专利名称：一种杠柳苷元的制备方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，更具体的说是一种杠柳苷元的制备方法。
背景技术：
中药香加皮(又名北五加皮、杠柳皮)是萝藦科植物杠柳(Periploca sepium)的干燥根皮，中医认为其具有祛风湿、强筋骨的功效，主要用于风寒湿痹、腰膝酸软、心悸气短、下肢浮肿等。
香加皮中含有强心苷成分杠柳毒苷(periplocin，C36H56O13)，杠柳毒苷也存在于杠柳植物的茎(包括茎皮和茎的木质部)中，这种成分也存在于杠柳的同属植物黑龙骨(又名滇杠柳，Periploca forrestii)中。
杠柳毒苷在一定条件下可以转变为杠柳苷元(C30H46O8)。
杠柳苷元有强心和抗肿瘤等药理作用。据中华医学杂志[J].1956，7651李章文等《杠柳皮(北五加皮)的强心作用》一文报道，杠柳苷元也有强心作用，而且起效迅速，蓄积性小。据中草药[J].2006，37(4)519陈书红等《香加皮的抗肿瘤活性成分研究(I)》一文中报道杠柳苷元对MCF-7肿瘤细胞增殖有很强的抑制作用。
关于杠柳苷元的制备目前没有成熟的可以工业化的生产方法。Hideji Itokawa等在《Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploca Sepium》(Chem.Pharm.Bull，1987，35(11)4524)中公布的分离杠柳苷元的方法是用甲醇提取香加皮→正己烷萃取后→水层用氯仿萃取→反复硅胶柱层析→C18反相柱层析→杠柳毒苷→酸醇水解→硅胶柱层析→杠柳苷元。此工艺是先得到杠柳毒苷单体再水解得到杠柳苷元，流程较长，反复硅胶柱层析不仅耗费有机溶剂，而且对杠柳毒苷的死吸附量较大；另外杠柳毒苷的分子中带有两个糖分子，有一定的极性，在氯仿中几乎不溶(孙文基天然药物成分提取分离与制备.1994，北京中国医药科技出版社269)，因此本工艺只能将药材中的微量的杠柳毒苷提取出来，采用此方法得到杠柳苷元成本较高。
胡英杰在《滇杠柳的化学成分》(云南植物研究[J]，1989，11(4)465)中报道的杠柳苷元的分离方法是以滇杠柳药材为原料，经过95％乙醇提取→石油醚脱脂→丙酮回流→硅胶柱层析→氯仿-甲醇混合溶剂洗脱→杠柳苷元单体，收率为0.06％。陈书红等在《香加皮的抗肿瘤活性成分研究(I)》中采用的分离方法是80％乙醇提取→石油醚萃取后→水层用乙醚萃取→水层用乙酸乙酯萃取→硅胶柱层析→氯仿-甲醇混合溶剂洗脱→杠柳苷元单体，收率为3.6×10-4％。以上两种分离方法基本上是直接采用有机溶媒提取原料中微量存在的杠柳苷元，而未对原料进行水解将杠柳毒苷变为杠柳苷元，因此收率很低，造成药材资源浪费，工艺流程较长，无法实现大批量工业化生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种杠柳苷元单体产率高、工艺方法简单、低成本、可实现大规模工业化生产的杠柳苷元的制备方法。
本发明的杠柳苷元的制备方法，包括如下步骤(1)对含有杠柳毒苷的原料进行酸水解和收集，得到中间体A；(2)将中间体A进行柱层析，采用洗脱剂进行梯度洗脱或等度洗脱，合并含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(3)将中间体B重结晶或高效液相制备得到纯度为90％～100％的杠柳苷元；所述重结晶的溶剂为C1-3低级脂肪醇之一种，优选甲醇或乙醇。
本发明所述含杠柳毒苷的原料可以是香加皮提取物、香加皮药材、滇杠柳药材(即杠柳的同属植物黑龙骨，Periploca forrestii)、杠柳的茎(包括茎皮和茎的木质部)或其他含有杠柳毒苷的中药材。
本发明所述的酸水解所用的酸为无机酸或有机酸例如盐酸、硫酸、醋酸、甲酸等等；水解温度为10～100℃，水解时间为0.1～48小时，水解的PH值控制在1～6。
本发明所述酸水解和收集可以一步完成或分两步完成。
酸水解和收集的一步完成是采用有机溶剂与酸水的混合溶液对含有杠柳毒苷的原料进行酸水解，分离有机层，浓缩干燥后得到中间体A；酸水解和收集的两步完成是(1)先采用酸水溶液或含有5-95％的C1-3低级脂肪醇的酸水溶液进行酸水解，浓缩；若用含有Cl-3低级脂肪醇的酸水溶液进行酸水解，在浓缩时应挥净脂肪醇。(2)用有机溶剂对步骤(1)的浓缩液进行1次或多次萃取，萃取液再浓缩干燥后得到中间体A。其中所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙醚、二氯甲烷之一种；常用的C1-3低级脂肪醇包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等等，优选甲醇、乙醇。
本发明所述的柱层析包括正向柱层析、反相柱层析，其中正向柱层析填料为80目～400目的硅胶或三氧化二铝；反向柱层析所用填料是5μm或10μm粒度的C18或C8。
柱层析所用洗脱剂的体积比一般位为10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、乙醚、石油醚、正己烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、水之二种。优选的体积比为10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、水之二种。例如石油醚—乙酸乙酯混合溶液；甲醇—水混合溶液；石油醚—氯仿混合溶液；石油醚—乙醇混合溶液等等。
本发明可以采用梯度洗脱，也可以采用等度洗脱，收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥，得到中间体B。将中间体B进行重结晶得到纯度为90％～100％的杠柳苷元；所述重结晶所用溶剂为甲醇、乙醇等低级脂肪醇之一种。
本发明所述的中间体B采用高效液相制备的方法如下C18或C8反相制备色谱柱；色谱条件流动相为甲醇—水；检测波长218nm～220nm，监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳苷元收集液；收集液浓缩干燥，得到杠柳苷元纯品。
用本发明方法制备的杠柳苷元经UV、IR、MS、13C、NMR结构鉴定确认为杠柳苷元。光谱数据与Hideji Itokawa等在文献《Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fractionfrom Periploca Sepium》(Chem.Pharm.Bull，1987，35(11)4524)中公布的杠柳苷元的光谱鉴定数据一致。
(1)紫外光谱 样品的紫外光谱的λmax为218nm。UV谱图见附图1。
(2)红外光谱 样品的主要吸收为3408，1777，1740，1628cm-1。样品的IR谱图见附图2。
(3)质谱 样品的分子离子峰为m/z 390(M+)，基峰为m/z 373(M+-OH)。其质谱谱图见附图3。
(4)核磁共振 样品的1H-NMR谱图见附图4，13C-NMR谱图见附图5。样品的核磁共振谱图中各谱线的归属分别见表1和表2。
表11H-NMR谱数据及归属
表213C-NMR谱数据及归属
本发明制备杠柳苷元的方法，与现有技术的主要区别在于(1)本发明是先将原料中的杠柳毒苷水解为杠柳苷元后再采用有机溶媒进行萃取富集和柱层析，因此收率明显提高。例如现有技术中香加皮药材采用有机溶媒萃取的收率仅为3.6×10-4％，而且工艺流程长，很难实现工业化生产，而采用本发明的技术方案后所得杠柳苷元单体的收率可高达0.21～1.7％。
(2)本发明的工艺简单，采用了酸水解后再分离的方法，简化了工艺，降低了有机溶剂用量，从而使成本大大降低，可实现工业化生产；所制备的杠柳苷元经重结晶或HPLC制备后纯度可以达到90％～100％。
图1为所制备杠柳苷元的UV图。
图2为所制备杠柳苷元的IR图。
图3为所制备杠柳苷元的MS图。
图4为所制备杠柳苷元的1H-NMR图。
图5为所制备杠柳苷元的13C-NMR图。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。其中所制备的杠柳苷元结晶的UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR图详见说明书附图。
杠柳毒苷易溶于甲醇和乙醇，微溶于水，所以无论是以水、醇还是醇水混合的溶剂制备的提取物中均含有杠柳毒苷。采用专利技术(专利申请号200410019975.5香加皮强心作用有效提取物、制备方法及用途)制备的香加皮提取物，因为使用了大孔树脂纯化，所以提取物中富集了杠柳毒苷，使杠柳毒苷的含量更高。以上均可作为制备杠柳苷元的原料。因为香加皮药材中杠柳毒苷含量较低，而香加皮提取物中较高，所以以提取物为原料时杠柳苷元的产率较高。
实施例1杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取香加皮提取物100克，用pH为3的盐酸水溶液与等体积的氯仿混合溶液进行酸水解，时间为1小时，温度为80℃。
(2)水解完毕分出氯仿层，浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为硅胶，采用梯度洗脱，洗脱剂为10∶0～10的乙酸乙酯—甲醇混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(4)将中间体B用乙醇进行重结晶，得到杠柳苷元结晶1.7克，收率为1.7％。
实施例2杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取香加皮提取物100克，用pH为1的盐酸水溶液进行酸水解，时间为0.1小时，温度为100℃。
(2)用乙酸乙酯对(1)的酸水解液萃取3次，萃取液浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为三氧化二铝，采用梯度洗脱，洗脱剂为10∶0～10的乙酸乙酯—乙醇混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(4)将中间体B用乙醇进行重结晶，得到杠柳苷元结晶1.5克，收率为1.5％。
实施例3杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取香加皮药材1公斤，用pH为6的硫酸水溶液进行酸水解，时间为48小时，温度为10℃。
(2)用乙醚对(1)的酸水解液进行萃取，萃取液浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为C18，采用等度洗脱，洗脱剂为10∶5的甲醇—水混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(4)将中间体B进行高效液相制备色谱柱Hypersil(5μm，20×250mm)，流动相为甲醇—水(70∶30)，流速2.5mL/min，得到杠柳苷元纯品2.1克，收率为0.21％。
实施例4杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取滇杠柳药材1公斤，用pH为2的硫酸水溶液与等体积的乙酸乙酯混合溶液进行酸水解，时间为6小时，温度为40℃。
(2)分出乙酸乙酯层，浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为C8，采用等度洗脱，洗脱剂为10∶6的乙醇—水混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(4)将中间体B进行高效液相制备色谱柱Irregular C18(10μm，20×200mm)，流动相为甲醇—水(65∶35)，流速3.0mL/min，得到杠柳苷元纯品3.2克，收率为0.32％。
实施例5杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取香加皮提取物100克，用pH为2的醋酸水溶液进行酸水解，时间为4小时，温度为50℃。
(2)用氯仿对(1)的酸水解液进行萃取，萃取液浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为硅胶，采用梯度洗脱，洗脱剂为10∶0～10∶10的石油醚—氯仿混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B。
(4)将中间体B用甲醇进行重结晶，得到杠柳苷元结晶1.35克，收率为1.35％。
实施例6杠柳苷元的制备方法，其工艺步骤为(1)取杠柳茎1公斤，用pH为4的甲酸水溶液进行酸水解，时间2小时，温度为70℃。
(2)用乙醚对(1)的酸水解液进行萃取，萃取液浓缩干燥得到中间体A。
(3)将中间体A进行柱层析，柱填料为硅胶，采用等度洗脱，洗脱剂为10∶5的石油醚—乙酸乙酯混合溶液；收集含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B。
(4)将中间体B用甲醇进行重结晶，得到杠柳苷元结晶3.0克，收率为0.3％。
权利要求
1.一种杠柳苷元的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)对含有杠柳毒苷的原料进行酸水解和收集，得到中间体A；(2)将中间体A进行柱层析，采用洗脱剂进行梯度洗脱或等度洗脱，合并含有杠柳苷元的馏分，浓缩干燥后得到中间体B；(3)将中间体B重结晶或高效液相制备得到纯度为90％～100％的杠柳苷元；所述重结晶的溶剂为C1-3低级脂肪醇之一种。
2.如权利要求1所述杠柳苷元的制备方法，其中所述含杠柳毒苷的原料可以是香加皮提取物、香加皮药材、杠柳的茎和滇杠柳药材或其他含有杠柳毒苷的中药材。
3.如权利要求1所述杠柳苷元的制备方法，其中所述酸水解和收集可以一步完成，或分两步完成。
4.如权利要求3所述杠柳苷元的制备方法，其中酸水解和收集的一步完成是采用有机溶剂与酸水的混合溶液对含有杠柳毒苷的原料进行酸水解，分离有机层，浓缩干燥后得到中间体A；两步完成是(1)先采用酸水溶液或含有5-95％的C1-3低级脂肪醇的酸水溶液进行酸水解，浓缩；(2)用有机溶剂对步骤(1)的浓缩液进行1次或多次萃取，萃取液再浓缩干燥后得到中间体A；其中所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙醚、二氯甲烷之一种；水解温度为10～100℃，水解时间为0.1～48小时，水解的PH值控制在1～6。
5.如权利要求1所述杠柳苷元的制备方法，其中所述柱层析包括正向柱层析、反相柱层析；所用洗脱剂的体积比为10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、乙醚、石油醚、正己烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、水之二种。
6.如权利要求5所述杠柳苷元的制备方法，其中所用洗脱剂的体积比为10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、水之二种。
7.如权利要求5所述杠柳苷元的制备方法，其中正向柱层析填料为硅胶或三氧化二铝；反向柱层析所用填料是C18或C8。
全文摘要
本发明公开了一种杠柳苷元的制备方法，其步骤为(1)对含有杠柳毒苷的原料进行酸水解和收集，得到中间体A；(2)将中间体A进行柱层析，浓缩干燥后得到中间体B；(3)将中间体B重结晶或高效液相制备得到纯度为90％～100％的杠柳苷元。应用本发明的方法制备杠柳苷元，将原料中的杠柳毒苷水解为杠柳苷元后再进行萃取和柱层析，因此收率高，工艺简单，降低了有机溶剂用量，成本低，可实现工业化生产。
文档编号A61P9/00GK1850847SQ20061001362
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月10日 优先权日2006年5月10日
发明者高秀梅, 刘虹, 张伯礼, 王怡, 潘桂湘, 郭俊华 申请人:天津中医药大学