专利名称：镇静催眠的复方酸枣仁油与栀子油组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于一种中药组成的药品，特别涉及一种镇静催眠的复方酸枣仁油与栀子油的组合物及其应用。
背景技术：
经典中药文献记载酸枣仁具有养肝、宁心、安神之功效；栀子具有清热泻火，除烦安神之功效。二者是常用养心、安神、除烦的中药对药，主治虚烦不得眠，常成对出现于养心安神中药复方中。
根据申请人所作地资料检索，有关酸枣仁油和栀子油的相关研究报道和专利申请如下
现代药理学研究报道，酸枣仁和栀子仁的水溶性部位(酸枣仁总苷、栀子醇提物)是他们的中枢神经作用有效部位。
酸枣仁油的相关研究报道酸枣仁油具有调节血脂作用，压榨提取法提取酸枣仁油具有中枢神经作用。
有关酸枣仁油专利申请酸枣仁油降脂滴丸的配方及其制备方法(94107184)；酸枣仁的加工方法(00104496)，超临界二氧化碳萃取法提取酸枣仁油和酸枣仁粉。
截止目前为止，申请人还没有见到栀子油的研究报道和专利申请，也没有检索到有关复方酸枣仁与油栀子油的组方比例、复方制剂的制备工艺，和有关复方酸枣仁油与栀子油组合物的镇静、催眠和促进学习记忆的功效和应用，及其复方酸枣仁油与栀子油组合物的协同镇静催眠作用的相关文献和专利申请。
在制药领域，二氧化碳萃取法和软胶囊制备是成熟工艺。
经申请人进行的资料检索，给出下列和本发明相关的文献作为参考
1.王钢力，陈德冒，赵淑杰.栀子属植物化学成分研究进展[J].中国中药杂志，1996，21(2)67。
2.吉力，徐植灵，潘炯光.栀子果实挥发油的GC-MS分析[J].中国药学杂志，1993，28(7)398.
3.李志孝，孟延发.栀子多糖的分离及其性质[J].生物化学与生物物理学报，1993，25(3)301。
4.张书楣.栀子的药理研究[J].国外研究参考，1976，(9)17-17。
5.刘晓庚，陈梅梅.黄栀子果、籽中油脂化学成分分析[J].粮食与油脂，2001，16，30-31。
6.梁惠玲，郑惠兰，陈泗英.黄栀子花中的色素[J].云南植物研究，1991，13(1)95-95。
7.杨静玉，吴春福.内源性睡眠诱导物质油酰胺研究进展[M].药理学进展，2004。
8.郭长彬，宋宏锐.内源性睡眠诱导物质油酰胺的研究进展[J].中国药物化学杂志2000，10(4)；300-310。
9.Yang JY，Wu CF，Wang F，Song HR，Pan WJ，Wang YL.The serotonergicsystem may by involved in the sleep-inducing action of oleamide in rats.NaunynSchmi edebergs Arch Pharmacol 2003；368457-462。
10.Coyne L，Lees G，Nicholson RA，Zheng J，Neufield KD.The sleep hormoneoleamide modulates inhibitory ionotropic receptors in mammalian CNS in vitro.Br J Pharmaco.2002；1351977-1987。
11.Yost CS，Hampson AJ，Leonoudakis D，Koblin DD，Bornheim LM，GrayAT.Oleamidepotentiates benzodiazepine-sensitive gamma-aminobutyric acidreceptor activity but does not alter minimum alveolar anesthetic concentration.Anesth Analg 1998；861294-1300。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种镇静催眠和促进学习记忆的复方酸枣仁油与栀子油组合物。
本发明的另一个目的在于，提供栀子油用于制备镇静催眠和促进学习记忆药物的应用。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种镇静催眠和促进学习记忆的复方酸枣仁油与栀子油组合物，其特征在于，该组合物由酸枣仁油与栀子油组成，其剂量比例为2∶1。
申请人按照医药学的要求，经过各种实验已得到证明，本发明的复方酸枣仁油与栀子油组合物镇静催眠和促进学习记忆的作用大于单味的2倍剂量的酸枣仁油、栀子油的作用，说明他们产生协同作用，证明了复方酸枣仁油与栀子油组合物能够用于制备镇静催眠和促进学习记忆药物的应用。同时也证明了栀子油具有镇静、催眠、抗惊厥及促进学习记忆的作用。
申请人已经着手准备酸枣仁油与栀子油复方新药或功能食品的研究和申报相关工作，开发复方酸枣仁与栀子油的复方及其栀子油的药用产品。
图1是小鼠自主活动次数的估计边缘均数图。
具体实施例方式
酸枣仁、栀子配对机理酸枣仁甘酸性平，善养肝血，益心阴而宁心安神，善治心肝血虚引起的心烦失眠、惊悸怔忡等。栀子仁苦寒，清热泻火，凉血解毒，取仁入药，擅入心经，长于清心透邪，除烦解郁而安神定志，多用治心经留热之心中懊侬、虚烦不眠等。二药合用，相辅同用，相辅相成，为治血虚阴亏、热扰神明而致心烦失眠之常用药对。酸枣仁养心血敛心阴而治本，栀子仁导热下行，清心经之火而治标。酸苦并投(一酸一苦)，敛泄合用(一敛一泄)，标本兼顾，共奏养血敛阴，除烦安神之功。一般酸枣仁用10～15g，栀子仁10g。临床应用二者常伍用于血虚阴亏，热扰神明之心烦盗汗，失眠多梦，心悸怔忡。
1.复方酸枣仁与油栀子油的组方和组方比例(正交试验)
1.1材料
(1)动物健康昆明种ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大学医学院动物实验中心提供(陕医动字第08-004，二级合格动物)。
(2)药品酸枣仁油、栀子油由超临界CO2萃取；地西泮(Diazepam injection)由上海徐东海普药业有限公司生产，批号041001。
(3)仪器YLS-1A小鼠自主活动记录仪
1.2方法
采用光电管法。取90只小鼠均衡随机分为9组，每组10只，用萃取物----酸枣仁油、栀子油组方L9(34)，因栀子有毒性，故剂量不宜过大。按实验计划表安排实验，测试前将90只小鼠禁食12h，次晨9时起均按0.01ml/20g、0.02ml/20g、0.04ml/20g灌胃给药，60min后，用YLS-1A小鼠自主活动记录仪依次记录各组小鼠30min的自主活动次数。1.3结果
正交试验小鼠自主活动次数的实验结果和用极差法分析结论见表1-1、1-2、1-3、1-4、1-5及图1。
表1-1酸枣仁油、栀子油正交试验设计的实验计划表及结果(x±s，n＝10)
表1-2药物相互作用分析
注a R Squared＝.188(Adjusted R Squared＝.108)
采用SPSS11.5分析，以小鼠自主活动次数为变量，通过对各目标效应检验，单变量组间比较的方差分析可知酸枣仁油在组方中的作用强(P＜0.01)为主药，栀子油的作用弱(0.05＜P＜0.25)为辅药。交互作用虽无统计学意义(P＞0.5)，但两药组方的模型是有意义的(P＜0.05)。从变量(小鼠自主活动次数)的估计边缘均数图可知(图1)酸枣仁油、栀子油在剂量0.02ml/20g、0.04ml/20g线交叉，故两药存在交互作用。
表1-3 酸枣仁油、栀子油正交试验设计的直观分析图
由直观分析图可知酸枣仁油的极差大，作用强，为主效应；栀子油的极差小，作用弱，为辅效应。
表1-4 酸枣仁油、栀子油正交试验设计的交互作用表
由交互作用表可知酸枣仁油以0.02ml/10g，栀子油以0.01ml/10g为最优剂量组合。最优剂量比为2∶1。
表1-5 酸枣仁油、栀子油正交试验设计的方差分析表
由方差分析表可知酸枣仁油、栀子油的方差分析结果P＞0.05，但酸枣仁油的方差大，为主效应；栀子油的方差小，为辅效应。
综上所述酸枣仁油、栀子油组成复方抑制小鼠自主活动，是有显著性意义的；组方中，酸枣仁油为主药，栀子油为辅药；酸枣仁油、栀子油的最优剂量比例为2∶1；酸枣仁油以0.02ml/10g，栀子油以0.01ml/10g为最优剂量组合，该组合抑制小鼠的自主活动作用最为明显。故酸枣仁油以0.02ml/10g，栀子油以0.01ml/10g设为中剂量组，酸枣仁油、栀子油以2∶1的剂量比组方，进行拆方研究及药效学实验。
2.复方酸枣仁与油栀子油对小鼠的镇静作用和拆方研究
2.1材料
(1)动物健康昆明种ICR小鼠18～22g，二级合格动物，♀，由西安交通大学实验动物中心提供(陕医动字第08-004)。
(2)药物酸枣仁油、栀子油由超临界CO2萃取；地西泮(Diazepam injection由上海旭东海普药业有限公司生产，批号041001；与生理盐水配成0.1％水溶液)
(3)仪器YLS-1A小鼠自主活动记录仪
2.2方法
采用光电管法。取♀小鼠90只，分层随机分为9组，复方酸枣仁与油栀子油分别按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，酸枣仁油大(4ml/kg)、中(2ml/kg)剂量组，栀子油大(2ml/kg)、中(1ml/kg)剂量组，地西泮阳性对照组按3mg/kg给药，对照组给予等体积的生理盐水，bid，连续给药15d，在d0、d1、d3、d5、d10、d15上午9:00时，给药60min后，用YLS-lA小鼠自主活动记录仪依次记录各组小鼠30min的自主活动次数，结果见表1(x±s，n＝10)。
2.3结果
表2-1 复方酸枣仁与油栀子油对小鼠自主活动的影响(x±s，n＝10)
注与NS组比较**P＜0.01；*P＜0.05；与复方中剂量相比，++P＜0.01；+P＜0.05。
该实验将复方酸枣仁油与栀子油的拆方实验与其及各单味药的镇静作用结合在一起进行研究，一次实验即可观察复方酸枣仁与油栀子油的拆方研究结果，又可观察它们是否具有镇静作用。当复方或各单味药的自主活动与生理盐水组比较有显著性差异时，表明其有镇静作用；当复方与两单味药中剂量组比较有显著性意义时，即AB＞A也＞B，表示两单味药有相加作用；当复方与两单味药大剂量组比较有显著性意义时，即AB＞2A也＞2B，表示两单味药有协同作用。发现单味酸枣仁油、单味栀子油、复方酸枣仁油与栀子油均抑制小鼠自主活动，表现出明显的镇静作用；复方酸枣仁油与栀子油起效慢，于用药第5天才逐渐产生明显的抑制小鼠自主活动的作用，但随用药时间延长抑制作用逐渐增强，且无耐受现象。而地西泮起效快，于用药1天后即表现出明显的抑制小鼠自主活动的作用，但随用药时间的延长该作用逐渐减弱，出现了耐受现象。组方中，以复方中剂量抑制小鼠的自主活动作用为佳，出现倒U形现象。复方中剂量抑制自主活动的作用比大、中剂量的酸枣仁油、栀子油的作用都强，与大剂量酸枣仁油比较，在用药第10天有显著性意义，与大、中剂量的栀子油在用药第10天亦有显著性意义，故呈明显的协同作用。(表2-1)
3复方酸枣仁油与栀子油对小鼠的催眠作用
3.1材料
(1)动物健康昆明种ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大学医学院动物实验中心提供(陕医动字第08-004，二级合格动物)。
(2)药品酸枣仁油、栀子油采用超临界CO2萃取；戊巴比妥钠(Pentobarbitalsodium，Sigma产品，上海化学试剂公司分装，批号F20030816)；地西泮(Diazepaminjection利君制药厂，批号050318)；
3.2方法
(1)复方酸枣仁与油栀子油对催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠时间的影响
取♀小鼠70只，分层随机分为7组，复方酸枣仁与油栀子油分别按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，地西泮模型组按3mg/kg给药，2ml/kg中剂量酸枣仁组，1ml/kg中剂量栀子油组，对照组给予等体积的生理盐水，60min后，各组均ip戊巴比妥钠50mg/kg，以翻正反射消失为睡眠潜伏期；以翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间。结果见表1
(2)复方酸枣仁与油栀子油对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠的作用影响
取♀小鼠70只，分层随机分为7组，复方酸枣仁与油栀子油分别按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，2ml/kg中剂量酸枣仁组，1ml/kg中剂量栀子油组，地西泮模型组按3mg/kg给药，对照组给予等体积的生理盐水，60min后，各组均ip戊巴比妥钠25mg/kg，记录睡眠小鼠数。结果见表2
3.3结果
表3-1 复方酸枣仁与油栀子油对催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠时间的影响(x±s)
注:为对比组，**P＜0.01；*P＜0.05-P＞0.05
表3-2 复方酸枣仁与油栀子油对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠的作用影响(x±s)
注:为对比组，**P＜0.01；*P＜0.05-P＞0.05
采用两组比较t检验，复方酸枣仁油与栀子油对戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期以及睡眠持续期均有影响，其可缩短睡眠潜伏期、延长睡眠持续期，与正常组比较有非常显著性意义。酸枣仁油对戊巴比妥钠诱导的睡眠持续期与正常组相比亦有显著性意义。复方酸枣仁与油栀子油中剂量组与中剂量的单味酸枣仁油、单味栀子油比较，其缩短睡眠潜伏期有显著性意义，呈明显的相加作用；延长睡眠持续期则无显著性意义。采用Fisher精确概率法(双侧检验)计算，复方酸枣仁油与栀子油对阈下催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠个数的影响与正常组相比有明显的显著性意义，表明其与戊巴比妥钠有明显的协同作用；复方酸枣仁与油栀子油中剂量组与中剂量的单味酸枣仁油、单味栀子油组比较则有显著性意义，表明酸枣仁油与栀子油呈明显的相加作用。单味酸枣仁油、单味栀子油对阈下催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠个数与正常组比较，亦有显著性意义。因此复方酸枣仁油与栀子油、单味酸枣仁油、单味栀子油有诱导阈下催眠剂量戊巴比妥钠小鼠入睡，复方酸枣仁油与栀子油、单味酸枣仁油尚有协同催眠剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠作用，产生明显的催眠效应；且复方中两药存在相加作用。
4.复方酸枣仁油与栀子油的抗惊厥作用
4.1材料
(1)动物健康昆明种ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大学医学院动物实验中心提供(陕医动字第08-004，二级合格动物)。
(2)药品酸枣仁油、栀子油由超临界CO2萃取；戊四氮(Pentetrazole，上海新亚药厂制造，批号610325)；苯巴比妥钠(Phenobarbital sodium天津金耀氨基酸有限公司，批号0501281)
4.2方法
(1)复方酸枣仁油与栀子油的抗戊四氮引起的阵挛性惊厥作用
取♀小鼠50只，分层随机分为5组，复方酸枣仁与油栀子油分别按40ml/kg、20ml/kg、10ml/kg灌胃，苯巴比妥钠模型组按40mg/kg给药，对照组给予等体积的生理盐水，60min后，均ip37.5mg/kg戊四氮溶液，观察小鼠的阵挛性惊厥。
(2)复方酸枣仁油与栀子油的抗戊四氮引起的强直性惊厥作用
取♀小鼠50只，分层随机分为5组，复方酸枣仁与油栀子油分别按40ml/kg、20ml/kg、10ml/kg灌胃，苯巴比妥钠模型组按40mg/kg给药，对照组给予等体积的生理盐水，60min后，均ip100mg/kg戊四氮溶液，观察小鼠的阵挛性惊厥、强直性惊厥。
4.3结果
复方酸枣仁油与栀子油均未发现有对抗戊四氮引起的阵挛性惊厥以及强直性惊厥的作用。苯巴比妥钠则有对抗作用。
5.复方酸枣仁油与栀子油学习记忆的实验研究
5.1材料
(1)动物昆明种ICR小鼠，♀，陕医动字第08-004，二级合格动物，体重18~22g，西安交通大学医学院实验动物中心提供。
(2)药品酸枣仁油、栀子油由超临界CO2萃取；地西泮(Diazepam injection利君制药厂，批号050318)；氢溴酸东莨菪碱(Scopolamine Hydrobromide)，徐州莱恩药业有限公司产品，批号0311181；环己米特(环己酰亚胺，cycloheximide)，Sigma公司产品；乙醇(ethanol)，西安化学试剂厂，批号051024。
(3)仪器避暗、跳台两用仪(西安交通大学医学院设备科制造)。
5.2方法
实验分3批进行，每批随机分为复方大、中、小剂量组，分别按6mL.kg-1、4mL.kg-1、2mL·kg-1ih，酸枣仁油中剂量组2mL·kg-1给药，栀子中剂量组1mL·kg-1，地西泮组3mL·kg-1，正常对照组3mL·kg-1，各记忆障碍模型均另设一组模型组，每组10只小鼠，各组小鼠每天上午9:00给药1次，连续给药10天。
(1)避暗法
第11天上午9:00时开始，进行学习训练，并进行学习记忆指标测定。将小鼠背朝暗箱口放入明箱，将小鼠第一次双前足接触暗箱铜栅遭电击的时间作为入室潜伏期，并记录5min内的入室错误次数。以此作为学习成绩。24h后，在相同的时间段内，重复测试入室潜伏期、错误次数，观察其记忆保持情况。
①复方酸枣仁油与栀子油对正常小鼠学习记忆的影响
第11天，测试并记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内入室错误次数。结果见表5-1。
②复方酸枣仁油与栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天上午9:00时，除正常生理盐水对照组外，各组小鼠均依次ip0.015％东莨菪碱溶液1.5mg/kg造成记忆获得障碍模型。15min后，开始进行学习训练，记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内错误次数。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录各组小鼠的入室潜伏期和3min内错误次数，结果见表5-2。
③复方酸枣仁油与栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天上午9:00时开始，进行学习训练，并进行学习记忆指标测定。除正常生理盐水对照组ip生理盐水外，各组小鼠均于训练后立即ip环己酰亚胺溶液120mg/kg造成记忆巩固障碍模型。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内电击次数。结果见表5-3。
④复方酸枣仁油与栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天上午9:00时开始，进行学习训练并进行学习记忆指标测定。24h后，在与训练日相同的时段，除正常对照组ih生理盐水外，各组小鼠均ih20％乙醇溶液10ml/kg造成记忆再现障碍模型。30min后，再次测试并记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内电击次数。结果见表5-4。
(2)跳台法
第11天上午9:00时，开始测试。取小鼠放在跳台仪的箱内，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，小鼠受到电击逃至安全台上，再次从安全台上下来，以两前足同时接触铜栅遭到电击为错误反应，观察记录3min内小鼠跳下跳台的错误反应次数，以此作为学习成绩。24h后重复测验1次，观察其记忆保持情况。
①复方酸枣仁与油栀子油对正常小鼠学习记忆的影响
第11天，取小鼠放在跳台仪的箱内，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，记录3min内小鼠跳下跳台的错误次数。结果见表5-5。
②复方酸枣仁油与栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天进行训练，除正常对照组ip生理盐水外，其余各组小鼠均ip东莨菪碱溶液1.5mg/kg造成记忆获得障碍模型。10min后，取小鼠放在跳台仪的箱内，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，记录5min内小鼠跳下跳台的错误次数。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录小鼠第一次跳下跳台的潜伏期和3min内错误次数，结果见表5-6。
③复方酸枣仁油与栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天进行训练，取小鼠放在跳台仪的跳台上，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，记录5min内小鼠跳下跳台的错误次数，并立即ip环己酰亚胺溶液120mg/kg造成记忆巩固障碍模型。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录小鼠第一次跳下跳台的潜伏期和3min内错误次数，结果见表5-7。
④复方酸枣仁油与栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆的影响
第11天进行训练，取小鼠放在跳台仪的箱内，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，记录5min内小鼠跳下跳台的错误次数。24h后于重复测试前30min，除正常生理盐水对照组外，各组小鼠均ip20％乙醇溶液0.1ml/10g造成记忆再现障碍模型。记录小鼠第一次跳下跳台的潜伏期和3min内错误次数，结果见表5-8。
5.3结果
表5-1 药物对正常小鼠学习记忆(避暗法)的影响(x±s，n＝10)
注与NS组比较，*P＜0.05、**P＜0.01。
表5-2复 方酸枣仁油与栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响
(x±s，n＝11)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。
表5-3 复方酸枣仁油与栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响
(x±s，n＝8)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。
表5-4 复方酸枣仁与油栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响
(x±s，n＝10)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。
表5-5 复方酸枣仁油与栀子油对正常小鼠学习记忆(跳台法)的影响
(x±s，n＝10)
注与NS组比较。
表5-6 复方酸枣仁与油栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响
(x±s，n＝11)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。
表5-7 复方酸枣仁油与栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响
(x±s，n＝8)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。
表5-8 复方酸枣仁油与栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响
(x±s，n＝10)
注与模型组比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与复方中剂量比较，单味药P＞0.05。选用t(t’)检验、部分指标选用非参检验(W-M-W法)。
对于正常小鼠，复方酸枣仁油与栀子油能减少正常小鼠的入室错误次数，与给予生理盐水的正常组比较有显著性意义，说明复方酸枣仁油与栀子油有促进正常小鼠的学习记忆作用(表5-1，表5-5)。
对于记忆获得障碍模型小鼠，训练时，复方酸枣仁油与栀子油能明显缩短小鼠入暗室的潜伏期，并减少入室错误次数。训练后，复方酸枣仁与油栀子油能明显延长小鼠入暗室的潜伏期并减少入室错误次数；减少跳下跳台的错误次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时、训练后小鼠的入室错误次数；延长训练后入室潜伏期，减少跳台错误次数。说明复方酸枣仁与油栀子油、酸枣仁油、栀子油对记忆获得障碍模型小鼠的学习记忆有促进作用(表5-2，表5-6)。
对记忆巩固障碍模型小鼠，训练时，复方酸枣仁与油栀子油能明显减少正常小鼠的入室错误次数。训练后，复方酸枣仁与油栀子油能延长小鼠的入室潜伏期，明显减少入室错误次数；减少跳台错误次数。酸枣仁油、栀子油对训练时、训练后的小鼠均可减少其入室错误次数。说明复方酸枣仁与油栀子油、单味的栀子油能改善记忆巩固障碍小鼠的学习记忆能力(表5-3，表5-7)。
对记忆再现障碍模型小鼠，训练时，复方酸枣仁与油栀子油能缩短正常小鼠的入室潜伏期，减少入室错误次数；能减少跳台错误次数。训练后，复方酸枣仁与油栀子油能明显延长小鼠入室潜伏期及减少入室错误次数；能减少跳台错误次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时的小鼠入室潜伏期及入室错误次数；减少训练后跳台错误次数。说明复方酸枣仁与油栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油能改善记忆再现障碍小鼠的学习记忆能力(表5-4，表5-8)。
6.栀子油对小鼠中枢神经系统的影响
6.1栀子油对小鼠自主活动的影响
取小鼠60只，随机分为6组，每组10只，给药组分别按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，阳性对照组给予3mg/kg地西泮，正常组给予等体积的生理盐水，60min后，用YLS-1A小鼠自主活动记录仪依次记录各组小鼠15min的自主活动次数。结果见表6-1。
采用两组比较t检验。大剂量栀子油(10mg/kg)在给药3天时可明显抑制小鼠自主活动，此作用随用药剂量增加而增强，且随用药时间延长未产生明显耐受现象。地西泮虽然作用较强，但10天后产生了耐受性。
表6-1 栀子油对小鼠自主活动的影响(x±s)
注*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较；各组上行为实测值，下行为变化率。
6.2栀子油对不同剂量戊巴比妥钠作用的影响
(1)栀子油对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠的小鼠诱导睡眠作用的影响
取小鼠75只，随机分为5组，每组15只，给药组分别按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kg灌胃给与栀子油，阳性对照组给予3mg/kg地西泮，正常组给予等体积的生理盐水作对照。灌胃给药1h后，每组均i.p阈下催眠剂量的戊巴比妥钠(25mg/kg)观察小鼠睡眠情况(入睡动物数)。由于样本数偏小(有0、1)，采用Fisher精确概率法(双侧检验)进行统计处理。研究表明，大剂量栀子油(10mg/kg)和地西泮对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠的小鼠诱导睡眠作用有非常显著性意义。结果见表6-2。
表6-2 栀子油对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠的小鼠诱导睡眠作用的影响(x±s)
注*P＜0.05，**P＜0.01，与NS组比较。
(2)栀子油对催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠时间的影响
取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药组分别按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，阳性对照组给予3mg/kg地西泮，正常组给予等容积的生理盐水作对照。60min后，各组动物均i.p戊巴比妥钠50mg/kg，以翻正反射消失时间、睡眠持续时间为指标，记录各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续期。结果见表6-3。
表6-3 栀子油对催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠时间的影响(x±s)
注**P＜0.01，与NS组比较。
采用两组比较t检验，地西泮(3mg/kg)及栀子油各剂量组(1、3、10ml/kg)对睡眠持续期的作用均有非常显著性意义，栀子油的催眠作用还表现为剂量依赖关系(r＝0.674，n＝30，p＜0.01)；未观察到地西泮及栀子油对睡眠潜伏期的显著性影响。
6.3栀子油对抗戊四氮所致小鼠惊厥作用的影响
取小鼠40只，随机分为4组，给药组分别按0.4L/kg、0.2L/kg i.g，阳性对照组给予0.04g/kg苯巴比妥钠，模型组给予等体积的生理盐水作对照，均i.p戊四氮溶液0.1g/kg，以强直性惊厥为指标，记录小鼠的惊厥数、死亡数、惊厥潜伏期、惊厥持续期。结果见表6-4。
表6-4 栀子油对抗戊四氮所致小鼠惊厥作用的影响(x±s)
注*P＜0.05，与模型组比较
采用两组比较t检验(部分为t’检验)。苯巴比妥钠完全对抗了戊四氮所致小鼠惊厥；大剂量栀子油延长小鼠惊厥潜伏期的作用有显著性意义，说明栀子油具有一定的抗惊厥作用。
6.4栀子油对小鼠学习记忆的影响
(1)避暗法将50只小鼠均衡随机分为5组，每组10只，♀，分组如下栀子油大、中、小剂量组按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kg i.g，阳性对照组给予3mg/kg地西泮i.g，正常组给予等体积的生理盐水作对照。qd，连续10d。第11d记录各只小鼠的入室潜伏期和5min内电击错误次数。研究表明，大剂量栀子油可减少电击错误次数，表明栀子油具有一定的促进学习技艺作用，结果见表6-5。
表6-5 栀子油对小鼠入室潜伏期和5min内电击错误次数的影响(x±s)
注*P＜0.05，与NS组比较。
(2)跳台法将50只小鼠均衡随机分为5组，每组10只，♀，分组如下栀子油大、中、小剂量组按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，阳性对照组给予3mg/kg地西泮，正常组给予等体积的生理盐水作对照。qd，连续10d。第11天早9:00时开始实验。先将小鼠放在跳台仪箱内，使之适应3min，然后立即给铜栅通以36V交流电，记录5min内小鼠跳下跳台的错误次数。根据研究表明，未观察到栀子油可减少跳台错误次数，结果见表6-6。
表6-6 栀子油对小鼠5min内的跳台错误次数的影响(x±s)
注与NS组比较，采用两组比较t检验。
7.讨论
酸枣仁油与栀子油组成的复方，对于抑制小鼠自主活动具有显著性意义；组方中，酸枣仁油为主药，栀子油为辅药；酸枣仁油与栀子油组合的最优剂量比例为2∶1；酸枣仁油以0.02ml/10g，栀子油以0.01ml/10g为最优剂量组合，该组合物抑制小鼠的自主活动作用最为明显。
复方酸枣仁与油栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油均抑制小鼠自主活动，表现出明显的镇静作用；复方酸枣仁油与栀子油起效慢，但随用药时间延长，抑制作用逐渐增强，且无耐受现象。组方中酸枣仁油与栀子油在镇静作用方面呈明显的协同作用。
复方酸枣仁油与栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油均有诱导阈下催眠剂量戊巴比妥钠小鼠入睡的作用，并具有促进催眠剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠作用；酸枣仁油与栀子油对戊巴比妥钠阈上和阈下催眠剂量小鼠的睡眠作具有协同作用。
复方酸枣仁油与栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油对小鼠学习记忆的影响，采用避暗、跳台训练时或训练后不同时间，给予不同化学药品，分别造成小鼠获得性、巩固性和再现性记忆缺损模型，以观察复方酸枣仁与油栀子油、酸枣仁油、栀子油对小鼠学习记忆不同阶段的影响。东莨菪碱作为M-胆碱受体拮抗剂，可降低大脑皮层和海马胆碱能系统活性，对记忆的获得产生阻抑效应，能显著破坏动物学习和记忆的获得，是一种公认的记忆获得障碍工具药；环己米特(环己酰亚胺)是蛋白质合成抑制剂，可干扰记忆巩固过程；而乙醇为致缺氧剂，使脑组织缺血缺氧，可明显干扰记忆的再现。本实验用地西泮作阴性对照药，发现其对正常和记忆缺损小鼠能延长入室潜伏期、增加入室错误次数；缩短错误跳台潜伏期及增加错误跳台次数；产生记忆损伤作用。而复方酸枣仁与油栀子油能减少正常小鼠入室错误次数。对记忆获得障碍模型、记忆巩固障碍模型、记忆再现障碍模型小鼠训练时的入暗室潜伏期有缩短作用，减少入室错误次数及错误跳台次数；对训练后的入暗室潜伏期有延长作用，也可减少训练后的入室错误次数及错误跳台次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时、训练后记忆障碍模型小鼠的入室错误次数；延长训练后入室潜伏期，减少跳台错误次数。因此，复方酸枣仁与油栀子油对正常和记忆缺损小鼠的学习记忆功能均有改善和提高作用；单味的酸枣仁油、单味的栀子油对记忆缺损小鼠的学习记忆功能也有改善和提高作用；未发现酸枣仁油与栀子油在学习记忆方面的相加或协同作用。
8.结论
1)酸枣仁油与栀子油组成中药复方中，酸枣仁油为主药，栀子油为辅药；酸枣仁油、栀子油的最优剂量比例为2∶1。
2)酸枣仁油与栀子油是中药对药，他们组成的复方，符合中医理论，在镇静催眠作用方面具有交互影响，发挥了相加或协同作用，说明复方酸枣仁与油栀子油组方合理，配比合适。
3)复方酸枣仁油与栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油(首次发现)具有镇静催眠作用。
4)复方酸枣仁油与栀子油、单味的酸枣仁油、单味的栀子油(首次发现)有促进学习记忆的作用。
5)复方酸枣仁油与栀子油的镇静作用虽起效慢，但随用药时间延长作用逐渐增强，未观察到耐受现象。
6)栀子油可明显抑制小鼠自主活动，说明栀子油具有镇静作用，此作用随用药时间延长而无明显耐受现象；栀子油可诱导阈下剂量戊巴比妥钠的小鼠入睡；明显延长小鼠睡眠时间，与戊巴比妥钠有协同作用，说明栀子油具有催眠作用；对戊四氮引起的小鼠惊厥潜伏期有明显延长作用，说明栀子油具有抗惊厥作用；栀子油可减少小鼠电击错误次数，说明栀子油具有还具有一定的促进学习记忆的作用。
研究同时表明，栀子油具有镇静、催眠、抗惊厥及促进学习记忆的作用。对于栀子脂肪酸产生镇静、催眠、抗惊厥、促学习记忆等作用除上述作用机制外，是否还有其它机制，包括与脑细胞直接发挥作用，有待进一步研究。
传统医学通常是采用栀子的水煎剂治疗失眠等疾病，单纯采用栀子油者未见报道。与以往资料相比，其产生镇静、催眠作用的成分很可能是其中的植物脂肪酸。近年来，随着人们对植物脂肪酸越来越多地关注，对植物脂肪酸有效成分的提取、在生物体内的转化、生物学效应、作用靶点以及信号转导等纵深方面的研究，对植物脂肪酸的综合利用和开发，提供了非常广阔的应用前景。
权利要求
1.一种镇静催眠的复方酸枣仁油与栀子油组合物，其特征在于，该组合物由酸枣仁油与栀子油组成，其剂量比例为2∶1。
2.复方酸枣仁油与栀子油的组合用于制备镇静催眠药物的应用。
3.复方酸枣仁油与栀子油的组合用于制备促进学习记忆药物的应用。
4.栀子油用于制备镇静催眠药物的应用。
5.栀子油用于制备促进学习记忆药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种镇静催眠的复方酸枣仁油与栀子油组合物，正交实验确定了酸枣仁油处于主药作用，栀子油处于为辅药作用；酸枣仁油、栀子油的剂量比例为2∶1。申请人按照医药学的要求，经过各种实验已得到证明，本发明的复方酸枣仁油与栀子油组合物其复方大于单质的酸枣仁油、栀子油的作用，并证明了复方酸枣仁油与栀子油组合物能够用于制备镇静催眠药物及其用于制备促进学习记忆药物的应用。本发明的酸枣仁油与栀子油是中药对药组成的复方，符合中医理论，在镇静催眠作用方面具有交互影响，发挥了相加或协同作用，说明复方酸枣仁油与栀子油组合物配方合理，剂量比例合适。同时也证明了栀子油具有镇静、催眠、抗惊厥及促进学习记忆的作用。
文档编号A61P25/00GK1879732SQ200610042809
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月15日 优先权日2006年5月15日
发明者袁秉祥, 李宝莉 申请人:西安交通大学