专利名称：Slit-robo介导的淋巴管形成及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及领域为Slit-Robo信号传导相关疾病的预防、诊断和治疗；特别是癌症发生及转移的诊断与治疗。
背景技术：
癌症在晚期的转移是癌症病人死亡的主因。已有大量工作投入于研究癌症及其治疗，尤其是研究调控癌症的成长和转移的机制。但癌症转移的分子机制仍不清楚。一般的癌转移过程是这样的癌细胞从原发灶浸润入血液循环系统或淋巴循环系统，然后通过循环系统到达并进入新的组织，成长为新的病灶。癌细胞的淋巴结高转移率表明淋巴系统在癌症转移中发挥着重要作用。淋巴系统对体内体液平衡的保持、免疫反应和脂肪酸的吸收都具有重要作用。除了这些正常的生理作用，淋巴系统对淋巴结肿大和炎症反应也有重要作用。在研究中发现， 很多发生癌症转移的病人都伴随淋巴管的增多，这表明淋巴系统在癌症转移的过程中有重要促进作用。可是，淋巴系统在癌症转移中究怎样发挥作用还没有研究清楚。由于淋巴系统在癌症的转移中扮演重要角色，将肿瘤的淋巴转移作为治疗靶点就成为一种治疗癌症的有效手段。
发明内容
本发明的一个方面是有关针对Slit蛋白引起疾病的预防和治疗的方法。其中一个具体方法是利用一种能够调节或抑制Slit和Robo蛋白相互作用的物质来调控淋巴管的形成，从而达到预防或治疗疾病的目的。该物质可以是针对Slit的抗体、针对Robo的抗体、一段Robo胞外区的蛋白或者是一段Robo胞外区的融合蛋白。Slit蛋白可能是Slit2， Robo蛋白可能是Robol或Robo4。本发明的另一方面是有关针对能够预防和治疗Slit蛋白引起的疾病的药物。其中一种合成药物包括一种能够调节或抑制Slit-Robo信号相互作用从而调控淋巴管的形成的物质与药物赋形剂、携带剂和溶解剂。该物质可以是针对Slit的抗体、针对Robo的抗体、一段Robo胞外区的蛋白或者是一段Robo胞外区的融合蛋白。Slit蛋白可能是Slit2， Robo蛋白可能是Robol或Robo4。本发明的一个方面是有关针对Slit蛋白引起的疾病的诊断的方法。其中一种针对Slit蛋白引起的疾病的诊断的方法如下(a)首先从检测目标得到检测样本，检测单独的Slit蛋白或Robo蛋白的表达水平或Slit蛋白和Robo蛋白两者的表达水平；(b)其次从正常人群众取得样品作为对照，检测该样品的单独的Slit蛋白或Robo蛋白的表达水平或Slit蛋白和Robo蛋白两者的表达水平；(c)然后比较(a)和(b)检测到的表达结果，来确定该检测目标是否有Slit蛋白引起的疾病。Slit蛋白可能是Slit2，Robo蛋白可能是 Robol或Robo4。所做的检测可以是DNA水平、RNA水平和(或)蛋白水平的检测。本发明的其他方面的权益将在随后的描述和附加声明中阐明。
图1展示了 Slit2蛋白在癌症中的表达情况。(a)用Slit2抗体通过免疫印迹实验检测多株来源于不同癌症的细胞株裂解液的Slit2蛋白表达情况。S1U2/293细胞株作为检测的阳性对照，V/293细胞株作为检测的隐性对照。(b)用Slit2抗体通过免疫组织化学检测人癌症样本的Slit2蛋白表达情况。箭头指示Slit2蛋白在肿瘤细胞中表达。上图的标尺代表100 μ m，下图的标尺代表10 μ m。(c)用Slit2抗体通过免疫组织化学检测人乳腺癌浸润样本展示的Slit2分布梯度。箭头指示肿瘤内部的细微管状结构。上图的标尺代表100 μ m，下图的标尺代表40 μ m。图2展示Slit2转基因小鼠的构建。(a)用于做转基因小鼠的携带人 Slit2(hSlit2)基因的表达载体的示意图。(b)斑点杂交法检测9#小鼠为hSlit2转基因阳性小鼠。(c)南方墨点法检测9#小鼠为hSlit2转基因阳性小鼠。(d)用hSlit2单克隆抗体5A5通过免疫印迹法检测hSlit2转基因小鼠胰腺部位的hSlit2表达情况。同型免疫球蛋白G作为阴性对照。HS1U2/293细胞裂解液作为阳性对照。(e)用FLAG单克隆抗体M2 通过免疫印迹法检测Flag-hSlit2转基因小鼠胰腺部位的hSlit2表达情况。(f)用RT-PCR 方法分析hSlit2转基因小鼠中FLAG的表达。C57小鼠作为阴性对照。(g)用免疫组织化学方法检测正常小鼠胰腺组织没有hSlit2的表达(左上图)，其余的图用连续切片进行免疫组化，展示Rip_Tag2转基因小鼠的胰腺组织的胰岛素的表达，hSlit2的表达，Robol的表达载，及vWF的表达。(h)免疫组织化学分析hSlit2/Ripl-Tag2转基因小鼠胰腺组织的 Slit2表达显著高于Ripl-Tag2转基因小鼠的表达。*p < 0. 05 ；标尺=IOym0图3展示Slit2促进胰腺肿瘤的生长。比较Ripl_Tag2和SlitZ/Ripl-hgZ转基因小鼠的(a)血性胰岛数目，(b)肿瘤体积，(c)肿瘤数目，(d)胰腺与血液的白细胞数目。 (e)转基因小鼠胰腺瘤的荧光染色。(f)转基因小鼠胰腺瘤的苏木精伊红染色。荧光染色和苏木精伊红染色都展示了 Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠比Ripl_Tag2转基因小鼠拥有更大的肿瘤，更多的血管。免疫组织化学方法比较Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠的(g)血管密度，(h)增殖指数，和(i)凋亡指数，展示出Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠比Ripl-Tag2转基因小鼠拥有更多的新生血管，更高的增殖和更少的凋亡。标尺50 μ m ；* ρ < 0. 05 ；** :p < 0. 01。图4展示14周龄Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠肿瘤淋巴转移的组织学鉴定和转移率分析。Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠展示(a)原位胰岛素瘤，肠系膜淋巴结转移灶和肠壁转移灶解剖示意图(箭头所示)，(b-c)转移灶的苏木精伊红染色(箭头所示为转移的肿瘤细胞)。(d-h)用T-antigen抗体进行免疫组化确证肠系膜淋巴结和肠壁的转移灶都是由胰岛β肿瘤细胞形成的。(i)Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2两种转基因小鼠转移率的统计，统计结果显示Slit2过表达显著促进胰岛肿瘤细胞的肠系膜淋巴结转移率。(j)图显示 14周龄两种小鼠胰岛素瘤的体积没有明显差异，说明转移率的上升不是由于肿瘤生长加快间接引起的，而是由于Slit2过表达直接引起的。(k)图显示Slit2/Ripl-Tag2小鼠的生存率明显下降。图5展示Slit2过表达促进体内胰岛素瘤的淋巴管新生及Slit2重组蛋白诱导体外人淋巴内皮细胞迁移及形成管状结构。免疫组化检测淋巴管标记蛋白，结果显示晚期Slit2/Ripl-Tag2小鼠肿瘤淋巴管新生明显高于Ripl-Tag2小鼠(a_c)。用免疫荧光的方法检测到Robol在胰腺淋巴管上表达(d)。同时Robol表达于原代淋巴内皮细胞膜上(e-f)。 重组的Slit2. 1蛋白通过作用于其受体Robol促进淋巴内皮细胞在Matrigel上的管腔形成(g_h)，并趋化淋巴内皮细胞迁移(i-j)；迁移和管状结构的形成都能被R5特异性抑制 (g-j)。“-” 是阴性对照。VEGF-C 是阳性对照·。* :p < 0. 05 ；** :p < 0. 01。图6展示(A)hRobo-Fc与hSlit2重组蛋白相互作用；(B) R5 (针对Robol蛋白第一个Immunoglobulin-Iike区段的单克隆抗体)抑制hRobo_Fc与hSlit2重组蛋白的相互作用。图7展示用标记了辣根过氧化氢酶的兔抗人免疫球蛋白检测分子量约为85道尔顿的重组hRobo-Fc蛋白。图8展示Slit2单克隆抗体的特异性分析及在多种人肿瘤组织的检测。免疫印迹实验被用于检测抗体Sl和S3对Slit2蛋白全长或片段的识别。(a)Sl通过与Slit2氮端结合识别全长Slit2。9E10和S3通过与Slit2碳端结合识别全长Slit2。抗体Sl和S3都能特异性识别Sli2，同时Sl也能识别Slitl和Slit3蛋白。9E10作为阳性对照。Sl单克隆抗体用于检测结肠癌和乳腺癌(b)，原位肺癌和转移肺癌(c)，和有淋巴转移和无淋巴转移的结肠癌(d)中Slit2的表达。mlgG作为阴性对照(免疫组织化学分析)。标尺10μπι。
具体实施例方式本发明主要针对Slit蛋白引起的疾病的诊断、预防和治疗方法，尤其是与淋巴管形成相关的疾病。这些Slit蛋白引起的疾病与Slit蛋白与其受体Robo蛋白的结合有关， 这些疾病包括肿瘤的生长和转移，比如肿瘤的淋巴转移。具体而言，本发明第一方面提供了一种预防或治疗由Slit蛋白引起的病症的方法，包含向个体施与有疗效剂量的可调节或阻断Slit蛋白与一种Robo蛋白相互作用的药物，其特征在于，所述病症与淋巴管形成相关。在一个优选的实施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一个优选的实施方案中，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。在另一个优选的实施方案中，所述药物是针对于Slit蛋白的一种抗体。在另一个优选的实施方案中，所述药物是针对Robo蛋白的一种抗体。在另一个优选的实施方案中，所述的抗体是一种单克隆抗体，优选是人源化的抗体。在另一个优选的实施方案中，所述药物是Robo蛋白胞外区的某一片段。所述的片段优选来源于Rob0蛋白的第一个免疫球蛋白样区域。在另一个优选的实施方案中，所述药物是一种Robo融合蛋白，优选是Robo-Fc融
合蛋白ο本发明第二方面提供了一种预防治疗Slit介导的疾病的药物。这种药物包含能调节或干扰Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物，和一种药物赋形剂、载体或溶剂，其中 Slit介导的疾病是与淋巴管形成有关。在一个优选的实施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一个优选的实施方案中，所述能调节或干扰Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物是针对于Slit蛋白或Robo蛋白的一种抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是一种单克隆抗体，优选人源化抗体。在另一个优选的实施方案中，所述能调节或干扰Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物是Rob0蛋白胞外区的某一片段。所述片段优选来源于Robo蛋白的第一个免疫球蛋白样区域。在另一个优选的实施方案中，所述能调节或干扰Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物是一种Robo融合蛋白，优选Robo-Fc融合蛋白。本发明第三方面提供了一种针对Slit蛋白引起的疾病的诊断的方法如下(a)首先从检测目标得到检测样本，检测单独的Slit或Robo的水平或Slit和Robo两者的水平； (b)其次从正常人取得样品作为对照，检测该样品的单独的Slit或Robo的水平或Slit和 Robo两者的水平；(c)然后比较(a)和(b)检测到的表达结果，来确定该检测目标是否有 Slit蛋白引起的疾病。在一个优选的实施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一个优选的实施方案中，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。在另一个优选的实施方案中，所述水平是DNA水平，RNA水平，蛋白水平，或综合上列2者或3者的水平。在另一个优选的实施例方案中，所述疾病是与Slit-Robo信号传导通路相关的疾病。在另一个优选的实施方案中，所述疾病是是癌症或与淋巴管形成相关的疾病。在另一个优选的实施方案中，所述疾病是癌症，优选转移性癌症。在另一个优选的实施方案中，所述癌症是下列癌症之一结肠癌，胃癌，食道癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，和膀胱癌。本发明第四方面提供了能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA 或它们的编码基因的物质在制备用于检测Slit蛋白介导的病症的诊断试剂中的应用，所述检测包括以下步骤(a)从检测目标得到检测样本，利用能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA或它们的编码基因的物质检测单独的Slit或Robo的水平或Slit和Robo两者的水平；(b)从正常人取得样品作为对照，利用能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA或它们的编码基因的物质检测该样品的单独的Slit或Robo的水平或Slit和 Robo两者的水平；(c)比较(a)和(b)检测到的表达结果，来确定该检测目标是否有Slit蛋白引起的疾病，如果检测样本的Slit或Robo水平高于对照，则表明该检测目标患有所述疾病。在一个优选实施方案中，所述能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的 mRNA或它们的编码基因的物质选自与Slit蛋白特异性结合的物质，优选与Slit蛋白特异性结合的抗体，更优选与Slit蛋白特异性结合的单克隆抗体；与Robo蛋白特异性结合的物质，优选与Robo蛋白特异性结合的抗体，更优选与Robo蛋白特异性结合的单克隆抗体； 与Slit或Robo的mRNA或编码基因结合的物质(如引物)。本发明的发明者意外地发现Slit蛋白与Robo蛋白(Slit蛋白的受体)之间的相互作用(相互结合作用)的信号传导能促进淋巴管形成。那么能够调控或影响Slit蛋白与它的受体(Robo蛋白)相互作用的试剂就有可能应用于调控淋巴管的形成或与淋巴管形成相关疾病的诊断、治疗，例如癌症的淋巴转移。本发明的一些具体部分是调控或影响Slit蛋白与它的受体(Robo蛋白)相互作用的一些试剂。这些试剂可以是Slit或Robo蛋白的蛋白片段或相似物(包括融合蛋白或蛋白片段)，或者Slit或Robo蛋白的抗体(多克隆抗体、单克隆抗体或人源化抗体)。本发明的另一些具体部分是针对Slit-Robo相互作用引起疾病的诊断、预防或治疗的方法， 尤其是癌症进程和癌症转移。随后的本发明的具体示例中用Slit2作为Slit蛋白的一个代表，用Robol和 Robo4作为Robo蛋白的代表。当然，本发明也包括其它的影响淋巴管形成的slit蛋白和 Robo蛋白。Slit基因编码一类在神经发育中极为重要的分泌蛋白。这些蛋白的功能主要是诱导神经迁移。在哺乳动物里，已知有三个Slit基因Slitl，Slit2，和Slit3。这些基因在非神经系统里也有表达(Holmes, G. P. et al. Mech. Dev. 79 :57-72 (1998))。例如，Slit2 和 Slit3的mRNA在大鼠内皮细胞也有被发现(没有发现Slitl) (ffu,J. Y. et al. Nature 410 948-952(2001)).结构上，Slit具有4个富含亮氨酸的重复序列、9个表皮生长因子(EGF)样功能域、1个位于第6和第7个EGF功能域间的ALPS片段，以及1个位于羧基端的胱氨酸结。 Slit虽是一种可溶性蛋白，但大部分附着在细胞表面。Slit蛋白与它们的受体Roundabout (Robo)蛋白结合。Slit和Robo蛋白共同作用在神经轴突导向与分叉及神经元迁移中起排斥作用(Kidd，T.et al.Cell 92 201-215(1998) ；Wang, K. -H. et al. Cell 96:771-784(1999) ；ffu, W. et al. Nature 400 331-336(1999))。另外Slit-Robo相互作用还能抑制内源白细胞化学趋向性(ffu, J. Y. et al. Nature 410 :948-952(2001)) 因为能抑制内源白细胞化学趋向性，Slit蛋白(例如Slit2蛋白)和体内发炎反应有关。(Wu，J.Y.et al. Nature 410 :948-952 Q001))。在炎症进程中，白细胞粘附于血管内皮细胞，穿越毛细血管壁，进入病损或感染的组织或器官，是炎症发生和发展过程中的重要环节，也是一个研究了数百年的生物学现象。随着生物学研究方法和技术的进步，近十年来对此现象的分子机制有了比较清楚的了解。目前普遍认为，白细胞粘连和穿壁运动是由多种分子，如趋化因子，细胞粘附分子、细胞骨架蛋白和金属酶分子等，在时间和空间上的协调作用来完成的。有文献报道，Slit2在体外能抑制趋化因子引起的白细胞的趋化运动， 并且这一作用可被Robo胞外可溶性片段(RoboN)所阻断，证明Slit对白细胞的这一作用也是基于其受体Robo所介导的信号通路(Wu et al.，2001Nature 410:948)。Slit蛋白的受体Robo是一类一次跨膜蛋白，目前在哺乳动物中发现了四个 Robo基因Robol，Robo2, Robo3和Robo4。Robo蛋白在神经系统外也有表达(Piper， Μ. et al. Mech. Dev. 94 :213-217 (2000)) 例如，小鼠白细胞发现 Robol mRNA (ffu, J.Y.et al. Nature 410 :948-952 (2001)) 人内皮细胞表达 Robo4 (Huminiecki，L. et al. Genomics. 79 :547-552 (2002))。当有配体(例如Slit蛋白)结合，Robo受体将信号传导至细胞内最终导致各种排斥性生物过程的发生，包括神经轴突导向和分叉，神经元细胞迁移，和白细胞化学趋向性运动。像上面提到的那样，受体Robo是一类一次跨膜蛋白。结构上，RoboU2和3的胞外段具有5个免疫球蛋白(Ig)样结构域和3个III型胶原重复序列，其中Ig样结构域是 Robo结合全长Slit及Slit富含亮氨酸重复序列所必须的；胞内段含多个结构域，其中包括CCO、CC1、CC2和CC3序列，已经证明这些结构与细胞内部的信号传递有关。而Robo4的胞外段仅含2个Ig样结构域，其胞内段仅含CCO和CC2序列。Slit2 蛋白与 Robol 的第一个 Ig 结构域结合(Chen et al.，J Neurosci. 200121 1548-1556)。一个特异识别Robol第一个Ig结构域的单克隆抗体R5能够中和Slit2诱导的血管生成(Wang et al.，Cancer Cell. 20034 :19-29)，证明 Slit2 与 Robol 的特异性结合对Slit2诱导的血管生成是至关重要的。Slit和Robo蛋白在包括血管发生在内的多种生物活性中发挥作用。本发明的发明者在完全客观的条件下发现Slit-Robo相互作用在淋巴生成中也发挥重要作用(例如淋巴管生成)。更重要的是发明者还发现Slit-Robo相互作用引起的淋巴管生成癌症转移密切相关。这样能够破坏Slit-Robo相互作用的物质就可以被用于癌症的预防和治疗，特别是癌症转移的预防和治疗。Slit2在多种癌症组织中都有高水平表达(图1)，而在正常组织或非典型增生组织中则表达很低或不表达。Slit2在癌症组织的高表达事实提示Slit2可能在癌症进程和转移过程中有重要作用。下文将会描述Slit2确实在癌症的进程和转移过程中发挥重要作用。一个与此作用相关的可能的机制就是能够诱导淋巴管生成。Slit2在肿瘤进程和转移过程中的重要作用已在一些动物模型中被检测。例如， 如图2所示，高表达Slit2的转基因小鼠被构建，将Slit2转基因小鼠与能够自发胰腺瘤的 Ripl-Tag2转基因小鼠杂交得到Slit2/Ripl-Tag2双转基因小鼠。有关Slit2/Ripl_Tag2 双转基因小鼠在示例部分中有详细描述。这些Slit2/Ripl-Tag2双转基因小鼠通过免疫组织化学实验方法检测可看到高水平的Slit2表达(图池)。同时，这些老鼠表现出了明显的淋巴管生成增加、肿瘤大小增大和肿瘤向肠系膜淋巴结转移现象(图幻。这些结果显示， Slit2蛋白表达水平的增加与肿瘤生长和转移的增加密切相关。Slit2促进胰腺癌的生长和转移。比较Ripl_Tag2和Slit2/Ripl_Tag2转基因小鼠发现，Slit2能够增加血性胰岛的数目(图3a)，肿瘤体积(图北)，肿瘤数目(图3c)，但不影响胰腺和血液中的白细胞数目(图3d)。图!Be展示了转基因小鼠胰岛素瘤的血管荧光标记，图3f展示了转基因小鼠胰岛素瘤的苏木精伊红染色，可以看到Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠有着比Ripl_Tag2转基因小鼠更大的肿瘤和更多的血管。通过免疫组织化学方法分析比较Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠和Ripl_Tag2转基因小鼠可以发现，血管密度(图3g)和增殖指数(图3h)都大大增加，凋亡指数则减少(图 3i)。这些结果表明，Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠比Ripl-Tag2转基因小鼠有着更多的新生血管，更高的增殖能力和减少的凋亡潜能。Slit2的过表达能够增加肿瘤数目这一现象提示Slit2可能促进肿瘤转移。这个可能性与Slit2能够影响淋巴管生成这一功能相关，因为大部分肿瘤转移都与淋巴系统相关。
图4展示了 Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠中Slit2蛋白的过表达实际上导致了淋巴管的增生和肿瘤淋巴转移。Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠展示出增多的肿瘤肠系膜淋巴结和肠壁转移(图如)，H&E方法对转移灶进行染色，发现β细胞转移至十二指肠的上皮细胞层与肌层之间；以及肠系膜淋巴结内部(图4b-c)。用T-antigen的抗体对转移灶组织切片进行免疫组织化学染色，发现确实是β细胞形成的转移瘤(图4d-h)。对大量14周龄的Ripl_Tag2和Slit2/Ripl_Tag2小鼠进行了解剖观察，发现在Ripl-Tag2小鼠(32只)中，只有2只有肠系膜淋巴结转移，1只肠壁转移；在Slit2/ Ripl-Tag2小鼠(50只)中，有17只肠系膜淋巴结转移，8只肠壁转移(图4i)。Chi-square 检验肠系膜淋巴结转移率有显著差异。用LYVE-I的抗体进行免疫组化实验和统计分析，结果显示，与Ripl_Tag2转基因小鼠相比，Slit2/Ripl-Tag2转基因小鼠胰腺瘤相关淋巴管形成明显上升(图5a-c)。这些结果表明Slit2过表达能诱导淋巴管形成和肿瘤淋巴转移。Robol的单克隆抗体R5 (图5c_e)或能与Slit2结合的Robol胞外区片段 RoboN(数据没有展示)能够特异性阻断Slit2诱导的淋巴内皮细胞的迁移和淋巴管形成， 进一步证实了 Slit2在肿瘤淋巴管生成中的重要作用。图6展示了 R5能够特异性破坏 Robol的重组蛋白(hRobo-Fc)(图7)和Slit2的重组蛋白之间的结合(图6A，6B)。上述数据清楚的显示出Slit-Robo相互作用在肿瘤淋巴管生成和肿瘤淋巴转移过程中的重要作用。因此，能够影响或调控Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的物质就可以作为治疗剂应用于某部分癌症的预防或治疗。根据本发明的研究提示，这些试剂可以包括 Slit的抗体，Robo蛋白的抗体，Robo蛋白的胞外区片段，等等。可以应用于本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。并且，该抗体还可以经过人源化修饰以减低免疫排斥或并发症。依据本发明所述，Robo的特异性抗体或胞外区活性片段可以用于竞争性抑制 Slit-Robo之间的相互作用，从而抑制Slit-Robo信号转导所调控的生物学功能。同样， Slit蛋白的特异性抗体也可以用于Slit-Robo信号引起的疾病的诊断、预防和治疗。依据本发明所述，用于Slit蛋白引起疾病的治疗的抗体可以制作成人源化抗体， 以最大程度减低临床上的免疫排斥反应。制作人源化抗体在技术上已成熟，本发明的部分工作涉及到大量制备这一类用于治疗的物质的方法。这些方法和试剂将在随后的描述中展
7J\ ο除了预防或治疗Slit蛋白引起的疾病，本发明还涉及到此类疾病的诊断。如上文所述，Slit蛋白的表达在多种癌症中都有表达上调的现象。那么，检测Slit蛋白的表达水平是否增加就有可能用来指示是否存在Slit蛋白引起的疾病。图8展示了 Slit2蛋白单克隆抗体的特异性分析及应用于人肿瘤样本的检测。本实验应用了三个抗体S1，S3和9E10。我们运用免疫印迹方法来检测抗体Sl和S3对Slit2 全长或片段的识别情况。如图8a所示，抗体Sl通过识别Slit2蛋白的氮端与Slit2蛋白结合，抗体S3通过识别Slit2蛋白的碳端与Slit2蛋白结合。抗体Sl和S3均能特异性识别Slit2蛋白，同时抗体Sl还能识别人的Slitl蛋白和Slit3蛋白。9E10抗体(购于ATCC 公司)作为阳性对照。如图8所示，抗体Sl能够用于检测人结肠癌和乳腺癌(图8b)，原位肺癌及转移肺癌(图8c)，伴随淋巴转移或没有淋巴转移的结肠癌(图8d)中的Slit2表达。上述实验清晰显示Slit蛋白的特异性抗体可以作为一种手段来各种癌症进行诊断预报。以下将进一步描述本发明的具体内容。预防或治疗与Slit2蛋白调控淋巴管形成相关的疾病的方法如上所述，本发明一方面涉及到针对某一主体预防或治疗与Slit2蛋白调控淋巴管形成相关的疾病的方法。依据本发明可以找到方法，例如，可以在某一主体内通过减少或抑制Slit-Robo之间的相互作用达到合适的水平以治疗该主体由于Slit-Robo相互作用调控淋巴管生成所引起的疾病。这些疾病可能与癌症的进程和转移有关。Slit2蛋白与Robo蛋白的相互作用(例如Slit2与Robol结合或Slit2与Robo4 结合)可以被很多合适的手段抑制。例如，可以通过某些有效物质来降低Slit2基因的复制，降低Slit2受体基因的复制，降低Slit2基因的转录，降低Slit2受体基因的转录，降低 Slit2mRNA的剪切或翻译，降低Slit2受体mRNA的剪切或翻译，降低Slit2前体的成熟或细胞内转运，降低Slit2受体前体的成熟或细胞内转运，等等。依据本发明的另一方面所述，可以通过给对象施加有效剂量的物质减少或抑制 Slit2蛋白与Robo蛋白的结合来降低Slit2-Robo的相互作用。任何合适的物质都可以用来减少或阻断Slit2-Robo蛋白之间的结合。举例来说，这些物质可包括针对Slit2的抗体，Robo的抗体，或者能与Slit2结合的Robo的胞外区蛋白片段。任何合适的针对Slit2 或Robo的抗体都可降低或抑制Slit2-Robo的蛋白结合，这些抗体可包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab或F(ab' )2抗体片段以及它们的人源化抗体。另外，能与Robo受体直接或间接结合的受体拮抗剂也包括在内。受体的拮抗剂可包括能与Robo结合的且不影响正常信号转导的小分子或Slit2的结构类似物。本发明所用方法可用于预防或治疗Slit2受体介导的淋巴管形成上的疾病或异常。例如可用于预防或治疗Slit2-Robol或者Slit2-Robo4介导的淋巴管形成相关疾病或异常。Slit2与Robol或者Robo4的相互作用可被任何适当的方法抑制。较好的方法是通过给予有效量的某些物质减少或抑制Slit2-Robo或Slit2-Robo4蛋白结合来降低 Slit2-Robol或Slit2-Robo4的相互作用。这些典型的物质包括针对Slit2的抗体、针对 Robol的抗体、针对Robo4的抗体以及能与Slit2结合的Robol或Robo4的胞外区段蛋白。任何针对Slit2的抗体适用于本发明，包括1999年Hu在Neuron上的文章中所述的针对Slit2的抗体。同样，任何合适的针对Robol的抗体也可以被使用，例如2002年 Hivert在Mol Cell Neurosci上的文章所述的针对Robol的抗体。本发明中Robol的抗体优先为针对Robol的第一个Ig区的抗体，更为优先的是针对Robol第一个Ig区的R5抗体。任何合适的Robol的胞外片段也能被使用，比如RoboN蛋白。本发明中所用物质可以单独给药，更适宜的方法是和药学上可以接受的载体或赋形剂一起给予。。本发明适用于预防或治疗Slit2介导的淋巴管形成相关的疾病或异常，例如癌症，尤其是转移性的癌症。举例来说，癌症可以是恶性黑色素瘤、膀胱鳞状癌、成神经细胞瘤、小细胞肺癌、结肠癌、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、涎腺腺样囊性癌、肝细胞瘤或横纹肌肉瘤。本发明适用于任何主体的Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的预防或治疗。优先主体是哺乳动物，特别是人类。
本发明中一些具体部分的主体是人类，相应的物质是人源化的单克隆抗体。用于预防或治疗Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的药物组分和药物组合另一方面，本发明的具体部分是关于预防或治疗某一主体的Slit2介导淋巴管形成相关疾病的药物组分。这些药物组分包含有效剂量的抑制Slit2-Robo结合的物质，可能还含有药学上可以接受的载体或赋形剂。药物的配方、给药剂量和给药途径可参照已有的技术方案(如Remington =The Scienceand Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro(Editor)Mack Publishing Company, April 1997 ；Therapeutic Peptides and Proteins FormuIation, Processing, and Delivery Systems, Banga,1999 ；and Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Hovgaard and Frkjr(Ed. ), Taylor & Francis, Inc. ,2000 ； Biopharmaceutical Drug Design and Development, Wu-Pong and Rojanasakul(Ed.), Humana Press,1999)。对于Slit2介导的淋巴管形成相关疾病或异常的预防或治疗，合适的剂量水平为每天每千克重量给药大约0. 01 500mg。更适宜的剂量水平是每天0. 1 250mg/kg。在有些部分，剂量水平可优化在每天0. 1 20mg/kg。可以用单一或多种合适剂量进行给药。 特定主体的剂量水平和给药的频率是可变的，依赖于多种因素，例如所用化合物的活性、代谢稳定性、化合物作用时间、主体年龄、体重、健康水平、性别、饮食、状态及给药时间、排泄速度、药物联合、特定环境和病人正在经受的治疗。本发明的药物组分可以通过口服、肠胃外、吸入、局部给药、直肠、鼻腔、口腔、阴道、埋植等任何合适的形式进行给药。另一方面，本发明的具体实施方案涉及预防或治疗Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的药物组合。这种药物组合可以包括1)本发明中减少或阻断Slit2-Robo结合的有效剂量的药物，幻抑制或阻断淋巴管形成的有效剂量的其他药物。对于治疗癌症，任何抗癌药物可以和本发明一起联合应用。可用于本发明中的抗癌药的实例参见U. S. patent application Ser. No. 2002/044, 919。其中被使用的一种抗癌试剂为抗血管生成试剂。抗血管生成试剂可以是基质膜降解抑制剂、细胞迁移抑制剂、内皮细胞增生抑制剂及三维组织构成抑制剂。这些抗血管生成试剂的具体实例参见Auertach andAuerbach, Pharmacol.Ther. ,63 :265-311 (1994) ；0 ‘ Reilly, Investigational New Drugs, 15 :5-13(1997) J.Nat ‘ 1 Cancer Instit.，88 :786-788 (1996) ;U. S. Pat. Nos. 5，593，990 ；5, 629，327和5，712，291。这些可用的抗癌试剂在另一方面体现为烷化剂、 抗代谢物、天然产物、钼类配位化合物、蒽二酮、取代脲、甲基胼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、 激素和拮抗剂。预防或诊断Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的方法和试剂盒本发明的一些实施方案涉及到用于预防或诊断Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的方法，例如，该实施方式中的一种方法可能包括1)获得待测主体的检测样本及检测上述样本中Slit2和(或)Slit2受体(Robo)的水平；幻获得不发生Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的对照主体的对照样本并检测上述样本中Slit2和(或)Slit2受体(Robo) 的水平；3)比较1)和2、两种样本中Slit2和(或)Slit2受体(Robo)的水平，跟对照主体样本相比，待测主体样本的Slit2和(或)其受体水平的上升则表明上述检测主体发生了 Slit2介导的淋巴管形成相关的疾病。此方法中检测的Slit2的受体可以是Robol或 Robo4。Slit2和(或)其受体在合适的水平的检测，如可以在核酸水平或蛋白水平。本发明的实施方案涉及到用于预防或诊断Slit2介导的淋巴管形成相关疾病的试剂盒，此试剂盒包含1)获得待测主体或对照主体检测样本的方法；幻评估上述待测或对照样本Slit2和/或Slit2受体表达水平的方法；3)比较上述待测样本与对照样本中 Slit2和/或Slit2受体表达水平的方法。依据本发明的具体部分，所测的Slit2的受体可以是 Robol 或 Robo4。实施例l)Slit2在多种人类癌细胞上表达为了探求应用价值，我们检测了不同组织来源的人癌细胞株是否表达Slit2。 图Ia表明Slit2在恶性黑色素瘤A375细胞株、膀胱鳞状癌SCaBER细胞株、成神经细胞瘤SK-N-SH细胞株、小细胞肺癌NCI-H446细胞株、结肠癌LoVo细胞株、膀胱移行细胞癌 T24细胞株、乳腺癌ZR-75-30细胞株、涎腺腺样囊性癌Acc_2和Acc-M细胞株、肝细胞癌 SMMC-7721细胞株及横纹肌肉瘤A673细胞株上都有表达。但是，Slit2在肺癌A549、宫颈上皮腺癌HeLa、乳腺癌MCF-7及原始肾细胞癌786-0细胞株上都不表达。Slit2在多种肿瘤细胞株上表达与RT-PCR方法检测到的Slit2在前列腺癌上表达的结果相一致。此外，图Ib表明Slit2在人恶性黑色素瘤、结直肠粘液腺癌、乳腺浸润性癌及肝细胞癌中都有表达。值得注意的是，在乳腺癌的切片中，肿瘤细胞及血管密集的地方 Slit2的染色比肿瘤细胞及血管稀少的地方强(图lc)。人肝细胞癌中也有类似的表达模式，但在结直肠腺癌中没有(结果未显示)。2)Slit2/Ripl-Tag2双转基因鼠的构建图加所示为CMV启动子驱动下融合了 Flag片段的人Slit2基因的表达质粒构建图。用此表达载体建立了 3株Slit2转基因纯和小鼠。通过点杂交(图2b)和Southern 印记(图2c)方法证实了转基因小鼠中人Slit2基因的表达，免疫印迹方法确证了人Slit2 蛋白水平的表达(图2d)。利用抗Flag的单抗(M2)通过Western免疫印迹和PCR方法分别在蛋白水平和DNA水平检测到了胰腺组织裂解液Flag标记分子的表达(图2e_f)。这些结果确证了表达Slit2的转基因小鼠的成功建立。图2g (上行左侧)显示正常C57小鼠胰岛不表达Slit2，而在12周龄Ripl_Tag2转基因小鼠胰岛中表达Slit2(图2g，上行右侧)。用连续切片进行免疫组化结果显示Slit2 的表达部位(图2g，上行右侧)与胰岛素的表达部位重叠(图2g，上行中间)。此结果表明 Slit2在胰腺β细胞成瘤过程中被上调表达。此外，连续切片进行的免疫组化结果显示，在 Ripl-Tag2转基因小鼠中，Robol和vWF在血管内皮细胞上表达而不表达于胰腺β细胞上 (图2g，下行)。为了进一步研究Slit2在肿瘤生长上的功能，我们将Slit2转基因小鼠与 Ripl-Tag2转基因小鼠杂交产生Slit2/Ripl-Tag2双转基因鼠。与同龄10周、13周 Ripl-Tag2小鼠相比，Slit2/Ripl-Tag2小鼠的Slit2蛋白水平明显增高(图2h)，表明杂交小鼠Slit2/Ripl-Tag2中Slit2的成功过表达。这些结果提示胰腺β细胞被诱导分泌 Slit2蛋白，通过旁分泌方式作用于稳定表达于胰腺血管内皮细胞上的Robol受体，从而激活胰岛素瘤生长的信号通路。
3) Slit2促进胰腺瘤生长图3a显示胰腺中血性胰岛的数目在9周龄Slit2/Ripl_Tag2小鼠中明显高于 Ripl-Tag2小鼠。图3b和图3c显示10周龄、12周龄Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰岛素瘤的数目和体积都明显高于Ripl-Tag2小鼠。然而，两种小鼠外周血白细胞和肿瘤浸润白细胞数目没有明显差异(图3d)。图!Be显示用带有FITC的Lectin蛋白标记血管后Slit2/Ripl_Tag2 小鼠血性胰岛内部有更为丰富致密的新生血管。图3f显示Slit2/Ripl-Tag2小鼠有更明显的血管膨大和微出血现象。通过免疫组化统计血管密度，结果显示Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰岛素瘤内部的血管密度明显高于Ripl-iTagZ小鼠(图3g)。此外，Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰岛素瘤的增生指数明显高于Ripl_Tag2小鼠(图池)，而凋亡指数明显低于Ripl_Tag2 小鼠(图3i)。这些结果表明Slit2过表达能够促进Ripl-Tag2小鼠胰岛素瘤的新生血管形成和肿瘤生长。Slit2过表达促进胰腺瘤的淋巴道转移Ripl_Tag2是一种自发产生胰腺瘤的转基因小鼠，其肿瘤发育有明显的阶段性 正常胰岛阶段、血性胰岛阶段、肿瘤阶段和浸润性肿瘤阶段；绝大多数Ripl_Tag2小鼠在 14-15周龄左右死于胰高血糖症。对大量14周龄的Ripl-Tag2和Slit2/Ripl_Tag2小鼠进行了解剖观察，发现在Ripl_Tag2小鼠(32只)中，只有2只有肠系膜淋巴结转移，1只肠壁转移；在Slit2/Ripl-Tag2小鼠(50只)中，有17只肠系膜淋巴结转移，8只肠壁转移(图 4i)。Chi-square检验肠系膜淋巴结转移率有显著差异。另外心、肝、脾、肺、肾等组织均无转移。而在此阶段，Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2两种小鼠的胰腺瘤的体积并无明显差异(图4j)。用LYVE-I的抗体标记淋巴管内皮细胞，免疫组化分析晚期胰腺瘤的淋巴管生成情况，结果表明相对于同期Ripl_Tag2小鼠，Slit2/Ripl-Tag2小鼠有更多的肿瘤相关淋巴管生成(图5a_c)。免疫荧光共标记LYVE-I和Robo 1，发现淋巴管内皮细胞上有Robol表达(图5d)。以上结果表明Slit2过表达能促进淋巴管生成和淋巴道转移。重组表达的Slit2蛋白能促进淋巴内皮细胞体外迁移和管腔形成用免疫荧光的方法检测人原代淋巴内皮细胞的标志蛋白和Robol的表达定位。可以看到，两个标志蛋白Lyve-I和都呈阳性，Lyve-I主要表达在膜上，Prox-I作为转录因子定位在核中。所用的Robol的抗体为特异识别Robol而不识别Robo2-4的单克隆抗体R4，结果显示Robol主要定位于细胞膜上，胞浆中也有少许表达。此结果表明此原代淋巴内皮细胞能够表达Slit2的受体Robol。应用Boyden Chamber方法检测重组表达的Slit2. 1蛋白对淋巴内皮细胞的迁移有无功能。用VEGF-C蛋白作为阳性对照。图5i-j显示Slit2. 1蛋白在200pM以上浓度能促进淋巴内皮细胞的迁移；过量的阻断Slit2与Robol结合的抗Robol单克隆抗体R5能抑制Slit2诱导的淋巴内皮细胞的迁移。应用Matrigel方法检测Slit2. 1蛋白对淋巴内皮细胞的体外管腔形成能力有无功能，同样也用VEGF-C作为阳性对照。图5g-h显示Slit2. 1蛋白在IOnM以上浓度能促进淋巴管腔形成；过量单克隆抗体R5能抑制Slit2介导的淋巴内皮管腔形成。这些结果表明 Slit2通过与其受体Robo结合从而促进了淋巴内皮细胞的迁移和管腔形成。Slit2是癌症病人淋巴道转移的诊断物质
上述结果提示Slit2可能成为预测癌症淋巴道转移的标志蛋白。应用病人肿瘤样 本进行的Slit2免疫组化检测的结果支持了这一观点。图8a显示了免疫组化实验中所用 的各种抗体的识别蛋白的特异性。针对Slit2的单克隆抗体Sl能够识别Slit2蛋白的全 长和N端。9E10识别融合于Slit2蛋白的c-myc片段。针对Slit2的另一单抗S3可识别 Slit2蛋白的全长和C端片段。Sl也识别人的Slitl和Slit3蛋白(图8a)。因此，Sl可 用来检测各种Slit蛋白。我们用Sl对955例病人肿瘤样本进行免疫组化，结果有742例 Slit表达呈阳性(表1，图8b-d)。更为重要的是，在淋巴道转移性的结肠癌、胃癌和肺癌 中，Slit的表达显著高于非转移性的同种肿瘤(表2，图8c-d)。表1 用Sl单抗进行免疫组化检测病人肿瘤样本Slit蛋白的表达癌症类型样本例数 Slit阳性例数 ％ Slit阳性率结直肠癌31425681.53胃癌3 23772.7食管癌898696.63肺鳞状细胞癌433888.37肺腺癌99100肝细胞癌534584.91乳腺浸润性导管癌 955557. 89膀胱癌261661.54表2 用Sl单抗进行免疫组化检测淋巴道转移和非转移病人肿瘤样本中Slit蛋 白的表达% Slit表达阳性率(淋% Slit表达阳性率(非巴道转移样本中Slit转移样本中Slit阳性样癌症类型 样本总例数 阳性样本数/淋巴道本数/非转移样本数)转移样本数)结直肠癌15556.06(37/66)25.84(23/89)胃癌6944.64(25/56)23.08(3/13)肺癌4945.45(10/22)29.63(8/27)上述实例清楚显示了 Slit-Robo信号通路在调节淋巴管形成和肿瘤淋巴道转移 上的重要功能。据此，能够调节或干扰Slit-Robo相互作用的试剂、技术和方法都可以用来 治疗Slit-Robo信号介导的淋巴管形成和/或淋巴道转移相关的疾病。举例来说，Robo蛋白片段(如Robo胞外区或其融合蛋白hRobo-Fc等)或针对 Slit、Robo的抗体都可用来调节干扰Slit-Robo的蛋白结合，从而提供了针对Slit-Robo信 号的治疗相关疾病的方法。据此，Robo蛋白的片段如胞外片段可用作诱馆蛋白与Slit配 体结合，从而阻止或减少Slit蛋白与Robo受体结合。除了治疗方面的应用，Slit和Robo 的蛋白片段、特异性的抗体还可以作为标记分子用来诊断或预测疾病。例如，可以应用针对 Slit或Robo的抗体来检测肿瘤病人Slit和/或Robo蛋白的表达水平，从而评估是否有淋巴道转移。本发明的一些具体部分有关基于Slit和/或Robo蛋白的试剂及其在治疗、诊断、 预测Slit-Robo信号通路相关疾病的方法。这些具体部分的实施例描述如下。(7)人Robol胞外IgG样区段与人免疫球蛋白Fc区段的融合蛋白(hRobo-Fc)的构建(7a)人免疫球蛋白Fc区段的克隆以购自US Biological公司的携带人免疫球蛋白基因恒定区的pAc-k-CH3质粒为模板，选择其重链C末端最后687个碱基的部分，用hFc forward和hFc reverse作为引物， 通过PCR制备人免疫球蛋白Fc区段。引物hFc forward和hFc reverse的序列如下hFc forward 5' -AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3，； [SEQ IDNO 1]hFc reverse :5，-CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3，。[SEQ IDNO :2]将获得的PCR产物以NotI和BglII双酶切，然后连接到同样经NotI和BglII双酶切的PVL1393载体(BD Pharmingen公司)，构建得到携带人免疫球蛋白Fc区段的杆状病毒表达质粒pVL1393-hFc。经测序确认此质粒的Fc区段DNA序列符合设计，没有突变。(7b) Robol基因区段的克隆以购自Origene公司的人Robol cDNA (核酸序列号NM_0(^941. 2，Origene公司货号SC109739)为模板，选择其细胞外包括五个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第1621位碱基，用Robol forward和Robol reverse作为引物，通过PCR制备Robol基因区段cDNA序歹lj。弓I物Robol forward禾口 Robol reverse的序列如下Robol forward 5' -GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ IDNO 3]Robol reverse :5，-CTATAAGCGGCCGCCAATGTAAGCACTCCATGTT-3，；[SEQ IDNO 4]将获得的PCR产物以^CbaI和NotI双酶切，然后连接到同样经)(bal和NotI双酶切制备的pVL1393-hFc质粒，构建得到携带人Robol基因胞外五个Ig样结构域和人免疫球蛋白Fc区段的融合蛋白表达质粒pVL1393-hRobo-FC。经测序确认此质粒的Robol基因片段DNA序列符合设计，没有突变，Robol基因片段与hFc区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。(7c) hRobo-Fc融合蛋白的表达与纯化实施例I 利用质粒大抽试剂盒^iagen公司)对pVL1393-hRobo-Fc进行大量提取，纯化方法根据Qiagen公司提供的QIAGEN Plasmid Midi Kit使用手册。 pVL1393-hRobo-Fc质粒纯化好之后，根据BD Pharmingen公司的杆状病毒表达系统使用手册，制备携带hRobo-Fc基因序列的重组杆状病毒。进行噬斑效价测定并对筛选到的重组病毒扩增，感染Sf9昆虫细胞(使用 Invitrogen公司IPL-41培养基培养于摄氏27°C )进行hRobo-Fc融合蛋白的表达。利用辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG (Santa Cruz Biotech)对hRobo-Fc融合蛋白的表达进行检测，确认其成功表达(图7)，还原条件下hRobo-Fc融合蛋白为单体，分子量约为8证(1。 根据BDWmrmingen公司的杆状病毒表达系统使用手册，利用携带hRobo-Fc基因序列的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，进行hRobo-Fc融合蛋白的大量表达。收集细胞培养液，利用ftOteinA亲和层析介质(GE Healthcare公司)纯化hRobo-Fc融合蛋白，纯化方法根据 GE Healthcare 公司提供的 nProtein A Sepharose 4Fast Flow 使用手册。从 1 升感染携带hRobo-Fc基因序列的重组杆状病毒的Sf9细胞培养液中，可以纯化得到数毫克级的 hRobo-Fc融合蛋白。对所得到的hRobo-Fc进行功能检测发现，hRobo-Fc能与hSlit2蛋白特异性结合(图6A)，而且针对Robol结构中的第一个Ig样结构域的单克隆抗体R5，能特异抑制hRobo-Fc与hSlit2的结合(图6B)，充分说明了由本发明所得到的Robo基因片段融合蛋白具有良好的生物活性和特异性。以上述具体实施例为例，充分说明了本发明的具体实施方案和效果的可行性及有效性。我们已基于此发明制备了多种涉及不同种系(如小鼠Robo基因)、不同区段(如包含1个Ig样结构域的人Robo胞外区段)、不同融合蛋白(如GST)和不同蛋白表达系统 (如CHO-dhfr 二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞表达系统)的Robo基因片段融合蛋白，为进行Slit-Robo信号通路参与的肿瘤和炎症等疾病相关的药物开发奠定了坚实的基础。其中部分实施例描述如下。实施例II 利用杆状病毒表达系统，进行包含小鼠Robol基因胞外区和小鼠免疫球蛋白1 区段的融合蛋白(mRobo-Fc)的大量表达。1.小鼠免疫球蛋白Fc区段的选取和克隆以小鼠IgGa单克隆抗体基因为模板，选择其重链C末端最后720个碱基的部分， 用mFc forward和mFc reverse作为引物，通过PCR制备免疫球蛋白Fc区段。引物mFc forward 禾口 mFc reverse 的序列如下mFc forward 5' -GCACTCTAGACTTGAGCCCAGCGGGCCCAT-3，； [SEQ ID NO 5]mFc reverse :5，-CTGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACCGGG-3，； [SEQ ID NO 6]将获得的PCR产物以XbaI和BamHI双酶切，然后连接到同样经XbaI和BamHI双酶切的PVL1393载体(BD Pharmingen公司)，构建得到携带小鼠免疫球蛋白Fc区段的杆状病毒表达质粒pVL1393-mFc。经测序确认此质粒的Fc区段DNA序列符合设计，没有突变。2.小鼠Robol基因区段的选取和克隆以小鼠Robol cDNA(核酸序列号NM_019413)为模板，选择包括其五个Ig样结构域和3个Fibronectin III结构域的区段，从起始密码子ATG直到第M45位碱基，用 mRoboIforward和mRobol reverse作为引物，通过PCR制备小鼠Robol基因区段cDNA序列。弓I物 mRobol forward 禾口 mRobol reverse 的序列如下mRobol forward :5，-ATCGAGATCTATGATCGCGGAGCCTGCTCACT-3，[SEQ IDNO 7]mRobol reverse 5' -GCTCTCTAGACGCTGCCACCTCCACACTGTA-3，[SEQ ID NO 8]将获得的PCR产物以BglII和XbaI双酶切，然后连接到同样经BglII和XbaI双酶切制备的pVL1393-mFc质粒，构建得到融合蛋白表达质粒pVL1393-mR0b0-Fc。经测序确认此质粒的小鼠Robol基因片段DNA序列符合设计，没有突变，小鼠Robol基因片段与mFc 区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。利用质粒大抽试剂盒(Qiagen公司)对pVL1393-mR0b0-Fc进行大量提取，纯化方法根据 Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手册。pVL1392-mRobo_Fc 质粒纯化好之后，根据BD Pharmingen公司的杆状病毒表达系统使用手册，利用携带mRobo-Fc 基因序列的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，进行mRobo-Fc融合蛋白的大量表达。收集细胞培养液，利用ftOtein A亲和层析介质(GE Healthcare公司)纯化mRobo-Fc融合蛋白， 纯化方法根据GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow使用手册。
实施例III 利用杆状病毒表达系统，进行包含人Robol基因胞外区(不同长度区段)和人免疫球蛋白Fc区段的融合蛋白的大量表达。1.人免疫球蛋白Fc区段的选取和克隆以人免疫球蛋白基因pAc-k-CH3(US Biological公司)恒定区为模板，选择其重链C末端最后687个碱基的部分，通过PCR制备免疫球蛋白Fc区段。引物序列如下hFc forward :5，-AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3，[SEQ IDNO 9]hFc reverse 5‘-CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3‘[SEQ ID NO 10]将获得的PCR产物以NotI和BagII双酶切，然后连接到同样经NotI和BagII双酶切的PVL1393载体(BD Wiarmingen公司)，构建得到杆状病毒表达质粒pVL1393_hFc。经测序确认此质粒的Fc区段DNA序列符合设计，没有突变。2.人Robol基因区段的选取和克隆以人Robol cDNA(核酸序列号NM_0(^941. 2，01^861^公司货号5(109739)为模板， 选择包括其四个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第1342位碱基，通过PCR制备基因区段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 11]Robo reverse2 :5，-CATTATGCGGCCGCCATCTGTAACTTCCAAATAT-3，[SEQ IDNO 12]以人Robol cDNA(核酸序列号NM_0(^941. 2，01^861^公司货号5(109739)为模板， 选择包括其三个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第1051位碱基，通过PCR制备基因区段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 13]Robol reverse3 5 ‘-ATAATAGCGGCCGCGAGGTTCTTGAACAGTCAGAGTA-3 ‘ [SEQ ID NO: 14]以人 Robol cDNA(核酸序列号 NM_0(^941. 2，Origene 公司货号 SC109739)为模板，选择包括其两个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第8 位碱基，通过PCR制备基因区段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 15]Robol reverse4 :5，-ATAATTGCGGCCGCCATCCACAGTTACTGCCAAGTTACT-3，[SEQ ID NO 16]以人 Robol cDNA(核酸序列号 NM_0(^941. 2，Origene 公司货号 SC109739)为模板，选择包括其一个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第5 位碱基，通过PCR制备基因区段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 17]Robol reverse5 5，-TTCTATGCGGCCGCAAGGGTTTTGTCTGAAGTCAT-3，[SEQID NO 18]将上述各步骤获得的PCR产物以^CbaI和NotI双酶切，然后连接到同样经^CbaI和 NotI双酶切制备的pVL1393-hFc质粒，构建得到携带人Robol基因胞外不同区段和人免疫球蛋白Fc区段的融合蛋白表达质粒。经测序确认此质粒的Robol基因片段DNA序列符合设计，没有突变。不同区段Robol基因片段与hFc区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。利用质粒大抽试剂盒(Qiagen公司)对pVL1393-hRobo-FC进行大量提取，纯化方
18法根据 Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手册。pVL1392-hRobo_Fc 质粒纯化好之后，根据BD Pharmingen公司的杆状病毒表达系统使用手册，利用携带hRobo-Fc 基因序列的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，进行hRobo-Fc融合蛋白的大量表达。收集细胞培养液，利用ftOtein A亲和层析介质(GE Healthcare公司)纯化hRobo-Fc融合蛋白， 纯化方法根据GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow使用手册。实施例IV 利用二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr)表达系统， 进行包含人Robol基因胞外区(不同长度区段)和人免疫球蛋白！^区段的融合蛋白的大量表达。1.人Robol基因区段的选取和克隆以人Robol cDNA(核酸序列号NM_0(^941. 2，01^86加公司货号5(109739)为模板， 选择包括其五个Ig样结构域的区段，从起始密码子ATG直到第1760位碱基，通过PCR制备基因区段cDNA序列。引物序列如下Robol fl760 :5，-GGCCAAGCTTATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ ID NO 19]Robol rl760:5，-TCCACGGAATTCAAATTTGGTTGCC-3，[SEQ ID NO 20]将上述各步骤获得的PCR产物以HindIII和EcoRI双酶切，然后连接到同样经 HindIII和EcoRI双酶切制备的pEGFP-附载体(BD Pharmingen)，构建得到携带人Robol 基因胞外五个Ig样结构域的质粒pEGFP-Nl-hRobo。经测序确认此质粒的Robol基因片段 DNA序列符合设计，没有突变。2.人免疫球蛋白Fc区段的选取和克隆以人免疫球蛋白基因pAc-k-CH3(US Biological公司)恒定区为模板，选择其重链C末端最后714个碱基的部分，通过PCR制备免疫球蛋白Fc区段。引物序列如下hFc forward2 :5，-AACCGTGAATTCCGTGGACAAGAGAGTTGAGCC-3，； [SEQ IDNO 21]hFc reverse2 5' -TACGGGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG-3，[SEQ ID NO 22]将获得的PCR产物以EcoRI和Mil双酶切，然后连接到同样经EcoRI和Mil双酶切的pEGFP-Nl-hRobo质粒，构建得到携带人Robol基因胞外五个Ig样结构域和人免疫球蛋白Fc区段的质粒pEGFP-Nl-hRobo-Fc。经测序确认此质粒的Fc区段DNA序列符合设计，没有突变。不同区段Robol基因片段与hFc区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。将获得的pEGFP-Nl-hRobo-Fc质粒以HindIII和Mil双酶切，然后连接到同样经HindIII和Mil双酶切的p3CI-dhfr载体，构建得到携带人Robol基因胞外五个Ig样结构域和人免疫球蛋白Fc区段的质粒p3CI-dhfr-hRobo-FC。经测序确认此质粒不同区段 Robol基因片段与hFc区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。利用质粒大抽试剂盒^iagen公司)对p3CI-dhfr-hRobo-Fc质粒进行大量提取，纯化方法根据Qiagen公司提供的QIAGEN Plasmid Midi Kit使用手册。 p3CI-dhfr-hRobo-Fc质粒纯化好之后，根据hvitrogen公司的Lipofectin使用手册，感染CHO-dhfr细胞，筛选高表达克隆。收集细胞培养液，利用ftOtein A亲和层析介质(GE Healthcare公司)纯化hRobo-Fc融合蛋白，纯化方法根据GE Healthcare公司提供的 nProtein A Sepharose 4 FastFlow 使用手册。实施例V 利用杆状病毒表达系统，进行包含人Robol基因胞外区和人免疫球蛋白Fc区段的融合蛋白的大量表达。1. pVL1393-hRobol-Fc 的构建以实施例IV中得到的p3CI-dhfr-hRobo-FC质粒为模板，通过PCR制备人免疫球蛋白Fc区段。引物序列如下Robol forward' :5，-AGGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ IDNO 23]hFc reverse3 5' -TACGGGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG-3，[SEQ ID NO 24]将获得的PCR产物以^CbaI和NotI双酶切，然后连接到同样经)(bal和NotI双酶切的PVL1393载体(BD Wiarmaingen)，构建得到携带人Robol基因胞外五个Ig样结构域和人免疫球蛋白Fc区段的质粒pVL1393-hRobo-FC。经测序确认此质粒不同区段Robol基因片段与hFc区段的翻译阅读框一致，起始密码子和终止密码子位置正确。 2. hRobo-Fc融合蛋白的表达与纯化利用质粒大抽试剂盒(Qiagen公司)对pVL1393-hRobo-FC质粒进行大量提取，纯化方法根据 Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手册。pVL1393-hRobo_Fc 质粒纯化好之后，根据BD Pharmingen公司的杆状病毒表达系统使用手册，利用携带 hRobo-Fc基因序列的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，进行hRobo-Fc融合蛋白的大量表达。收集细胞培养液，利用ftOtein A亲和层析介质(GE Healthcare公司)纯化mRobo-Fc 融合蛋白，纯化方法根据GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow 使用手册。实验方法RT-PCR 和 Northern 杂交原代HUVECs 细胞培养如文献(Geng，J.-G. et al. Nature 343 :757-760(1990)) 所述。半定量 RT-PCR 实验方法如文献(Ma，Y. -Q. and Geng, J. _G. J. Immunol. 165 558-565 QOOO))所述。本研究中所用引物如下human Robol sense (+4440) 5 ‘ -CCT ACA CAG ATG ATCTTC C_3 ‘ (SEQ ID NO :25)，antisense (-4956) 5 ' -CAG AGG AGC CTG CAG CTC AGC TTTCAG TTT CCT C_3 ' (SEQ ID NO :26) ；human Slit2 sense (+3611) 5' -GGT GAC GGA TCCCAT ATC GCG GTA GAA CTC-3' (SEQ ID NO :27)， antisense (-4574) 5' -GGA CAC CTCGAG CGT ACA GCC GCA CTT CAC-3' (SEQ ID NO: 28) ；human β -actin sense (+1)5' -ATGGAT GAT GAT ATC GCC GC-3' (SEQ ID NO :29)， antisense (-1127) 5' -CTA GAA GCA TTTGCG GTG G_3' (SEQ ID NO :30)。使用 32P 标记的 Slit2或Robol cDNA片段检测A375细胞和原代HUVECs细胞总RNA。抗体的制备，免疫印迹和免疫染色Slit2_GST(包括人Slit2第57位到207位碱基)和Robol-GST融合蛋白(包括大鼠Robol第1位到168位碱基或第961位到1217位碱基)构建入pGEX_4T_l载体(购自Amersham Pharmacia Biotech公司)。以此融合蛋白为抗原免疫兔或小鼠用以制备 anti-Slit2或anti-Robol多克隆抗体和单克隆抗体。免疫组织化学实验方法如文献(Liu， L. -P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 :281-291 (2001))所述。Slit2和RoboN蛋白的分离纯化稳定表达全长人Slit2蛋白(羧基端融合myc标签)的人胚肾四3细胞系 Slit2/293 建系方法如文献(Li, H. S. et al. Cell 96:807-818(1999) ；Wang, K. -H. etal.Cell 96 :771-784(1999))所述。收集细胞培养液，利用抗myc标签的单抗9E10 ( lmg/ ml of Affi-Gel 10 ;Bio_Rad)，使用亲和色谱法纯化Slit2蛋白。Slit2蛋白的银染和免疫印迹方法如文献(Ma, L. et al. J. Biol. Chem. 269 :27739-27746(1994))所述。稳定表达Robol胞外区蛋白(羧基端融合血红素凝结素hemoagglutinin标签)的人胚肾 293 细胞系 RoboN/293 建系方法如文献(Li，H. S. et al. Cell 96 :807-818(1999)； Wang, K. -H. et al.Cell 96 :771-784 (1999))所述。收集细胞培养液，使用偶联抗HA单抗 HAll (购自BAbCO公司)的亲和柱纯化RoboN蛋白。Boyden Chamber 实验使用购自Neuro Probe公司的48孔Boyden Chamber进行细胞迁移实验 (Terranova, V. P. et al. J. Cell. Biol. 101 :2330-2334(1985))。实验前，待测细胞在 EBM/2%FBS饥饿4-8小时(根据细胞状态而定)。实验时，8um孔径的聚碳酸酯膜在1 %明胶中浸泡45-60分钟。在明胶中浸泡45-60分钟。Chamber下层中加入Slit2或bFGF (购自Sigma公司)；Chamber上层加入一定密度的细胞悬液(HUVECs、rRobo 1/293和V/^293细胞于FCS/M199培养液中，密度为500000Cell/ml)。细胞迁移的环境为37°C，孵育时间为4小时。待迁移结束，小心从Chamber上取下膜，并去除膜上层未迁移的细胞，膜的上层向下浸泡在4%多聚甲醛中4°C固定过夜，然后PBS清洗膜一次并于0. 5%结晶紫/PBS中染色(室温4-6小时)，PBS洗去表面浮色，在显微镜下观察并统计迁移的细胞数目。Directional Migration ^^t蛋白梯度使用文献(Hopker，V.H. et al. Nature 401 :69-73 (1999))提到实验方法产生。压缩空气钢瓶为压力注射器提供气压，刺激器发出一定频率的脉冲信号，控制压力注射给药。使用尖端直径约为1微米玻璃毛细管给药，每次喷入0. 15 μ M/p i CO litre Slit2 或 1 μ Μ/ρicolitre bFGF。24 孔板内加入 200ul 的 Matrigel (购自 Becton Dickinson Labware)，将待测细胞加入到铺有Matrigel的孔内，在37°C 5% CO2培养箱中温育。玻璃毛细管调整至其与细胞距离100微米，使用连接在Olympus 1X70显微镜上的CXD照相机 (JVC)将图像纪录并保存在电脑中，使用NIH Image或其他合适软件分析在任意时间点的细胞迁移情况。Tube Formation Assay96孔板和Matrigel事先在冰上预冷。每孔加入IOOul的Matrigel (冰上无菌操作)，37°C放置 30 分钟(Malinda，K. Μ. et al.，Identification of Iaminin α 1 and β 1 chain peptidesactive for endothelial cell adhesion, tube formation and aortic sprouting, FASEB J. 13 :53-62 (1999))。待其凝固成胶状后，以 130000Cell/ml 的细胞浓度将HUVEC细胞稀释在M199/2% FCS溶液中，加IOOul的细胞悬液到铺有Matrigel的96孔板中。细胞在37°C /5% C02培养12-18小时后，于显微镜下观察拍照并统计网络样结构的长度。Xenograft肿瘤生长实验A375 细胞用购自 Gibco 公司的 Lipofectin 转染并用 400 μ g πιΓ1 的 hygromycin B(购自Sigma公司)筛选。使用Robol、Slit2或tubulin(作为上样对照)的抗体，用免疫印迹的方法验证RoboN/A375_Cl、C2、C3和V/A375细胞。细胞悬浮于DME培液中，在裸鼠腋下皮下注射 0. 2ml 细胞悬液(0' Reilly, M. S. et al.，Endostatin :An endogenousinhibitor ofangiogenesis and tumor growth, Cell 88 :277185 (1997))。对于抗体抑制实验，注射肿瘤细胞的小鼠采取腹腔注射的方式，每次每只裸鼠注射Img的R5或对照IgG2b 抗体，每周注射两次(Muller，A. et al. Nature 410 :50-56 (2001)) 大约 30 到 35 天以后， 裸鼠取血统计血液中白细胞的数目，然后处死裸鼠。测量肿瘤块中的嗜中性粒细胞数目的髓过氧化物酶 MPO 方法如文献(Wang，J. _G. et al. Inflamm. Res. 51 :435-43(2002))所述。Cell Proliferation Assay对数生长期的细胞用胰酶消化，并以5000细胞/毫升悬浮在1640培养液中。将 100微升的细胞悬液加入到96孔板中一孔，放置在37°C、5% CO2培养箱内培养。在不同的时间点，每孔内加入20微升的tetrazolium salt, 37°C放置4小时，再加入100微升的10% SDS/5% isobutanol/孔终止反应。在酶标仪上测量0D570/630值。其他实验如免疫沉淀实验，lectin灌注实验，HE染色和免疫荧光染色同各实验室公认实验方法。本发明将提供如何有效大量制备Robo基因片段融合蛋白的具体技术方案，包括 Robo基因片段、融合蛋白和表达系统的选择等。本发明还可以通过对介导新生血管形成、淋巴管形成和肿瘤淋巴转移的信号通路研究，开发对肿瘤或炎症等疾病的治疗和诊断方法。 如通过特异性抑制Slit-Robo信号通路，破坏Slit蛋白和其受体Robo蛋白的结合，进而抑制新生血管形成、淋巴管形成和肿瘤淋巴转移，为进行Slit-Robo信号通路参与的肿瘤和炎症等疾病相关的药物开发奠定了坚实的基础。虽然本实验已经阐述了少数实施方案，但本领域专业人员知道在不背离本发明范围的条件下此发明设计包含其他实施方案。所以，本发明范围由附加要求保护界定。
权利要求
1.物质在制备用于预防或治疗由Slit蛋白介导的疾病的药物中的应用，所述物质是能调节或阻断Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物，所述疾病与淋巴管形成相关。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物选自针对Slit蛋白的抗体、针对Robo蛋白的抗体、能结合Slit蛋白的Robo蛋白胞外区片段、或Robo融合蛋白。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗体是人源化抗体。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述能结合Slit蛋白的Robo蛋白胞外区片段来源于Robo蛋白的第一个免疫球蛋白样区域。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Robo融合蛋白是Robo-Fc融合蛋白。
9.一种预防或治疗由Slit蛋白介导的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含能调节或阻断Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物，和药学上可接受的药物赋形剂、载体或溶剂，其中所述疾病与淋巴管形成相关。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
11.如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述能调节或阻断Slit蛋白与Robo蛋白相互作用的药物选自针对Slit蛋白的抗体、针对Robo蛋白的抗体、能结合 Slit蛋白的Robo蛋白胞外区片段、或Robo融合蛋白。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
14.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述能结合Slit蛋白的Robo蛋白胞外区片段来源于Robo蛋白的第一个免疫球蛋白样区域。
15.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述Robo融合蛋白是Robo-Fc融合蛋白ο
16.能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA或它们的编码基因的物质在制备用于检测Slit蛋白介导的病症的诊断试剂中的应用，所述检测包括以下步骤(a)从检测目标得到检测样本，利用能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA或它们的编码基因的物质检测单独的Slit或Robo的水平或Slit和Robo两者的水平；(b)从正常人取得样品作为对照，利用能够检测到Slit蛋白或Robo蛋白或它们所对应的mRNA或它们的编码基因的物质检测该样品的单独的Slit或Robo的水平或Slit和Robo 两者的水平；(c)比较(a)和(b)检测到的表达结果，来确定该检测目标是否有Slit蛋白引起的疾病，如果检测样本的Slit或Robo水平高于对照，则表明该检测目标患有所述疾病。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
18.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。
19.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述水平是DNA水平，RNA水平，蛋白水平，或综合上述2者或3者的水平。
20.如权利要求1或16所述的应用或权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述疾病是与Slit-Robo信号传导通路相关的疾病。
21.如权利要求1或16所述的应用或权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述疾病是癌症或与淋巴管形成相关的疾病。
22.如权利要求21所述的应用或药物组合物，其特征在于，所述癌症是转移性癌症。
23.如权利要求21所述的应用或药物组合物，其特征在于，所述癌症是下列癌症之一 结肠癌，胃癌，食道癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，和膀胱癌。
全文摘要
本发明是关于一种预防或治疗Slit蛋白介导的淋巴管形成相关疾病的方法，包括给予某一主体有效剂量的调节或抑制Slit蛋白与Robo蛋白结合的某一药物。一种预防或治疗Slit蛋白介导的疾病的合成药物，包含调节或干扰Slit蛋白与Robo蛋白结合的某种药物。一种预防或诊断Slit蛋白介导的疾病的方法，包括1)获得待测主体的检测样本及检测上述样本中某一Slit2和(或)Robo蛋白的表达水平；2)获得不发生疾病的对照主体的对照样本并检测上述样本中某一Slit和(或)Robo蛋白的表达水平；3)比较1)和2)两种样本中Slit和(或)Robo的表达水平，以获得关于Slit蛋白诱导疾病的相关结果。
文档编号A61K49/00GK102233134SQ201010169208
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者杨小妹, 池姗, 耿建国, 陈铭 申请人:中国科学院上海生命科学研究院