专利名称：脑苷肌肽溶液的制备方法及脑苷肌肽注射液制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及脑苷肌肽的制备方法，更具体地说，涉及脑苷肌肽溶液的制备方法。
本发明还涉及通过本发明方法制备的脑苷肌肽注射液制剂。
背景技术：
脑苷肌肽注射液为采用现代生物技术纯化制备的含有复合神经节苷脂和天然活性多肽的药品。神经节苷脂是一种可以直接作用于人神经细胞及中枢神经系统的特效物质，其含量的高低直接影响到神经的生长、修复和再生，并且对神经组织具有高度亲和性，其中单唾液酸神经节苷脂(以下简称神经节苷酯GM1或GM1)是体内含量较高也是最重要的一种神经节苷酯。天然活性多肽以神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)为主，促进脑神经新陈代谢，能够为生命活动及机体病变修复提供高效能量补充和营养支持。
神经节苷脂与小分子多肽，这两种具有重要生理作用的物质，当它们同时作用于同一病理部位时，由于其作用的互补性，所产生的药理学作用远大于两者单独作用时效果的简单加成。
脑苷肌肽有五大作用1.脱水作用 人体组织受到损伤，尤其是颅脑受伤后，会伴发一系列继发性损害，水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿，对于阻止病情发展及预后意义重大。实验证明脑苷肌肽注射液脱水快速，其作用大大优于单纯的神经节苷脂及传统脱水方法。天津医科大学总医院华耀松教授指出，对脑出血病人及时治疗脑水肿及采用其他基础治疗，有可能度过危险期达到康复的目的。
2.解毒、排毒作用 神经细胞损伤后，导致细胞凋亡的一个重要原因是兴奋性氨基酸的神经毒性。脑苷肌肽注射液中的神经节苷脂是目前公认的一种兴奋性氨基酸神经毒性的拮抗剂，能有效拮抗兴奋性氨基酸对脑组织的损害。
脑苷肌肽注射液通过其解毒、排毒的联合作用，阻断了一系列以神经细胞凋亡为终结的病理变化，从而达到了细胞损伤过程中的早期保护作用。
3.纠正离子紊乱、平衡电生理作用 神经系统的损害是以膜损害为开始，进而导致膜功能紊乱、细胞内外离子紊乱、电生理异常、丧失细胞间信息传递，最终导致神经系统瘫痪。
脑苷肌肽注射液在纠正离子紊乱的过程中，其多种神经节苷脂首先以单分子形式直接嵌入细胞膜中，激活细胞膜上的离子泵系统，使其进行膜内外离子平衡的调节。而外源性小分子多肽迅速补充泵能，提供足量的能量物质ATP，使膜上离子泵的调节功能持久。同时，小分子多肽调节膜通道，平衡离子交换，使膜内外离子在脑苷肌肽的作用下达到生理平衡状态。
4.神经修复与再生作用 国内、外的许多研究在离体神经细胞培养和动物试验中发现，神经节苷脂和多肽能促进神经细胞的分化、增殖和生长，恢复或提高神经系统残余部分的功能。这些功能均取得了电生理学和形态学证据。
5.重组神经网络作用 脑苷肌肽注射液中的神经节苷脂，通过促进神经生长、再生的作用，能对受损神经进行重组，形成新生的神经网络，重新执行必需的生理功能。在对心、脑血管及神经系统疾病治疗的过程中，脑苷肌肽注射液中的神经节苷脂与小分子多肽，共同完成了“神经治疗”。其中的小分子多肽能够促进血红蛋白的变构，提高血红蛋白的载氧能力，使血液中富含大量的氧；同时，多肽本身是神经系统的营养物质，又具有抑制血小板聚集和粘附的作用，这样使血液具有了恢复病灶功能的物质基础，形成了“血液治疗”，小分子多肽能与血管紧张素相互作用，激活下游蛋白酶，维持血管松驰与紧张，调节心脑血管及全身循环，形成了“血管治疗”。
现有的脑苷肌肽制剂为脑苷肌肽注射液，是由健康家兔肌肉提取物和牛脑提取物混合制成的无菌水溶液。多肽含量为标示量的85.0％～115.0％，唾液酸为标示量的85.0％～115.0％。
规格和含量分别为2ml:6.4mg(多肽):100μg(唾液酸)5ml:16mg(多肽):250μg(唾液酸)10ml:32mg(多肽):500μg(唾液酸)但现有的脑苷肌肽制剂缺陷在于含有牛脑提取物，属牛源性医药制品，考虑到“疯牛病”已引起全球的广泛关注，针对牛源性医药制品的管理现状及国内有关部门对涉及牛源性制品的管理措施，同时为了保障人民用药的安全，最大限度地降低使用牛源性医药制品传播疯牛病的风险，不同职能部门已有相应的管理措施。因此需要以非牛源性的动物材料代替牛脑来制备脑苷肌肽制剂。
中国专利申请200410013624.3公开了一种注射用脑苷肌肽及其制备工艺，其以动物脑组织，包括牛脑为原料，以甲醇-水混合溶液提取制得含神经节苷酯(GM1)的动物脑组织提取物，另以健康家兔肌肉为原料，制备含小分子多肽的肌肉提取物，二者以等比例混合，并添加赋形剂，制备注射用脑苷肌肽。在该申请的方法中，由于采用甲醇-水混合溶液作为提取GM1的溶剂，极性酯类的污染较为严重，降低了提取物中GM1的含量；制剂中含赋形剂，对含量的测定会造成一定的影响，并且在冻干的过程中造成多肽和GM1的损失；而且在保存的过程中制剂中的赋形剂易与多肽、蛋白产生聚合物，患者使用时存在生物大分子导致过敏反应的危险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑苷肌肽溶液的制备方法，该方法使用非牛源动物脑组织和非牛源动物肌肉组织为材料，制得神经节苷脂含量大于0.05mg/ml，小分子多肽含量大于3.2mg/ml的脑苷肌肽溶液，而且可使产品生物活性成分不受破坏，在低温状态下微生物不易繁殖，保证了产品的卫生学要求。
本发明的另一个目的在于提供一种脑苷肌肽注射液制剂，其含有按照本发明方法制备的脑苷肌肽溶液以及药学上可接受的附加剂，在一个优选的实施方案中注射液制剂中神经节苷脂含量为0.05mg/ml，小分子多肽含量为3.2mg/ml。
为实现上述目的，本发明的脑苷肌肽溶液的制备方法，包括以下步骤1)以非牛源动物脑组织为原料，以氯仿/甲醇混合溶剂从动物脑组织中制备含神经节苷脂的提取物溶液，其中所述氯仿/甲醇混合溶剂的体积比为氯仿∶甲醇＝(1～2)∶1；2)从非牛源动物的肌肉组织中制备含分子量8000道尔顿以下的小分子多肽的提取物溶液；3)按照神经节苷脂∶小分子肽＝(85～115μg)∶(5.44～7.36mg)的比例混合步骤1)中制备的含神经节苷酯的提取物溶液和步骤2)中制备的含小分子多肽的提取物溶液，获得所述脑苷肌肽溶液；其中所述脑苷肌肽溶液中神经节苷酯的含量为大于0.05mg/ml，小分子多肽的含量为大于3.2mg/ml。
而且，为实现上述目的，其中，动物脑提取物溶液的制备过程为取新鲜或速冻保存的动物脑剥离脑膜血管，除去杂质并洗净；将处理好的动物脑匀浆，匀浆液加2～10倍冰丙酮搅拌，-10℃放置，离心，收集沉淀；沉淀用丙酮反复洗涤，沉淀置80℃干燥，得丙酮粉；丙酮粉加入6～15倍氯仿-甲醇的混合液，(其中氯仿、甲醇混合液的配制比例为(1～2)∶1)，室温搅拌，离心，收集上清液，上清液应为清澈的有机溶剂混合液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩，于5％氯化钠/甲醇(1∶1，V/V)混合液中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次以上，合并上层液蒸发浓缩去除甲醇。用分子量6000～10000的超滤膜超滤，取透过液即得动物脑提取物溶液。
为实现上述目的，含有小分子肽的提取物的制备过程为取新鲜或速冻保存的家兔肌肉，摘去脂肪及其它杂质；将处理好的兔肌绞碎，绞成碎块的组织按1～3∶1的比例加入注射用水匀浆；根据要求进行冻融冷冻温度-10℃以下；融化温度20～30℃，冻融3次以上；将冻融液加热至50℃以上，保持20min～40min，得热变性液，迅速冷却至室温，离心，取上清液；离心上清液经高分子量超滤膜除去较大颗粒，滤液用分子量8000～10000及6000～8000超滤膜超滤，透过液装于灭菌容器内即得兔肌提取物溶液。
本发明还提供了一种脑苷肌肽注射液制剂，其含有由权利要求1方法制得的神经节苷酯及小分子多肽，其中单位制剂中的神经节苷酯达到0.05mg/ml，小分子多肽达到3.2mg/ml。
所述脑苷肌肽注射液制剂，可以进一步包含药学上可接受的附加剂。
所述的附加剂包括选自亚硫酸钠(0.1～0.2％重量)、亚硫酸氢钠(0.1～0.2％重量)、焦亚硫酸氢钠(0.1～0.2％重量)或硫代硫酸钠(0.1％重量)的抗氧剂；选自肌酐(0.5～0.8％重量)、甘氨酸(1.5～2.25％重量)、烟酰胺(1.25～2.5％重量)或辛酸钠(0.4％重量)的稳定剂；选自氯化钠(0.5～0.9％重量)、葡萄糖(4～5％重量)或甘油(2.25％重量)的等渗调节剂。
所述单位制剂为每个制剂包装，例如一个安瓿瓶。可供肌肉注射、静脉注射及静脉滴注的注射用制剂。
采用本发明的脑苷肌肽溶液的制备方法制备的脑苷肌肽注射液，其优点在于1.制剂的主要成分神经节苷脂与小分子多肽具有重要生理作用，由于其作用的互补性，所产生的药理学作用远大于两者单独作用时效果的简单加成。
脑苷肌肽具有脱水作用，解毒、排毒作用，纠正离子紊乱、平衡电生理作用，神经修复与再生作用，重组神经网络等作用。
小分子多肽能够促进血红蛋白的变构，提高血红蛋白的载氧能力，使血液中富含大量的氧；同时，多肽本身作为神经系统的营养物质，又具有抑制血小板聚集和粘附的作用，使血液具有了恢复病灶功能的物质基础，形成了“血液治疗”；小分子多肽能与血管紧张素相互作用，激活下游蛋白酶，维持血管松驰与紧张，调节心脑血管及全身循环，形成了“血管治疗”。
在对心、脑血管及神经系统疾病治疗的过程中，神经节苷脂与小分子多肽，共同完成了“神经治疗”。
2.本发明的脑苷肌肽注射液是由非牛源动物脑提取物和健康家兔肌肉提取物混合制成的无菌水溶液。具有药效迅速、剂量准确、作用可靠等优点。与注射用粉针相比具有生产周期短、成本低，价格便宜的优势。
3.本品采用有机溶剂混合物氯仿-甲醇从动物脑组织中提取的总神经节苷脂比用甲醇-水提取的含量高，且其它极性脂类的污染少。
4.本发明的脑苷肌肽注射液经高温、强光等特殊条件以及室温放置2年的稳定性考察，含量测定无明显变化，可以达到质量标准的要求。结果表明制剂稳定。
4.1脑苷肌肽水针制剂在保存过程中，无多聚体的产生，更好的避免了过敏性反应产生的可能性；
4.2脑苷肌肽水针制剂无赋形剂加入，避免了赋形剂对含量测定的影响及冻干过程的含量损失。而粉针制剂在冻干过程中多肽损失约10％，神经节苷酯损失约5％，这无形中降低了制品的活性，增加了患者在使用过程中的注射剂量，同时也就增大聚合体产生的可能性，由此增加了大分子产生过敏反应的几率；4.3脑苷肌肽水针制剂中加入了稳定剂和等渗调节剂，使本品具有更好的安全性与稳定性，长期放置2年以上无降解产物与聚合物的产生；5.本发明的方法简便，可制备神经节苷脂含量大于0.05mg/ml，小分子多肽含量大于3.2mg/ml的脑苷肌肽溶液，能够满足神经节苷脂含量达到0.05mg/ml，小分子多肽达到3.2mg/ml的制剂要求。由于该方法在低温下操作，充分保持了产品的生物活性，而且可抑制微生物繁殖，制得的脑苷肌肽溶液和制剂符合国家药品标准的要求，能够满足临床需要。
本发明的脑苷肌肽水针剂型与冻干粉针剂型相比，优势明显，对比结果如下表脑苷肌肽水针制剂与冻干粉针剂型对比表
图1为本发明脑苷肌肽溶液制备的技术路线及工艺流程图；图2为脑苷肌肽注射液制剂工艺流程。
具体实施例方式
实施例1～3为脑苷肌肽溶液的制备方法，图1为本发明脑苷肌肽溶液制备的技术路线及工艺流程图。
附图左边表示动物脑提取物溶液的制备工艺流程，附图右边表示兔肌提取物溶液制备工艺流程。
以下实施例中如无特别说明，所使用的材料均为市售购买。
实施例1取速冻保存的猪脑100Kg置专用水槽内融化，剥离脑膜血管，除去杂质并洗净；将处理好的动物脑匀浆，匀浆液加4倍量的冰丙酮搅拌，-10℃放置，离心，收集沉淀；沉淀用丙酮洗涤3次，烘干，约得丙酮粉5Kg；丙酮粉加入6倍量的氯仿-甲醇的混合液，(其中氯仿、甲醇的体积比为2∶1)，室温搅拌，离心，收集上清液，上清液应为清澈的有机溶剂混合液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩。
提取的总脂在5％氯化钠/甲醇混合液(1∶1，V/V)中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次以上，合并上层液蒸发浓缩去除甲醇。用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤，收集透过液即得脑提取物溶液。
神经节苷脂含量(唾液酸)测定参比溶液的制备 取唾液酸对照品(Sigma公司，纯度95％)，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中含100μg的溶液。
标准曲线的制备 精密量取参比溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，分别置具塞试管中，各加水至2.0ml，再分别精密加入间苯二酚溶液(取2％间苯二酚溶液10ml、2.5％硫酸铜溶液0.25ml，盐酸80ml，加水至100ml)2ml，摇匀，置水浴中反应15分钟，取出置冷水中10分钟。分别精密加醋酸正丁酯-正丁醇(85∶15)5ml，剧烈振摇后放置15分钟。取上层液于585nm的波长处测定吸收度；以0管作为空白。以测得的吸收度与对应的浓度计算回归方程。
测定法 取上述制备的动物脑提取物溶液，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中约含唾液酸50μg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2ml，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入间苯二酚溶液”起，依法测定，从回归方程求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为唾液酸含量。经含量测定神经节苷酯(唾液酸)含量为2.4mg/ml。
取新鲜或速冻保存的家兔肌肉100kg，摘去脂肪及其它杂质；将处理好的兔肌绞碎，绞成碎块的组织加入注射用水35升匀浆；根据要求进行冻融冷冻温度-10℃以下；融化温度20～30℃，冻融3次以上；将冻融液加热至50℃以上，保持30min，迅速冷却至室温，离心，取上清液；离心上清液经高分子量超滤膜除去较大颗粒，滤液用分子量8000～10000及6000～8000超滤膜超滤，透过液装于灭菌容器内即得兔肌提取物溶液。
多肽含量测定 取上述制备的兔肌提取物溶液，加水制成每1ml中约含多肽0.15mg的溶液，作为供试品溶液，照福林酚法测定。
福林酚测定法碱性铜试液 取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并甲、乙两液，加水至500ml。
操作法(1)对照品溶液的制备 取牛血清白蛋白对照品(中国药品生物制品检定所，纯度99.6％)，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
(2)供试品溶液的制备 取供试品溶液适量，加水制成每1ml中约含多肽0.15mg的溶液。
(3)标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟。以0号管作为空白在650nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
(4)测定法 精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。
经含量测定，制备得到的多肽提取物溶液中小分子多肽含量为15mg/ml。
将上述脑提取物溶液及兔肌提取物溶液按1∶10比例混合配制成脑苷肌肽溶液。
按脑苷肌肽溶液内控标准检测，神经节苷酯含量为206μg/ml，小分子多肽含量为13.1mg/ml，分子量大于10000道尔顿的高分子量物质未检出，性状、鉴别、蛋白质均符合规定。
实施例2取速冻保存的羊脑100Kg置专用水槽内融化，剥离脑膜血管，除去杂质并洗净；将处理好的动物脑匀浆，匀浆液加8倍冰丙酮搅拌，-10℃放置，离心，收集沉淀；沉淀用丙酮洗涤3次，80℃烘干，得丙酮粉5Kg；丙酮粉加入10倍氯仿-甲醇的混合液，(其中氯仿、甲醇的体积比为2∶1)，室温搅拌，离心，收集上清液，上清液应为清澈的有机溶剂混合液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩。
提取总脂于5％氯化钠/甲醇混合液(1∶1，V/V)中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次以上。合并上层液，蒸发浓缩去除甲醇。用分子量8000道尔顿的超滤膜超滤，即得动物脑提取物溶液。
经含量测定神经节苷酯含量为1.8mg/ml。
取新鲜或速冻保存的家兔肌肉100kg，摘去脂肪及其它杂质；将处理好的兔肌绞碎，绞成碎块的组织加入注射用水50升匀浆；根据要求进行冻融冷冻温度-10℃以下；融化温度20～30℃，冻融3次以上；将冻融液加热至50℃以上，保持30min，迅速冷却至室温，离心，取上清液；离心上清液经高分子量超滤膜除去较大颗粒，滤液用分子量8000～10000及6000～8000超滤膜超滤，透过液装于灭菌容器内即得兔肌提取物溶液。
经含量测定小分子多肽含量为18mg/ml。
将上述所述的动物脑提取物溶液及兔肌提取物溶液按1∶6.4比例混合配制成脑苷肌肽溶液。
按脑苷肌肽溶液内控标准检测，神经节苷酯含量为234μg/ml，小分子多肽含量为15.5mg/ml，分子量大于10000道尔顿的高分子量物质未检出，性状、鉴别、蛋白质均符合规定。
实施例3取速冻保存的兔脑100Kg置专用水槽内融化，剥离脑膜血管，除去杂质并洗净；将处理好的动物脑匀浆，匀浆液加10倍冰丙酮搅拌，-10℃放置，离心，收集沉淀；沉淀用丙酮洗涤3次，80℃烘干，得丙酮粉；丙酮粉加入10倍氯仿-甲醇的混合液，(其中氯仿、甲醇混合液的配制比例为2∶1)，室温搅拌，离心，收集上清液，上清液应为清澈的有机溶剂混合液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩，于5％氯化钠/甲醇混合液(1∶1，V/V)中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次以上，合并上层液蒸发浓缩去除甲醇，用分子量8000道尔顿的超滤膜超滤，即得动物脑提取物溶液。
经含量测定神经节苷酯含量为1.2mg/ml。
取新鲜或速冻保存的家兔肌肉100kg，摘去脂肪及其它杂质；将处理好的兔肌绞碎，绞成碎块的组织加入注射用水100升，匀浆；根据要求进行冻融冷冻温度-10℃以下；融化温度20～30℃，冻融3次以上；将冻融液加热至50℃以上，保持30min，迅速冷却至室温，离心，取上清液；离心上清液经高分子量超滤膜除去较大颗粒，滤液用分子量8000～10000及6000～8000超滤膜超滤，透过液装于灭菌容器内即得兔肌提取物溶液。
经含量测定小分子多肽含量为16.8mg/ml。
将上述所述的动物脑提取物溶液及兔肌提取物溶液按1∶4.6比例混合配制成脑苷肌肽溶液。
按脑苷肌肽溶液内控标准检测，神经节苷酯含量为208μg/ml，小分子多肽含量为13.6mg/ml，分子量大于10000道尔顿的高分子量物质未检出，性状、鉴别、蛋白质均符合规定。
氯仿-甲醇混合液与甲醇/水溶液提取脑苷肌肽溶液对比以猪脑为例，取速冻保存的猪脑100Kg两份，分别置专用水槽内融化，剥离脑膜血管，除去杂质并洗净；将处理好的动物脑匀浆，匀浆液加4倍冰丙酮搅拌，-10℃放置，离心，收集沉淀；沉淀用丙酮洗涤3次，80℃烘干，各得丙酮粉约5Kg；
两份丙酮粉分别加入6倍氯仿-甲醇(2∶1)的混合液，8倍甲醇/水(90∶10)的混合液室温搅拌，离心，收集上清液，上清液应为清澈的有机溶剂混合液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩，于5％氯化钠/甲醇混合液(1∶1，V/V)中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次以上，合并上层液蒸发浓缩去除甲醇，用分子量8000道尔顿的超滤膜超滤，即得动物脑提取物溶液。
两种提取液提取神经节苷脂含量(唾液酸含量)测定结果如下
实施例4～6为脑苷肌肽注射液制剂的制备方法，图2为脑苷肌肽注射液制剂工艺流程。
实施例4首先，取实施例1得到的脑苷肌肽溶液12～15L，用10000道尔顿的超滤器超滤，收集透过液于无菌无热原容器，经中间体测定，神经节苷酯含量为204μg/ml，多肽含量为12.9mg/ml；然后，在局部百级洁净区内，按工艺处方准确量取上述中间体10L于配液容器，加无菌无热原的亚硫酸氢钠60g作为辅料，再加注射用水至40L，充分混匀，除菌过滤，将滤液分装入安瓿瓶中随后封口得成品；最后，经检漏、灯检及成品检验合格后，进行包装，入成品库存放。制剂规格有2ml:6.4mg(多肽):100μg(唾液酸)；5ml:16mg(多肽):250μg(唾液酸)；10ml:32mg(多肽):500μg(唾液酸)。
实施例5首先，取实施例2得到的脑苷肌肽溶液11～14L，用10000道尔顿的超滤器超滤，收集透过液于无菌无热原容器，经中间体测定，神经节苷酯含量为229μg/ml；多肽含量为15.2mg/ml；然后，在局部百级洁净区内，按工艺处方准确量取上述中间体10L于配液容器，加无菌无热原的亚硫酸钠60g作为辅料，再加注射用水至45L，充分混匀，除菌过滤，将滤液分装入安瓿瓶中随后封口得成品；最后经检漏、灯检及成品检验合格后，进行包装，入成品库存放。制剂规格有2ml:6.4mg(多肽):100ug(唾液酸)；5ml:16mg(多肽):250ug(唾液酸)；10ml:32mg(多肽):500ug(唾液酸)。
实施例6首先，取实施例3得到的脑苷肌肽溶液10～15L，用10000道尔顿的超滤器进行超滤，收集透过液于无菌无热原容器，经中间体测定，神经节苷酯含量为203μg/ml；多肽含量为13.4mg/ml；然后，在局部百级洁净区内，按工艺处方准确量取上述中间体10L于配液容器，加无菌无热原的甘氨酸600g作为赋形剂，再加注射用水至40L，充分混匀，除菌过滤，将滤液分装入安瓿瓶中随后封口得成品；最后经检漏、灯检及成品检验合格后，进行包装，入成品库存放。制剂规格有2ml:6.4mg(多肽):100ug(唾液酸)；5ml:16mg(多肽):250ug(唾液酸)；10ml:32mg(多肽):500ug(唾液酸)。
实施例7上述的脑苷肌肽注射液，所述的附加剂可以为抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠；稳定剂包括肌酐、甘氨酸、烟酰胺、辛酸钠；等渗调节剂包括氯化钠、葡萄糖、甘油等。
而且，在本发明中，以规格2ml:6.4mg(多肽):100μg(唾液酸)的脑苷肌肽注射液为例，使用各附加剂的具体制剂配方为配方1脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)亚硫酸钠 2.15～4.3g注射用水 至2150ml制成 1000支(每支装量2.15ml)配方2脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)亚硫酸氢钠 2.15～4.3g注射用水 至2150ml制成 1000支(每支装量2.15ml)配方3脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)
焦亚硫酸氢钠2.15～4.3g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方4脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)硫代硫酸钠 2.15g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方5脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)肌酐10.75～17.2g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方6脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)甘氨酸 32.25g～48.375g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方7脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)烟酰胺 26.875～53.75g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方8脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)
辛酸钠 8.6g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方9脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)氯化钠 10.75～19.35g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方10脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)葡萄糖 86～107.5g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)配方11脑苷肌肽中间体 适量(含多肽6.88g，含唾液酸107.5mg)甘油48.375g注射用水至2150ml制成1000支(每支装量2.15ml)本发明的效果与现有剂型的脑苷肌肽相比，本发明制备方法将牛脑提取物改为猪脑、羊脑、兔脑等其他哺乳动物脑，降低了使用牛源性医药制品传播疯牛病的风险。采用有机溶剂混合物氯仿-甲醇从动物脑组织中提取总神经节苷脂，比单纯用甲醇-水提取的神经节苷酯含量高，且其他极性脂类污染少。
制剂优点包括本发明的脑苷肌肽注射液是由健康家兔肌肉提取物和动物脑提取物混合制成的无菌水溶液。具有药效迅速、剂量准确、作用可靠等优点，与注射用粉针相比具有生产周期短，成本低，价格便宜的优势。
脑苷肌肽水针制剂在保存过程中，无多聚体的产生，更好的避免了过敏性反应产生的可能性；脑苷肌肽水针制剂无赋形剂加入，避免了赋形剂对含量测定的影响及冻干过程的含量损失，脑苷肌肽在冻干过程中多肽损失约10％，神经节苷酯损失约5％，这无形中降低了制品的活性，增加了患者在使用产品过程中，对异体蛋白的加大注射剂量，同时也增大聚合体产生的可能性，相对容易产生大分子量蛋白的过敏反应；水针剂型的脑苷肌肽中高浓度稳定剂的加入，使本品具有更好的安全性与稳定性，长期放置2年以上无降解产物与聚合物的产生。
当然，本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种脑苷肌肽溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)以非牛源动物脑组织为原料，以氯仿/甲醇混合溶剂从动物脑组织中制备含神经节苷脂的提取物溶液，其中所述氯仿/甲醇混合溶剂的体积比为氯仿∶甲醇＝(1～2)∶1；2)从非牛源动物的肌肉组织中制备含分子量8000道尔顿以下的小分子多肽的提取物溶液；3)按照神经节苷脂∶小分子肽＝(85～115μg)∶(5.44～7.36mg)的比例混合步骤1)中制备的含神经节苷酯的提取物溶液和步骤2)中制备的含小分子多肽的提取物溶液，获得所述脑苷肌肽溶液。
2.如权利要求1所述的脑苷肌肽溶液的制备方法，其特征在于，所述脑苷肌肽溶液中神经节苷酯的含量为大于0.05mg/ml，小分子多肽的含量为大于3.2mg/ml。
3.如权利要求1所述的脑苷肌肽溶液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括1a)取新鲜或速冻保存的非牛源动物脑组织剥离脑膜血管，除去杂质并洗净，将处理好的动物脑组织匀浆，在2～10倍体积的丙酮中搅拌，离心，制得丙酮粉；1b)将丙酮粉加入到6～15倍体积的氯仿/甲醇混合溶剂中搅拌，离心或过滤取上清液；提取总脂后蒸发浓缩，在5％氯化钠/甲醇(1∶1，V/V)混合液中进行Folch分配，使神经节苷酯从有机相溶媒转入水相，收集上层液，蒸发浓缩上层液去除甲醇，用分子量6000～10000的超滤膜超滤，取透过液即得含神经节苷酯的提取物溶液。
4.如权利要求1所述的脑苷肌肽溶液的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括2a)取新鲜或速冻保存的家兔肌肉，摘去脂肪及其它杂质；将处理好的兔肌绞碎，匀浆；2b)将获得的匀浆液反复冻融，冷冻温度-10℃以下；融化温度20～30℃，冻融3次以上；2c)将冻融液加热至50℃以上，保持20min～40min，迅速冷却至室温，离心，取上清液；2d)离心上清液经高分子量超滤膜除去较大颗粒，滤液用分子量8000～10000及6000～8000超滤膜超滤，透过液装于灭菌容器内即得含小分子多肽的提取物溶液。
5.一种脑苷肌肽注射液制剂，其特征在于，其含有权利要求1方法制备的脑苷肌肽溶液以及药学上可接受的附加剂。
6.如权利要求5所述的脑苷肌肽注射液制剂，其特征在于，所述制剂中含有神经节苷酯0.05mg/ml，小分子多肽3.2mg/ml。
7.如权利要求6所述的脑苷肌肽注射液制剂，其特征在于，所述的附加剂包括选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的抗氧剂，选自肌酐、甘氨酸、烟酰胺或辛酸钠的稳定剂和选自氯化钠、葡萄糖或甘油的等渗调节剂。
全文摘要
本发明公开一种脑苷肌肽溶液的制备方法及脑苷肌肽注射液制剂。脑苷肌肽注射液为采用现代生物技术纯化制备的含有神经节苷脂和天然活性多肽的药品。该方法包括以下步骤以非牛源动物脑组织为原料，以氯仿/甲醇混合溶剂从动物脑组织中制备含神经节苷脂的提取物溶液，其中所述氯仿/甲醇混合溶剂的体积比为氯仿∶甲醇＝(1～2)∶1；从非牛源动物的肌肉组织中制备含分子量8000道尔顿以下的小分子多肽的提取物溶液；按照步骤1)中制备的含神经节苷酯的提取物溶液神经节苷脂∶小分子肽＝(85～115μg)∶(5.44～7.36mg)的比例混合和步骤2)中制备的含小分子多肽的提取物溶液。本品在脑梗死、急性颅脑损伤、冠心病、缺血性脑血管疾病等方面有良好疗效。
文档编号A61K31/7028GK101041060SQ200610011529
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月22日 优先权日2006年3月22日
发明者马骉, 单连慧, 姜桂荣 申请人:北京赛生药业有限公司