专利名称：海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法。
淋巴囊肿病毒是发生在我国养殖海水鱼中的病毒病，也是阻碍世界海水养殖业发展的重大疾病，此病的防治不解决，鱼类养殖难以持续。鉴于鱼类淋巴囊肿病毒是一种具有韧性色膜的肿瘤，虽经反复冻融，也很难将其完全地打碎，故造成了纯化过程中病毒颗粒被膜组织等携带丢失，因此存在难以得到高纯度，高得率的淋巴囊肿病毒的问题。
本发明的目的在于克服以上缺点，提供一种海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法，以满足制备疫苗或作为病毒基因学、致病基因筛选和克隆技术使用的病毒。
病毒纯化方法有多种，但用单纯一种方法难以获得该病毒的高纯度和高得率，本发明采用微孔滤膜过滤法和蔗糖密度梯度离心法相结合的方法，并考虑到尽量减小污染和保证无菌操作条件。
本发明的具体方法A、取病鱼体表囊肿物每20g左右，用无菌生理盐水多次洗净，再用组织研磨器研碎，然后加无菌TE缓冲液200ml，在室温下、-20℃冻融4次。之后将上述融液用孔径为8、3、0.8和0.3μm的微孔滤膜从大到小依次抽滤。再将滤液移入透析袋中用聚乙二醇2000浓度缩至7ml左右，便可取得该病毒悬液移入无菌的试管中、以备下面使用。为了使该病毒粒子顺利通过上述微孔滤膜，在操作中TE缓冲液尽量冲稀匀浆液。该步骤为微孔滤膜过滤法B、将配制好浓度为50％、40％、30％、20％和15％的蔗糖溶液，各取1ml，依次注入离心管中、并静静重层。然后，吸上述滤膜过滤的病毒悬液1ml，静静注于离心管内重层的蔗糖溶液上方。2400rmp离心2小时。离心后即得纯度高的病毒。必要时可取病毒带、负染色电镜下观察病毒粒子。纯化结果是超速离心后，悬液中杂质少、病毒粒子得率高，病毒粒子直径约为130nm。该步骤为蔗糖密度梯度离心法在整个病毒纯化过程中，为减少其他微生物的污染，所用仪器、缓冲液均应灭菌并在无菌条件下操作。
显然作为综合方法的本发明，其优点是纯度高，得率亦高。
权利要求
1.一种海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法，其特征步骤是A、取病鱼体表囊肿物每20g左右，用无菌生理盐水多次洗净，再用组织研磨器研碎，然后加无菌TE缓冲液200ml，在室温下、-20℃冻融4次，之后将上述融液用孔径为8、3、0.8和0.3μm的微孔滤膜从大到小依次抽滤，再将滤液移入透析袋中用聚乙二醇2000浓度缩至7ml左右，便可取得该病毒悬液移入无菌的试管中，B、将配制好浓度为50％、40％、30％、20％和15％的蔗糖溶液，各取1ml，依次注入离心管中、并静静重层，然后，吸上述滤膜过滤的病毒悬液1ml，静静注于离心管内重层的蔗糖溶液上方2400rmp离心2小时，离心后即得纯度高的病毒。
全文摘要
本发明涉及一种海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法。它是采用微孔滤膜过滤法和蔗糖密度梯度离心法相结合的方法,并考虑到尽量减小污染和保证无菌操作条件制成。本发明的特点是可以获得高纯度和高得率的淋巴囊肿病毒,以满足制备疫苗或作为病毒基因学、致病基因筛选和克隆技术使用的病毒。
文档编号C12N7/02GK1370831SQ0110782
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月23日 优先权日2001年2月23日
发明者孙修勤, 曲凌云, 张进兴 申请人:国家海洋局第一海洋研究所