专利名称：基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物和检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于磁共振成像造影剂领域，涉及基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物。本发明还涉及上述耦联物中抗体是否具有活性的检测技术。
背景技术：
磁共振成像(MRI)技术现已发展成为临床医疗诊断中的一种常见手段，是诊断肿瘤最为有效的方法之一。为了增强病变组织与正常组织图像之间的对比度和清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。这些造影增强剂绝大多数是利用金属离子的顺磁特性。Gd3+因为具有强顺磁性，它的络合物是目前应用最广泛和最有效的一类造影增强剂。最近的研究结果表明，Gd@C82(OH)40的MRI造影效率是临床所用Gd-DTPA二乙烯三胺五醋酸，DTPA螯合物造影剂的20倍(Mikawa，M.，et al.，Bioconjugate Chemistry，2001.12(4)p.510-514)。此发现表明基于金属富勒烯的水溶性衍生物可用于制作高效的MRI造影剂。但基于金属富勒烯的具有靶向性检测功能的MRI造影剂的研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，其制备过程简单，反应条件温和，有扩大成工业生产的巨大的应用前景。利用本发明技术制备的耦联物可以使抗体富集并保持其活性，可成为靶向性MRI诊断材料。
本发明的另一目的在于提供上述耦联物中抗体是否具有活性的检测技术，用全反射荧光显微镜进行单分子水平荧光强度检测，通过与对照(符合一步漂白曲线的单分子抗体与单分子绿色荧光蛋白作用)比拟，推测出一个聚集体单元的平均耦联数和活性。
本发明的基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，是将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后直接与抗体发生耦联反应制得，具体可按如下步骤制备(a)将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用新鲜制备的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液活化，优选10～20分钟；所述的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐和含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物的摩尔比优选为50～100∶1；(b)将相对于含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物1/10～1/20摩尔当量的抗体加到步骤(a)得到的溶液中搅拌反应，优选3～4小时，即可得到本发明的基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物(MRI-anti)。所述的抗体为绿色荧光蛋白抗体或肿瘤抗体，所述反应优选在室温下进行(如15～25℃)。
所述的步骤(a)中的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐水溶液应新鲜制备，即现配制现使用，否则会水解而失效。
所述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物，是把含Gd的金属富勒烯笼外修饰羧基后制得，其分子表达式为Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l，式中m＝2～6，n＝12～18，l＝6～8；或Gd@C60[C(COOH)2]10。
所述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物可分别按如下参考文献制备Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l制备文献见Shu，C.Y.，et al.，Carbon，2006.44(3)p.496-500。
Gd@C60[C(COOH)2]10制备文献见Bolskar，R.D.，et al.，Journal of theAmerican Chemical Society，2003.125(18)p.5471-5478。
具体上述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l，可按如下步骤制备(a)配制浓度为0.5～3mol/L的β-丙氨酸的碱溶液(如NaOH或KOH溶液等)，并加入该碱溶液体积2～4倍量的乙醇；(b)15～25℃下，将步骤(a)得到的溶液滴加到金属富勒烯的甲苯溶液中，其β-丙氨酸与金属富勒烯的摩尔比为300∶1～1000∶1，得到混合物溶液；所述的金属富勒烯为Gd@C82；(c)15～25℃下，将步骤(b)得到的混合物溶液搅拌反应3～5天，分液浓缩，葡聚糖凝胶做固定相，去离子水做流动相，收集pH＝6～7的组分，得到目标产物-金属富勒烯的水溶性衍生物，Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l其中m＝2～6，n＝12～18，l＝6～8(简称AAD-EMFs)。
上述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物Gd@C60[C(COOH)2]10，可按如下步骤制备在Gd@C60的四氢呋喃溶液中加入相对于Gd@C6015～20倍摩尔当量的二乙基溴代丙二酸酯和过量的NaH或KH，15～25℃下搅拌2～4h，Gd@C60就迅速转变为丙二酸酯的衍生物。加浓度为30～60wt％的盐酸溶液回流8～12h，Gd@C60的丙二酸酯的衍生物就转变成水溶性的丙二酸衍生物。静置，分液，水相减压浓缩后用葡聚糖凝胶G-25做固定相，用去离子水作洗脱剂，收集pH＝6～7的棕色组分即为本发明所使用的Gd@C60的羧基化水溶性衍生物，Gd@C60[C(COOH)2]10。
为提高含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物的纯度，预先对其进行提纯，提纯可用常用的方法，如过葡聚糖凝胶G-25柱子，收集窄的棕色馏分。
本发明的基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物中抗体是否具有活性的检测技术，包括以下步骤(a)修饰有生物素(Biotin)的牛血清白蛋白(BSA)分别平铺在2块玻璃板上固定10～15分钟，而后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗掉没固定上的牛血清白蛋白(BSA)；(b)分别加链霉亲和素(Sreptavidin)使其与生物素(Biotin)发生耦联反应，10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗掉没固定上的链霉亲和素；(c)分别加绿色荧光蛋白抗体(Anti)和耦联物(MRI-anti)，同样作用10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗掉没固定上的绿色荧光蛋白抗体(Anti)和耦联物(MRI-anti)；(d)分别加等量的绿色荧光蛋白(GFP)，作用10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗掉没固定上的绿色荧光蛋白(GFP)；(e)用全反射荧光显微镜分别对上述对照物和耦联物成像，检测荧光强度，即可得知耦联物中抗体是否具有活性。
与其它现有技术比较，本发明具有以下特点1.本发明巧妙利用羧基活化后易与蛋白或抗体上氨基残基发生耦联反应这一特点，在室温下经过一步反应大量制得耦联有抗体的MRI造影剂，因而具有简单经济、操作方便和便于实现规模化生产的优点。
2.本发明所用金属富勒烯水溶性衍生物只含有供交联反应的羧基，因此活化过程中避免了发生自交联反应产生的聚集甚至沉淀。
3.本发明所采用的制备MRI造影剂与抗体的耦联物的方法，可扩展到与其它肿瘤抗体的耦联，从而制备对肿瘤检测具有靶向性的MRI造影剂。
4.用全反射荧光显微镜进行单分子水平荧光强度检测时，不需分离产物，可进行实时检测，从而有效地避免了繁琐的分离过程。该检测方法属于单分子水平检测，用量少，灵敏度高，是一种简单、经济、便捷的表征抗体活性的新方法。
图1.本发明具体实施方式
(一)实施例1(3)的基于金属富勒烯的磁共振成像(MRI)造影剂与抗体的耦联反应流程图。EDC在AAD-EMFs表面与羧基反应得到活性酯中间体，而后在亲核试剂氨基的存在下通过形成稳定的酰胺键而耦联成功。
(a)水溶性金属富勒烯衍生物[Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l]n的羧基官能团先用新制备的EDC水溶液活化15min；(b)将1/10摩尔当量的抗体加到步骤(a)得到的溶液中搅拌反应4h，即可得到本发明的MRI与抗体的耦联物(MRI-anti)。
图2.本发明具体实施方式
(二)中检测耦联物中抗体是否具有活性时制备样品的流程图。
(a)修饰有生物素(Biotin)的牛血清白蛋白(BSA)平铺在玻璃板上固定10min，而后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的BSA；(b)加链霉亲和素(Sreptavidin)使其与生物素(Biotin)发生耦联反应，10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的链霉亲和素(Sreptavidin)；(c)加耦联物(MRI-anti)，同样作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的MRI-anti；(d)加适量的绿色荧光蛋白(GFP)，作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的GFP。
图3A.绿色荧光蛋白(GFP)与单个抗体作用的荧光像。
图3B.本发明实施例1(3)的耦联物与绿色荧光蛋白(GFP)作用的荧光像。
图4A.本发明实施例2(1)的单个GFP在玻片上的一步漂白曲线。
图4B.本发明实施例2(1)的对照(符合一步漂白曲线的单个抗体分子)和实施例2(2)耦联物与GFP作用的荧光强度分布曲线。
具体实施例方式
(一)制备MRI与抗体的耦联物的具体实施方式
实施例1(1)使用商用1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(规格Alfa Aesar CAS#2595252-8，Lot#K22P29)配制0.1M的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液；(2)Gd@C82O6(OH)16(NHCH2CH2COOH)8的制备配制3mol/Lβ-丙氨酸的NaOH溶液，并加入该碱溶液体积的2倍量的乙醇；在25℃下，将该溶液滴加到金属富勒烯的甲苯溶液(～5mg)中，继续搅拌反应3天，分液浓缩，葡聚糖凝胶做固定相，去离子水做流动相，收集pH＝6-7的组分，得到目标产物-金属富勒烯的水溶性衍生物，Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l其中m＝6，n＝16，l＝8(简称AAD-EMFs)。
(3)耦联物的制备含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物，Gd@C82O6(OH)16(NHCH2CH2COOH)8，(40μL，2×10-7M)，用新鲜EDC水溶液(10μL，0.1M)活化15min。在室温下，将1/10摩尔当量的抗体加到上述混合溶液中，在室温下搅拌反应4h，即可得到本发明的MRI与抗体的耦联物(MRI-anti)。
实施例2(1)同实施例1(1)(2)Gd@C60[(C(COOH)2)]10的制备在Gd@C60(～10mg)的四氢呋喃溶液中加入相对于Gd@C6020倍摩尔当量的二乙基溴代丙二酸酯和过量的NaH，20℃下搅拌2h，Gd@C60就迅速转变为丙二酸酯的衍生物。加浓度为60wt％的盐酸溶液回流12h，Gd@C60的丙二酸酯的衍生物就转变成水溶性的丙二酸衍生物。静置，分液，水相减压浓缩后用葡聚糖凝胶G-25做固定相，用去离子水作洗脱剂，收集pH＝6～7的棕色组分即为本发明所使用的Gd@C60的羧基化水溶性衍生物，Gd@C60[C(COOH)2]10。
(3)耦联物的制备用经过提纯的含有羧基的具有造影效果的含Gd金属富勒烯水溶性衍生物Gd@C60[(C(COOH)2)]10反应，用新鲜EDC水溶液(10μL，0.1M)活化10min。其余条件同实施例1(3)。
(二)检测MRI与抗体的耦联物中抗体的活性的具体实施方式
对照例1修饰有Biotin的牛血清白蛋白(BSA)(1.5mg/mL，20μL)平铺在玻璃板上固定10min，而后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的BSA；加链霉亲和素(Sreptavidin)(0.25mg/mL，20μL)与生物素(Biotin)发生耦联反应，10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的Sreptavidin；加绿色荧光蛋白抗体(Anti)(1.6×10-7M，15μL)，同样作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的Anti；加绿色荧光蛋白(GFP)(3.38×10-9M，15μL)，作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的GFP；用全反射荧光显微镜给上述绿色荧光蛋白分子成像，检测其平均荧光强度为320。
实施例1修饰有Biotin的牛血清白蛋白(BSA)(1.5mg/mL，20μL)平铺在玻璃板上固定10min，而后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的BSA；加链霉亲和素(Sreptavidin)(0.25mg/mL，20μL)与生物素(Biotin)发生耦联反应，10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的Sreptavidin；加具体实施方式
(一)实施例1(3)中的反应产物(MRI-anti)(1.6×10-7M，15μL)，同样作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的MRI-anti；加绿色荧光蛋白(GFP)(3.38×10-9M，15μL)，作用10min后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液冲洗掉没固定上的GFP；用全反射荧光显微镜给上述耦联物成像，检测平均荧光强度为870。
由于对照例1符合一步漂白曲线规律，说明该浓度下的检测属于单个抗体分子与绿色荧光蛋白分子作用，从而可以根据以下公式推测一个MRI造影剂聚集体分子上的具体抗体偶联数，所以我们可根据公式Naver＝(Isample-Bsample)/(Ism-Bsm)＝(870-513)/(319-248)＝5.03其中Isample，Ism分别为单分子水平上的绿色荧光蛋白分子与耦联物和对照(单分子水平上的绿色荧光蛋白分子与抗体作用)的平均荧光强度；Bsample和Bsm分别为其相应的平均背景荧光强度。由此推测耦联物中抗体的平均耦联数为5，并且抗体的活性在耦联后得以保持。
权利要求
1.一种基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，其特征是可按如下步骤制备(a)将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用新鲜制备的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐水溶液活化；(b)将相对于含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物1/10～1/20摩尔当量的抗体加到步骤(a)得到的溶液中搅拌反应，即得到基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征是所述的1-乙基-3(3-二甲基-氨基-戊基)碳二亚胺盐酸盐和含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物的摩尔比为50～100∶1。
3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征是所述的抗体为绿色荧光蛋白抗体或肿瘤抗体。
4.根据权利要求1所述的偶联物，其特征是所述步骤(a)中活化的时间为10～20分钟。
5.根据权利要求1所述的偶联物，其特征是所述步骤(b)中反应的时间为3～4小时。
6.根据权利要求1所述的偶联物，其特征是所述步骤(b)中反应的温度为15～25℃
7.根据权利要求1或2所述的偶联物，其特征是所述的含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物，其分子表达式为Gd@C82Om(OH)n(NHCH2CH2COOH)l或Gd@C60[C(COOH)2]10，其中m＝2～6，n＝12～18.l＝6～8。
8.一种权利要求1所述的耦联物中抗体是否具有活性的检测技术，包括以下步骤(a)修饰有生物素的牛血清白蛋白分别平铺在2块玻璃板上固定10～15分钟，而后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗掉没固定上的牛血清白蛋白；(b)分别加链霉亲和素使其与生物素发生耦联反应，10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗掉没固定上的链霉亲和素；(c)分别加绿色荧光蛋白抗体和耦联物，同样作用10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗掉没固定上的绿色荧光蛋白抗体和耦联物；(d)分别加等量的绿色荧光蛋白，作用10～15分钟后用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗掉没固定上的绿色荧光蛋白；(e)用全反射荧光显微镜分别对上述对照物和耦联物成像，检测荧光强度，即可得知耦联物中抗体是否具有活性。
全文摘要
本发明公开了基于金属富勒烯的磁共振成像造影剂与抗体的耦联物，可按如下步骤制备(a)将含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物用新鲜制备的1－乙基－3(3－二甲基－氨基－戊基)碳二亚胺盐酸盐水溶液活化；(b)将相对于含羧基的水溶性金属富勒烯衍生物1/10～1/20摩尔当量的抗体加到步骤(a)得到的溶液中搅拌反应即可。本发明还公开了上述耦联物中抗体是否具有活性的检测技术。本发明制备过程简单，反应条件温和，有扩大成工业生产的巨大的应用前景。利用本发明技术制备的耦联物可以使抗体富集并保持其活性，可成为靶向性磁共振成像诊断材料。
文档编号A61K49/06GK101062422SQ200610011778
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者王春儒, 舒春英, 马新勇, 方晓红 申请人:中国科学院化学研究所