII(健康动物)。在该图中，不同字母表示显著的差异(p＜0.001)(其指在指定的测量日，所有组之间的统计学显著性)。
在该图中可以看出，从诱导疾病后第12天开始，组I、II和XI的动物开始显示RA的特征性临床征兆。许多动物还显示出关节外的表现如耳、尾和四肢中的小结。第20天左右，在三个患病动物组中观察到最严重的RA表现。在用E18-12治疗的动物中，在第21天，我们没有看出相对于疾病诱导对照组的显著差异。然而，在诱导疾病后第35天左右，该组动物中的临床征兆显著低于组XI的那些(p＜0.001)。这些结果表明，E18-12肽的保护性效果在第35天左右显现。从该意义上来说，推荐在疾病早期施用该肽以便在第21天获得更好的结果。然而，在组II动物的情况下，与组I和XI相比，炎症的临床征兆明显更小(p＜0.001)，这表明该肽在诱导了疾病的动物中发挥了强而有效的保护作用。
序列表<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología<120>HSP60的肽和APL型衍生物及药物组合物<130>pepMC<140>
<141>
<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>1Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>2Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly20 25
<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>3Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Leu Asp Ala Ala1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>4Ile Ile Asp Pro Thr His Val Val Arg Thr Glu Leu Leu Asp Ala Ala1 5 10 15<210>5<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>5Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20
<210>6<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>6Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Met Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>7Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Ala Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>8<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>8
Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Leu Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>9<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>9Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>10<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>10Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Leu Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>11<211>21
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>11Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>12<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>12Met Gly Pro Lys Leu Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>13<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>13Met Gly Pro Lys Leu Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20
<210>14<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>14Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>15<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>15Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Ser1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>16<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽
<400>16Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Ser1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>17<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>17Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>18<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>18Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Leu Val Ala Ash Asn Thr Ash Glu Glu Ala20 25<210>19
<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>19Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Ala Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>20<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>20Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Ala Asn Glu Glu Ala20 25<210>21<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>21Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val
1 5 10 15Gln Leu Val Ala Asn Asn Ala Asn Glu Glu Ala20 2权利要求
1.构成T细胞表位的60kDa人热休克蛋白的肽，所述肽用于在类风湿性关节炎患者中诱导外周耐受机制，特别是引起无变应性的机制或由调节性T细胞克隆介导的机制，其特征在于具有以下序列E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)E18-3SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG(SEQ.ID.NO2)F19-6IIDPTKVVRTALLDAA(SEQ.ID.NO3)。
2.根据权利要求1的肽，其特征在于是肽E18-12(SEQ.ID.NO1)的APL型衍生肽，其在与人MHC分子的接触位点处进行修饰，其中氨基酸序列MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK1 2 34 56 7在下列位置处进行置换位置1置换为A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，位置4置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y。
3.根据权利要求2的APL型衍生肽，其具有选自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO5、SEQ.ID.NO6、SEQ.ID.NO7、SEQ.ID.NO8、SEQ.ID.NO9、SEQ.ID.NO10、SEQ.ID.NO11、SEQ.ID.NO12和SEQ.ID.NO13。
4.根据权利要求1的肽，其特征在于是肽E18-3(SEQ.ID.NO2)的APL型衍生肽，其在与人MHC分子的接触位点处进行修饰，其中氨基酸序列SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA1 2 3 45 6 7 8在下列位置处进行置换位置1置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置换为L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置换为A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。
5.根据权利要求4的APL型衍生肽，其具有选自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO14、SEQ.ID.NO15、SEQ.ID.NO16、SEQ.ID.NO17、SEQ.ID.NO18、SEQ.ID.NO19、SEQ.ID.NO20和SEQ.ID.NO21。
6.根据权利要求1的肽，其特征在于是肽F19-6(SEQ.ID.NO3)的APL型衍生肽，其在与大鼠MHC分子的接触位点处进行修饰，其中氨基酸序列IIDPTKWRTALLDAA (F19-6)1 2在位置1处置换为H，在位置2处置换为E，从而产生了肽F19-7(SEQ.ID.NO4)。
7.药物组合物，其含有一种或多种权利要求1-6的肽以及可药用载体或赋形剂。
8.根据权利要求7的药物组合物，其用于治疗类风湿性关节炎。
9.治疗类风湿性关节炎的方法，包括向患者施用有效量的根据权利要求1-6中任一项的肽或根据权利要求7的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及形成T细胞表位的60－kDa人热休克蛋白的肽以及从其衍生的肽，所述衍生的肽在与MHC分子的接触位点处进行修饰，它们可用于在类风湿性关节炎患者中诱导外周耐受机制，特别是引起无变应性的机制或由调节性T细胞克隆介导的机制。本发明还涉及含有这样的肽的药物组合物，其用于治疗类风湿性关节炎。
文档编号A61K38/17GK101065398SQ200580040389
公开日2007年10月31日 申请日期2005年9月22日 优先权日2004年9月24日
发明者M·D·C·多明格斯奥尔塔, G·R·帕德龙帕洛马雷斯, N·洛佩斯马林, N·洛伦索佩雷斯, A·巴尔贝拉贝当古, A·埃尔南德斯加西亚, V·莫雷拉科尔多瓦, C·科斯梅迪亚斯, N·J·梅里诺加西亚, A·巴斯克斯博纳切亚, J·苏亚雷斯阿尔巴 申请人:遗传工程与生物技术中心