专利名称：治疗神经和非神经痛的方法
技术领域：
本发明涉及调节腺苷酸环化酶1活性的方法。
背景技术：
神经性疼痛和炎性疼痛的区别在于它们的病原学、病理生理学以及对不同药物治疗剂治疗的响应。由于同时涉及神经纤维和伴随的炎症，创伤通常导致两种疼痛的结合。大多数时间，一种成分可能会影响另一种，使得难以得到确定的诊断。此外，目前这两种疼痛的治疗方式完全不同(参考文献)，使得难以通过一个治疗完全缓解疼痛。严重急性疼痛响应μ阿片样物质受体激动剂(吗啡)和NMDA受体拮抗剂(克他命(ketamine))；慢性炎性疼痛响应环氧合酶抑制剂(bextra、塞来昔布(celebrex))和前列腺素抑制剂(醋氨酚(acetaminophen))；神经性疼痛响应抗癫痫药物(卡马西平(carbamazepine))和仍然没有完全了解作用的药物(加巴喷丁(gabapentin))。
疼痛诱导了神经元群、背根节神经元、脊髓背角和前扣袋回(ACC)中疼痛传播激活的提高水平的腺苷酸环化酶下游分子。这些分子包括转录因子pCREB(Anderson和Seybold，2000；Kawasaki等，2004，Ma和Quirion，2001)和即早期基因Egr-1(Wei等，2000，Ko等，2005)和Arc(Li等，2004)。由于与神经元膜上G蛋白、NMDA受体、电压依赖性钙通道和μ阿片样物质受体相互作用的特异性，认为腺苷酸环化酶(AC)是神经元中的重合探测剂(coincidence detector)。腺苷酸环化酶的作用显示出在慢性炎症相关行为敏化中的重要性(Wei等，2002b)。通过腺苷酸环化酶激活诱导的常见信号途径已经证明了它们在记忆和炎性疼痛中作为关键起始分子的能力(Woolf和Salter等，2000)；(Kandel，2001，Nestler，2001和Zhuo，2004)和它们对NMDA受体依赖性突触增强持续数小时的作用(Wong等，1999)。
已经鉴定的AC十个不同异构体中(Xia和Storm，1997)，AC1是存在于脑和脊髓中的钙钙调蛋白(CaM)刺激的AC，其是高度神经元特异性的。缺乏AC1和8的小鼠显示缺乏对消极躲避、前后关系和空间记忆的长期记忆(Wong等，1999，Wu等，1995)。缺失AC1和8的小鼠还显示了小鼠中降低的慢性炎性疼痛(Wei等，2002b)。因此，结合神经元膜的AC是重要的结合膜的酶，这些酶可以调节最终调节基因转录的分子的下游级联并在神经传导或突触可塑性改变中通过表达的蛋白来介导它们的效用。进行AC1和AC8效用的比较研究来鉴定更有效的靶向异构体。发现缺失AC1的小鼠对皮下炎性疼痛(Wei等，2002)、急性肌肉疼痛、慢性肌肉疼痛和神经性疼痛具有优良的作用。
根据上述的，希望发展通过调节导致这样病症的化学成分来治疗疼痛病症的新方法。
发明概述已经发现了抑制腺苷酸环化酶的新方法。在此鉴定了属于环状化合物家族的腺苷酸环化酶，其在神经和非神经痛两者的联合、同时治疗中具有作用。
因此，本发明的一方面是抑制AC1的方法。该方法包括将AC1接触具有以下通式(1)的化合物的步骤 其中A选自H、OH、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷、C2-C6链烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷氧基；B选自羟基、硫、-OR1、-NH2、-NO2、-NHR1、-NR1R2、-SR1或由一个或多个选自羟基、卤素、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1的取代基任意地取代的-C1-C6饱和或不饱和烷基，由OH、卤素、硫、NH2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇(alkanol)或C1-C6烷氧基任意取代的C3-C10芳族或非芳族环结构或C3-C9芳族或非芳族杂环结构，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基烷基，或NR1R2形成由OH、卤素、硫、NH2、NO2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基或C1-C6羧基烷基任意取代的C3-C6芳族或非芳族杂环，D选自H、卤素、羟基、NH2、硫、NHR1、NR1R3、SR1、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基，其中R1如上定义，且R3定义和R1一样；E是H或OH，或由C1-6烷基、氨基、NHR1、NR1R2、硫、SR1任意取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-10-芳基-C1-6-烷基或C3-10-芳氧基-C1-6-烷基，未取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基(alkanoyl)、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或未取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，其中R1和R2如上定义；和G、H、J和M各自是N，或H和J各自是C，G和M各自是N、S或O，或H、J和M各自是C，G是N、S或O。
本发明另一方面中，提供了抑制AC1的组合物，该组合物具有例如联合治疗神经和非神经痛的作用。该组合物包括上述通式(1)所示的化合物结合药物学上可接受的载体。
另一方面中，提供了产品。该产品包含含有组合物的包装材料。该组合物包括通式(1)的化合物和药物学上可接受的载体。包装材料被标记来说明该组合物可用于联合治疗哺乳动物的神经和非神经痛。
参照以下附图来描述本发明的这些和其它方面，其中附图简述
图1a说明了通过RT-PCR扩增证实的AC1表达载体进入HEK细胞系中的稳定转染。
图1b图示了forskolin和钙离子载体对AC1转染细胞系中腺苷酸环化酶1的刺激。相对于未刺激的表达AC I的HEK293细胞的cAMP水平来表示数据(n＝4细胞)。
图1c图示了非竞争性AC1抑制剂对腺苷酸环化酶的forskolin和钙离子载体刺激的作用。
图1d图示了非竞争性AC1抑制剂对腺苷酸环化酶1的作用，显示为CREB表达水平的改变。
图2是选定AC抑制剂对AC1表达累积激活的剂量依赖性抑制的对数坐标图。
图3是显示了腺苷酸环化酶抑制剂对急性炎症肌肉疼痛的剂量响应的直方图。
图4通过直方图(bar graph)说明了腺苷酸环化酶钙刺激异构体的基因缺失在通过肌内福尔马林诱导的急性持续肌肉疼痛中(a)和通过机械异常性疼痛(allodynia)诱导的神经性疼痛中(b)的作用；图5通过直方图说明了AC1抑制剂，HTS09836，对慢性炎症肌肉疼痛(a)，神经性疼痛(b)以及结合的神经性和炎症肌肉疼痛的作用(c)；和图6说明了根据本发明所用的AC1抑制剂。
发明详述本发明提供了抑制AC1的方法。该方法在结合治疗哺乳动物的神经和非神经痛中是有用的。
术语“抑制AC1”指的是AC1的部分或全部抑制。这样的抑制通过在此更详细描述的测定是可检测的。
术语“联合治疗”指的是两种不同类型疼痛的同时治疗，即，同时通过单一治疗例如给药通式(1)限定的AC1抑制剂来治疗神经来源的疼痛(神经性疼痛)和非神经来源的疼痛(伤害性疼痛)。
神经或神经性疼痛指的是由外周或中枢神经系统的创伤或机能失调引起的疼痛。神经疼痛可以由创伤引起，但不必定涉及神经系统的实际损伤。神经可以受到肿瘤的渗透或压迫，疤痕组织的绞窄或感染的发炎。神经性疼痛通常是慢性的，且不能很好地响应阿片样物质的治疗。
非神经或伤害性疼痛指的是来自组织创伤的疼痛，包括例如扭伤、骨折、烧伤、撞伤、瘀伤、发炎、阻塞和肌筋膜疼痛。这种疼痛通常是时间有限的(相对于慢性)且能很好地响应阿片样物质的治疗。
本发明的一方面中，提供了包括同时治疗神经和非神经疼痛的方法。该方法中，使用具有以下通式(1)的抑制剂通过抑制AC1来治疗神经和非神经疼痛 其中A选自H、OH、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷、C2-C6链烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷氧基；B选自羟基、硫、-OR1、-NH2、-NO2、-NHR1、-NR1R2、-SR1或由一个或多个选自羟基、卤素、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1的取代基任意地取代的-C1-C6饱和或不饱和烷基，由OH、卤素、硫、NH2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇或C1-C6烷氧基任意取代的C3-C10芳族或非芳族环结构或C3-C9芳族或非芳族杂环结构，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基烷基，或NR1R2形成由OH、卤素、硫、NH2、NO2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基或C1-C6羧基烷基任意取代的C3-C6芳族或非芳族杂环，D选自H、卤素、羟基、NH2、硫、NHR1、NR1R3、SR1、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基，其中R1如上定义，且R3定义和R1一样；E是H或OH，或由C1-6烷基、氨基、NHR1、NR1R2、硫、SR1任意取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-10-芳基-C1-6-烷基或C3-10-芳氧基-C1-6-烷基，未取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或未取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环，其中R1和R2如上定义；和G、H、J和M各自是N，或H和J各自是C，G和M各自是N、S或O，或H、J和M各自是C，G是N、S或O。
通式(1)化合物中的基础杂环系统可以是可变的G、H、J和M各自是氮(N)，即嘌呤环系统。或者，H和J可各自是碳，G和M可以选自N、S或O，例如，苯并噻唑。另一可替换方案中，H、J和M可以各自是碳(C)和G可以是N、S或O，例如各自来产生吲哚，苯并噻吩或苯并呋喃环系统。
可变的A可以是H；OH；卤素如F、Cl、Br和I；C1-C6烷基，包括支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、3-甲基戊基、己基和异己基；C1-C6卤代烷如氯甲基、氟甲基、溴乙基、溴乙烯基、丙基氟、异丙基碘、氯丁基、1，1-二氯-2，3-丁炔基、2-溴戊基、3-氯己基、1-氟-3-甲基己基和1，1-二氟己基；C2-C6链烯基，包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、异丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、异戊烯基、2-戊烯基和己烯基；C2-C6炔基，包括支链炔基；C1-C6烷氧基，包括支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基丙基、丙氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基、戊氧基、异戊氧基、己氧基和异己氧基。
可变的B可以是羟基、卤素、硫、-OR1、-NH2、-NO2、-NHR1、-NR1R2、SR1或-C1-C6饱和或不饱和烷基，例如，如上例举的烷基、链烯基或炔基，由一个或多个选自羟基、卤素、硫、-OR1、-NH2、-NO2、-NHR1、-NR1R2或SR1的取代基任意取代，或由OH、卤素、硫、NH2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇或C1-C6烷氧基任意取代的C3-C10芳族或非芳族环结构或C3-C9芳族或非芳族杂环结构。在此所用的术语“环结构”指的是由单环以及双环结构构成的结构。术语“杂环”或“杂环结构”意思是包括核心环结构中包括至少一个选自O、S和N杂原子的3-9元环结构。合适环结构的实例包括苯、萘、1，2，3，4-四氢化萘、萘烷、哌啶、吡咯烷、呋喃、哌嗪、四氢噻吩、吗啉、咪唑、苯并噻吩、喹啉、异喹啉、吲哚、苯并呋喃和嘌呤。
可变的R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷、C1-C6链烯基、C1-C6炔基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基，或C1-C6羧基烷基。因此，OR1可以是例如氧甲基(oxymethyl)、氧二甲基、氧乙基、氧-3-氯丁基、氧丙烯基或氧丙醇。NHR1可以是，例如，烷基胺如甲胺，以及2-氯-丙胺、NH-乙醇、NH-丙醇、NH-乙基甲基酯或N-丁酸。相似地，NR1R2可以是二烷基胺如二-乙胺或可以，例如，N-氯-N-丙基，N-甲基-N-丁酸，N-甲基-N-丙醇。
NR1R2还可以形成C3-C10芳族或非芳族杂环结构，如上所示例的，可以任意地由OH、卤素、硫、NH2、NO2、C1-C6烷基、C1-C6烷醇、C1-C6烷氧基或C1-C6羧基烷基取代。
可变的D可以是H、卤素、羟基、NH2、硫、-NHR1、-NR1R3、-SR1、-C1-C6烷基或-C1-C6烷氧基。R1如上定义且R3的定义与R1一样。因此，D可以是，例如，未取代的基团，如H、卤素、羟基、-NH2、硫(S)、-C1-C6烷基或-C1-C6烷氧基。D还可以是取代的基团，例如，D可以是-NHR1，其中R1是C1-C6烷基，如甲基、乙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、2-甲基-丁基；D可以是-NR1R3如甲基乙基胺或N-丙基-N-溴胺；或D可以是-SR1如硫乙基、硫戊基、硫乙酸。C1-C6烷基和C1-C6烷氧基还可以由如之前所述的卤素、羟基、NH2、硫、NHR1、NR1R3和SR1任意取代。
可变的E可以是H或OH。E还可以是由C1-6-烷基、氨基、-NHR1、-NR1R2、硫、-SR1任意取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-10-芳基-C1-6-烷基或C3-10-芳氧基-C1-6烷基，未取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素和OH取代基取代的C3-C7环烷基、苯基或C4-C6杂环。E还可以是未取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素和OH取代基取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环。R1和R2如之前所定义的。
E特定的实例基团包括-甲基苯基、-乙基苯基、-丙基苯基、-甲胺-苯基、-甲胺-丙醇、-乙胺-戊醇、-1-甲基-2，6-二氯苯基、-1-2，3-二羟基-4-甲醇-四氢呋喃和-对乙氧甲苯基。
可以以药物学上可接受的盐、酯、酰胺或前体药物来给药本方法的化合物。在此所用的术语“药物学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物”指的是本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前体药物，其在探测医疗判断的范围内，适用于接触患者的组织而没有不当的毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的益处/风险比例相匹配，并对它们预定的用途是有效的，如果可能，以及本发明化合物的两性离子形式。术语“盐”指的是本发明化合物相对无毒的、无机和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最后合成阶段原位制得或通过其游离碱基形式的纯化化合物与合适的有机或无机酸分开反应并分离因此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘盐(naphthylate)、甲磺酸盐(mesylate)、葡庚糖酸盐(glucoheptonate)、乳糖酸盐和月桂磺酸盐，等等。这些可以包括基于碱和碱土金属，如钠、锂、钾、钙、镁等等的阳离子，以及基于无毒胺、季胺，和酰胺的阳离子包括但不限于胺、四甲基胺、四乙基胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺，等等。(参见，例如，S.M.Berge等，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.，1977；661-19，其在此引入作为参考)。
术语“前体药物”指的是体内快速转化来产生上述通式的母体化合物的化合物，例如，通过血中的水解。
详尽的讨论提供于T.Higuchi和V.Stella，“Pro-drugs as NovelDelivery Systems，”A.C.S.Symposium Series的Vol.14，和Bioreversible Carriers in Drug Design，编辑Edward B.Roche，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，两者在此引入作为参考。
此外，本方法的化合物可以以非溶剂化物以及与药物学上可接受溶剂如水、乙醇等等一起的溶剂化物形式存在。通常，为了本发明的目的，将溶剂化物形式认为等同于非溶剂化物形式。
为了测定通式(1)的化合物是否抑制了AC1，使用非常确定的测定如cAMP测定。由于AC1催化ATP至cAMP的转化，可以监控测试化合物存在下AC1-表达细胞的cAMP产生来测定测试化合物的AC1-抑制活性。简短地，用不同浓度的潜在AC1抑制化合物孵育用编码AC1的DNA转染的非AC1-表达细胞。合适的反应时间后，通过测定反应混合物中的cAMP含量来测量AC1活性。少或无cAMP表示为抑制活性。
还可以使用双重萤光素酶报告系统来测定AC1抑制活性，如以下特定实施例中更详细的描述。该测定中，随萤火虫萤光素酶表达水平的改变检测胞内cAMP浓度的改变，萤火虫萤光素酶的转录受到结合上游cAMP响应元件(CRE)的转录因子cAMP响应元件结合蛋白(CREB)的调控。用编码萤光素酶的构建体转染细胞并用测试化合物孵育，如HEK293细胞。合适的孵育阶段后，测定萤光素酶活性。萤光素酶活性的抑制表示为AC1抑制剂。
根据通式(1)化合物的实例包括图6中所示的那些化合物。尽管使用本领域技术人员已知的标准化学合成实验方案可以容易地合成这些化合物，还可以从供应商购得如Asinex Ltd.，Chemical DiversityLabs和Maybridge。特别地，在此表示为“BAS”的通式(1)化合物从Asinex Ltd.购得，表示为“HTS”、“JFD”、“RJC”、“SB”和“BTB”的通式(1)化合物从Maybridge购得，表示为“C”的通式(1)化合物从Chemical Diversity Labs购得。
本发明的另一方面中，提供了包括使用具有以下通式(2)的嘌呤抑制剂同时治疗神经和非神经痛的方法 其中，可变的A、B、D和E如上定义。
治疗神经性和非神经性痛的方法中，通式(1)的化合物可以结合药物学上的有效载体给药。表述“药物学上可接受的”意思是适用于制药和兽医领域，即，没有不可接受的毒性或其它不适。药物学上可接受辅助剂的实例是通常与基于肽的药物一起使用的那些，如稀释剂、赋形剂等等。可以参考“Remington′sThe Science and Practice ofPharmacy”，第21版，Lippincott Williams & Wilkins，2005，通常用于指导药物配制。辅助剂的选择取决于预定的组合物给药形式。本发明一实施方案中，将化合物配制成通过灌输或通过皮下或静脉注射给药，因此以无菌水溶液和无热原形式和任意缓冲的或制成等渗的使用。因此，化合物可以稀释于水中给药，或更理想地，稀释于盐水、磷酸盐缓冲的盐水或5％葡萄糖溶液中给药。制备通过片剂、胶囊或悬浮液口服给药的组合物，使用辅助剂如糖如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，包括羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉花籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；多元醇如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；藻酸；水；等渗盐水和磷酸盐缓冲溶液。还可以存在润湿剂、润滑剂如月桂磺酸钠、稳定剂、成片剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂和调味剂。可以使用合适的基料如甘油三酯基料制得用于局部应用的霜剂、洗剂和膏剂。这样的霜剂、洗剂和膏剂还可以含有表面活性剂。还可以制成气雾剂制剂，其中使用合适的推进辅助剂。还可以将与怎样给药无关的其它辅助剂加入组合物中，例如，可以将抗微生物剂加入组合物中来防止微生物生长以延长保存期。
根据本发明，在联合治疗神经和非神经痛中将治疗有效量的通式(1)化合物给药于哺乳动物。如在此所用的，术语“哺乳动物”意思是包括但不限于人，家畜如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊等等，以及野生动物。术语“治疗有效量”意思是用于治疗疼痛所示的化合物含量而没有超过导致显著副作用的含量。给药的剂量取决于许多因素，包括治疗中所用的化合物和待治疗的个体。如通过本领域技术人员已知的，使用适当的受控试验，来确定合适的剂量，并基于测定的细胞水平上有效而无毒的剂量。
本发明的另一方面中，提供了产品。该产品包含含有组合物的包装材料。该组合物包含具有上述化学通式(1)的AC1抑制剂和药物学上可接受的载体。包装材料被标记来说明该组合物可用于联合的同时治疗神经和非神经痛。
包装材料可以是任何合适的通常用于包装用于治疗的组合物的材料，包括瓶子、纸盒、管子，等等。
以下非限制性的特定实施例中描述了本发明的实施方案。
实施例细胞培养将已知缺失AC1的人胚胎肾293(HEK293；ATCC#CRL-1573)细胞生长于补充10％胎牛血清的DMEM中，于37℃，湿度95％空气，5％CO2的培养箱中。
HEK293细胞中AC1的表达AC1表达载体(pcDNA3-AC1)由Dr.Ron Taussing(University ofTexas Southwestern Medical Center)慷慨提供。为了DNA转染，将HEK293细胞以1×106每平板的密度涂布于60mm直径的培养皿中(含有含10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM)，生长过夜并用pcDNA3-AC1(0.8μg DNA每平板)通过Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染。选择含有0.8mg/ml G418的培养基中稳定转染的克隆并维持于该培养基中。
逆转录酶-PCR使用RNeasy Mini kit(QIAGEN Inc，Canada)从转染的HEK293细胞分离总RNA。通过QIAGEN One step RT-PCR Kit(QIAGEN Inc，Canada)在50μl反应体积中进行RT-PCR，使用以下的扩增条件初始变性94℃5分钟，接着94℃45秒、58℃30秒和72℃45秒的35个循环，最终在72℃延伸7分钟。AC1的PCR引物如下正向5′-TGCCTTATTTGGCCTTGTCTACC-3′。反向5′-GACACCCGGAAAAATATGGCTAG-3′。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。
AC1转染细胞中的cAMP测定如之前所述的(Storm等，1998)使用HitHunter cAMP XS测定试剂盒(Discoverex，Fremont，CA)测定腺苷酸环化酶活性。将稳定表达AC1的HEK293细胞生长至汇合。使用PBS中0.02％的EDTA分离细胞。在无酚红的含有低葡萄糖(Gibco)、0.1％牛血清清蛋白(Sigma)和1mM 3-异丁基-1甲基黄嘌呤(Sigma，St.Louis)的DMEM中制得1×106细胞/ml的细胞悬浮液。将约20000细胞(20μl)加入96孔培养平板的每个孔中。在连续浓度的腺苷酸环化酶潜在非竞争性抑制剂的不存在或存在下，用10μM forskolin(非特异性腺苷酸环化酶激活剂)、10μM A23187(钙离子载体)和2mM CaCl2的组合物刺激细胞，在37℃ 5％CO2培养箱中孵育45分钟。加入cAMP XS抗体/裂解混合物(20μl)并在RT孵育60分钟，接着再加入20μl cAMP XS ED试剂并在RT孵育60分钟。加入EA/CL底物混合物(40μl)并在RT孵育过夜后在CLIPR读数器(Molecular Devices)上读出化学发光。测定进行四组。
通过双萤光素酶报告测定的表达AC1的HEK293细胞中的化学筛选为了测定AC1抑制剂对CREB表达的下游效应，使用了双萤光素酶报告系统(Williams C.Nat Rev Drug Discov.2004年2月；3(2)125-35.综述)。该报告测定中，随萤火虫萤光素酶表达水平的改变来测定胞内cAMP浓度的改变，萤火虫萤光素酶的转录受到结合上游cAMP响应元件(CRE)的转录因子cAMP响应元件结合蛋白(CREB)的调控。在不存在抗生素下将HEK293细胞传代培养入96孔平板中，生长过夜并使用Lipofectamine 2000试剂用pGL3-CRE-萤火虫萤光素酶和pGL3-CMV-Renilla萤光素酶构建体(0.25μg DNA每孔)来转染。将转染细胞孵育过夜，并将培养基改为含有10％胎牛血清的DMEM。48小时后，在浓度为100μM的每种测试的AC1抑制剂的不存在或存在下，将细胞独立地用10μM forskolin、10μM钙离子载体A23187和2mMCaCl2，或10μM forskolin、10μM A23187和2mMCaCl2的组合物处理。在6小时孵育阶段的最后，收集细胞，并通过Dual-LuciferaseReporter Assay System(双萤光素酶报告系统)(Promega)测定萤光素酶活性。通过SIRIUS发光计测量相对光单位。
动物该研究中所用的小鼠是C57B1/6株系成年鼠(8周大)和C57B1/6背景的敲除AC1的小鼠(Wei等，2002；Neuron)。以12h∶12h的光∶暗周期并用随意可得的食物和水饲养动物。所有实验方案根据AnimalCare Committee of the University of Toronto。很好地照看野生型和敲除型。实验者不知道基因型。
急性炎症肌肉疼痛的福尔马林舔测试(Formalin lick test)
在简短halothane麻醉下，将10μL的5％福尔马林注射进左腓肠肌(gastronemius)肌肉中。将针从侧面直接取出以避免任何骨穿透并将尖端停止于肌肉腹部的中间。2小时时间段内每5分钟记录并总计舔或咬包括大腿和爪的注射腿花费的总时间。为了研究测试化合物对行为的作用，在肌内注射福尔马林30分钟之前，腹膜内注射测试的每种化合物。
慢性炎症肌肉疼痛的诱导使原来发展来研究慢性疼痛的机械异常性疼痛的肌肉模型(Sluka等，2001)适应这些实验。将小鼠简短地在halothane下麻醉。将20μL卡拉胶(carrageenan)(3％，于pH7.2的生理盐水中)深入肌内注射进左腓肠(gastronemius)肌肉中。生理盐水用作对照。在第1天和第5天进行注射。在第1、2、5天(在注射之前和之后)、14和28天测量行为伤害性响应。
无害机械刺激的响应将小鼠放置于丛-玻璃限制器中并在测试前使其适应30分钟。基于后爪对von Frey丝至弯曲点应用的响应性测量机械异常性疼痛(Stoelting，Wood Dale，Illinois)。阳性响应包括舔、咬和后爪的突然退缩。进行实验来表征极限刺激。发现1.65丝的机械压力(0.008gm的力)是无害的。然后将丝用于测试机械异常性疼痛。每隔5分钟每次进行10个试验并将结果表示为阳性响应的百分比。阳性响应包括伴随舔或抓伤的延长的爪退缩。
对神经性疼痛的AC1抑制的测量如所述的(插入的参考文献)通过结扎普通腓骨神经来诱导神经性疼痛。发现该方法对于测量神经性疼痛中行为伤害性响应是有效的小鼠模型。在第7天测量AC1抑制对结扎同侧足背部上最大机械异常性疼痛的效用。腹膜腔内注射AC1抑制剂30分钟后，在AC1敲除小鼠以及正常小鼠中进行实验。
数据分析结果表示为平均±平均的标准误差(SEM)。通过变量的two-way分析(ANOVA)进行统计学比较。P＜0.05认为是统计学显著的。
化学物质使用上述测试所测试的化学物质(抑制剂)包括图6中所示例的那些。
结果通过cAMP测定AC1稳定表达HEK293中化学物质的浓度依赖性效应将AC1表达载体稳定转染入HEK293细胞中，并通过RT-PCR来证实AC1表达(图1a-泳道1100bp DNA阶梯分子量标记。泳道2ACI表达载体pcDNA3-AC1的PCR产物作为对照。泳道3无AC1载体转染的HEK293。泳道4AC1表达载体转染的HEK293。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。
然后，在有或无AC1表达的HEK293细胞中比较forskolin和A23187的刺激效果。发现forskolin和A23187两者在AC1表达细胞中诱导的cAMP水平高于无AC1表达的HEK293细胞(图1b)。Forskolin和A23187的结合导致较高水平的cAMP(图1b)。然后测试抑制剂对AC1转染的HEK293细胞中forskolin和钙离子载体刺激的cAMP水平的作用。所有抑制剂显示出cAMP水平的统计学显著降低(P＜0.001)(图1c)新AC1抑制剂对CREB表达的作用比较了有或无AC1表达的HEK293细胞中forskolin和A23187对CREB表达的刺激作用。forskolin和A23187两者在AC1表达细胞中诱导的萤光素酶活性高于无AC1表达的HEK293细胞。Forskolin和A23187的结合可以导致萤光素酶活性最强的诱导。然后测定每种AC1抑制剂对forskolin加A23187刺激的AC1稳定表达HEK293的效用。发现所有测试的抑制剂在100μM的浓度抑制了萤光素酶活性(图1d)。
通过选定的AC抑制剂对AC1表达累积激活的剂量依赖性抑制在AC1抑制剂存在下，用10μM forskolin、10μM A23187和2mMCaCl2的组合处理表达AC1的HEK293细胞。每种抑制剂在0.2至200μM之间以浓度依赖性方式抑制cAMP生产，对于SQ22536，IC50为22μM，对于HTS09836，IC50为10μM，对于JFD02793，IC50为18μM和对于SB01788/DA，IC50为45μM(图2)。
新AC1抑制剂对急性炎症肌肉疼痛中伤害性响应的剂量依赖性抑制HTS09836显示了0.1至5mg/kg体重剂量范围的急性肌肉炎性疼痛舔响应的显著降低(P＜0.001)，在1mg/kg体重达到峰值响应(图3)。
腺苷酸环化酶1作用于急性持续炎症肌肉疼痛在将10μl的5％甲醛肌内注射入左腓肠肌(gastronemius)肌肉诱导的急性肌肉疼痛中测定AC1对动物行为响应的作用。通过侧向方法小心注射并将针尖保持在肌肉的中间。福尔马林测试是组织损伤介导的炎性疼痛诱导的行为改变的常见测试(Haley等，1990)，(Wei等，2001；Wei等，2002a)。观察动物对注射腿的舔和咬响应120分钟(野生型，N＝8只小鼠用于盐水对照；野生型，N＝8只小鼠用于甲醛对照；注射AC1，N＝8只小鼠)(图4a)。根据脑和脊髓不同水平的NMDA受体，福尔马林诱导的行为响应由三个阶段构成((Haley等，1990)和(Wei等，2001)。与野生型相比较，AC1敲除中第一阶段的响应未显著改变表明了AC1没有显著作用于对甲醛的早期急性感官响应。在阶段2和3观察到的野生型和AC1敲除小鼠之间的显著差异表明AC1对急性炎症过程中的持续响应是必要的。通过NMDA受体-介导的钙进入激活钙调蛋白刺激的AC，阶段2和3中的降低可能是由于另外持续几小时的NMDA受体-依赖性突触增强的丢失(Wong等，1999)。
腺苷酸环化酶1作用于神经性疼痛在结扎左普通腓骨神经后第7天测试神经性疼痛过程中诱导的机械异常性疼痛。在120分钟内的三个阶段中作出动物的行为响应对时间的曲线。AC1 KO小鼠呈现出所有阶段过程中同侧响应的显著降低。
AC1抑制剂逆转了慢性炎症肌肉疼痛和神经性疼痛测试了AC1抑制剂对慢性炎症肌肉疼痛的抗伤害性效用。测试了对von Frey丝的机械性响应。0.1和1mg/kg体重的剂量都显示了机械异常性疼痛的显著降低。发现1mg/kg体重的剂量具有优良的效果(图5a)。对于神经性疼痛，在0.1和1mg/kg体重的剂量，异常性疼痛都显著降低(图5b)。更严重形式疼痛中的机械异常性疼痛(作为慢性炎性疼痛和神经性疼痛的结合引入)，通过0.1和1mg/kg体重的HTS09836的动物预治疗(i.p.注射)，显著降低(图5c)。
讨论AC1敲除小鼠呈现了阶段2和3持续炎性疼痛感觉显著降低，表明了Ca-钙调蛋白刺激的AC是持续肌肉疼痛感知中的关键分子。缺失AC1的小鼠显示了较低的神经性疼痛，未能呈现皮下组织和肌肉两者慢性炎症中的长期痛觉过敏。由于cAMP对大多数细胞中的正常功能是必要的，测试这些酶的非竞争性抑制剂来选择一种特异性抑制AC1以最小化对其它代谢途径的作用的抑制剂。
针对这些抑制剂分子对培养中AC1转染细胞系的活性的筛选使得AC1特异性抑制剂的选择成为可能。由于AC1是神经元特异性的，认为这些非竞争性抑制剂只作用于神经元。动物模型中急性持续、神经性和慢性皮下和肌肉炎性疼痛中由于AC1选择性抑制剂的行为伤害性响应的明显降低表明了AC1在调节这些不同类型疼痛中的作用。
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权利要求
1.联合治疗哺乳动物中神经和非神经痛的方法，包括将治疗有效量的具有以下通式(1)的化合物给药于哺乳动物的步骤 其中A选自H、OH、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷、C2-C6链烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷氧基；B选自羟基、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1或由一个或多个选自羟基、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1的取代基取代的C1-C6，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基烷基，或NR1R2形成C3-C10芳族或非芳族环结构或C3-C10芳族或非芳族杂环结构，由OH、卤素、硫、NH2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇或C1-C6烷氧基任意取代，D选自H、卤素、羟基、NH2、硫、NHR1、NR1R3、SR1、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基，其中R1如上定义，且R3定义和R1一样；E是H或OH，或由C1-6-烷基、氨基、NHR1、NR1R2、硫、SR1任意取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-10-芳基-C1-6-烷基或C3-10-芳氧基-C1-6-烷基，未取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基的取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或未取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基的取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，其中R1和R2如上定义；和G、H、J和M各自是N，或H和J各自是C，G和M各自是N、S或O，或H、J和M各自是C，G是N、S或O。
2.如权利要求1限定的方法，其中G、H、J和M各自是N。
3.联合治疗神经性和非神经性痛的组合物，包含药物学上可接受载体结合如权利要求1中所限定通式(1)的化合物。
4.一种产品，包含含有组合物的包装材料，其中该组合物包含权利要求1中所限定通式(1)的化合物，和药物学上可接受的载体，并且该包装材料被标记来说明该组合物可用于哺乳动物的神经和非神经痛的联合治疗。
5.抑制AC1的方法，包括将AC1与具有以下通式(1)的化合物接触 其中A选自H、OH、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷、C2-C6链烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷氧基；B选自羟基、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1或由一个或多个选自羟基、硫、OR1、NH2、NO2、NHR1、NR1R2、SR1的取代基取代的C1-C6，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C1-C6链烷醇、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基烷基，或NR1R2形成C3-C10芳族或非芳族环结构或C3-C10芳族或非芳族杂环结构，由OH、卤素、硫、NH2、C1-C6烷基、C1-C6链烷醇或C1-C6烷氧基任意取代，D选自H、卤素、羟基、NH2、硫、NHR1、NR1R3、SR1、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基，其中R1如上定义，且R3定义和R1一样；E是H或OH，或由C1-6-烷基、氨基、NHR1、NR1R2、硫、SR1任意取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-10-芳基-C1-6-烷基或C3-10-芳氧基-C1-6-烷基，未取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基的取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或未取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，或具有一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6羧基烷基、卤素或OH取代基的取代的C3-C7环烷基、苄基或C4-C6杂环，其中R1和R2如上定义；和G、H、J和M各自是N，或H和J各自是C，G和M各自是N、S或O，或H、J和M各自是C，G是N、S或O。
全文摘要
提供了例如在联合治疗哺乳动物的神经性和非神经性疼痛中的抑制ACl的方法，包括将ACl接触具有以下通式(1)的抑制剂其中式1中各基团定义详见说明书。
文档编号A61K31/7042GK1947717SQ20061001989
公开日2007年4月18日 申请日期2006年3月1日 优先权日2005年10月14日
发明者卓敏 申请人:卓敏