专利名称：抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体讲是一种抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法，其属于免疫学和分子病毒学交叉技术领域。
背景技术：
鱼类淋巴囊肿病的病原是淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)。自1997年淋巴囊肿病在我国初次大规模爆发以来，受害鱼类已达10余种，每年养殖的海水鱼类都会因该病大量死亡，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。由于LCDV是寄生于宿主细胞内的非细胞型超微微生物群体，所以至今也未研究出既能杀伤病毒又不损伤宿主细胞的有效药物。另外，该病毒的隐性感染和鱼类特殊的水生环境，使病毒的感染难以觉察，常常一旦发现症状，即到了无法挽救的地步。
特异性结合病毒多肽的单克隆抗体是建立病毒免疫学检测方法及早期诊断技术的必备材料。同时，以特异性结合病毒多肽的单克隆抗体为工具研究不同地域、不同宿主的病毒，可为病毒中和抗体的研制及保护性抗原的确认积累基础材料。另外，特异性结合病毒多肽的单克隆抗体也可用于研究该病毒多肽在宿主体内或细胞中的定位，表达等。目前，国内外尚未有研制淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗牙鲆淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法。本发明拟研制特异性结合淋巴囊肿病毒(简称LCDV)的衣壳蛋白的单克隆抗体；填补有关抗鱼类LCDV衣壳蛋白的单克隆抗体研究的空白，为建立淋巴囊肿病早期诊断技术及保护性抗原的研究作出贡献。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。所述的单克隆抗体是由名称为杂交瘤细胞LCDV-V，保藏号为CCTCC-C200619，保藏日期2006年4月26日的杂交瘤培养细胞分泌的。
所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是淋巴囊肿病毒衣壳蛋白，该衣壳蛋白分子量范围为115kDa——125kDa。
一种制备抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的方法，所述的制备方法是从以分离的、分子量范围为115kDa——125kDa的淋巴囊肿病毒衣壳蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。
所述的免疫学的检测筛选方法是间接免疫荧光抗体法，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法；其中，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法，这两个检测实验方法结合起来，能够确定该单克隆抗体(以下简称VP单抗)的抗原决定簇在鱼类淋巴囊肿病毒的分子量范围为115kDa——125kDa的衣壳蛋白上。
本发明的优点在于由于采用了间接免疫荧光抗体鉴定方法，间接免疫荧光抗体法反应灵敏，结果观察直观，能够避免酶联免疫吸附法和免疫酶法等由于细胞和组织内存在内源酶而出现的假阳性结果，所以使得确认VP单抗与LCDV发生的特异性结合反应真实存在。同时，由于采用了胶体金标记免疫电镜方法，它能在超微结构水平上精确、细致的定位，特异性高，标记物清晰可辨，具有其他标记方法无法比拟的优越性，该技术把免疫学中抗原抗体反应的高度特异性、敏感性与组织化学的形态可见性有机的结合起来了，可在亚细胞及分子水平上研究免疫反应。因此采用该方法进一步直观地证实该VP单抗与位于LCDV衣壳蛋白上的抗原决定簇发生了特异性结合反应。本发明尤其重要的是采用了免疫印迹法确认了含有该抗原决定簇的病毒衣壳蛋白的分子量，免疫印迹方法是近年来发展起来的一种新方法，具有特异性强、灵敏性高的优点，该方法直接确定了与VP单抗特异性结合的LCDV蛋白多肽的分子量范围为115kDa——125kDa。综合本发明的胶体金标记免疫电镜结果和免疫印迹结果可知与VP单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于LCDV的衣壳蛋白上，且该衣壳蛋白的分子量范围为115kDa——125kDa，这一成果为建立LCDV的单克隆抗体早期诊断方法，为从分子水平上定位该病毒的靶器官，为不同地域、不同宿主病毒的区分以及研究该病毒流行病学规律奠定了坚实的基础。此外，特异性结合LCDV多肽的单克隆抗体不但能用于研究病毒多肽在宿主体内或细胞中的定位，表达等，也可利用单抗与相应抗原决定簇相结合抑制该抗原的特性，研究病毒抗原表位的定位，抗原表位的数量和相互关系。它为进一步弄清病毒的抗原位点，不同位点之间的关系，不同位点与不同生物学功能之间的关系，以及选择保护性位点，制备亚单位疫苗提供理论依据。
图1为间接免疫荧光抗体法检测结果图。
图2为胶体金标记免疫电镜鉴定结果图。
图3为免疫印迹方法测定的结果图。
图1中，可见囊肿细胞的细胞质边缘出现散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。
图2中，可见背景清洁，无散在的金粒子，在LCDV的衣壳上特异性结合有大量的金粒子。
图3显示本发明的VP单抗和已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1)的免疫印迹结果。图3中M为分子量标准；V为LCDV的电泳图谱，可见在分子量范围为115kDa——125kDa间仅有一条蛋白多肽；1为抗LCDV的VP单抗的免疫印迹结果，可见VP116单抗能特异性结合一条电泳后的分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽；2为已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419)与电泳后的分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽不反应的免疫印迹结果。
本发明所述VP单抗的制备方法，是以分离的、淋巴囊肿病毒分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，产生杂交瘤细胞，再应用免疫学的检测鉴定方法，筛选鉴定出VP单抗。
所述的免疫学的检测鉴定方法是间接免疫荧光抗体法，免疫印迹法和胶体金标记免疫电镜法。
应用间接免疫荧光抗体法，有该VP单抗的鉴定结果显示囊肿细胞的细胞质边缘出现散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。该结果确认VP单抗与LCDV病毒粒子发生的特异性结合反应真实存在。
应用胶体金标记免疫电镜法，有该VP单抗的鉴定结果显示在LCDV病毒粒子的周围特异性结合有大量的胶体金粒子，即表征与该VP单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于LCDV的衣壳蛋白上。
应用免疫印迹法，有该VP单抗的鉴定结果显示该VP单抗能特异性结合一条病毒的蛋白多肽，该多肽的分子量范围在115kDa——125kDa间。即表征与该单抗特异性结合的抗原决定簇位于分子量范围在115kDa——125kDa间的蛋白多肽上。
胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法这两种检测方法结合起来，能够确定VP单抗的抗原决定簇在淋巴囊肿病毒的分子量范围在115kDa——125kDa间的衣壳蛋白上。
具体实施例方式
本发明VP单抗具体制备方法结合实施例及其附图进一步说明如下实施例1研制抗牙鲆LCDV的VP单抗1.)LCDV病毒提纯(1)取10g病鱼的囊肿组织，加入适量石英砂和10倍体积的TNE缓冲液(0.05mol/L Tris-HCL；0.15mol/L NaCl；0.01mol/L EDTA；pH7.4)，冰浴匀浆；(2)匀浆液4℃，600g离心30min，取上清液；(3)4℃，1 800g再次离心30min；收集上清液；(4)4℃，8 000g离心2h；弃上清，收集沉淀；(5)向沉淀中添加适量TNE，将其轻置于由37％、40％、47％、52％、57％、62％(W/V)组成的蔗糖密度梯度离心管上层，4℃，78 000g离心2h；(6)用一次性注射器小心吸出病毒带，TNE重悬病毒带，4℃，78 000g离心1h以除去蔗糖。
2.)LCDV病毒衣壳蛋白的分离制备(1)由浓度为12％分离胶和浓度为5％浓缩胶两部分配制电泳凝胶；(2)纯化的病毒液与电泳样品缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl pH6.8；1％SDS；1％疏基乙醇；10％甘油；0.02％溴酚蓝)等体积混合，加热煮沸3min；(3)采用Tris-甘氨酸(Gly)电泳缓冲液(0.025mol/L Tris；0.25mol/LGly；0.1％SDS；pH8.3)，4℃条件电泳；(4)电泳后的凝胶在CuCl2可逆染色液(CuCl2·2H2O 5.11g溶于100ml双蒸水中)中，染色5min。
(5)取出凝胶，根据分子量标准切下范围在115kDa——125kDa间仅有的一条目的蛋白条带——VP蛋白条带。放入脱色液中脱色。
(6)将目的蛋白条带装入洗脱仪中(洗脱仪Model 422，Bio-Rad)，加入洗脱缓冲液(50mmol/L NH4HCO3，0.1％SDS，4℃存放)。按10mA/管设置电流值，恒流洗脱5h。
(7)将回收室中的回收液吸出，双蒸水透析过夜。
(8)透析后的样品液冷冻干燥，置于-80℃备用。
3.)免疫免疫四周龄Balb/c小鼠，共免疫4次，具体免疫程序如下(1)基础免疫，将样品液与弗氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方法；(2)2周后加强免疫，将样品液与弗氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方法；(3)1周后再加强免疫1次，采用尾静脉直接注射方法，注射剂量为0.1mL，无佐剂；(4)再1周后加强免疫第2次；本次免疫后的第3天，将小鼠脱颈椎处死，取脾脏用于细胞融合。
4.)细胞融合在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与P3-X63-Ag8-U1骨髓瘤细胞用50％PEG融合，融合细胞(105cells/ml)用HAT-GIT选择性培养液重悬，滴入加有营养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养，倒置相差显微镜观察杂交瘤细胞生长情况。大约两周后，检测杂交瘤细胞上清液，筛选阳性细胞。
5.)克隆采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞用GIT培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1ml细胞液加入9ml培养液，混合均匀，滴入加有营养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液(即含有本发明的VP单抗)用免疫荧光抗体法检测。每株杂交瘤细胞克隆3次。
6.)冻存取生长旺盛，形态良好的待冻存细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液(含10％DMSO的细胞培养液)，使最终细胞密度为5×106个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜(8-12小时)后，再浸入液氮内长期保存。
实施例2间接免疫荧光抗体法筛选鉴定(1)取新鲜囊肿，切成约8mm×5mm×7mm的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用组织冷冻包埋剂OCT包埋，-20℃放置30min，冰冻切片，切片厚度5μm。丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；(2)以杂交瘤细胞培养上清液为第一抗体，加在切片上；(3)37℃湿盒孵育45min，PBS-T(0.05％Tween-20)浸洗3次，每次5min；(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG，加在切片上；(5)37℃湿盒孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(6)甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照。
结果间接免疫荧光抗体法检测结果显示特异性荧光信号仅出现在囊肿细胞的细胞质边缘，阳性信号呈楔状、块状，或数个成链圈状排列，且集中在细胞质的边缘部分。
实施例3胶体金标记免疫电镜定位本发明VP单抗特异性结合的抗原决定簇(1)取纯化的病毒悬液10μl，滴在覆盖有Formvar膜的铜网上，静止5min，吸去多余的病毒悬液，PBS-T浸洗；(2)含2％牛血清白蛋白的PBS，37℃封闭1h，PBS-T浸洗3次，(3)加入本发明VP116单抗，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次；(4)加入15nm的胶体金标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，双蒸水浸洗3次；(5)2％的磷钨酸负染色1min，吸去残留染液，电镜观察。
结果胶体金标记免疫电镜观察结果显示视野背景清洁，无散在的金颗粒或其他污染物，胶体金颗粒集中结合在LCDV粒子衣壳周围，在病毒外区域没有的胶体金颗粒散布。
实施例4本发明VP单抗与已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1)的免疫印迹实验结果(1)由浓度为12％分离胶和浓度为5％浓缩胶两部分配制电泳凝胶；(2)纯化的病毒液与电泳样品缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl pH6.8；1％SDS；1％疏基乙醇；10％甘油；0.02％溴酚蓝)等体积混合，加热煮沸3min；(3)采用Tris-甘氨酸(Gly)电泳缓冲液(0.025mol/L Tris；0.25mol/L Gly；0.1％SDS；pH 8.3)，4℃条件电泳；(4)电泳完成后，取出凝胶，一份考马斯亮兰染色，一份移到电泳转移槽；(5)稳流200mA，转移5h。
(6)将转移后的硝酸纤维素膜用2％牛血清白蛋白4℃封闭过夜，次日PBS-T浸洗3次，，每次5min；(7)加入要检测的单克隆抗体，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min，(8)加入AP标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(9)加NBT/BCIP，室温显色。
结果免疫印迹方法测定单抗特异性结合的病毒多肽的分子量结果显示本发明VP单抗能识别一条电泳后分子量范围在115kDa——125kDa间的多肽，而已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1)的免疫印迹结果则未显示特异性结合电泳后的蛋白带。见图3中2显示的免疫印迹结果。同时该实验也说明本发明的VP单抗所识别的抗原决定簇为线性抗原决定簇，而已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1)的抗原决定簇为构象抗原决定簇；即本发明的单克隆抗体特异性结合的抗原决定簇与已知单克隆抗体(保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1的杂交瘤细胞株分泌的单抗)特异性结合的抗原决定簇是不相同的。
实施例5本发明VP单抗在牙鲆鳃细胞中定位LCDV的应用(1)将无菌的洁净盖玻片放入培养瓶中，接种生长旺盛的FG细胞；(2)倒置显微镜观察，培养瓶底长满单层细胞后，用PBS缓冲液清洗，加入4倍稀释的病毒液0.5ml；(3)20℃孵育1小时，吸出病毒液，加MEM维持液(含2％小牛血清)5ml，20℃培养；(4)48h后取出盖玻片，PBS浸洗3次，丙酮固定20min，室温晾干；(5)将盖玻片固定在载玻片上，加入本发明VP116单抗；(6)37℃湿盒孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(7)加FITC标记的羊抗小鼠IgG，37℃湿盒避光孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(8)甘油封片，荧光显微镜观，结果以未接种病毒的FG细胞为阴性对照。结果显示感染病毒的牙鲆鳃细胞的细胞质内均能见到特异性荧光，表明该病毒多肽定位于细胞质中，而在未感染病毒的牙鲆鳃细胞中呈阴性反应。
实施例6应用本发明VP单抗，调查引起许氏平鲉(Sebastes schlegeli)淋巴囊肿病的LCDV粒子是否与来自牙鲆的LCDV具有相同的抗原决定簇。
1.)冰冻切片的制作取发病囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2.)荧光抗体染色(1)吸取本发明VP116单抗15μl，加在切片上。
(2)37℃湿盒中孵育45min；(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，加在切片上。
(5)37℃湿盒中避光孵育45min。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)Olympus荧光显微镜观察。
结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在许氏平鲉囊肿细胞中散布有点状或带状的阳性信号。表明许氏平鲉囊肿细胞中的LCDV粒子存在与牙鲆LCDV相同的抗原决定簇。
实施例7应用本发明VP单抗，调查引起云纹石斑鱼(Epinephelus moara)淋巴囊肿病的LCDV是否与来自牙鲆的LCDV具有相同的抗原决定簇。
1.)冰冻切片的制做取发病云纹石斑鱼囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2.)其次，荧光抗体染色步骤同实施例7结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在云纹石斑鱼囊肿细胞中散布有阳性信号。表明云纹石斑鱼囊肿细胞中的LCDV粒子存在与牙鲆LCDV相同的抗原决定簇。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.一种抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为杂交瘤细胞LCDV-V，保藏号为CCTCC-C200619，保藏日期2006年4月26日的杂交瘤培养细胞分泌的。
2.根据权利要求1所述抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是淋巴囊肿病毒衣壳蛋白，该衣壳蛋白分子量范围为115kDa——125kDa。
3.一种制备抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的方法，其特征在于所述的制备方法是从以分离的、分子量范围为115kDa——125kDa的淋巴囊肿病毒衣壳蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述制备抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的方法，其特征在于所述的免疫学的检测筛选方法是间接免疫荧光抗体法，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法；其中，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法，这两个检测实验方法结合起来，能够确定该单克隆抗体的抗原决定簇在鱼类淋巴囊肿病毒的分子量范围为115kDa——125kDa的衣壳蛋白上。
全文摘要
本发明是抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。其是由名称为杂交瘤细胞LCDV－V，保藏号为CCTCC－C200619的杂交瘤培养细胞分泌的。该单抗具有与淋巴囊肿病毒的分子量范围为115kDa－125kDa的衣壳蛋白发生特异性结合的特性。制备该单抗的方法是从以分离的、淋巴囊肿病毒分子量范围为115kDa－125kDa的衣壳蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。
文档编号A61K39/395GK1850860SQ20061004458
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者战文斌, 程顺峰 申请人:中国海洋大学