专利名称：调节尿柠檬酸浓度防治肾结石的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种盐的用途，确切讲是指锂的碳酸盐用于制备一种调节控制尿柠檬酸浓度，防治肾结石的药物。
背景技术：
根据资料报道，低柠檬酸尿病人和正常人胃肠道对柠檬酸的吸收没有显著差别。低柠檬酸尿不是胃肠道吸收不良的结果，而是肾脏过分重吸收性转运所致。柠檬酸可从肾小球自由滤过，排出尿液中柠檬酸浓度取决于血浆柠檬酸浓度和肾近区小管对它的重吸。其过分重吸收将导致柠檬酸从尿液排泄量减少。通过对肾近区小管组织的离体研究，证实了肾脏重吸收柠檬酸的第一步是位于肾近区小管刷状缘和基底膜的二羧酸转运子(NaDC1和NaDC3)对它的转运。而另一些类似研究证实，血柠檬酸的吸收主要由分布在肝脏等组织中的Na+依赖性柠檬酸转运子(NaCT)介导。因此，这些转运子的功能状态对尿柠檬酸的调节起着决定性的作用。
NaDC-1是一种钠离子依赖性二羧酸转运蛋白。它的底物亲和力较低，主要生理功能是吸收柠檬酸循环中间产物，如柠檬酸、琥珀酸盐等，但以琥珀酸为主。NaDC-3是一种钠离子依赖性、与底物有高度亲和力的二羧酸转运蛋白，它存在于肾、脑、肝和胎盘中。肾中NaDC-3的功能主要是产生有机阴离子转运子OAT1的驱动力以促使有机阴离子通过基底膜进入肾小管壁细胞。NaCT是新近发现的这一转运子家族成员之一，它在肝，睾丸和脑表达，与柠檬酸的亲和力较高，是主要转运枸橼酸二羧酸转运蛋白。它对其他二羧酸和三羧酸也可转运但亲和力很低。
肾脏对尿液中柠檬酸的过分重吸收是形成低柠檬酸尿的重要原因之一。低柠檬酸尿在肾结石病人中发生率较高，其中大部分是先天性的。引起先天性低柠檬酸尿的机理至今尚不清楚，但在其发病过程中，Na+依赖性二羧酸转运子(NaDC1和NaDC3)和Na+依赖性柠檬酸转运子(NaCT)可能起着重要作用，参见He，Y.N.，Chen，X.C.，Yu，Z.H.Sodium dicarboxylate cotransporter-1expression in renal tissues and its role in rat experimentalnephrolithiasis.J Nephrol，1734，2004；HE，Y.N.，CHEN，X.M.，YU，Z.H.，et alThe change of human Na+/dicarboxylate co-transporter 1expression in the kidney and its relationship withpathogenesis ofnephrolithiasis Natl Med J China，811066，2001；Pajor，A.M.Molecularcloning and functional expression of a sodium-dicarboxylate co-trans-porter from human kidney.Am J Physiol，270F6422648，1996。
研究还发现，通过与钙离子络合、抑制钙在尿液中凝集以及草酸钙结晶形成，柠檬酸可有效防治肾结石形成，参见Ryall，R.Urinary inhibitors ofcalcium oxalate crystallization and their potential role in stoneformation..World J Urol，15155，1997。现阶段已知口服柠檬酸盐(如柠檬酸钾、柠檬酸镁钾等)可提高尿柠檬酸浓度，从而有效抑制肾结石形成，参见Hamm，L.，Hering-Smith，K.Pathophysiology of hypocitraturicnephrolithiasis.Endocrinol Metab Clin North Am，31885，2002，和，Hojgaard，I.，Tiselius，H.The effects of citrate and urinarymacromolecules on the aggregation of hydroxyapatite crystals insolutions with a composition similar to that in the distal tubule.UrolRes，2689，1998。但这些药物的口感很差、胃肠道反应较重，因而限制了临床推广应用。另外采用局部灌注含柠檬酸溶液也可有效溶解含钙结石，参见Zhang，X.B.，Wang，Z.P.，Duan，J.M.Urothelial injury to the rabbitbladder caused by calcium dissolving agents including two new citratesolutions.Urol Res，33309，2005，和，Zhang，X.B.，Wang，Z.P.，Duan，J.M.New chemolysis for urological calcium phosphate calculi-a studyin vitro.BMC Urol 59 2005。但其难以忍受的副作用，如对泌尿系粘膜的损伤，以及灌注所需的局部置管等对机体的损伤等使这些疗法难以在临床广泛推广应用。因此，有必要继续探索新的治疗途径，找出新的控制尿中柠檬酸浓度的药物和新的治疗肾结石的药物。
发明内容
本发明通过一系列的实验研究，提供了一种新的用于制备控制尿中柠檬酸含量、治疗肾结石的药物。
本发明是用碳酸锂制备控制尿中柠檬酸浓度的药物和治疗肾结石的药物。
现阶段碳酸锂是精神病科的一种常用药，用于治疗躁狂症等。碳酸锂可以有效减轻症状，且其安全性已经证实。但至今尚未发现用碳酸锂治疗其它疾病的报道。
本发明的研究表明，采用碳酸锂治疗可使人和大鼠尿柠檬酸浓度显著增加，从而可有效抑制肾结石发展；可使草酸铵造成的结晶沉积，肾小管扩张和管周炎细胞浸润等损害明显减轻。说明碳酸锂对草酸钙结石有着显著防治效果。根据碳酸锂用于治疗人躁狂型精神病的大量临床报道，碳酸锂口服给药是安全的，没有发现治疗剂量碳酸锂对人有明显的毒副作用，其不良反应的发生程度可能低于口服其它柠檬酸盐，如柠檬酸钾和柠檬酸镁钾等；且该药提高尿柠檬酸水平的效率明显高于后者。但锂可能发生蓄积中毒。因此，服用该药期间，应定期检测血锂浓度，以据此适当调节给药量。
图1碳酸锂治疗后尿柠檬酸浓度变化。图中x±s，bP＜0.05在同一时间点与其它组相比。
图2碳酸锂治疗后大鼠血浆柠檬酸浓度变化。图中x±s，bP＞0.05在同一时间点与其它组相比。
图3碳酸锂治疗后血浆柠檬酸浓度变化。图中x±s，cP＜0.01与碳酸锂治疗组相比。bP＜0.05与36.9mg、52.4mg碳酸锂治疗组大鼠相比。eP＜0.05与52.4mg/d碳酸锂治疗组大鼠相比。
图4至图7为结石模型大鼠肾病理形态变化。标本取自结石模型大鼠并经福尔马林固定皮质组织切片经常规染色后进行观察、比较。其中图4为对照组肾脏组织(×200)。
图5为用含5％草酸铵建模14天后的肾脏组织(×200)。由图中可见肾小管明显扩张，炎细胞向间质渗出。
图6为结石模型大鼠经碳酸锂治疗7天后的肾脏组织(×200)。由图可见肾小管轻度扩张和少量炎细胞渗出。
图7为结石模型大鼠经碳酸锂治疗14天后。由图可见病理损害较上述碳酸锂治疗7天时进一步减轻。
图8碳酸锂治疗后病人尿柠檬酸浓度变化。图中bP＜0.05与安慰剂组在同一时间点相比。
具体实施例方式
本发明以下给出有关的实验及结果动物实验所用实验动物是Waster大鼠。
取Waster大鼠120只，根据体重随机分成4组(1)对照组。正常饲料，自由饮用自来水。
(2)5％草酸铵组。饲用含5％草酸铵饲料，自由饮用自来水(下同)+自来水灌胃，2次/天。
(3)碳酸锂组。正常饲料，自由饮用自来水+18.2mg/ml碳酸锂灌胃，2次/天。
(4)5％草酸铵+碳酸锂组。饲用含5％草酸铵饲料7天后，加用18.2mg/ml碳酸锂灌胃，2次/天。
在实验中，(3)组，也就是碳酸锂组，从开始即予碳酸锂18.2mg/ml.1ml灌胃，每天二次；(4)组，即5％草酸铵+碳酸锂组，自饲用含5％草酸铵饲料7天后再加用碳酸锂18.2mg/ml.1ml灌胃，每天二次。同时观察应用碳酸锂26.4mg/天、52.4mg/天两个剂量治疗时对大鼠的量效关系。实验开始前所有大鼠均饲喂7天以使其适应代谢笼环境，分别于碳酸锂治疗后第3，7和14天大鼠置代谢笼收集尿液24h标本，加入麝香草酚和0.5ml 12N盐酸防止柠檬酸被尿细菌分解，然后经右心室途径采集血液标本。右肾置10％福尔马林中以备组织学检查，左肾用作肾结晶情况检查。
酶法检测血清柠檬酸和草酸。其他生化指标如血、尿肌酐，钙，磷，钾，镁和尿酸等采用全自动生化分析仪(SYNCHRON CX7，Beckman Coulter公司制造)检测。用pH计(Mettler Toledo 320-S，灵敏度0.01)检测尿液pH值，偏光显微镜检测结晶尿。
肾脏结晶沉积检测肾脏结晶沉积情况分级0＝无结晶沉积；1＝少量结晶分散于肾髓质；2＝中等量结晶分散于肾髓质和乳头；3＝大量结晶分散于肾髓质，肾乳头和皮质；4＝大量结石片分布于肾乳头并伴发肾积水或肾结石。
肾脏病理检查肾皮质组织石蜡切片常规，HE染色。根据肾脏组织受损由轻到重，分级为0，1，2和3(0＝无明显损害；1＝部分肾小管轻度扩张，肾小管周围组织炎细胞浸润性损害＜20％；2＝较多肾小管扩张，肾小管周围组织炎细胞浸润性损害＜40％；3＝多数肾小管严重扩张，肾小管周围组织炎细胞浸润性损害＞40％)。
本发明除进行了动物实验外，还对人碳酸锂治疗效果进行了相应的实验。
从精神病科随机选择55例正在接受碳酸锂治疗病人(男39人，女17人，平均年龄分别为35.8岁和30.6岁)，分别收集血、尿标本，观察相关生化指标变化。排除梗阻性尿路疾病，慢性泌尿系脓肿，肾功能衰竭(血清肌酐大于168μmol/L，正常不大于132μmol/L)，肾小管性酸中毒和6个月内曾行碎石治疗病人。55例病人均签订知情同意书。其中，35例病人给予0.5g碳酸锂bid，口服治疗；其余17例病人接受安慰剂治疗。
以上的实验均采用统计学处理，用SPSS13.0统计软件进行数据处理，统计分析采用LSD-t检验或Dunnett t-检验。P＜0.05为有显著性意义。
相应的实验结果如下一、碳酸锂对大鼠生化指标的影响经碳酸锂治疗3天后，大鼠尿柠檬酸浓度均明显增高。和对照组相比，碳酸锂组尿柠檬酸浓度增加4倍(P＜0.05)。但随着治疗时间的延长和剂量的增大，没有明显进一步增加。碳酸锂治疗组血柠檬酸水平略有升高，但和对照组比较无显著性意义(P＞0.05，Fig 2)。血Li+浓度随着治疗剂量的增加而增加，参见图3。应用36.9mg/d碳酸锂治疗下，Li+浓度平均为0.82mmol/L。在(2)，(3)和(4)组大鼠中，尿中尿酸从14天略有增加，但与对照组相比无显著性差别。所有用碳酸锂治疗的大鼠，其尿液pH值明显升高。第(4)组，即5％草酸铵+碳酸锂组，其尿肌酐水平从第7天有一定程度升高，而仅使用碳酸锂的第(3)组，其尿肌酐水平从第14天有所升高。第(2)、(3)和(4)组血清肌酐浓度均有不同程度增高，但仅第(4)组在第21天和对照组比较有显著性意义，参见表1。受试鼠的其他血清生化指标，如Na+，K+，Mg+和P等无明显变化。
草酸铵诱导的肾结石模型饲喂草酸铵3天后，鼠尿中草酸和钙浓度明显增高，且随时间进展无明显波动，血清草酸浓度无明显增加，参见表2。受试大鼠中87％出现结晶尿，但未发现大鼠肾结晶沉积。第7天大鼠结晶尿比例上升为100％，肾髓质和乳头出现中到大量的结晶沉积(87％)。第14天，所有草酸铵治疗大鼠均出现大量结晶沉积，参见表2。病理检查显示，第3天仅有轻微肾小管扩张，参见表3，第7天可见明显的肾小管扩张，结晶沉积和明显的管周炎细胞浸润，参见图5。除碳酸锂治疗组外，所有上述饲喂草酸铵的受试鼠的肾脏损害明显加重参见表2和3。而碳酸锂治疗组受试鼠无明显肾脏损害发生，结石+碳酸锂组高草酸尿和结晶尿持续存在。但加用碳酸锂治疗后肾脏损害逐渐减轻，至第21天基本恢复正常，参见图6，图7。
二、病人生化指标变化碳酸锂治疗后，病人的尿柠檬酸浓度明显增高且不随碳酸锂剂量增加而增加(图6)。血清柠檬酸浓度无明显变化。血清Li+浓度随碳酸锂剂量增加而增加。1.0g/d.碳酸锂和1.5g/d.碳酸锂治疗病人的平均血清锂浓度分别为0.62(0.62±0.12)mmol/L和0.80(0.80±0.21)mmol/L。病人体重无明显减轻，无明显其他生化指标变化。
以上的实验表明，经碳酸锂治疗3天后，尿柠檬酸浓度明显升高并且随治疗时间延长和剂量增加无明显进一步增加。尿中这种变化的机理是Li+能代替Na+与这些二羧酸转运子结合位点之一结合，这种结合可显著影响其转运功能，从而减少尿、血柠檬酸浓度的增加，间接增加排出尿液中柠檬酸浓度。由于受到离子替换位点的限制和滤出尿液中柠檬酸含量的限制，致使增加剂量或延长治疗时间对尿柠檬酸浓度无进一步显著影响。这从另一方面说明，较低的治疗剂量已经达到最大调节效果，因而无需试图增加治疗剂量以求进一步提高疗效。
图8为分别应用安慰剂和碳酸锂治疗病人后尿柠檬酸浓度变化情况。Placebo为安慰剂组，LiC为碳酸锂治疗组。可见应用碳酸锂治疗后病人尿柠檬酸浓度明显增高。
为评估碳酸锂对肾结石的治疗效果，我们用含5％草酸铵饲料饲喂大鼠以建立大鼠肾结石模型。草酸铵是一种有效的肾结石形成抑制物，它可有效增加大鼠尿结石形成物质，参见Khan，S.Animal models of kidney stone formationananalysis.World J Urol，15236，1997。本实验中，5％草酸铵饲料饲喂大鼠3天后可见明显的低柠檬酸尿，高草酸尿和结晶尿，7天大鼠肾髓质和乳头可见大量结晶沉积。14天时除上述病理变化外，尚可见大量结石片以及肾小管周围大量炎细胞浸润。应用碳酸锂后，结晶沉积和肾小管周围炎细胞浸润逐渐减轻，至21天，基本消失，说明该疗法对大鼠实验性结石确有良好疗效。
由以上实验表明碳酸锂可以用于制备调节尿中柠檬酸浓度，治疗肾结石的一种药物。使用碳酸锂可使人和大鼠尿中的柠檬酸浓度显著增加，从而可有效抑制肾结石发展；可使草酸铵造成的结晶沉积，肾小管扩张和管周炎细胞浸润等损害明显减轻。
权利要求
1.碳酸锂用于制备控制尿中柠檬酸浓度的药物。
2.碳酸锂用于制备治疗肾结石的药物。
全文摘要
本发明公开锂的碳酸盐用于制备一种调节控制尿柠檬酸浓度，防治肾结石的药物。
文档编号A61P13/12GK1965858SQ20061004293
公开日2007年5月23日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者王志平, 张向波, 罗纳德·罗德里格斯 申请人:兰州大学