专利名称：：淋巴囊肿病毒的实时定量pcr检测方法
技术领域：
：本发明是属于淋巴囊肿病毒的检测技术，是一种采用荧光探针或SYBRGREENI荧光染料的实时定量PCR技术的检测方法——淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法。技术背景淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdiseasevirus,LCDV)属于虹彩病毒科，淋巴囊肿病毒属，可感染9目34科计140种以上鱼类，对鱼类危害严重，给水产养殖业带来巨大的损失，同时严重影响经济鱼类的进出口贸易。淋巴囊肿病毒被世界动物卫生组织(O正)、世界粮农组织亚太水产病害网络(NACA)和各个国家列入水生动物病害检疫名录，因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的淋巴囊肿病毒的检测方法。目前检测淋巴囊肿病毒的方法包括细胞学技术、免疫学诊断技术、分子生物学技术三大类-1.细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察。这些方法操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低。2.免疫学技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交。这些方法具有特异性强、敏感性高的优点，但操作步骤相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。3.分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，该技术比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察结果，EB是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量。实时定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水生生物细菌(如对虾弧菌、贝副溶血弧菌)、病毒(对虫下白斑综合症病毒、鱼传染性造血器官坏死病毒)等病原体，但是尚未用于淋巴囊肿病毒的检测。
发明内容本发明的目的是提供一种利用荧光探针(Taqman探针)或SYBRGREENI荧光染料定量检测淋巴囊肿病毒的方法，以克服现有技术的不足。本发明的技术方案如下首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据。上述的设计特异性引物序列和荧光探针序列选取淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因保守序列，利用巳有的PrimerExpress2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为正向引物LCDV-F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3'反向引物LCDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3'荧光探针LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3'。荧光探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片断长度为82bp。上述的建立实时定量PCR反应体系和反应程序按照常规操作，首先要采用传统的酚/氯仿法或者商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA，之后通过调整实时定量PCR各组分的用量，以定量PCR仪器检测到高荧光信号和低Ct值为依据，建立定量PCR的反应体系和反应程序。上述的制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线首先设计包含实时定量PCR扩增区域的正链引物和负链引物，扩增淋巴囊肿病毒得到401bp的扩增产物，按照己有的分子克隆操作方法，制备质粒并提取质粒DNA，命名为pLCDV-MCP，即为标准品。将标准品测定浓度后并梯度稀释，之后进行实时定量PCR反应。定量PCR仪器计算Ct值(Thresholdcycle,循环阈值)，Ct值是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。根据标准品的浓度和Ct值，仪器软件自动绘制出标准曲线。上述的建立待测样品的结果判定依据利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用分析软件处理数据，得到扩增曲线、熔解曲线、Ct值、Tm值。以最低浓度的标准品对应的Ct值作为待测样品的判定界限，以标准品对照的Tm值作为SYBRGREENI荧光染料的判定依据。本发明适用于对淋巴囊肿病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是牙鲆、鲈鱼等养殖场的疫病监控及进出口贸易中淋巴囊肿病毒的检测。本发明与已有技术对比其特点是1、检测快速、高效该检测方法在定量PCR反应结束后，可立即通过仪器软件进行结果判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、EB染色观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需要4小时；一次可以进行96个样品的检测，具有高效性。2、可实现准确定量通过制备标准品及绘制标准曲线，再根据待测样品的Ct值，可以对待测样品中的淋巴囊肿病毒进行定量，准确度高，做到了真正意义上的定量检测。3、特异性强特异性引物和荧光探针只与淋巴囊肿病毒特异性地结合，与虹彩病毒科的其他病毒都没有反应。4、检测范围广，灵敏度高，在标准品为3"07-30拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达7个数量级；检测限达30个拷贝，是其他检测方法无法比拟的。图l.本发明的不同浓度的淋巴囊肿病毒标准品的实时定量PCR反应的扩增曲线图谱横坐标代表PCR反应循环数，纵坐标代表荧光信号强度。1-7:PCR反应体系中标准品浓度分别为3xl07、3xl06、3xl05、3xl04、3xl03、3><102、3xl01拷贝图2.本发明的淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法的标准曲线图谱横坐标代表样品的拷贝数，纵坐标代表Ct值。拷贝数X与Ct值的线性关系为Ct=-3.631gX+41.86，相关系数R2=0.9915。图3.本发明的利用荧光探针实时定量PCR检测牙鲆样品的扩增曲线图谱P:淋巴囊肿病毒标准品；B:空白对照；1-5:为5份牙鲆样品图4.本发明的利用SYBRGREENI实时定量PCR检测牙鲆样品的熔解曲线图谱横坐标代表反应温度，纵坐标代表荧光信号导数。A:淋巴囊肿病毒标准品及5份牙鲆样品，熔解曲线的峰值对应的温度即为Tm值，待测样品的Tm值介于74.4。C一74TC之间；B:空白对照(水)图5.本发明的其他病毒的SYBRGREENI实时定量检测结果的熔解曲线图谱A:淋巴囊肿病毒标准品；B:流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)具体实施方式下面结合具体实施例及附图进一步阐述本发明。实施例1、以牙鲆样品为例，采用荧光探针实时定量PCR方法定量检测淋巴囊肿病毒。牙鲆样品采自山东莱州某养殖场，具有感染淋巴囊肿病毒的典型临床症状，鱼皮肤、鳍及眼球等处出现小泡状的肿胀物，其病史患有纤毛虫病、鼓眼病等。上述的设计特异性引物序列和荧光探针序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索淋巴囊肿病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE7.1软件分析比较各个基因序列的保守性，结果表明淋巴囊肿病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因序列比较保守。因此，以MCP基因为目标基因，利用已有的PrimerExpress2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列。设计的引物序列Tm值在58'C-6(TC之间，不具有二级结构，两条引物的Tm值相差2'C以内，且不形成引物二聚体。荧光探针的Tm值比引物高8'C-1(TC。特异性引物包括正向引物和反向引物，荧光探针为Taqman探针，设计的实时定量PCR的特异性引物序列和荧光探针序列如下正向引物LCDV腳F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3'反向引物LCDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3'荧光探针LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT—TAMARA-3'。扩增片断长度为82bp。设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公司，采用J3-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行特异性引物和荧光探针的合成与荧光标记。荧光探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。上述的建立PCR反应体系和反应程序按照常规操作，首先要提取待测样品的DNA。取牙鲆的肾、脾、脑等组织匀浆，采用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer3.0DNA提取试剂盒，按照说明书进行DNA的提取，之后用核酸分析仪进行定量，调整DNA浓度为100ng/nL。实时定量PCR反应体系由以下组分构成2pL待测样品DNA，12.5piL2xPCRMasterMix(美国ABI公司)，l(Himol/L正向引物、反向引物各2pL，lpL10|xmol/L荧光探针，补充水至25^L。采用ABI7900HT型定量PCR仪器进行反应，PCR反应程序为5(TC2min;95°C10min;之后95。C15sec，60°Clmin进行40个循环。上述的制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线利用PRIMEREXPRESS2.0软件，设计包含定量PCR扩增区域的PCR引物，用于制备阳性质粒。PCR引物序列为LCDV-659F:ACGACTCTACCATCATGCCTTTG;LCDV-1059R:AAGACGAGCACTATTTTCATAAACCA。扩增片断长度为401bp。按照常规PCR扩增淋巴囊肿病毒，得到401bp的扩增片段。再按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217-1259页，构建含有目的扩增片段的质粒，命名为pLCDV-MCP。用BECKMAN核酸分析仪测定质粒浓度为50ng4tL。pMD19-T载体长度为2692bp，插入的MCP基因片段长度为401bp，每对碱基的平均分子量为660g/mo1，再根据阿佛加德罗常数(6.02x1023)，计算出标准品的浓度为1.5x107拷贝尔L。为了绘制标准曲线，将标准品进行IO倍系列稀释，分别得到浓度为1.5xl07、1.5xl06、1.5xl05、1.5x104、1.5x103、1.5x102、1.5x101拷贝/ixL的标准品。以各个浓度的标准品为模板，进行实时定量PCR反应，每个浓度做2个平行样，通过定量PCR仪器的分析软件绘制出标准曲线。ABI7900HT型定量PCR仪器在反应过程中自动收集荧光信号，反应结束后，利用仪器自带的SDS2.1软件进行数据分析，包括査看扩增曲线、Ct值。淋巴囊中病毒各个浓度的标准品的扩增曲线图谱见图1。结果表明，反应体系中标准品为3"07-30个拷贝，7个数量级的范围内都有"S"型扩增曲线，表明该实时定量PCR检测方法检测范围广。标准品浓度最低为30个拷贝，对应的Ct值为35.85，因此以Ct值36作为判定待测样品结果的界限，判定该方法的检测限为30个拷贝。根据标准品拷贝数与Ct值的关系，SDS2.1软件自动绘制出的标准曲线见图2。其中，模板浓度X与Ct值的线性关系为Ct=-3.631gX+41.86，相关系数R2=0.9915。上述建立待测样品的结果判定依据待测样品的结果判定是通过其扩增曲线及Ct值进行的。若待测样品的Ct值536.0，同时有"S"型扩增曲线的待测样品，判定为含有淋巴囊肿病毒。经检测，发现5份牙鲆待测样品都含有淋巴囊肿病毒，其扩增曲线见图3。根据待测样品的Ct值，结合标准曲线，仪器计算出5份牙鲆样品的淋巴囊肿病毒拷贝数，见表2。在本检测过程中，以淋巴囊肿病毒标准品、水为模板，分别作为阳性对照、空白对照，以排除试剂污染或试剂失效造成的假阳性或者假阴性结果。表25份牙鲆样品淋巴囊肿病毒的定量PCR检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2、以牙鲆样品为例，利用SYBRGREENI荧光染料检测牙鲆样品是否含有淋巴囊肿病毒。牙鲆样品的来源同实施例1，设计的特异性引物序列实施例1，在利用SYBRGREENI荧光染料的情况下不需要设计荧光探针。SYBRGREENI实时定量PCR反应体系及反应程序同实施例1，只是将反应体系中的luL10pmol/L荧光探针换成l^L25xSYBRGREENI荧光染料。而且要在PCR反应程序结束后，利用ABI7卯0HT定量PCR仪器进行熔解曲线分析，其程序为95°C15min，60'C15min,95°C15min,升降温速率为每25秒温度变化rC。结束后，由SDS2.1软件给出待测样品的Tm值。定量PCR仪器收集荧光信号、分析数据同实施例1。5份牙鲆待测样品的熔解曲线见图4。在本检测过程中，以淋巴囊肿病毒标准品、水为模板，分别作为阳性对照、空白对照，以排除试剂污染或试剂失效造成的假阳性或者假阴性结果。结果表明，淋巴囊肿病毒标准品的熔解曲线的峰值与横坐标的交点，即Tm值，为74.5'C。由于定量PCR仪器有系统误差，因此若待测样品的Tm值介于74.0°C—75.(TC之间则判定感染了淋巴囊肿病毒。实验结果表明牙鲆待测样品的Tm值为74.4'C—74.7'C之间，荧光信号导数强度与质粒相当，因此判定5尾牙鲆都感染了淋巴囊肿病毒。实施例3、分析淋巴囊肿病毒的SYBRGREENI实时定量PCR检测方法的特异性。作为对照，采用与淋巴囊肿病毒亲缘关系较近的其他病毒，利用SYBRGREENI实时定量PCR方法进行检测。这些病毒都属于虹彩病毒科，它们是流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)，。检测步骤同实施例2，只是将待测样品的DNA换成流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)的DNA。SYBRGREENI实时定量PCR的熔解曲线见图5，其中淋巴囊肿病毒扩增产物的Tm值为74.5'C，其它4种病毒的Tm值约为77'C，超出了74.(TC—75.0范围，且熔解曲线的荧光信号值远低于阳性质粒，因此判定流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)没有发生实时定量PCR反应，表明SYBRGREENI实时定量PCR检测淋巴囊肿病毒的方法特异性好，与其它相近病毒没有交叉反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>caagctatacaatccaattacaccagtt28〈210>3〈211>22〈212〉丽<213〉人工序列〈220〉<221〉primer—bind<222〉(1)…22)〈223〉根据实时定量PCR反应要求设计，用于扩增淋巴囊肿病毒的负链引物。<400〉3cagcagcaatacccggtaaatc22〈210>4〈211〉31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉primer一bind<222〉(l)...(31)<223>根据实时定量PCR反应要求设计，用于扩增淋巴囊肿病毒的Taqman探针。〈400〉4TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT31〈210>5〈211>23<212〉■〈213>人工序列〈220〉<221〉primer—bind〈222>(1)…22)<223〉根据PCR反应要求设计，用于制备阳性质粒的正链引物。<400>5acgactctaccatcatgcctttg22<210〉6〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221>primer一bind〈222〉(1)…26)〈223〉根据PCR反应要求设计，用于制备阳性质粒的负链引物。〈400〉6aagacgagcactattttcataaacca26〈210〉7<211〉82〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉定量PCR反应的目的扩增片段序列<400>7caagctatacaatccaattacaccagttcttctcctgtaatctttgacggtggaattgct60agcgatttaccgggtattgctg8权利要求1、一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据。2、根据权利要求1所述的淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于特异性引物序列、荧光探针序列为-正向引物LCDV-F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3';反向引物LCDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3';荧光探针LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3';3、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于上述PCR反应体系由以下组分组成12.5nL2xPCRMasterMix，10nmol/L正向引物、反向引物各l-2pL，0.5-lpL10pmol/L荧光探针，lOOng/pL待测样品的DNAl-2pL，补充双蒸水至25^L。4、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于上述PCR反应体系由以下组分组成12.5^L2xPCRMasterMix，10nmol/L正向引物、反向引物各l-2^L;0.5-lpL25倍SYBRGREENI荧光染料，lOOng/^L待测样品的DNAl-2^L，补充双蒸水至25pL。5、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于PCR反应程序为50°C2min;95°C10min;95°C15sec，57。C-63。C间的某一温度lmin，进行40个循环。6、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于结果判定依据为若采用荧光探针，当待测样品有"S"型扩增曲线，且Ct值《6.0时，则待测样品中含有淋巴囊肿病毒，通过待测样品的Ct值和标准曲线，由定量PCR仪器自动计算出淋巴囊肿病毒含量值；若采用SYBRGREENI荧光染料，当待测样品的Tm值介于74.(TC—75.(TC之间时，判定待测样品中含有淋巴囊肿病毒。全文摘要一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，属于病毒检验技术。其技术方案是首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立检测样品的结果判定依据。本发明包括设计的特异性引物序列和荧光探针序列，以及与之配套的定量PCR反应体系和反应程序，记忆检测样品的结果判定方法。本发明解决了从鱼样本中检测淋巴囊肿病毒的方法，具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，可以进行定性、定量检测，适合鱼病毒的快速检验检疫，具有很强的推广性和实用性。文档编号C12Q1/70GK101240351SQ20081001482公开日2008年8月13日申请日期2008年3月20日优先权日2008年3月20日发明者岳志芹,骏应,彪徐,朱来华,梁成珠,肖西志,辛学谦,邓明俊,郑小龙,晓陈申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心