专利名称：基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的磁共振成像造影剂及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有骨组织靶向性检测的高效磁共振成像造影剂，本发明还涉及上述磁共振成像造影剂的制备方法。
背景技术：
磁共振成像(MRI)技术现已发展成为临床医疗诊断中的一种常见手段，是诊断肿瘤最为有效的方法之一。为了增强病变组织与正常组织图像之间的对比度和清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。这些造影增强剂绝大多数是利用金属离子的顺磁特性。Gd3+因为具有强顺磁性，它的络合物是目前应用最广泛和最有效的一类造影增强剂。最近的研究结果表明，Gd@C82(OH)40的MRI造影效率是临床所用Gd-DTPA二乙烯三胺五醋酸，DTPA螯合物造影剂的20倍(Mikawa，M.，et al.，Bioconjugate Chemistry，2001.12(4)p.510-514)。此发现表明基于金属富勒烯的水溶性衍生物可用于制作高效的MRI造影剂。然而，由于碳笼表面没有修饰与生物体的某一特定组织有亲和性的功能团，使得该物质不具有靶向性检测性功能，从而在相同的使用剂量下大大降低了检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的之一在于提供基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的高效磁共振成像造影剂。
本发明的另一目的在于提供上述的基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的高效磁共振成像造影剂的制法。
对Gd-络合物的表面进行化学修饰制备对某一特定组织具有靶向性检测的MRI造影剂的广泛研究，启发发明人对金属富勒烯Gd@C82的笼外进行对生物骨组织具有亲和性的功能化修饰，制备针对骨组织靶向检测的高效低毒MRI造影剂。本发明的优点在于表面修饰的磷脂基对骨组织有亲和性，可以使该物质在骨组织处富集，从而在使用很少的剂量下使得骨组织有明显的对比度，实现骨组织病变的早期诊断。
本发明的基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的磁共振成像造影剂，为含Gd的金属富勒烯的水溶性衍生物，该造影剂的分子表达式为Gd@C82Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10或GdaM3-aN@C80Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10或Gd2@C80Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10其中a＝1、2或3；M＝Sc或Er；x＝2～8，y＝12～16；Et为乙基；本发明提供的制备上述造影剂的方法，是利用含Gd的金属富勒烯为原料，在NaH存在下直接与四乙基亚甲基二磷酸酯发生Bingel加成反应，而后再与OH-发生亲核加成反应，来大规模合成笼外修饰磷脂基的金属富勒烯水溶性衍生物，按以下步骤进行(a)取摩尔当量15至30倍于金属富勒烯的四乙基亚甲基二磷酸酯溶于无水、非质子化有机溶剂中(如无水甲苯溶液等)；(b)优选在室温下(如15～30℃)，将步骤(a)得到的溶液滴加到搅拌的含有NaH的金属富勒烯的无水甲苯溶液中，其中所述NaH和四乙基亚甲基二磷酸酯的摩尔比为50～100∶1；所述的金属富勒烯为Gd@C82、GdaM3-aN@C80(式中a＝1、2或3；M＝Sc或Er)或Gd2@C80。
所述的金属富勒烯可分别按如下参考文献制备Gd@C82制备文献见Shu，C.Y.，et al.，Carbon，2006.44(3)p.496-500.
GdaM3-aN@C80制备文献见Dorn，H.C.，et al.，Abstracts of Papers of theAmerican Chemical Society，1999.218p.U726-U726.
Gd2@C80制备文献见Lu，X.，et al.，Carbon，2005.43(7)p.1546-1549(c)优选在室温下(如15～30℃)，将步骤(b)得到的混合物溶液搅拌1～3h，然后边搅拌边滴加去离子水直至无气泡产生，继续搅拌后(优选12～24h)，静置分液，弃除无色甲苯层，将得到的棕色水层进行浓缩，优选将棕色水层用有机溶剂洗涤后再浓缩，所述有机溶剂为分析纯甲苯等。用葡聚糖凝胶做固定相，去离子水做流动相，收集pH＝6～7的棕色色带即为本发明的基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的磁共振成像造影剂。
为提高金属富勒烯的纯度，最好预先对金属富勒烯进行提纯，提纯可用常用的方法，如通过直流电弧放电法制备含有金属富勒烯的碳炱，用二硫化碳(CS2)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲苯等有机溶剂提取结合高效液相色谱分离提纯得到高纯度的金属富勒烯的甲苯溶液，然后用该甲苯溶液进行反应制备本发明的磁共振成像造影剂。
与其它现有技术比较，本发明具有以下特点1.本发明利用磷脂基功能团具有趋骨性的特点来修饰富勒烯造影剂，使其成为靶向性造影剂。
2.本发明制备的基于金属富勒烯的新型MRI造影剂(EMF-TEMDP)造影效率远远优于现临床所用的Gd-DTPA。
3.本发明巧妙利用四乙基亚甲基二磷酸酯具有活性氢的特性在NaH存在下与缺电子的Gd@C82发生Bingel加成反应这一特点，在室温下经过一步反应大量制得含有磷脂基的Gd@C82的衍生物，因而具有简单经济、操作方便和便于实现规模化生产的优点。
4.本发明不需加分离中间产物，有效地利用水溶液中的OH-直接与中间物质发生亲核加成反应，制备出水溶性好的高效MRI显影剂，在很大程度上简化了合成步骤，降低了经济成本。
5.本发明中合成的靶向性造影剂，由于碳笼的存在，有效地保护了有毒的Gd3+离子，防止了其在生理条件下的泄漏，从而大大降低了其毒性。
图1.本发明实施例1基于金属富勒烯Gd@C82的笼外修饰磷脂基的磁共振成像造影剂的制备过程示意图。
图2.本发明实施例1所制备的修饰有磷脂基的水溶性金属富勒烯Gd@C82衍生物(Gd-TEMDP)结构示意图(为简化起见，省略掉OH-)。
图3A.本发明对照例1用反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图。
图3B.本发明实施例1反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图。
图4.本发明实施例1中Gd@C82O2(OH)16(C(PO3Et2)2)10(Gd-TEMDP)、和对照例1中的临床使用造影剂Gd-DTPA在同一浓度下和纯水的体外T1加权像对比图(Gd浓度为4μM，1.5T自旋—回波序列TR/TE＝800ms/15ms，FOV＝17.1×22.8cm2，T＝24℃)。
图5.实施例1 Gd-TEMDP的红外光谱图。
图6.实施例1 Gd-TEMDP在重水中的31P-NMR谱。
图7.实施例1 Gd-TEMDP中不同价态的C1s键合能实验曲线和拟合曲线。
图8.实施例1 Gd-TEMDP中不同价态的O1s键合能实验曲线和拟合曲线。
具体实施例方式
对照例1作为对照，所用的临床使用的马根维显(Gd-DTPA，Magnevist)为钆喷酸葡胺注射液(德国先灵公司生产，先灵药业有限公司分包装。进口药品注册证号H20030138，批准文号国药准字J20030062)，分别配制一系列浓度的水溶液，用翻转—恢复序列测得纵向弛豫时间T1，而后用其倒数对浓度作图，得到表征其水质子弛豫率大小的重要参数R1值3.18mM-1s-1。
实施例1把1g NaH加到Gd@C82(5mg)的无水甲苯溶液(25mL)中，边搅拌边滴加四乙基亚甲基二磷酸酯(10μL)的无水甲苯溶液(0.5mL)，25℃下搅拌1h后，往混合液中缓慢滴加去离子水(50mL)，继续在25℃下搅拌24h，直至甲苯层完全褪色。棕色水层用分析纯甲苯洗涤三次后减压浓缩，用葡聚糖凝胶G-25做固定相，用去离子水作洗脱剂，收集pH＝6～7的棕色组分即为本发明制备的含有趋骨性功能团磷脂基的Gd@C82的水溶性衍生物Gd@C82O2(OH)16(C(PO3Et2)2)10(Gd-TEMDP)。
图1描述了基于金属富勒烯Gd@C82的笼外修饰磷脂基的磁共振成像造影剂的制备过程。
(a)通过直流电弧放电法制备含有金属富勒烯Gd@C82的碳炱，用CS2，DMF，甲苯等有机溶剂提取结合高效液相色谱分离提纯得到高纯度的金属富勒烯Gd@C82的甲苯溶液(A)。
(b)取摩尔当量15倍于A的四乙基亚甲基二磷酸酯溶于适量无水甲苯溶液中(B)。
(c)在室温下，往A溶液中加摩尔当量50倍于四乙基亚甲基二磷酸酯的NaH，然后将溶液B滴加到搅拌的溶液A中即得到混和物溶液C。
(d)将得到的混和物溶液C在室温搅拌1h，然后边搅拌边缓慢地滴加去离子水直至无气泡产生，继续搅拌24h后，静置分液，弃除无色甲苯层，将得到的棕色水层进行浓缩。用葡聚糖凝胶做固定相，去离子水做流动相，收集pH＝6～7的棕色色带即为本发明的笼外修饰有磷脂基的水溶性金属富勒烯Gd@C82衍生物(Gd-TEMDP)。
由图3B得到新制备含有磷脂基的MRI造影剂(Gd-TEMDP)的纵向弛豫率R1为58.0mM-1s-1。由图3A和图3B得到的纵向弛豫率R1比较可知，我们制备的新型造影剂的造影效率是临床使用Gd-DTPA的近20倍。
图4说明该物质的造影效果明显优于临床所用的Gd-DTPA。
图5FT-IR光谱在3427cm-1处的强的吸收峰归属为O-H的伸缩振动，在2979，2930cm-1处的弱吸收峰归属为C-H的伸缩振动。在1616，1392，1205和1048cm-1处的尖的吸收峰归属为C＝C的伸缩振动、O-H的弯曲振动、磷脂基中的P＝O的伸缩振动和C-OH的伸缩振动。在527cm-1的弱吸收归属为C82的骨架振动峰。揭示了所修饰的官能团的存在。
图6中Gd-TEMDP在重水中的31P-NMR谱只在δ16.45ppm处出现了一个单峰，说明该物质中只有一种化学环境的P。
由图7可知
由图8可知
根据新鲜制备Gd-TEMDP的XPS谱中的C1s、O1s和P2p的原子比和各种元素不同化学态的含量比可以推测出该物质的平均分子式为Gd@C82O2(OH)16(C(PO3Et2)2)10。
根据方程式1所示，B在NaH存在下可与A发生Bingel加成反应。加水后，过量的NaH会生成NaOH，OH-与中间产物进一步发生亲核加成反应生成水溶性物质，从而导致黄绿色的Gd@C82的甲苯溶液逐渐变成无色，而下面的水层变成棕色。
实施例2用经过提纯的含Gd的TNT型金属富勒烯，如Gd2ScN@C80(约10mg)配制成甲苯溶液，在NaH存在下与四乙基亚甲基二磷酸酯亦可发生Bingel加成反应，30℃下搅拌2h，其余条件同实施例1。
实施例3用经过提纯的另一种具有造影效果的含Gd金属富勒烯Gd2@C80(约5mg)配制成甲苯溶液，在NaH存在下与四乙基亚甲基二磷酸酯亦可发生Bingel加成反应，23℃下搅拌2h，其余条件同实施例1。
权利要求
1.一种基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的磁共振成像造影剂，其特征是该造影剂的分子表达式为Gd@C82Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10或GdaM3-aN@C80Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10或Gd2@C80Ox(OH)y(C(PO3Et2)2)10其中a＝1、2或3；M＝Sc或Er；x＝2～8，y＝12～16；Et为乙基。
2.一种根据权利要求1所述磁共振成像造影剂的制法，按以下步骤进行(a)取摩尔当量15至30倍于金属富勒烯的四乙基亚甲基二磷酸酯溶于无水、非质子化有机溶剂中；(b)将步骤(a)得到的溶液滴加到搅拌的含有NaH的金属富勒烯的无水甲苯溶液中；所述的金属富勒烯为Gd@C82、GdaM3-aN@C80或Gd2@C80，其中a＝1、2或3；M＝Sc或Er；(c)将步骤(b)得到的混合物溶液搅拌1～3小时，然后边搅拌边滴加去离子水直至无气泡产生，继续搅拌后，静置分液，弃除无色甲苯层，将得到的棕色水层进行浓缩；用葡聚糖凝胶做固定相，去离子水做流动相，收集pH＝6～7的棕色色带即为基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的磁共振成像造影剂。
3.根据权利要求2所述的制法，其特征是步骤(a)中所述无水、非质子化有机溶剂为无水甲苯溶液。
4.根据权利要求2所述的制法，其特征是步骤(b)中所述NaH和四乙基亚甲基二磷酸酯的摩尔比为50～100∶1。
5.根据权利要求2所述的制法，其特征是步骤(b)中所述金属富勒烯用二硫化碳、二甲基甲酰胺或甲苯提纯。
6.根据权利要求2所述的制法，其特征是步骤(c)中所述棕色水层用有机溶剂洗涤后再浓缩。
7.根据权利要求6所述的制法，其特征是所述有机溶剂为分析纯甲苯。
全文摘要
本发明公开了基于金属富勒烯的具有骨组织靶向性检测的高效磁共振成像造影剂及其制法，其分子表达式为Gd@C
文档编号A61K49/06GK101062421SQ20061001177
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者王春儒, 舒春英 申请人:中国科学院化学研究所