专利名称：一种仿生肝组织工程支架与接口及其成形工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种仿生肝组织工程支架及其制造工艺，特别涉及一种可生物降解的、模拟自然肝脏结构的仿生肝组织工程支架与接口，以及采用单层压印结合冷冻干燥致孔与层叠组装的集成化成形工艺。
背景技术：
肝脏移植是治疗各种慢性肝病的最有效的手段，然而供体的匮乏一直制约着肝脏移植。组织工程为体外培养活体肝脏提供了可能，它有望恢复人体肝脏更多的生化功能。然而肝组织工程对支架结构有特定的要求支架内应存在三种形态的微观结构——光滑的微管道、孔洞及二者之间的半透孔隙。微管供内皮细胞贴壁生长形成血管(血窦)，孔洞供肝细胞聚团生长形成肝细胞索，半透孔隙是尺度更小的微观结构，其大小应使营养液通过，但对血浆细胞有阻隔作用。因此，如何制造这种独特结构的支架成为肝组织工程的关键问题之一。
传统的支架制造方法包括相分离法、冷冻法、致孔剂析孔法和发泡法等。但这些工艺可控性差，难以构建结构复杂、供多细胞生长的支架微观结构，更重要的是无法实现多种细胞在支架内的有序分布。
发明内容
为了克服传统制造方法存在的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种仿生肝组织工程支架与接口及其成形工艺。
本发明的目的通过以下的具体措施(工艺)达到一种仿生肝组织工程支架与接口，其特征在于该仿生肝组织工程支架与接口的外形为圆柱状，由支架主体和接口以及密封套组成；其中
支架主体模拟自然肝脏的肝小叶结构，包括门静脉和中央静脉；沿中央静脉周围至门静脉之间均匀排列有多层肝细胞微管和内皮细胞微管，肝细胞微管和内皮细胞微管之间由含有孔隙的生物可降解材料隔离，孔隙具有半透膜的作用；接口的输入端和输出端布置在圆柱的两端，用于与生物反应器连接；或者布置在圆柱的同一端，以利于体内植入；内皮细胞微管接口两端为管状突起状结构，用于与血管或生物反应器相连，其中，进口端接口为仿门静脉结构，并由入口分为6个主流道；出口端接口采用仿中央静脉的主流道接口。在支架主体一端的圆柱端面上，还分布有六个肝细胞灌注口。
支架主体和接口连为一体，安装在密封套内。
所述的密封套的材料为纤维蛋白凝胶或生物橡胶。
所述的生物可降解支架材料采用壳聚糖凝胶、蚕丝/胶原、壳聚糖/胶原、聚乳酸或聚乳酸-聚羟基乙酸，与抗凝血剂混合，其混合比例为5∶1～2∶1。
上述仿生肝组织工程支架与接口的制造工艺，其特征在于包括下列步骤1)首先设计支架微流道和接口立体结构及单层结构；并根据设计结果，利用快速成型或微雕刻或精密加工制造压印模具，其中肝细胞微流道直径在0.1～0.5 mm之间，内皮细胞微流道直径在0.3～1 mm之间；2)在模具上涂覆混合有抗凝血剂的生物可降解支架材料其生物可降解支架材料抗凝血剂的混合比例为5∶1～2∶1，然后快速冻干，冷冻干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之间；3)冷冻干燥致孔后脱模，然后采用生物粘结剂将支架逐层粘结组装起来；4)支架接口采用单层压印、层叠粘结制造，或采用整体浇注成形，即可得到仿生肝组织工程支架与接口；5)支架与接口表面包裹一层防止支架渗血的密封材料。
本发明的仿生肝组织工程支架与接口，采用压印工艺制造单层内皮细胞微管道和肝细胞微管道，采用冷冻干燥致孔形成孔隙，采用层叠粘结工艺形成立体支架。支架接口既可以采用单层压印、多层粘结制造，也可以采用整体浇注成形。
本创新技术与现有技术相比具有如下优点1.模拟自然肝脏的肝支架有利于支架降解向自然肝脏的转变。
2.采用了先进成型方法与传统指控工艺相结合，既能保证支架内部的导通，又能提高支架的孔隙率，采用的层叠粘结方法能较方便地形成立体支架。
3.充分考虑了支架的接口结构，有利于体内植入及生物反应器培养。
图1是本发明的仿生支架与接口的基本结构图；其中图(a)是主视图，(b)是图(a)的A-A剖视图，(c)是图(a)的B-B剖视图，(d)是图(a)的C-C剖视放大图；图2仿生支架与接口的制造工艺流程图，其中图2(a)是设计与加工压模图，图2(b)是涂覆支架材料图，图2(c)是下压合模图，图2(d)是冷冻干燥致孔图，图2(e)是脱模图，图2(f)是逐层定位、粘结图，图2(g)是包裹密封套图，图2(h)是复合肝细胞和内皮细胞、静态培养图，图2(i)是植入体内、或生物反应器培养图。
下面将结合附图对本支架的结构及工艺流程加以详述。
具体实施例方式
图1是仿生支架与接口的基本结构图。该支架与接口模拟自然肝脏的肝小叶结构，支架具有独立的模拟肝小叶结构的两套微观管路系统，并分别与两端的接口连接，分别用于内皮细胞和肝细胞生长的微流道结构；两套管路之间并不导通，但通过支架材料进行渗透，可进行物质交流。两端的接口分别可用于灌注肝细胞及与血管或营养液输送管相连。具体结构详述如下。
如图1(a)所示该仿生肝组织工程支架与接口的外形为圆柱状，由支架主体和接口(包括密封套)组成。其中，如图1(d)C-C剖视图所示支架主体模拟自然肝脏的肝小叶结构，包括门静脉和中央静脉，沿中央静脉周围至门静脉之间均匀排列有多层肝细胞微管和内皮细胞微管，这两套微管之间由含有更小孔隙的可降解材料隔离，孔隙具有半透膜的作用。接口的输入端和输出端布置在圆柱的两端，以利于与生物反应器连接；也可以布置在圆柱的同一端，以利于体内植入。如图1(b)A-A剖示图所示内皮细胞微管接口两端设计成管状突起状结构，便于与血管或生物反应器相连，其中进口端接口采用仿门静脉结构，由进口分流为若干个主流道(主流道的数量可以根据需要选择，本实施例为6个，用于体外培养时可与生物反应器循环系统接口相连，用于体内植入时可与上腔静脉相连；出口端接口采用仿中央静脉的主流道接口，用于体外培养时可与生物反应器循环系统接口相连，用于体内植入时可与下腔静脉相连。此外，如图1(c)B-B剖示图所示，还设有若干个(本实施例为6个)肝细胞灌注口，灌注口的数量可以根据实际需要选择，灌注完成时，灌注口须密封，如纤维蛋白凝胶。整个结构安装在密封套内，密封套材料可以采用纤维蛋白凝胶或生物橡胶。
该仿生支架具有分别用于肝细胞灌注和内皮细胞生长的两套相互独立的微观通道结构，可用于体内植入或体外生物反应器培养。
图2是该支架及接口的制造过程图。制造工艺的核心是采取单层压印、冷冻干燥和层叠组装相结合的集成工艺方法。其中，单层压印的作用是制造微流道结构；冷冻干燥致孔是为了形成孔隙，进一步提高其孔隙率，以利于肝细胞的长入，为肝细胞的剧团生长提供更加广阔的孔洞，并使材料具有一定的半透膜作用；层叠粘结的目的则是为了形成立体化的肝支架。
具体工艺结合附图2说明如下(1)图2(a)是设计与加工压模图。即首先利用计算机辅助设计(CAD)软件(如PROE、UG等)设计支架微流道和接口立体结构，支架结构如图2所示，其中肝细胞微流道直径约在0.1～0.5mm之间，内皮细胞微流道直径在0.3～1mm之间；其次分解成单层结构；然后设计出压模的形状；最后采用微雕刻机或快速成型机或精密切削机床加工出压模。
(2)图2(b)是涂覆支架材料图。支架材料采用壳聚糖凝胶、或蚕丝/胶原、或壳聚糖/胶原、或聚乳酸、或聚乳酸-聚羟基乙酸等材料，可与其溶液混合后涂敷，并与抗凝血剂混合。生物可降解材料和抗凝血剂的混合比例为5∶1～2∶1，可采用的抗凝血剂有柠檬酸钠，浓度为3.8％；肝素，大约每ml血需要40单位的肝素；EDTA钾，浓度在0.4％。
(3)图2(c)是下压合模图。将预先制好的压模压在支架材料上，压制时应保证接触均匀。实际上应根据溶液的粘稠程度决定压模的方位，如果溶液较稀，可将压模水平放置微流道特征朝上，然后将溶液直接涂覆在模具上即可；反之若溶液较稠，则必须线将溶液涂覆在基板上，通过下压力才能保证材料充满模具。
图2(d)是冷冻干燥致孔图。将模具与涂覆的材料放入冷冻干燥机中，温度可根据孔隙大小要求确定，10℃～-80℃的范围均可以选择，如孔隙要求较大，则冷冻温度较高。冷冻干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之间，其中，以150微米为宜。
图2(e)是脱模图。脱模时，应仔细剥离，避免脱模时损坏单层流道结构。为方便脱模，也可以硬模具通过翻制成硅橡胶软模具，以利于脱模。
图2(f)是逐层定位、粘结图。将各层制备好的单层支架与接口层逐层粘结起来，粘结时应保证各层流道对准。实际上壳聚糖本身就可以作为良好的粘结剂。有些生物材料遇水后也有一定的粘结性能，因此也可以采用蒸馏水作为粘结剂。
图2(g)是包裹密封套图。为防止支架渗血或泄露营养液，植入前表面包裹一层密封套材料(如纤维蛋白凝胶或生物橡胶等)。密封材料可采用纤维蛋白凝胶、生物橡胶或人造血管密封，但人造血管不可降解。
图2(h)是复合肝细胞和内皮细胞、静态培养图。在制作好的支架内分别灌注肝细胞及内皮细胞(包括生长因子)，然后作体外短暂静态培养。
图2(i)是植入体内、或生物反应器培养图。最后可植入体内或用于生物反应器培养。体内植入时支架输入端和输出端须分别与门静脉和下腔静脉缝合或粘结。
权利要求
1.一种仿生肝组织工程支架与接口，其特征在于该仿生肝组织工程支架与接口的外形为圆柱状，由支架主体和接口以及密封套组成；其中支架主体模拟自然肝脏的肝小叶结构，包括门静脉和中央静脉；沿中央静脉周围至门静脉之间均匀排列有多层肝细胞微管和内皮细胞微管，肝细胞微管和内皮细胞微管之间由含有孔隙的生物可降解材料隔离，孔隙具有半透膜的作用；接口的输入端和输出端布置在圆柱的两端，用于与生物反应器连接；或者布置在圆柱的同一端，以利于体内植入；内皮细胞微管接口两端为管状突起状结构，用于与血管或生物反应器相连，其中，进口端接口为仿门静脉结构，并由入口分为6个主流道；出口端接口采用仿中央静脉的主流道接口，在支架主体一端的圆柱端面上，还分布有六个肝细胞灌注口。支架主体和接口连为一体，安装在密封套内。
2.如权利要求1所述的仿生肝组织工程支架与接口，其特征在于，所述的密封套的材料为纤维蛋白凝胶或生物橡胶。
3.如权利要求1所述的仿生肝组织工程支架与接口，其特征在于，所述的生物可降解支架材料采用壳聚糖凝胶、蚕丝/胶原、壳聚糖/胶原、聚乳酸或聚乳酸-聚羟基乙酸，与抗凝血剂混合，其混合比例为5∶1～2∶1。
4.实现权利要求1所述的仿生肝组织工程支架与接口的制造工艺，其特征在于包括下列步骤1)首先设计支架微流道和接口立体结构及单层结构；并根据设计结果，利用快速成型或微雕刻或精密加工制造压印模具，其中肝细胞微流道直径在0.1～0.5mm之间，内皮细胞微流道直径在0.3～1mm之间；2)在模具上涂覆混合有抗凝血剂的生物可降解支架材料其生物可降解支架材料抗凝血剂的混合比例为5∶1～2∶1，然后快速冻干，冷冻干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之间；3)冷冻干燥致孔后脱模，然后采用生物粘结剂将支架逐层粘结组装起来；4)支架接口采用单层压印、层叠粘结制造，或采用整体浇注成形，即可得到仿生肝组织工程支架与接口；5)支架与接口表面包裹一层防止支架渗血的密封材料。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的密封材料为纤维蛋白凝胶或生物橡胶。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的生物可降解支架材料采用壳聚糖凝胶、蚕丝/胶原、壳聚糖/胶原、聚乳酸或聚乳酸-聚羟基乙酸，与抗凝血剂混合，其混合比例为5∶1～2∶1。
全文摘要
本发明公开了一种新的仿生肝组织工程支架与接口及其成形工艺，其主要内容是仿照自然肝脏肝小叶结构设计了一种肝组织工程支架，支架内部为肝细胞和内皮细胞设置了两组独立的微管道结构及接口。其中内皮细胞微管接口可以与自然肝脏内部的血管相连，或与生物反应器的循环系统相连，肝细胞微管结构用于灌注肝细胞时加快肝细胞的扩散。通过压印方法制作单层流道与接口，之后通过冷冻干燥可进一步形成两种微管结构之间的孔隙，从而提高材料的孔隙率并使其具有一定的半透膜作用，然后通过层叠粘结方法制造含有肝细胞微管结构和内皮细胞微管结构的立体化支架与接口。
文档编号A61B17/00GK1883420SQ20061004285
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者刘亚雄, 李涤尘, 贺健康, 卢秉恒 申请人:西安交通大学