专利名称：淋巴囊肿病毒的快速检测试剂盒及其检测方法
淋巴劉中病毒的鹏检测试剂敲微测方法
狱领域
本发明属于水产动物病原的检测技术，具体是一种，环介导等温扩增技术对: #巴劉中病 行鹏检测的縱i戯微测施。 背景狱
淋巴劍中病毒(Lymphocystis disease virus，简称LCDV)属于SE0病毒科，淋巴戴中病毒属，可感 染9目34科计140种以上M,是对^^危害较为严重的病毒病之一，M^率达80%，死亡率达30%。 患病鱼在口唇、鳃、鳍、M^体表等处散布大小不一的单个^^糊肿瘤，失去商品价值。淋巴劐中病 毒给7JC产f^lk带来巨大的损失，同时严驟响经、^&类的进出口贸易。屮国国家质量监督检验检疾总 局与韩国海洋7R^于2005年发布的《中韩进出口活水生-搬验^S协议》中规定，中国出口到韩国 的舻鱼、真鲷、大,平、牙辨^^i、鹏滩巴劐中病毒的检验驗。
目前鱼魏毒的检测方法主要包括邻胞学诊断技术、敏学诊断技术、肝生物学诊断駄三大类。 细胞学珍断技术主要包括細细胞土^#分离病毒、组织滴理切片及电^U察，其樹1^J贞，检测周期长， 且灵S^低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光樹则、免疫点杂交，其方法具^t寺异性强、敏感性高的 优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；OT生物学诊断技术主要包括聚合^^反应 (PCR)，比较|^1、灵敏，但虔需要昂贵的PCR仪器，另外需要琼脂撒 电泳，溴化乙锭^fe^察 结果，溴化乙锭^5fe^物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比S^重。
7jc产辭直业和国p示鱼类贸易的am切需要^:'腿、灵敏、M盼淋巴戴中病毒的检测方法，打 破国夕hfe^H^，为国家贸易服务。环介导^ST增(Loop"Mediated Isothermal Amplification,简称LAMP) 技术，是一种敏感性高、特异性强的耙DNA tfei检测方法，不需要品贵的仪器，样品中含有少量的病
原就能检出。环介导等显扩增目前已lferSMB于检测水产动物的病原体，如 的鱼1#血;1 ^毒、传
染幽^ffii^i毒；X独下的病毒白斑纟^^鶴毒、黄 毒；细菌中的迟钝爱德华氏菌等。据1t^',目
前尚未JAL^环介导等显扩增技术对淋巴劉中病^t行'l3fai检测的M。
发明内容
本发明的目的^lf共一种禾,环介导^^扩增技^^则淋巴翻屮病毒的检测l叙iJ盒，3^艮现有技术 的不足，以满足i贴邻PRt^测的要求。
本发明的另一目的^if共^^淋巴劉中病毒的检测方法，以方便在水产^5fclk和国际錢贸易屮对
淋巴劐巾病wai行t^i樹则中的鹏。
本发明的主要原理为LAMP技术是使核酸Mii在^a环境中的循环置銜广增实J!X揭E^列的放 大，从而游l脸测的目的。基*^醉是针对鹏因的6个区域，设计2)(#寺异性引物，同时可以设计l-2 条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothemiopMus DNA pdyme跳简称BstDNA聚娜)，在直温65。C左右鹏lh。 Bst DNA聚^f两娥性一是具有 5'-3'聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是BstDNA聚合酶具有lia换活性，肖剖冬新合成的核酸单!i^人新M的DNA双链上置^(代)卜'来，形成两条^&的核酸单链以开启下1的DNA核 齢成，进而免去了每MT增前的DNA变性环节。LAMPSJSa程中， 一对弓胸的5'端含有一段与 下鄉增产物互补的穷K，因此，劍弓嫩的单飽^物就可形成-个类似咂铃状的回文结构，这种结构 !B子为下一^^温H^r增反/^t共了一个可棚而fl^,用,嫩，BstDNA聚^SI^fIIB换活性， 后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的持续进行。LAMP切iZ^成一系列不RI 长度的具^^环结构的DNA产物，可以fflil荧^^料进行检测。 本发明的技术方案如下
淋巴劉中病毒的环介导^a扩增快速检测淑U盒，包括提供^SiMl、须的BstDNA聚儒、逆转录酶、 反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧舰色剂，以及鹏一种f柳该试齐隐检测鱼类 样品中淋巴劐中病毒的方法，以实iPt淋巴劐中病毒^I检测的杏^l化，为fe^淋巴劐中病毒的機则提 供一种快速、简便、齡效、实用的检测方法。
本发明盼淋巴劐巾病毐的环介导等显扩增|^1检》繊1」盒的配方如下
试剂A: BstDNA聚儒，每^L含8个活性单位(8U4iL);
i叙UB:鹏缓冲液，提供Bst腿聚娜辦作用所必须的物质，其中含有200画J/Lp腦的 三羟基甲基 甲^^ (Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化钾(KC1)、 100mmoVL硫自((NH4)zS04)、 20mmol/L硫,(MgS04)禾口l^曲f顿X-100 (TritonX-100);
i叙化环介导^U扩增混合液，其中含有2.(M.0pL2.5mmol/LdNTP、 2.0"5.0pL1.6mo]/L甜麵 禾口 3.0-10.0 pL ^"子生物学MM7K;
縱IJD:引tr混合液，其屮含有0.8-2.0mL 10Mmol/L正向内引物、0.8-2.0^L10Mmol/L反向内弓l物、 0.2-0.5[iL 10 pmol/L正向夕卜弓|物、0.2-0.5mL 10 |jmol/L反向外弓l物和0.5-1.010 pmol/L环弓l物；其中弓I
物序列分别如下
正向内'j l物5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCArnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'; 反向内引物5'-CCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGATnTGATCAGCAGCAATACCCG-3'; iK向外弓物5'- ACAAACAGCACCTAAACATG -3'; 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'; 环弓l物5'《GGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
试剂E:荧腿色剂，成分为100x的荧光染料SYBRGREENI。
上面所述的试剂C的最f铖分为3攀2.5誦l/LdNTP、 4.0pL 1.6mol/L甜^Wl 6攀針生物 学鄉餘
上面所述的试剂D的最{f减分为:0.8 mL 10 Mmol/L正向内弓卿、0.8|jL 10 pmol/L反向内弓胸、0.2 10 Mmol/L正向外弓胸、0.2 joL 10pmol/L反向外弓胸和0.5 ^iL 10 jjmol/L环3胸。 利用J^淋巴劐中病毒的LAMP 'I^S樹则试剂盒的樹则方法如下 (1)待检样品的DNA的提取
用商业化的试剂盒^^传统的方^^取待检样品的DNA，用核^^析仪测定DNA的OEWOD2so， 保证雜1.7-2.0范围内，调整其^M 50-500n^iL之间。(2) 进斤淋巴劐中病毒的环介导等显扩增反应
首先取一个0,2mL的聚丙烯塑料管，加入1-5ML的步骤(1)提取的待测样品的DNA，再力PAlnL i叙UA、 2.5-5.0mL i式剂b、 7.0-19.0 pL试剂C和2.5-6.0 fjL试剂D,使得鹏总#|只为25^iL。其中弓l 物序列分别如下
正向内引物5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCATnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'; 反向内引物5'- CCAGTrcrrCTCCTGTAATCnTGATnTGATCAGCAGCAATACCCG -3'; 正向外引物5'-ACAAACAGCACCTAAACATG-3'; 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'; 环引物5'"CGGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
将说塑料管置于60-65t:的瞎^7K^^中，力燈40^60min进fi^介导等显扩增鹏；之后将水温 再调到80-95'C，方燈3-5min以终止及应，取出含扩增产物的塑料管待检。
(3) 扩增产,的检测
在步骤(2)的待检塑料管中力U入lnL试剂E，混合均匀，肉鹏见察^4勿的Mfe。，如果为《絶，则 判定待检样品含裙林巴劐中病毒，如果为驗，贝鹏定待检样品不含有淋巴劉中病毒。 与现有^B比，本发明的有^llfe括
第一，本发明不需要,的仪器，不需^jt^剂，只需一(I^MM能反应，能满忠见场及,
测的要求，操作简单简便。第二，本发明包括DNA提取、环介导等显扩增鹏、；^t^测3^1程， 在不到3小时内即可完成，^iJ时间短。第三，本发明的扩增模板可仅为10拷贝甚至更少，产量可达到
109-101()个拷贝，灵敏变高。第四，本发明扩增iem列的六个区段，并_^^六个区段的川^^也有规定，因
此具有高度特异性。第五，本发明的LAMP附广增产物可以与荧光染料结合，肉目歐见察就可以进4离果 判定，简便高效。
Tffi结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。 織例l
按照下列配方制悄林巴麵歸的环介导等W增鹏检测试齐睑。 微!JA: l攀BstDNA聚娜(8U批)；
淑JB: 2.5^iL鹏缓冲液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫l^安((NH4》S04)、 20mmol/L硫麟(MgS04)和1%曲拉 通X-IOO (TritonX-謂)；
试剂C:环介导^^显扩增混合液，其中含有2.0 pL2.5 mmol/LdNTP、 3.0 pL 1.6mol/L舌旨^T礙口 10.0 舒生物学^S^toK，共计15.0pL。
试剂D:引牧r混^^液，其中含有1.0(aL10MmoI/L正向内引物、1.0|jL10^imol/L反向内引物、0.5^L 10Mmol/L正向夕卜弓W勿、0.5pL10ijmol/L反向夕卜弓l物和0.5ML10Mmol/L环弓lt/， ^^十3.5mL。其中弓l物
序列分别如下
正向内弓吻5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCATnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'，反向内弓l物5'- CCAGTrCTrCTCCTGTAArcnTGATnTGArCAGCAGCAATACCCG -3'， 正向外弓l物5'-ACAAACAGCACCTAAACATG隱3'， 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'， 环引物 5'《GGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
淑IJE: 1.0^荧舰色齐lj，成分为100x的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下辦进行翻
G) 待检样品DNA的提恥
待检样品为某#51场謝^^染淋巴觀中病的3^平，体表和鳍m，腹部膨胀，内有膨K。 ^^^S^物:r^呈公司的核^l取淑iJ盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)，按照说 明书进行样品DNA的提取。具体步骤为取50mg的动物组织J(AS敝集管中，力口入350pL的溶液A和 0.9的RNase Al后用研磨棒I^S研磨成匀浆，65。C保温5併中。力口入400nL的溶液B，振荡混合。 加入1 ml的4。C预冷的溶液C，充分混匀后，ipm离心2 5>1中。弃去JlMWmt目，再加入1 ml 的4。C预冷的溶液C，充分混匀后，12,000 ipm离心2化钟。弃去上MW机相，然后将*#溶液(趙 下层)转移至置于收集管上的过滤管中，12,000 ipm离心1併中。弃过滤管，在滤液中加入4(X^L的 DB缓冲液，混合均匀。将试齐隐中的Spin Column安置于 管上。将±^作中混合溶 ^至Spin Column中，12,000rpm离心l併巾，弃滤液。加入500ijL的RinseA， 12,000rpm离心30秒，弃滤液。 加入700pL的Rinse B， 12,000 ipm离心30秒，弃滤液。将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上， 在Spin Column膜的中央处加入50 200mL的分子生物学M^屯水，室温静置1 ->1中。12,000 ipm离心1 化沐即得到3W样品的DNA。用核M^析仪测^3W样品的DNA， ODW OD28o为1.8，浓度为100
(2) 进fi邻巴顯中病毒的环介导離扩增鹏
首先取一个0,2mL的聚丙烯塑料管，力口入步骤(1)提取的3^样品的DNA3.0ML，再加入lpL试 剂A、 2.5 mL试剂B、 15.0^试剂C禾tB.5ML试剂d，鹏总^I只为25^L。调节水滞呙^^^至60。C， 将i^塑料管于其中方燈30min以进行邻介导幾點广增鹏，之后将水温再调到8(TC，放置3min以终 止i^Z，取出含扩增;^勿的塑料管待检。
(3) 扩增产物的检测
在步骤(2)的待检塑料管中力口入lpL^^E，混合均匀，柳歐见察产物的鹏。鹏&物鹏为 乡tfe，据此判定待检样品 中含有淋巴戴中病毒。 鄉例2
按照下列配方制作、淋巴劐中病毒的环介导難江扩增鹏检测翩盒。
试剂A:同鄉例l。
i叙UB: 5.0nL反应缓冲液，成分同实施例l。
试剂C:环介导^^扩增混合液，其中含有3.0pL2.5mmol/LdNTP、4.0ML1.6mol/L甜^f戯口6.0pL 好生物学繊fcK，共计13攀。
i叙UD:引物混合液，其中含有0.8nL10pmol/L正向内引物、0.8pL10pmol/L反向内引物、0.2pL10nmol/L正向外引物、0.2nL10Mmol/L反向外引物和0.5nL10nmol/L环引物，共计25ijL。其中引物 序列同实施例l。
试剂E:同实施例l。 按照以下辦进行检测
(1) 样品DNA的提取 样品为M^国进口的大^g科羊品，夕卜观正常。
利用传统的方舰行大^F样品的DNA的提取，参照好克隆实验指南(第二版)。具体为取50 mg 大^IWBMa织，加入600mL分离缓冲液a0mmol/LpH7.4的三P逮甲基魏甲烷—盐酸,10mmol/L氯 化钠，25mmol/L乙二胺四乙酸)，研磨后，力口入60^10%十二烷基磺,，混匀，力口入50ML10mg/ml 蛋白酶K， 37。C保温2小时，憩赂液澄清。加入^^只酚氯仿:异戊醇(25:24:1 )抽提，待分层后，3000ipm 离心5溯。^Jb层7j^目至干净的离心管中，力口入l/0^^只的3mol/L的醋,及2倍^f只的^K乙醇， 颠倒混合，-20°C^j[ ^N、al1J]^DNA。之后10000 rpm离心15 ^H中，倒 体，用70%乙||^先涤沉淀， 千/蹄溶解于30mL肝生物学MM7K中。用核酸分析仪测定OIWOD28o为1.9，鹏为50ng/pL。
(2) 进fr淋巴翻中病毒的环介导織扩增鹏
首先取—个0.21111的聚丙稀塑料管，力口入步骤(1)提鹏大^m羊品的DNA3.5pL，再加入lpL
i凝U a、 5.0 mL试剂b、 13.0 (jL试剂c和2.5 试剂d， M/^总4^只为25&。调节水滞呙的觀tM恒 ^7K浴65。C，将，塑料管方JS其中50min以进行环介导^^扩增H/免之后将7jC温调到85。c，方燈 3min以终止反应，取出含扩增汽勿的塑料徵寺检。
(3) 扩增,的检测
在步骤(2)的待M料管中力口入&Li叙UE,混合均匀，肉目歐见察产物的0;色。切5^物颜色为 m，据此判定待检样品大,中不含有淋巴ftH中病毒。 鄉例3
按照同实施例2的配方制很林巴,中病毒的环介导^^扩增'I^I检测淑!J盒。 按照以下辦进朽穩
(1) 样品DNA的提取 样品为某銜直场采集的舻鱼，夕卜miE常。
取50 mg舻MilM且织，样品的DNA的提取方法同^M例2。用核^^析仪测定舻鱼样品的DNA ODWOD2so为1.8，浓度为70ng/pL。
(2) 进斤淋巴劐中病毒的环介导離扩增鹏
取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，力口A^骤(1)提取的舻鱼样品的DNA3.5^， 1F加入的其它反 舰分及鹏斜牛同鄉例2。
(3) 扩增产物的翻!l
在步骤(2)的待,料管中力口入lML试剂E，混合均匀，卿歐je察产物的颜色。^Z产物鹏为 gfe，据此判定待检样品舻鱼中不含有淋巴戴中病毒。
7核苷酸序列表
<110>山东出入境检验^SM检验^^駄中心 <120>淋巴,中病毒的tfel检测试布皿^^则方法 <160> 5
<210> 1 <211> 52 〈12> DNA <213> AXj^列 <220>
<221> primer一bind <222> (1)...(52)
<223> t鹏环介导^a扩增sj应要求设计，用于扩增淋巴劐中病毒的正向内引物。
<400> 1
accgaaaaaaaggattttaatggcattttacctctaactattccaagtccta 52 <210> 2 《1> 47 <212> DNA 《3> AX序列 <220>
<221> primer一bind <222> (1)…(47)
<223>根据环介导等温扩增鹏要求设计，用于扩增淋巴-劐中病毒的反向内引物。 <400> 2
ccagttcttc tectgtaatc tttgattttgatoagcagcaatacccg 47
《10> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> AU宇列 <220>
<221> primer—bind<222> (1)."(20)
<223>根据环介导紫显扩增阅应要求设计，用于扩增淋巴劐中病毒的正向外引物。 <400> 3
acaaacagcacctaaacatg 20
<210> 4
<211> 23
々12> DNA
<213> AX/^列 <220>
<222> (1)…(23)
<223> ISg环介导等温扩增SiS要求设计，用于扩增淋巴劐中病毒的反向夕卜引物。
<400> 4
cgagcactat tttcataaac caa 23
<210> 5 〈11> 18 <212> DNA <213> Aim列 <220>
<221> primer—bind <222> (1)...(18)
々23>根据环介导等显扩增切立要求设计，用于扩潜淋巴劐中病毒的环引物。 <400> 5
cgg^gaattgctagcga 18
权利要求
1.一种淋巴囊肿病毒的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括试剂A-E试剂ABst DNA聚合酶，8U/μL；试剂B反应缓冲液，其中含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；试剂C环介导等温扩增混合液，其中含有2.0-4.0μL 2.5mmol/L dNTP、2.0-5.0μL 1.6mol/L甜菜碱和3.0-10.0μL分子生物学级超纯水；试剂D引物混合液，其中含有0.8-2.0μL 10μmol/L正向内引物、0.8-2.0μL 10μmol/L反向内引物、0.2-0.5μL 10μmol/L正向外引物、0.2-0.5μL 10μmol/L反向外引物、0.5-1.0μL 10μmol/L环引物；其中各引物序列如下正向内引物5′-ACCGAAAAAAAGGATTTTAATGGCATTTTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3′；反向内引物5′-CCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGATTTTGATCAGCAGCAATACCCG-3′；正向外引物5′-ACAAACAGCACCTAAACATG-3′；反向外引物5′-CGAGCACTATTTTCATAAACCAA-3′；环引物5′-CGGTGGAATTGCTAGCGA-3′；试剂E荧光显色剂，成分为100×的荧光染料SYBR GREENI。
2.湖权利要求1中臓盼鹏检测i叙,行淋巴,病毒的樹则施，辦征在于检W辦口下(1) 待检样品的DNA的提取提取待检样品的DNA，其中提取的样品DNA OEW OD2so在1.7-2.0范围内，鹏在50-500 ng/pL 之间；(2) 进斤淋巴劐中病毒的环介导^a扩增a^首先取一个0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口A^骤(1)提取的待测样品的DNA l-5^L，再加入1 pL 淑!JA， 2.5-5.0mL反j^!冲液，7.(M9.0ML试剂C， 2.5mL试剂d。然后将塑料管置于60-65。C的恒 船jc辦呙中，方燈30"60min;之后将水温调到80-95°C，方爐3-5min以终ih&iSL取出含扩增，的塑 料管待检。(3) 扩增，的检测在步骤(2)的待;^M料管中加入lnLi叙UE，混合均匀，肉目歐见察J^的Mfe，如果为纟絶，则 判定待检样品含有淋巴戴中病毒，如果为m，贝,定待检样品不含有淋巴戴中病毒。
全文摘要
本发明公开一种淋巴囊肿病毒的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明包括由Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂共5种试剂组成的试剂盒，以及使用该试剂盒检测鱼类样品中淋巴囊肿病毒的一套检测操作程序，以实现对淋巴囊肿病毒快速检测的标准化，为鱼类的健康养殖和国际鱼类贸易的发展提供科学依据。本发明具有特异性好、灵敏度高、操作简便、高效等优点，可广泛的应用于水产养殖场以及进出口鱼类贸易中的现场即时检测，并可以为相关基础研究提供技术支持，具有广泛应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101550456SQ200810160300
公开日2009年10月7日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者岳志芹, 健 张, 朱来华, 琼 李, 梁成珠, 肖西志, 贾俊涛, 巍 赵, 辛学谦, 邓明俊, 郑小龙, 晓 陈 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心