专利名称：用于肿瘤淋巴靶向治疗载体的功能化碳纳米管的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物医药制造领域，涉及肿瘤淋巴靶向治疗新载体，具体涉及一种 用于肿瘤淋巴治疗的主动靶向的新载体-功能化碳纳米管及其制备方法。
技术背景肿瘤临床研究显示，多数上皮源性的恶性肿瘤早期即可发生淋巴道转移，约60% 病人在初诊时已有淋巴转移，故防治肿瘤淋巴途径转移具有重要意义。淋巴道转移与 淋巴管的特殊结构有关。毛细淋巴管的管腔相对较大且不规则，管壁较薄，仅由单层 内皮细胞和极薄的结缔组织构成，当组织癌变时瘤细胞则黏附在内皮外暴露的粘连蛋 白上而易于发生浸润及转移。淋巴化疗(lymphatic chemo therapy)又称淋巴结靶向化疗(lymph node targeted chemotherapy).药物性淋巴结清扫(medicinal lymph node dissection),是利用淋巴系统 具有吞噬人分子物质和微粒的特性，将化疗药与载体共价结合、物理包裹或吸附，改 变药物的药代动力学，保持化疗药物活性，构成淋巴靶向给药系统利用淋巴回流较慢 的特点，通过淋巴靶向给药系统维持局部药物浓度平衡的方式缓释化疗药，使区域淋 巴结内较长时间维持抗癌药物浓度，从而有效杀伤淋巴系统内的肿瘤细胞，还可重新 调整局部淋巴结内的免疫活性，恢复淋巴细胞功能，消灭残存的肿瘤细胞，减少肿瘤 经淋巴途径转移。同时淋巴化疗能控制药物进入血循环，降低化疗副反应的目的。消化道恶性肿瘤治疗原则是以手术为主的综合治疗。术中尽管切断淋巴管，切除 转移的淋巴结，但肿瘤细胞遗漏到腹腔的可能仍然存在，可造成肿瘤复发。尽管新辅 助化疗对降低术后复发具有重要意义，但由于血液流速是淋巴流速的200 500倍，故 静脉化疗、区域动脉化疗、局部植入化疗使药物在体内分响:主要通过血一液转运，而局 部淋巴结中浓度极低。20世纪60年代起，有学者从淋巴管注射水溶剂型抗癌药物治疗 淋巴转移灶，因淋巴管管壁薄而细小不易注射及药物难以到达淋巴转移灶，导致失败。 70年代许多学者提出了利用药物运载系统将抗癌药物连于亲淋巴载体的新剂型AO， 此疗法称为"药物淋巴清扫"。本世纪初研究提示最理想的给药途径应为淋巴管灌注，使高浓度的化疗药物直接进入淋巴系统，自接接触杀伤经淋巴转移的癌细胞。本领域研究认为，淋巴靶向给药体系所选择的药物和结合物，应具各以下几点功 能(l)药物易被包裹或偶联，做成制剂后疗效不降低；(2)药物化学性质稳定；(3)具 有亲淋巴性；(4)具有缓释作用，释放的药物能在靶区提供治疗所需浓度；(5)良好的生 物相容性，无抗原性，毒副反应低；(6)局部刺激性小。理想的淋巴靶向体系还应具有-(l)对肿瘤细胞特异靶向性，容易进入肿瘤细胞内；(2)兼可起到前哨淋巴结导航作用。 目前用于淋巴化疗的药物有丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶吟(MTX)、 环磷酰胺(CTX)、表柔比星(EDR)、博来霉素、顺铂等，还有造影剂、同位素显影剂等。用于淋巴靶向的载体有话性炭、脂质体、硅粒、多糖类、多肤类、单克隆抗体、 牛血清白蛋白(BSA)、 IgG及DNA，磁响应物质(Fe3CX0等。碳纳米管(carbon nanotube, CNT)是日本科学家Iijima于1991年发现的，它是由 碳原子组成的石墨片巻成的无缝、中空的管体，是碳元素除金刚石和石墨外的第三种 稳定存在的晶体结构，其直径为纳米级，长度为纳米至微米级。CNT有2种存在结构， 即单壁碳纳米管(Single -walled carbon nanotubes ， SWCNTs)和多壁碳纳米管 (Multi-walled carbon nanotubes， MWCNTs)。由于CNT特殊的力学、电磁学和化学性能， 因而在物理、化学和材料科学中受到广泛重视。但是在生物医学领域，由于单纯的碳 管不溶于任何溶剂，生物相容性差，没有得到应用。近年研究发现对碳管改性(将有 效化学基团连于管壁)可显著提高CNT的溶解度、稳定性和生物相容性，使CNT在 生物医学领域的运用成为可能。目前碳纳米管在实验肿瘤学领域的研究未见公开报道， 不同理化特性的CNTs对肿瘤细胞的作用特点尚不知晓。发明内容本发明的目的是提供一种用于肿瘤淋巴治疗的主动靶向的新载体，具体涉及一种 用于肿瘤淋巴靶向治疗载体的功能化碳纳米管。本发明功能化碳纳米管能用于肿瘤淋 巴治疗，提高抗肿瘤淋巴转移治疗疗效。本发明的另一目的是提供所述的功能化碳纳米管的制备方法。本发明的目的通过下述技术方案实现通过测定肿瘤的毛细淋巴管间隙和窗孔的大小；制备相应粒径的功能化修饰碳纳 米管；使用功能化碳纳米管吸附特定的药物，携带进入肿瘤淋巴系统进行释放，达到杀伤肿瘤的有效浓度，实现实体肿瘤淋巴化疗目的。碳纳米管(carbonnanotube， CNT)是普通碳纳米管在经过偶氮二异丁腈(AIBN) 改性后，经碱性条件制成的水溶性碳纳米管，所述的功能化碳纳米其粒径与相应肿瘤 毛细淋巴管间隙和窗孔的大小相应，平均管长大于lPm，管径在30 60nm之间，具备 特殊的淋巴趋向性。CNTs改性的方法有许多种，如酸氧化法、氟化法、氯化法等，修饰的部位主 要是在端口或侧壁。改性后的CNTs对生物体毒性作用小，相容性好，无免疫原性，其 自身稳定性强，具有独特的管腔样结构和细胞穿透性，表面积大，吸附能力强，可以 与许多功能基团相结合，如生物活性多肽、蛋白分子、DNA核酸和药物等，具备理想 生物载体的潜质。本发明通过下述步骤1. 利用透射或者扫描电镜进行观察、检测，进而利用软件测量、统计肿瘤毛细淋巴管 的裂隙、窗孔、破口的内径分布范围；2. 应用CVD方法制备与相应肿瘤毛细淋巴管间隙和窗孔的大小相应粒径的多壁碳纳 米管(MWNTs)，将多壁碳纳米管与过氧化苯甲酰(BPO)及与偶氮二异丁腈(AIBN) 进行化学反应生成AIBN改性的MWNTs，再在碱性条件下水解制备水溶性碳管；3. 在水域超声器中将水溶性的、AIBN改性的MWNTs与化疗药物混合进行物理吸附， 所述的化疗药物可选自5-氟尿嘧啶或吉西他宾；4. 通过体外B超、CT等辅助设备定位后进行肿瘤穿刺，将已混合化疗药物且具特定 粒径的MWNTs注入实体肿瘤内，依托肿瘤自身的淋巴回流系统进行药物播散；携 药物MWNTs在外周淋巴管内开始解附，并逐步达到杀伤肿瘤的有效浓度，起到淋 巴化疗的作用。本发明经实验证实，所述的功能化碳纳米管吸附药物后在淋巴系统及血浆内解附， 解附能力良好，可携带药物进行淋巴化疗，具有良好的淋巴趋向性，淋巴化疗疗效良 好。
图l:胰腺癌毛细淋巴管通透性透射电镜图片，其中，l为血管内皮细胞，2为基底膜，3为周细胞，畴为内皮细胞间裂隙，》为 窗孔，标尺为1微米；图中可见内皮细胞菲薄多孔，基底膜菲薄疏松，周细胞连接松散，裂隙明显，窗孔多见，裂隙10-20纳米，窗孔30-50纳米。 图2:多壁碳纳米管透射电镜图片。 图3:水溶性功能修饰后多壁碳纳米管。 图4:透射电镜显示碳纳米管进入Bx-PC3胰腺癌细胞内。图5:碳纳米管对5-氟尿嘧啶吸附能力，显示随着给药量的增加吸附量的变化关系。 图6:碳纳米管对吉西他宾吸附能力的测定，显示随着给药量的增加吸附量的变化 关系。图7:换液次数与累计释放率之间的关系。 图8:换液次数与累计释放率之间的关系。图9:水溶性功能化多壁碳纳米管注入SD大鼠爪垫皮下效果图。 图10: 24小时后SD大鼠腦窝淋巴结解剖图。图ll:胭窝淋巴结病理切片，HE染色。 图12:裸鼠胰腺癌淋巴道转移模型。图13:接种Bx-PC3胰腺癌细胞株5周后，LN内可见肿瘤细胞。 图14:碳纳米管吸附吉西他滨局部皮下注射后，胭窝LN内可见碳纳米管以及坏死 的肿瘤细胞。图15:功能化碳纳米管淋巴化疗疗效评估试验结果。图16:对照组凋亡示意图。图17:吉西他滨静脉注射组凋亡示意图。图18:碳纳米管-吉西他滨皮下注射组凋亡示意图。
具体实施例方式实施例1 测定肿瘤毛细淋巴管间隙和窗孔的大小1. 选取不同病理类型，本实施例以导管腺癌为例，选取不同病程胰腺癌病理标本io例；2. 取样固定每例标本[A]肿瘤中心部位、[B]边缘部位、[C]瘤旁组织、[D]正常胰 腺，各取5-8块lmmi组织，固定液固定(4摄氏度)；3. 制片电镜室包埋制作电镜切片；4. 观察记录透射电镜下观察记录胰腺肿瘤毛细淋巴管形态，血管内皮细胞形态、厚度，内皮细胞间隙、窗孔、破口等.拍摄不同放大倍数电镜照片；5.观察测量与统计采用Image pro plus 5.2图像分析软件分析测量电镜照片，分析测量胰腺肿瘤毛细淋巴管形态，血管内皮细胞形态、厚度，内皮细胞间隙内径、窗孔内径、破口内径等。图1显示了 ABC三组各形成毛细淋巴管内皮细胞列200条左右，内皮细胞间隙测量300个以上，窗孔测量300个以上，破口20个以上，图中可见内皮细胞菲薄多孔，基底膜菲薄疏松，周细胞连接松散，裂隙明显，窗孔多见，裂隙平均10-20nm，窗孔平均30-50nm。实施例2制备相应粒径的功能化修饰碳纳米管 试剂与原料1. 多壁碳纳米管(MWNTs):由CVD方法制备，购自深圳纳米港。纯度〉99%,平均管 长大于1 u m，管径在30 60nm之间；2. 过氧化苯甲酰(BPO):化学纯，北京金龙化学试剂有限公司，用氯仿重结晶3. 偶氮二异丁腈(AIBN):化学纯，上海试四赫维化工有限公司BPO (AIBN)与MWNTs的溶液反应典型反应在100ml三颈瓶中加入20mg MWNTs和20ml甲苯，超声5min，接通冷凝 水，通氮气半小时，搅拌下升温至90'C。另称取一定量的BPO溶解于一定量的甲苯中， 除氧完毕后加入反应体系，在9(TC反应2小时。反应结束后，用甲苯洗去未反应的BPO， 置入真空烘箱干燥过夜。最终产物为黑色固体。 反应式如下(PhC00)2 Toluene 2Ph, + 2C02 卯。cn Ph'十MWNTs MWNTs-(Ph)n90oC同样实验方法，将BPO换成AIBN进行反应，反应温度降至75。C，最终得用AIBN改性 的碳管。反应式如下CH3 CH3 CH3i i Toluene 'CH3— C — N =N — CCH3 -" 2 CH3— C+ N2I I 750C 1CN CN CNCH3 CH3I Toluene I CH3— C + MWNTs-> MWNTsi pCH3 )n1 750CCN CNAIBN改性的MWNTs在碱性条件下水解制备水溶性碳纳米管反应式如下CH3 CH3 KOH/ETOHMWNTs~e f>CH3 )n------ MWNTs"十「-CH3 )n1 850CCN COOH在100ml圆底烧瓶中，将0. 5g改性碳管(用naibn/nMWNTs-10改性的碳管)超声 分散于50mlK0H的乙醇溶液，浓度为lmol/L，通冷凝水，搅拌下升温至85并开始回流， 回流下反应7小时。反应结束后，用乙醇洗去K0H，抽滤后得水解产物，置入真空烘箱 干燥过夜。同上述实验方法，将用naibn/nMWNTs=50改性的碳管进行水解反应。实施例3功能化碳纳米管与抗肿瘤药物吸附及解附能力的试验 1.碳纳米管对5-氟尿嘧啶吸附能力的测定a) 分9个实验组，每个实验组6例样本；b) 分别称取5-氟尿嘧啶5mg、 10mg、 20mg、 30mg、 60mg、 90mg、 120 mg、 130mg、 140mg,将药物放入试管中，加蒸馏水10ml，将试管置于水域超声 器中5分钟；c) 称取碳纳米管50mg/份，供54份；d) 待5-氟尿嘧啶药物晶体完全溶解后，将称取的50mg碳纳米管加入试管中，蜗 旋l分钟使之充分混匀后，将试管置于水域超声器中，分别超声震摇25分钟， 试管超速离心，15000转/分钟，2(TC,离心30分钟；e)取上清液分别进行稀释后，紫外分光光度计测定吸光度，计算上清液药物浓度、游离药物量及吸附量。表l是投药量与吸附量数据。表l给药量mg吸附量mg吸附百分率5.24. 50.86538461510. 17.90. 78217821820.413.50.66176470630.2 ，16. 050.53145695460. 524. 950.41239669489.927.910.310456062120.628.890.239552239130.629.40. 225114855140.529.90.2128113882.碳纳米管对吉西他宾吸附能力的测定a) 分9个实验组，每个实验组6例样本。b) 分另U称取吉西他宾5mg、 10mg、 20mg、 30 mg、 60mg、 90 mg、 120 mg、 mg、 140mg、 150mg，将药物放入试管中，加蒸馏水10ml，置于水域超声器中5分 钟。c) 其余步骤同5-氟尿嘧啶吸附能力的测定。表2是投药量与吸附量数据。表2_给药量mg_吸附量mg_吸附百分率5.1 4.8 0.94117647110.4 8.959 0.86144230830.6 18.15 0.59313725540.2 21.23 0.52810945360.8 23.27 0.38273026390.5 27.2 0.300552486120. 3 30.23 0.251288446140.6 31.4 0.223328592150.7 32.12 0.213138686结果表明1. 碳纳米管对5-氟尿嘧啶吸附呈正相关关系，但随着给药量的不断增大，其吸附量 逐渐达到饱和状态。2. 碳纳米管对吉西他宾吸附呈正相关关系，但随着给药量的不断增大，其吸附量逐渐 达到饱和状态。3. 吸附5-氟尿嘧啶的碳纳米管解附能力的测定a) 实验分为6个实验组，每个实验组6例样本；b) 称取5-氟尿嘧啶30mg/份，共36份。将30 mg 5-氟尿嘧啶放入试管中，加蒸 馏水10ml，将试管置于水域超声器中超声5分钟使药物充分溶解；c) 称取碳纳米管50mg/份，共36份；d) 待5-氟尿嘧啶药物晶体完全溶解后，将称取的50mg碳纳米管加入试管中，蜗 旋l分钟使之充分混匀后，将试管置于水域超声器中，分别超声震摇25分钟；e) 试管超速离心，15000转/分钟，20'C，离心30分钟；f) 取上清液分别进行稀释后，紫外分光光度计测定吸光度，计算上清液药物浓度、 游离药物量(即本次解附量)、剩余吸附量，并计算本次解附百分比；g) 取上清液8.5ml，弃用，计算丢弃药物量，剩余游离药物量，剩余吸附药物量。h) 试管中加入8.5ml蒸馏水，恢复原体积，蜗旋1分钟使碳纳米管与水充分混匀， 然后将试管重新置于水域超声器中，分别超声震摇25分钟；i) 震摇后，试管超速离心，15000转/分钟，20°C，离心30分钟；j)循环上述测定吸光度、换液、超声震摇及离心等步骤，直到单次解附量小于 0.5mg为止。图7显示了换液次数与累计释放率之间的关系，表明碳纳米管吸附5-氟尿嘧啶后累 计释放率与换液次数呈正相关关系，提示解附能力良好。4. 吸附吉西他宾的碳纳米管解附能力的测定a) 实验分为6个实验组，每个实验组6例样本；b) 称取吉西他宾40mg/份，共36份，将40mg吉西他宾放入试管，加蒸馏水10ml， 将试管置于水域超声器中超声5分钟使药物充分溶解；c) 其余步骤同吸附5-氟尿嘧啶的碳纳米管解附能力的测定。图8显示了换液次数与累计释放率之间的关系，表明碳纳米管吸附吉西他宾后累计 释放率与换液次数呈正相关关系，提示解附能力良好。实施例4功能化碳纳米管淋巴趋向性动物试验a) 药物水溶性功能化碳纳米管，b) 动物SD大鼠，5 6周龄，250g左右，c) 方法O.lml水溶性功能化碳纳米管左足爪垫皮下注射，24h后解剖 结果显示将水溶性功能化多壁碳纳米管注入SD大鼠左足爪垫皮下，24小时后解剖SD大鼠左侧胭窝淋巴结，可见部分淋巴结呈灰色，经胭窝淋巴结病理切片证实碳纳 米管存在于淋巴细胞内，提示功能化碳纳米管具有良好的淋巴趋向性。实施例5 建立胰腺癌淋巴道转移动物模型a) 药物水溶性功能化碳纳米管，b) 动物SD大鼠，5 6周龄，250g左右，C)方法采用体内连续接种法建立胰腺癌淋巴道转移模型，d) O.lml水溶性功能化碳纳米管左足爪垫皮下注射，24h后解剖。结果显示裸鼠胰腺癌淋巴道转移模型接种Bx-PC3胰腺癌细胞株5周后，淋巴结 内可见肿瘤细胞，碳纳米管吸附吉西他滨局部皮下注射后，胭窝淋巴结内可见碳纳米 管以及坏死的肿瘤细胞，提示水溶性功能化碳纳米管携带药物可进行淋巴化疗。实施例6功能化碳纳米管淋巴化疗疗效评估试验 1.淋巴系统内药物浓度测定a) 药物水溶性功能化碳纳米管，b) 动物SD大鼠，5 6周龄，250g左右，c) 方法采用HPLC法测定大鼠淋巴结和血浆内吉西他滨的药物浓度O.lml水溶性功能化碳纳米管左足爪垫皮下注射，24h后解剖 注药后分别于第l天、2天、至10天解剖大鼠，取淋巴结和静脉血。 结果显示能化碳纳米管吸附药物后在淋巴系统及血浆内解附，其有效药物浓度短 期内高于对照组，功能化碳纳米管淋巴化疗疗效良好。(见图15) 2.淋巴系统内肿瘤杀伤效果比较图16-18分别显示了对照组、吉西他滨静脉注射组和碳纳米管-吉西他滨皮下注射 组胭窝LN中肿瘤细胞不同的的凋亡情况，表明本发明碳纳米管携药在淋巴系统内杀伤肿瘤细胞效果明显好。表3是三组胭窝LN中肿瘤细胞的凋亡率比较。表^_组别 凋亡率对照组 13.047±2.038吉西他滨静注组 32.029±2.076碳纳米管-吉西他滨皮下注射组 43.980±2.07权利要求
1. 用于肿瘤淋巴靶向治疗载体的功能化碳纳米管，其特征在于将普通碳纳米管经偶氮二异丁腈改性，在碱性条件下制成水溶性碳纳米管，所述的功能化碳纳米其粒径与相应肿瘤毛细淋巴管间隙和窗孔的大小相应，平均管长大于1μm，管径为30～60nm，具淋巴趋向性。
2、 权利要求1所述的用于肿瘤淋巴靶向治疗载体的功能化碳纳米管的制备 方法，其特征在于通过下述步骤1) 获得肿瘤毛细淋巴管的裂隙、窗孔和破口的内径分布范围； 利用透射或者扫描电镜进行观察、检测，进而利用软件测量、统计肿瘤毛细淋巴管的裂隙、窗孔、破口的内径分布范围；2) 制备与相应肿瘤毛细淋巴管间隙和窗孔的大小相应粒径的多壁碳纳米管，将多壁碳纳米管与过氧化苯甲酰及与偶氮二异丁腈反应生成改性的多壁碳纳米管后，在碱性条件下水解制成水溶性碳管；3) 在水域超声器中将步骤2)的水溶性的、改性的多壁碳纳米管与化疗药 物混合进行物理吸附，制成具特定粒径的多壁碳纳米管。
3、 按权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2的多壁碳纳米 管与过氧化苯甲酰及与偶氮二异丁腈反应生成改性的多壁碳纳米管， 其反应式是-<formula>formula see original document page 2</formula>及反应式是<formula>formula see original document page 2</formula>i Toluene 1<formula>formula see original document page 3</formula>所述的在碱性条件下水解制备水溶性碳纳米管，反应式是<formula>formula see original document page 3</formula>
4、 按权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤3的化疗药物选 自5-氟尿嘧啶或吉西他宾。
5、 按权利要求1所述的用于肿瘤淋巴靶向治疗载体的功能化碳纳米管，其 特征在于所述的肿瘤是实体肿瘤。
全文摘要
本发明属分子生物医药制造领域，涉及肿瘤淋巴靶向治疗新载体，具体涉及一种用于肿瘤淋巴治疗的主动靶向的新载体-功能化碳纳米管及其制备方法。本发明通过测定肿瘤的毛细淋巴管间隙和窗孔的大小，制备相应粒径的功能化修饰碳纳米管，吸附特定的药物，携带进入肿瘤淋巴系统进行释放，经实验证实，所述的功能化碳纳米管吸附药物后在淋巴系统及血浆内解附能力良好，具有良好的淋巴趋向性，达到杀伤肿瘤的有效浓度，淋巴化疗疗效良好。
文档编号A61P35/00GK101239187SQ200710037418
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者傅德良, 骥 李, 忱 金, 江 龙 申请人:复旦大学附属华山医院