专利名称：一种预测妊娠不良结局发生风险的方法
技术领域：
本发明涉及利用血管和内皮功能调节通路上的重要酶基因的单核苷酸多态性(SNP)体外预测妊娠不良结局发生风险的方法，包括先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫等妊娠不良结局，属于医药领域。
背景技术：
生殖生育健康是涉及母婴健康、家庭幸福和人口社会可持续发展的世界性问题。妊娠期间发生先兆早产和早产(Preterm)、胎儿宫内发育迟缓(Uterus GrowthRetardation，UGR)和出生低体重(Low Birth Weight，LBW)、以及妊娠高血压综合症(pregnancy induced hypertension syndrome，PIHs)和其重度临床表现的先兆子痫和子痫等三大妊娠不良结局，是损害围产期母子健康、影响孕产妇和新生儿、婴儿死亡和相关疾患地的最常见和最主要的原因。在孕前、孕中早期预防最常见和主要的生殖健康问题，对提供围产期母婴健康水平意义十分重要。
早产(Preterm delivery)指在妊娠28-37足周(196-258日)之间终止而分娩者。先兆早产指在妊娠28-37周之间出现临产前兆，伴有宫颈管展平和宫口扩张。伴有见红和胎膜早破的早产一般较难控制，而一旦出现宫口扩张，颈管展平，则往往发展至早产分娩。全国2002～2003年早产儿回顾调查表明，77所城市医院一年6179名新生儿中，产科出生的早产发生率7.8％，住院病人中早产儿占19.7％，性比1.67∶1。胎龄32-36周占63.5％。出生低体重(＜1500g)占32.3％。早产的高危因素依次为母亲流产史(36.8％)、多胎(20.1％)、胎膜早破(19.8％)和妊高症(12.6％)。中华医学会儿科学分会新生儿学组，中国城市早产儿流行病学初步调查报告，中国当代儿科杂志，2005，7(1)25-28其他引发早产的临床常见因素还有母亲的急性感染性疾病、生殖器异常和胎儿本身的疾病。约30％的早产无明显原因。
低出生体重指足月出生的新生儿体重低于2500克。极低出生体重儿＜1500克。早产和低出生体重儿是围产儿死亡和疾病的主要原因。低出生体重儿发病率为4.52％(476/10522)，各年间没有明显变化，其中早产发生率达到一半(53.57％)，足月产和过期产分别为36.13％和10.29％。王刚琴，袁蜀豫，出生体重儿发生的相关因素分析与结局，中华现代妇产科学杂志，2006，3(1)14临床观察发现，低出生体重的发病因素与早产、胎膜早破、妊娠高血压综合征、多胎妊娠等有关。既往早产次数越多，本次妊娠发生早产的可能越大。第一次妊娠分娩新生儿体重≤1.5kg的产妇，第二次妊娠发生早产的机会为50％。
妊娠期女性人群高血压最常见的是妊娠期高血压综合症(简称妊高症)。孕前有原发性高血压者，定义为慢性高血压合并妊娠。孕前血压正常，孕中期才开始血压升高，定义为妊娠高血压综合症。妊高症多发生在妊娠20周后至产后2周，发展为重度妊高症，则为先兆子痫(Preeclampsia)和子痫(Eclampsia)。我国参照WHO的建议分类标准，1983年制定了现行分类法(见表1)余振球等主编，《实用高血压学》科学出版社，1998年第二版，609-23页表1.妊娠高血压综合症分类
注血压如不符合以上标准时，则以其收缩压或舒张压之高者为标准，例如血压为150/110或170/100均按重度妊高症计之。
妊高症是孕产妇人群特有的一种全身性疾病，临床上主要表现为水肿、高血压、蛋白尿三大症候群。患者伴有头痛、眼花、甚至抽搐、昏迷。妊高症总体发病率为5-15％，我国的发病率为9-10％。我国妊高症科研协作组90年代370万人群调查显示，妊高症平均发病率9.2％，轻中重度先兆子痫和子痫的发病率分别为4.7％、2.6％、1.7％和0.2％，慢性高血压合并妊娠仅为0.2％全国妊高症科研协作组，全国妊高症流行病学调查，中华妇产科杂志，1991，2667-70。妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性，使胎儿子宫内生长迟缓、低氧血症、酸中毒、早产、新生儿低出生体重；还可使母亲出现子痫、脑出血、胎盘早剥、弥漫性血管内凝血、肝出血、肾衰、肺水肿、中风，甚至危及生命。调查表明，轻度先兆子痫随诊病人，早产率显著高于普通人群，达13-54％。惊厥和胎盘早剥发生率分别为0.2％和1％，胎儿或新生儿死亡率约1％，胎儿生长迟缓出现率5-13％。
妊娠不良结局的病因深层机制尚不清楚。既往研究已知，妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性，是引起早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的重要因素之一。目前认为，妊高症最具特征性的病理改变是子宫-胎盘单位缺血缺氧和全身广泛小血管内皮损伤。子宫-胎盘缺血可能是妊高症及发生先兆子痫的起始环节，胎盘血灌注不足导致其代谢改变，释放某种因子进入外周血循环，引起广泛血管内皮细胞损伤，继而导致血管收缩痉挛、凝血系统功能变化、体液重新分流；可能是妊高症临床表现及其多器官功能障碍，以及由妊高症进一步发展导致多种不良妊娠结局的早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重相关病理机制的基础。有报道，先兆子痫病人的HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板计数下降)和妊娠34周前母婴病死率明显增加。另有研究提示，妊娠期滥用中枢神经兴奋剂可卡因，造成局部的麻醉和缩血管作用，可致离体胎盘强烈收缩，加强一种缓激酞诱导的缩血管物的作用，可明显降低胎儿血供，而致缺氧，导致胎儿宫内发育迟缓。妊娠期间生活过度紧张或有严重生活事件打击，可导致早产。由此提示了，子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤，可能多组妊娠不良结局的共有的重要深层病因机制线索。
要发现并早期预测先兆早产和早产、以及宫内发育迟缓或低出生体重等妊娠不良结局，早期发现高危妇女人群给予预防和治疗，目前在内在病因尚不完全清楚情况下，早期识别高危人群，目前仍依赖于临床流行病的一些危险因素。如年轻初孕妇、高龄初产妇、有妊高症或先兆子痫病、或先兆早产、或低出生体重史、高体重指数者，家族高血压、肾炎、或糖尿病病史者，多胎妊娠、羊水过多、葡萄胎患者，经济条件差，营养不良，重度贫血者；妊娠期心理社会压力大，对妊娠恐惧、精神过分紧张或受刺激者，生活卫生状况差，伴有急性或慢性生殖系统炎症；母亲本人为低出生体重儿、早产儿，或有慢性高血压病史、糖尿病、凝血异常和脂代谢异常者。但这些指标还不够敏感和特异。寒冷季节、气压升高时妊娠不良结局的发病也会增多。
既往研究提示，妊高症、早产和低出生体重等妊娠不良结局都称为复杂遗传疾病，是环境与遗传共同作用导致的复杂疾病特征，都有家族遗传倾向。有妊高症家族史的孕妇要比无家族史者发病率高8倍，表明孕妇对妊高症的易感性具有遗传特性王志坚，余艳红。妊娠高血压综合症合并胎儿生长受限胎盘组织血管细胞粘附因子1的表达。中华围产医学杂志，2003；675-7。
妊娠不良结局都倾向于多基因遗传，确切的遗传基础尚不十分清楚。目前研究较多发病相关基因有1、调节血压和体液量的易感基因血管紧张素原基因(angiotensinogen，AGT)、Ag-II 1型受体基因(angiotensin I receptor，AT-1)、血管紧张素转化酶基因(angiotensin-converting enzyme，ACE)；2、血栓形成的易感基因凝血因子V leiden突变、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate，MTHFR)、凝血酶原基因、凝血酶原调节蛋白(thrombomodulin，TM)；3、与内皮细胞功能相关的基因一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide sythase gene，eNOS)；4、参与脂质代谢的易感基因脂蛋白脂肪酶基因(lipoprotein lipase gene，LPL)、载脂蛋白E基因(apolipoprotein E，apo E)；5、与免疫相关的基因人类白细胞抗原(HLA)易感基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因和启动子；6、与线粒体相关的易感基因细胞色素C氧化酶和长链-3-羟乙酰-辅酶A脱氢酶。7、印迹基因。
疾病相关的候选基因多态性是疾病发生风险个体差异性的重要遗传学基础。功能基因组学是基于的DNA检测疾病发生相关候选基因多态性手段。妊高症易感基因的遗传特征，还表现为单核苷酸点变异形成人群中在基因多态性，即不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异特征。生物学通路上重要酶基因上SNP突变，可以是无意义的、隐性的，也可能会造成重要酶活性和整个生物学功能改变，甚至影响整个生物学通路功能，直接与临床个体发病差异有关。据估算，平均每1000对基因碱基会出现一个SNP，而两个无关个体间大约有300万个SNP。这种个体间遗传学上的差别造成的发病风险差异可以达上百倍之多。如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)在患病人群中进行SNP检测，能够预测患者发生某一特定疾病特征的可能程度，从而为疾病诊断提供新的辅助依据。另外，还可帮助认识疾病或其某症状的发生和控制机制。
妊高症易感基因的遗传特征，还可以帮助推测与妊高症相关的染色体片段。目前已发现与妊高症相关的染色体片段包括6号染色体；17号染色体(血管紧张素转化酶)；21号染色体(超氧化物歧化酶基因)；3号染色体(血管紧张素I型受体)Brought PF.What is the place of genetics in the pathogenesis of preeclampia.BiolNeonate，1999，76325-330。
2004年6月30日授权公告的专利(授权公开号CN 1155722C；发明名称孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法)中所谓的报警基因包括了N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因，可用于在孕前诊断子代是否会发生神经管畸形。
为了克服临床预测妊娠不良结局依赖临床经验、灵敏和特异指标低下之不足，需要利用生物样本的遗传标记特征信息，建立一种预测妊娠不良的发生风险的方法，帮助提高预测效率。这将有助于更早期有效保护妊娠不良结局的高危人群，减少临床不良预后风险，降低医疗治疗的盲目性和高成本，提高围产期母婴生活质量。
发明内容
本发明的目的就是提供一种早期、安全、方便、快速且灵敏的、通过测定生物样本与体外预测与妊娠不良结局，包括先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、以及妊娠高血压综合症和子痫等，共同相关的脯氨酸羧肽酶基因上的多态性位点基因型，可在孕前预测母亲妊娠不良结局发生风险的方法，降低临床预防和控制妊娠不良结局上的盲目性和滞后性，改善公共卫生和临床辅助诊断水平，早期发现个体差异和高危人群，减少孕产期间的妊娠不良结局发病率、并发症和病死率。该方法还可用于研制预测妊娠不良结局发生风险的预测试剂盒。
为实现上述发明目的，采取以下技术方案本发明的预测妊娠不良结局发生风险的方法，通过测定来自受试者的生物样品中脯氨酸羧肽酶基因(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)的多态性位点E112D的基因型来预测妊娠不良结局的发生风险当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高。
脯氨酸羧肽酶是血管和内皮功能调节通路上的关键酶，PRCP E112D(rs2298668)多态性位点和妊娠不良结局的发生有关，具有显著预测效果。具体的，当(1)所述PRCP位点基因型为112EE纯合野生型时，预测妊娠不良结局发生率较低；(2)所述的PRCP位点基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率较高；
(3)当妊娠妇女合并慢性高血压且PRCP基因型为112EE杂合型时，上述预测效果更加明显，即预测PRCP EE纯合野生型基因型的无高血压的妊娠妇女发生妊娠不良结局概率，低于伴有慢性高血压的妊娠妇女。
(4)预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型的妊娠妇女，若合并慢性高血压时，妊娠不良结局发生率极高于其他PRCP基因型的妊娠妇女。
在本发明的上述方法中，所述预测的妊娠不良结局包括先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫等妊娠不良结局，这些不同阶段的妊娠不良结局，可能在子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤上具有共同的发病发展的病理机制。
上述PRCP的多态性位点E112D(rs2298668)的基因型除了直接进行测定外，还可以通过测定该位点附件与之存在连锁不平衡的其它多态性位点基因型来确定，这样的多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明中，可利用多态性分型寡核苷酸来检测上述多态性位点的基因型。优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断，它能够检测血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP基因的多态性位点基因型，和/或(2)用于检测血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP基因的多态性位点的核酸杂交。优选地，所述寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
由此，本发明预测妊娠不良结局发生风险的方法，具体可包括以下步骤1)利用上述多态性分型寡核苷酸检测来自个体的样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；2)建立含有检测样品PRCP多态性位点基因型的预测模型；3)根据所述多态性位点基因型预测妊娠不良结局的风险，以及合并伴随慢性高血压者发生妊娠不良结局的风险。
在本发明所述的方法中，可用于预测妊娠不良结局发生风险的的多态性位点至少包含上述PRCP的E112D(rs2298668)多态性位点，还可以进一步包含其它的与与之存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明所述的方法中，测定所述多态性位点的基因型可以使用选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、测序法、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者试剂盒。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、测序法、Teqman基因扫描技术是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。
本发明对于位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测以妊娠不良结局发生率为核心的其他风险均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测妊娠不良结局发生率的事例。
在本发明所述的方法，其中所述来自个体的生物样品选自如外周全血、外周血细胞、白细胞、血清等的血液样品，尿液、唾液等体液样品，口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织等组织样品，组织样分泌物、排泄物样本，培养细胞，优选的，所述样品为血液样品，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总核酸。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一种重要的血管紧张素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先发现。PRCP在pH等于5时，具有最佳的酶活性，当pH升高到7时酶活性只剩下最大时的20-50％。PRCP属于丝氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在内皮细胞的外膜表达。PRCP是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和激肽-缓激肽系统(KKS)之间的调节剂，是血管和内皮功能的另一种重要的调节系统。PRCP降解血管紧张素II，使得具有强烈缩血管活性的血管紧张素II转变成具有舒血管活性的血管紧张素1-7，参与RAAS系统功能的调节。此外，PRCP还是一种独立于XIIa之外的血浆激肽酶原激活物，能够使得激肽酶原激活生成缓激肽。由于PRCP既能降解血管紧张素II，增加血管紧张素1-7的生成又能促进缓激肽的释放，两种作用都能使得NO的生成增多，进而舒张血管，起到降低血压的作用。
脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人类11号常染色体的长臂上(11q14)，编码一种溶酶体酶，作用是酶切如血管紧张素II、血管紧张素III和缓激肽等肽类与脯氨酸连接的C末端氨基酸。位于其外显子上的一个A-C的碱基突变，导致了第112位氨基酸(Glu)由谷氨酸变成天门冬氨酸(Asp)。我们研究发现，该多态性位点与PRCP的mRNA的表达及活性等有关。鉴于PRCP对RAAS系统和血压的重要调节作用，该功能性单核苷酸多态性位点很有可能会影响到ACEI类药物的药物作用。但利用该位点预测妊娠不良结局的方法和试剂盒尚无文献报道。
常见的单核苷酸多态性(SNP)位点可以位于基因的外显子部位、内含子部位和非编码区部位，优选为外显子部位，尤其是能改变编码的氨基酸序列的多态性位点。
本发明涉及的研究发现发现并早期预测先兆早产和早产、以及宫内发育迟缓或低出生体重等妊娠不良结局，早期发现高危妇女人群给予预防和治疗，在内在病因尚不完全清楚情况下，早期识别高危人群，目前仍依赖于临床流行病的一些危险因素。但这些指标还不够敏感和特异。既往研究提示，妊高症、早产和低出生体重等妊娠不良结局都称为复杂遗传疾病，是环境与遗传共同作用导致的复杂疾病特征，都孕妇对妊娠不良结局的易感性具有遗传特性家族遗传倾向。
妊娠不良结局的病因深层机制尚不清楚。既往研究已知，妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性高血压，是引起早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的重要因素之一。目前认为，妊高症最具特征性的病理改变是子宫-胎盘单位缺血缺氧和全身广泛小血管内皮损伤。子宫-胎盘缺血可能是妊高症及发生先兆子痫的起始环节，胎盘血灌注不足导致其代谢改变，释放某种因子进入外周血循环，引起广泛血管内皮细胞损伤，继而导致血管收缩痉挛、凝血系统功能变化、体液重新分流；可能是妊高症临床表现及其多器官功能障碍，以及由妊高症进一步发展导致多种不良妊娠结局的早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重相关病理机制的基础。有报道，先兆子痫病人的HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板计数下降)和妊娠34周前母婴病死率明显增加。另有研究提示，妊娠期滥用中枢神经兴奋剂可卡因，造成局部的麻醉和缩血管作用，可致离体胎盘强烈收缩，加强一种缓激酞诱导的缩血管物的作用，可明显降低胎儿血供，而致缺氧，导致胎儿宫内发育迟缓。妊娠期间生活过度紧张或有严重生活事件打击，可导致早产。由此提示了，子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤，可能多组妊娠不良结局的共有的重要深层病因机制线索。
流行病学资料提示，妊娠不良结局有家族遗传倾向，有妊高症家族史的孕妇要比无家族史者发病率高8倍，表明孕妇对妊高症的易感性具有遗传特性，但目前该病确切的遗传基础还不十分清楚，能调节血压、体液量、胎盘生长、血栓形成、血管重铸、血管内皮细胞功能的基因都可能是妊高症的易感基因。因此，建立能预测妊娠不良结局发生相关遗传特征的试剂盒，可能使识别妊娠不良结局的高危妇女的更早更准确，使从进入育龄妊娠到生产各期能够尽早采取预防措施和处理措施，能最大限度减少发病率、并发症和病死率，是挽救和治疗妊娠不良结局的关键。
妊娠不良结局是一组多基因疾病。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotension system，RAAS)基因可能在妊娠不良结局的发病机制上是主要深层次的病因候选基因。RAAS是一种激素内分泌系统，循环RAAS即肾脏来源的肾素，在外周血中使肝脏合成的血管紧张素原，转变为血管紧张素I，再在肺脏经血管紧张素转换酶的作用，转变成血管紧张素II(Ang II)；Ang II分泌到血液中，随血流至远端靶器官(血管、心脏、脑、肾脏、肾上腺等)，与靶器官上的特异性受体结合，调节心血管系统和水电解质平衡。很多外周靶器官(如血管、心脏、脑、肾脏、肾上腺、胎盘、子宫、卵巢、睾丸等)存在局部RAAS的成分。RAAS的主要成分包括肾素、血管紧张素转换酶、血管紧张素酶原、血管紧张素I、血管紧张素II和它们的受体，都存在于胎盘。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一种重要的血管紧张素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先发现。PRCP在pH等于5时，具有最佳的酶活性，当pH升高到7时酶活性只剩下最大时的20-50％。PRCP属于丝氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在内皮细胞的外膜表达。PRCP是RAAS和激肽-缓激肽系统(KKS)之间的调节剂，是血管和内皮功能的另一种重要的调节系统。PRCP降解血管紧张素II，使得具有强烈缩血管活性的血管紧张素II转变成具有舒血管活性的血管紧张素1-7，参与RAAS系统功能的调节。此外，PRCP还是一种独立于XIIa之外的血浆激肽酶原激活物，能够使得激肽酶原激活生成缓激肽。由于PRCP既能降解血管紧张素II，增加血管紧张素1-7的生成又能促进缓激肽的释放，两种作用都能使得NO的生成增多，进而舒张血管，起到降低血压和减低血管内皮细胞损害的作用，此外，在妊娠过程中可能细胞对胎盘局部和母亲全身的供血和血压调节或内皮保护上。
脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人类11号常染色体的长臂上(11q14)，编码一种溶酶体酶，作用是酶切如血管紧张素II、血管紧张素III和缓激肽等肽类与脯氨酸连接的C末端氨基酸。位于其外显子上的一个A-C的碱基突变，导致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)。我们研究发现，该多态性位点与PRCP的mRNA的表达及活性等有关。鉴于PRCP对RAAS系统和血压的重要调节作用，该功能性单核苷酸多态性位点很有可能会影响到ACEI类药物的药物作用。但与妊高症、早产和宫内发育迟缓和低出生体重的关系及其预测试剂方法尚无文献报道。
本发明依次发现并证明在综合分析妊娠不良结局层面上，观察妊娠分娩妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在妊娠不良结局患者中比无妊娠不良结局的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊娠不良结局发生率的OR值为4(95％ CI1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测妊娠不良结局的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测妊娠不良结局的发生。
本发明依次发现并证明在各案分析先兆早产和早产层面上，在妊娠妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在先兆早产和早产患者中比无先兆早产和早产的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的先兆早产和早产发生率的OR值为4(95％ CI1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测先兆早产和早产的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测先兆早产和早产的发生。
本发明依次发现并证明在各案分析胎儿宫内发育迟缓和低出生体重层面上，在妊娠妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在胎儿宫内发育迟缓和低出生体重患者中比无先兆早产和早产的胎儿宫内发育迟缓和低出生体重比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的胎儿宫内发育迟缓和低出生体重发生率的OR值为4(95％ CI1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的发生。
本发明依次发现并证明在各案分析妊高症和子痫层面上，在妊娠妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在妊高症和子痫患者中比无妊高症和子痫的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊高症发生率的OR值为4(95％ CI1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测妊高症的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测妊高症的发生。
本发明以慢性高血压进行分层后进一步相关分析，发现并证实与未合并慢性高血压的PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊娠妇女相比较，慢性高血压单独增加了11倍患妊高症的风险，而PRCP E112D杂合型基因型妊娠妇女合并慢性高血压增加了120倍患妊高症的风险。结果提示PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型可以预测妊娠妇女妊高症的发生(见表2)，尤其对于合并慢性高血压的妊娠妇女预测作用更加明显。
应用本发明成果，选择PRCP作为妊娠不良结局的预测基因，增强了目前传统开展的育龄妇女、孕产妇针对妊娠不良结局的预防水平和控制能力。便于社区妇女保健咨询时和/或临床医生对初诊孕妇通过测定PRCP基因多态性位点基因型，为就诊者更科学地提供预测妊娠不良结局和高血压防治的咨询服务，发现和保护高危人群。
图1是使用PCR-RFLP方法检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的凝胶电泳图。
图2是使用Taqman方法检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的荧光图谱。
其中1——167bp片断；2——101bp片断； 3——66bp片断；4——发出FAM荧光区域； 5——发出两种荧光区域；6——发出VIC荧光区域。
具体实施例方式
实施例1测定PRCP基因的多态性位点基因型并预测妊娠不良结局的发生(一)测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA按照常规的分子生物学方法操作。
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干；(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型(a)用PCR仪扩增PRCP功能基因多态位点及其侧翼序列，在5μl PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG(组成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.90μM的正向引物，0.90μM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.25μM.
引物序列为正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.1)反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.2)等位基因特异性探针的序列为VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.3)对应于“T(或Glu)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.4)
对应于“G(或Asp)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件95℃10min，1个循环；92℃15s，60℃1min，50个循环。
(b)在ABI Primer 7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息进行基因型的鉴定将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用SDS 2.1软件中“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断发出FAM荧光者的基因型为Asp/Asp纯合子；发出VIC荧光者的基因型为Glu/Glu纯合子；发出两种荧光者的基因型为Asp/Glu杂合子。
(3)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCPE112D多态性位点根据PRCP E112D基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.5)反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.6)PCR反应体系基因组DNA 15ng/μl，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 1.25mmol/L，10×buffer 1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，dH2O补足总体积至6.55μl。
PCR反应条件94℃预变性3min后；94℃变性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1sec，38个循环周期；最后72℃延伸7min。；得到167bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15μl)PRCP E112D位点PCR产物目的片段长度为167bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10ul，10×NEBuffer#2 1.5μl，AVaII内切酶(其识别片断为G/GWCC，其中W为A或T)4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
基因型结果判定将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，37℃酶切过夜后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为167bp，PRCP基因型为112EE(野生型)；酶切片段为167+101+66bp，PRCP基因型为112ED(杂合子)；酶切片段为101+66bp，PRCP基因型为112DD(纯合子)。
(二)发生妊娠不良结局风险的预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测妊娠不良结局发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将妊娠不良结局病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和妊娠不良结局总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表2)在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，妊娠不良结局发生比例较高(52.6％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为2.7，95％CI为1.1-11.6，p＝0.035。
表2.PRCP基因E112D多态性基因型与妊娠不良结局危险性的相关分析
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％ CI95％可信区间)。
实施例2测定PRCP基因的多态性位点基因型并预测先兆早产和早产的发生(一)测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA按照常规的分子生物学方法操作。(同实施例1)(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型(同实施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCPE112D多态性位点(同实施例1)(二)发生先兆早产和早产风险的预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测先兆早产和早产发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测先兆早产和早产发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测先兆早产和早产发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将先兆早产和早产病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和先兆早产和早产总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表3)在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，先兆早产和早产发生比例较高(36.1％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为1.6，95％CI为1.1-10.6，p＝0.041。
表3.PRCP基因E112D多态性基因型与先兆早产和早产危险性相关分析
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％ CI95％可信区间)。
实施例3测定PRCP基因的多态性位点基因型并预测宫内发育迟缓和低出生体重的发生(一)测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA按照常规的分子生物学方法操作。(同实施例1)(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型(同实施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCPE112D多态性位点(同实施例1)(二)发生宫内发育迟缓和低出生体重风险的预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将宫内发育迟缓和低出生体重病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和宫内发育迟缓和低出生体重总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表4)在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，宫内发育迟缓和低出生体重发生比例较高(47.4％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为1.7，95％CI为1.2-11.2，p＝0.036。
表4.PRCP基因E112D多态性基因型与宫内发育迟缓和低出生体重危险性相关分析
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI95％可信区间)。
实施例4测定PRCP基因的多态性位点基因型并预测妊高症和子痫的发生(一)测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA按照常规的分子生物学方法操作。(同实施例1)(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型(同实施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCPE112D多态性位点(同实施例1)(二)发生妊高症和子痫风险的预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊高症和子痫发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测妊高症和子痫发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊高症和子痫发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将妊高症和子痫病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和妊高症和子痫总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表5)在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，妊高症和子痫发生比例较高(15.8％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为2.9，95％CI为1.2-10.1，p＝0.035。
携带PRCP基因EE基因型的孕妇，妊娠前伴有慢性高血压者与不伴有慢性高血压者相比，患妊高症和子痫的风险显著增加，OR值为8.8，95％CI为3.6-12.7；而妊娠前伴有慢性高血压同时具有PRCP ED杂合基因型的孕产妇，患妊高症和子痫的风险较EE基因型且不伴有慢性高血压者更为显著，OR值为138.。以上结果提示，PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型和妊高症和子痫发生有很显著的预测关联关系。
表5.PRCP基因E112D多态性基因型和慢性高血压与妊高症和子痫危险性相关分析
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI95％可信区间)。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110> 安徽省生物医学研究所<120> 一种预测妊娠不良结局发生风险的方法<130> JSP060090<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1
<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<400> 1gtttgccaaa aggttcagtg actt 24<210> 2<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<400> 2tctccatagt atcgatgttc agcaaac27<210> 3<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 3catagctttc agttcctca 19<210> 4<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 4atagctttca ggtcctca 18<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工序列
<400> 5atggtttgcc aaaaggttca20<210> 6<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 6tgtcaccaaa ggggagagac20
权利要求
1.一种预测妊娠不良结局发生风险的方法，通过测定来自受试者的生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型来预测妊娠不良结局的发生风险当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者为慢性高血压合并妊娠妇女，当其基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率高于无高血压的妊娠妇女；当其基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率明显高于无高血压的妊娠妇女。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自血液样品、体液样品、组织样品、组织样分泌物、排泄物样本、培养细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血液样品选自外周全血、外周血细胞、白细胞、血清；所述体液样品选自尿样、唾液；所述组织样品选自口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的妊娠不良结局包括先兆早产、早产、宫内发育迟缓、低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中测定脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型的方法选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应、PCR-限制性片段长度多态性分析、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、以及Taqman生物检测方法。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过利用多态性分型寡核苷酸检测生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型，其中，所述的多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断，和/或(2)用于检测所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与含有所述脯氨酸羧肽酶基因多态性位点的核酸杂交。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型是通过该多态性位点附件与之存在连锁不平衡的其它多态性位点的基因型来确定的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的其它多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
全文摘要
本发明涉及一种通过测定个体脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型来预测妊娠不良结局发生风险的方法当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高。本发明可在孕前预测母亲妊娠不良结局发生风险，可帮助医生早期识别妊娠不良结局的高危妇女，从进入育龄、妊娠到分娩各期尽早采取预防措施、医疗随诊和适时分娩，减低临床预防和控制妊娠不良结局上的盲目性和滞后性，尽可能降低妊娠不良结局引起的孕产期间的发病率、并发症和病死率。
文档编号A61B10/00GK101063678SQ200610011838
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者邢厚恂, 张岩, 王滨燕, 李志平, 吴涤, 王晓斌, 臧桐华, 徐希平 申请人:安徽省生物医学研究所