一种治疗地中海贫血的药物及其制备方法

专利名称：一种治疗地中海贫血的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗地中海贫血的药物及其制备方法。
背景技术：
地中海贫血是遗传性贫血疾病，由于患者体内血红蛋白的珠蛋白合成障碍，导致遗传性慢性溶血性贫血，因在地中海地区首先发现而得名。地中海贫血主要分成两大类，包括α-地中海贫血和β-地中海贫血。β-地中海贫血属世界上发病高、危害最大的单基因遗传病，是严重危害人类健康的世界性顽症之一，它广泛分布在地中海沿岸及中东，东南亚各国；我国云贵、两广、湖南、四川、江西等地发病率较高，其中广西、广东、云贵发病率最高。β-地中海贫血症是β-珠蛋白基因表达功能障碍而致的遗传性溶血性贫血，其分子基础是β-珠蛋白基因缺陷，β-珠蛋白不能合成，导致早期造血障碍。国内外尚无有效治疗办法，多为个案报道；国内外治疗β-地中海贫血症多以输血为主；常用的有高量输血、幼红细胞输注和铁蟹合剂等，但由于病人大量溶血，引起巨脾，功能亢进。加重了贫血和其他血细胞的损伤，这种维持疗法只能暂时缓解症状；也有切脾、脾栓塞、烷化剂治疗(用羟基尿与氮胞苷等化疗药物治疗，也有用马利兰治疗)，但这些药物有极强的副作用，限制了在临床上的应用、骨髓和造血干细胞移植受髓源和配型的限制，无法普及；近年有人试图把正常的β-珠蛋白基因导入含有突变的基因细胞内进行基因治疗，但因同源重组率问题未解决，很难进行，目前基因治疗尚存在严重问题，无法在临床上应用。因此，对β-地中海贫血症的治疗至今仍是世界医学尚未解决的难题之一。由于难度大至今还没有治疗β-地中海贫血有效的中、西药。
我国是地中海贫血高发国。广西β-地贫发病率5％，α-地贫发病率15％，仅广西、广东地贫基因携带者近1500万，我国每年有大量β-地贫患儿出生。对本病的防治研究，关系到人口与健康，有重大的社会效益和实际意义。
肾藏精生髓的理论是传统中医的重要基础理论。一直指导着临床实践。中医认为“肾是五脏六腑之根”《灵枢》说“生之来谓之精”，称“肾为先天之本”，肾气盛衰不仅影响到骨的发育，脑的功能，也影响到髓的充盈和血的生源。肾精足髓海满盈，血有生源；反之肾精不足髓海失充则无生源。

发明内容
本发明的目的是提供一种治疗地中海贫血的药物及其制备方法。
本发明所提供的治疗地中海贫血的药物，主要由以下重量份的原料制成山茱萸6-12份 何首乌4-10份炙黄芪4-8份 阿胶2-6份鳖甲4-8份所述治疗地中海贫血的药物中，所述原料中还可包含重量份数为3-8份的党参和/或重量份数为4-8份的鸡血藤和/或重量份数为1-4份的砂仁和/或重量份数为6-10份的熟地和/或重量份数为4-10份的补骨脂和重量份数为4-8份的当归。
所述治疗地中海贫血的药物，优选为主要由以下重量份的原料制成山茱萸6-12份 何首乌4-10份 熟地6-10份 补骨脂4-10份炙黄芪4-8份 当归4-8份 阿胶2-6份 党参3-8份鸡血藤4-8份 鳖甲4-8份 砂仁1-4份优选为山茱萸12份何首乌8份 熟地8份 补骨脂6份炙黄芪6份 当归6份 阿胶3份 鸡血藤6份党参6份 鳖甲8份 砂仁2份为了使药物具有较好口感，所述药物中还可含有1-2重量份数比的矫味剂。
为了服用方便，本发明的药物还可被制成制剂，所述原料中还可包含3-12重量份的辅料，所述辅料可为糊精、β-环糊精、HP-β-CD、DM-β-CD、α-CD、淀粉或γ-CD等。
本发明所提供的制备治疗地中海贫血的药物的方法，包括下述步骤1)在由6-12重量份的山茱萸和4-10重量份的何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量2-10倍的质量百分含量为30％-95％乙醇在70-90℃加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液，除去乙醇；2)在由4-8重量份的当归和1-4重量份的砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量4-10倍量的水浸泡1-4小时，水蒸气蒸馏1-10小时，收集挥发油；3)在由6-10重量份的熟地、4-8重量份的炙黄芪、3-8重量份的党参、4-8重量份的鳖甲、4-10重量份的补骨脂和4-8重量份的鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量6-10倍的水，煎煮2-3次，每次1-2小时，合并煎液与步骤1)得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.25-1.40(50℃)的稠膏；4)将阿胶冷冻粉碎与步骤2)得到的挥发油和步骤3)得到的稠膏混合，即得治疗地中海贫血的药物。
为了方便服用，将药物制成制剂，所述方法中，所述步骤2)的挥发油可用是其1-10倍质量的β-环糊精或羟丙基倍他环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin；HP-β-CD)、2，6-二-O-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、α-环糊精(α-CD)或γ-CD包含。
所述包含步骤为在20-60℃，在所述β-环糊精或羟丙基倍他环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin；HP-β-CD)、2，6-二-O-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、β-环糊精(β-CD)或γ-CD的水溶液中，加入所述步骤2)得到的挥发油，包含10-60分钟，8-1℃冷藏2-12小时，低温干燥，得到挥发油的环糊精包含物。
所述步骤4)中还加有1-2重量份的矫味剂和3-12重量份的辅料，所述辅料为糊精、β-环糊精、HP-β-CD、DM-β-CD、α-CD、淀粉或γ-CD等。
根据《内经》“精不足者补之以味”的原则、肾生髓藏精及精血同源之理，按滋肾养阴，益精生血，健脾补气，消痞退黄的治疗原则，针对β-地中海贫血症的发病特点，在原补肾生血药基础上，取六味地黄汤，当归补血汤中补肾益精生血的主要部分有机组合而成。地中海贫血症，多因先天禀赋不足，肾精不充所致，先天之本在于肾，肾主骨，生髓，藏精，血为精所化，肾精不足者血之化生减少乃致血虚。本中药制剂以山茱萸、何首乌为君，滋阴补肾，意在补肾中真阴(真精)使真阴得养，髓海充盈，血有生源，故能益髓生精化血，臣药熟地、补骨脂，协助君药生精化血，加强补肾之功。又补骨脂补肾阳，生发阳气，宗《景岳全书》所云“善补阴者必阳中求阴”，佐药炙黄芪、阿胶共奏益气补血之功。补肾药是从根本上治疗地中海贫血，可谓治本，益气血可治标，标本同治相得益彰，本并肾虚不能温养脾土，因而脾虚，脾主气，气帅血，脾虚则气弱，不能帅血运行，致血滞为瘀，发为症积，佐药党参健脾利湿，且黄芪，党参补气，利于帅血运行。佐药鸡血藤、鳖甲活血软坚散结，消散腹中症积，使药砂仁，消减养阴补血药之滋腻，使该药久服不碍脾胃。佐药当归(生血养血)。本方君、臣、佐、使四者合用，即治本，又治标，即治主病，又治兼症，与地中海贫血的病因，病机，辨证论治非常贴合，也与再障的病因病机辨证论治非常贴合，故本方除治疗β-地中海贫血症外，也适用再障等病。
本发明根据中医理论和临床实践，首次提出“肾生髓、髓生血”是中医治疗β-地中海贫血症理论基础；治则治法为“补肾益髓”法。研制了中医药治疗地中海贫血的药物。本发明的药物以滋阴补肾、益髓生血、补气健脾、消痞退黄、改善全身症状为特点，用于脾肾两虚、精血不足证，适用于地中海贫血，对早期造血障碍，特别是对β-地中海贫血症有明显疗效，能有效缓解头晕目眩、面色萎黄、心悸、气短、倦怠乏力、食少纳呆等症状。在广西高发区，用本发明制备的药物进行临床观察治疗β-地中海贫血有效率达92.9％，取得了领先的临床研究成果。本发明在中药治疗β-地贫方面，首次从理论基础、治则治法、作用特点、可能机制等提出了指导临床实践的创新理论认识。
通过动物毒性试验表明，本发明的药物在制定的剂量范围内对动物无长期或短期的毒性。
通过开展高发区临床的实验，并以患者为对象进行疗效分子机理表明，本发明的药物治疗β-地中海贫血症临床实验取得了可重复的肯定疗效，并且，临床症状明显改善与外周血象的提高有很好的一致性，其中，血红蛋白(Hb)明显升高(P＜0.001)，疗效维持时间长，后效应好。
通过临床疗效分子机理实验表明，本发明的药物治疗β-地中海贫血症，能明显提高整体效应，明显提高Hb，能从不同的途径(如γ珠蛋白基因转录和表达，诱导HbF合成增加)代偿β-珠蛋白基因功能缺陷。


图1为治疗组、对照组中医证候量化评分总和比较图2为α与β珠蛋白基因共扩增与γ与β珠蛋白基因共扩增结果图3为24例β-地贫患者治疗前后抗碱血红蛋白(HbF)的平均值柱状4为28例β-地贫患者治疗前后γ/β+γ珠蛋白链比值的平均值柱状5为28例患者治疗前后血红蛋白γ/β+γmRNA克分子比的平均值柱状6为12例患者治疗前后静脉血细胞中GM-CSF与α-globin相对比值的平均值柱状图具体实施方式
用中医理论阐述适应证病机与治疗原则β—地中海贫血系遗传性珠蛋白合成障碍所致早期造血障碍，是严重危害人类健康的世界性顽症之一。该病多为婴幼儿、少年发病，表现为虚劳、眩晕、心悸、黄疸、腹中症积，生长发育迟缓等，多由先天禀赋不足，肾精不充所致。患者症见严重贫血，地贫貌面色萎黄，头颅方大，颚骨突起，鼻梁凹陷，眼睑浮肿，肤色如黄土，唇舌色淡，肝脾肿大。血象检查有小细胞低色性贫血，可出现靶形细胞，网织细胞增加，核红细胞、红细胞渗透压减低。β-地中海贫血症患者，除上述特征其临床上表现出腰膝酸软、眩晕、心悸、气短、乏力、脱发耳鸣、面色、唇、甲苍白，手足心热，盗汗，中医辨证属肾阴亏虚，精血不足症侯，腰为肾之府，肾精亏虚，故腰膝酸软脑为髓海，肾精亏虚，髓海失充，故眩晕、耳鸣、血虚，血不养心，神不守舍故心悸、血虚不荣故而面色及唇甲色淡。肾精不足，精不化气故气短乏力，手足心热，盗汗，为阴不制阳所致。同时，因肾阴亏虚，不能温养脾土，而脾虚，脾主气，气帅血，脾虚则气弱，不能帅血运行，致血滞为瘀，发为症积；又脾虚运化失职，则水湿不化，湿热相蒸，而成黄胆。此症在治疗上应采用滋补肾阴，益精生血，益气健脾，消痞退黄。
本发明的药物的主旨是治疗β-地中海贫血系遗传性珠蛋白合成障碍所致早期造血障碍，具有如下功能和疗效功能滋阴补肾，益精生血，益气健脾，消痞退黄。
主治肾阴亏损，精血不足，肾脾两虚、心悸、黄疸、腹中症积，如地中海贫血症，慢性再生障碍性贫血症等病。
用法用量温开水冲服，成人一次10g，一日2次。儿童酌减。
具体的药物配制方法和疗效实验如下述实施例所示下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法实施例1、本发明治疗地中海贫血的药物的制备一、药物活性成分及药物活性成分用量(重量份)山茱萸12份 何首乌8份 熟地8份补骨脂6份炙黄芪6份 当归6份 阿胶3份鸡血藤6份党参6份 鳖甲8份 砂仁2份二、按步骤一的药物活性成分及用量配比制备中药1、在由12重量份山茱萸和8重量份何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量8倍的80％(质量百分含量)的乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收得到无醇味的提取液。
2、在由6重量份当归和3重量份砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量6倍的水浸泡1小时，水蒸气蒸馏8小时，收集挥发油，过滤，得到挥发油滤液备用。
3、在由8重量份熟地、6重量份炙黄芪、6重量份党参、8重量份鳖甲、6重量份补骨脂和6重量份鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量6倍质量的水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液与步骤1得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.20-1.40(50℃)的稠膏。
4、将3重量份阿胶冷冻粉碎过80目筛，与步骤2得到的挥发油和步骤3得到的稠膏混合，即得治疗地中海贫血的药物。
实施例2、本发明治疗地中海贫血的药物的制备一、药物活性组分及药物活性组分用量(重量份)山茱萸6份 何首乌4份 熟地6份 补骨脂4份炙黄芪4份 当归4份 阿胶2份 党参3份鸡血藤4份 鳖甲4份 砂仁1份二、按步骤一的药物活性成分及用量配比制备中药1、在由6重量份山茱萸和4重量份何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量10倍的30％(质量百分含量)的乙醇加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，减压回收得到无醇味的提取液。
2、在由4重量份当归和1重量份砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量4倍的水浸泡4小时，水蒸气蒸馏2小时，收集挥发油，过滤，得到挥发油滤液备用。
3、在由6重量份熟地、4重量份炙黄芪、3重量份党参、4重量份鳖甲、4重量份补骨脂和4重量份鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量10倍质量的水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液与步骤1得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.20-1.40(50℃)的稠膏。
4、将2重量份阿胶冷冻粉碎过100目筛，与步骤2得到的挥发油和步骤3得到的稠膏混合，即得治疗地中海贫血的药物。
实施例3、本发明治疗地中海贫血的药物的制备一、药物活性组分及药物活性组分用量(重量份)山茱萸8份 何首乌10份 熟地10份 补骨脂10份炙黄芪8份 当归8份 阿胶6份党参8份鸡血藤8份 鳖甲8份 砂仁4份二、按步骤一的药物活性成分及用量配比制备中药1、在由8重量份山茱萸和10重量份何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量3倍的95％(质量百分含量)的乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压回收得到无醇味的提取液。
2、在由8重量份当归和4重量份砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量10倍的水浸泡4小时，水蒸气蒸馏8小时，收集挥发油，过滤，得到挥发油滤液备用。
3、在由10重量份熟地、8重量份炙黄芪、8重量份党参、8重量份鳖甲、10重量份补骨脂和8重量份鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量8倍质量的水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液与步骤1得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.20-1.40(50℃)的稠膏。
4、将阿胶冷冻粉碎过100目筛，与步骤2得到的挥发油和步骤3得到的稠膏混合，即得治疗地中海贫血的药物。
实施例4、本发明治疗地中海贫血的药物制剂的制备一、药物活性组分及药物活性组分用量(重量份)山茱萸8份 何首乌10份 熟地10份 补骨脂10份炙黄芪8份 当归8份 阿胶6份党参8份鸡血藤8份 鳖甲8份 砂仁4份二、按步骤一的药物组成及用量中制备药制剂1、在由8重量份山茱萸和10重量份何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量的8倍的80％(质量百分含量)的乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收得到无醇味的提取液。
2、在由8重量份当归和4重量份砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量的6倍的水浸泡2小时，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油，过滤，得到挥发油滤液备用。
3、将是步骤2得到的挥发油滤液的1倍质量的β-环糊精溶于水中。在常温至60℃间，在不断搅拌下缓慢加入步骤2得到的挥发油滤液，搅拌或超声或研磨包含50分钟，4℃冷藏10小时，滤过，低温干燥，得挥发油的环糊精包含物。
4、在由10重量份熟地、8重量份炙黄芪、8重量份党参、8重量份鳖甲、10重量份补骨脂和8重量份鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量9倍质量的水，煎煮3次，每次2小时，合并煎液与步骤1得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.20-1.40(50℃)的稠膏。
5、将6重量份的阿胶与是阿胶等质量的辅料-糊精、淀粉、或乳糖混合，粉碎，过80目筛。
6、将步骤3制备的包含物、步骤4制备的稠膏和步骤5制备的阿胶等粉碎物混合均匀，加入1重量份矫味剂和6重量份糊精，混合均匀，制备软材，制粒、干燥、包装即得治疗地中海贫血的药物制剂。
实施例5、本发明治疗地中海贫血的药物制剂的制备一、药物活性组分及药物活性组分用量(重量份)山茱萸8份 何首乌10份 熟地10份 补骨脂10份炙黄芪8份 当归8份 阿胶6份党参8份鸡血藤8份 鳖甲8份 砂仁4份二、按步骤一的药物组成及用量中制备药制剂1、在由8重量份山茱萸和10重量份何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量的8倍的80％(质量百分含量)的乙醇加热提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收得到无醇味的提取液。
2、在由8重量份当归和4重量份砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量的6倍的水浸泡2小时，水蒸气蒸馏8小时，收集挥发油，过滤，得到挥发油滤液备用。
3、将是步骤2得到的挥发油滤液的10倍质量的羟丙基倍他环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin；HP-β-CD)溶于水中。在常温至60℃间，在不断搅拌下缓慢加入步骤2得到的挥发油滤液，搅拌或超声或研磨包含20分钟，4℃冷藏4小时，滤过，低温干燥，得挥发油的环糊精包含物。
4、在由10重量份熟地、8重量份炙黄芪、8重量份党参、8重量份鳖甲、10重量份补骨脂和8重量份鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量7倍质量的水，煎煮2次，每次2小时，合并煎液与步骤1得到的提取液混合，减压浓缩至相对密度1.20-1.40(50℃)的稠膏。
5、将6重量份的阿胶与是阿胶2倍质量的辅料-糊精、淀粉、或乳糖混合，粉碎，过100目筛。
6、将步骤3制备的包含物、步骤4制备的稠膏和步骤5制备的阿胶等粉碎物混合均匀，加入1重量份矫味剂和6重量份糊精，混合均匀，制备软材，制粒、干燥、包装即得治疗地中海贫血的药物制剂。
实施例6、治疗地中海贫血的药物及制剂的相关动物毒性试验1、动物急性毒性试验将实施例1制备药物溶于水中，含量为0.91g药粉/ml(此为药物可以灌胃给药的最大浓度)。选取体重范围在20±1g的昆明种小白鼠雌、雄性各10只，同性别的10只小鼠合放于一笼，给药前分别对这20只小鼠禁食(不禁水)14小时。按照72.07g生药/kg体重(0.8ml/20g体重)的剂量，分别对20只空腹小鼠经口灌胃给药(此为小鼠所能容纳的最大体积)，24小时内给药2次。第一次给药后每笼均普通颗粒性饲料250g，不限制小鼠的自由进食和饮水。间隔12小时后以同样剂量和方法对所有小鼠再次给药。给药后即观察小鼠的即刻反应，随后每天观察一次，连续观察7天。实验室温度为22±2℃。
结果表明，给药后所有小鼠均表现为活动略微减少，轻微嗜唾，30分钟后逐渐恢复正常活动和进食饮水。6小时后有黑褐色药物状大便排出。在距第一次给药12小时后，以同样剂量和方法对所有小鼠再次给药，小鼠表现均同前。即24小时内对所有小鼠灌胃给药2次，小鼠2次服药后的表现均一致，无一只小鼠死亡。对全部存活小鼠连续观察7天，均健康存活，无死亡现象发生，记录7天后的体重和饲料消耗量(饲料消耗量＝开始时添加饲料量-结束时所剩饲料量)，具体结果如表1所示。最大耐受量72.07×2＝144.14g生药/kg。相当于推荐临床用量(0.79g生药/kg)的182.0倍以上。最大给药浓度和最大给药体积条件下未测定出半数致死剂量。当24小时内给药2次。无一只试验小鼠死亡时，方测出最大耐受量大于144.14g生药/kg，为推荐临床用量的182.0倍以上。表明实施例1中制备的药物作为口服中成药，在限制使用的剂量范围内是安全可靠的。
表1.小鼠给药前后的体重和饲料消耗量

2、动物长期毒性试验为观察动物因连续用药而产生的毒性反应和严重程度，以及停药后的发展和恢复情况，为拟定临床安全用药剂量提供参考，保证临床用药安全，通过试验动物经口灌胃给药，进行了长期毒性试验，以评价其长期用药的安全性。
尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，北京中生生物工程高技术公司生产，批号971203。
雄性及雌性Wistar种大白鼠各80只，体重范围为170±20g，购自中国医学科学院试验动物研究所繁育场，级别为二级，经检疫，动物健康无病，动物合格证书为医动字第01-3008号。
大鼠普通颗粒性饲料购自中国医学科学院试验动物研究所繁育场。
大白鼠按体重随机分成四组，分别为对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组。每一组的大鼠均为40只(20雄20雌)，雌雄按性别分开饲养，每笼均为同性的5只大鼠，每组大鼠均分成8笼。四组大鼠共160只分别饲养于32个笼中。小、中、大三个剂量组按给药剂量分别是10.301、19.89和32.91g生药/kg分别灌胃实施例1中制备的药物，分别相当于推荐临床用量的11、21和34倍，剂距为1.0∶1.9∶3.1。药物小、中、大三个剂量组用药以水配制成相同体积。对照组灌胃等量水。大白鼠于每日晨投给普通颗粒性饲料前按1.5ml/100g体重的给药剂量每日一次经口灌胃(给药后不限制大鼠的自由进食和饮水)连续给药26周。观察动物服药后的一般状态、行为、皮毛及大小便等情况。每一或二周称量一次体重和进食普通颗粒性饲料量，以调节给药剂量。在给药第13周时，每组分别处死16只大鼠(8雄8雌)，四个试验组共处死64只大鼠，取血查血象及肝肾功能，其剩余的四组共96只大鼠(每组12雄12雌)继续给药。同时将每组同性别的大鼠调整成每笼4只，即每组大鼠分成6笼，四组剩余共96只分别饲养于24个笼中。在26周末次给药24小时后，停止大鼠给药，体检，查血常规。随后将每组大鼠各处死12只(6雄6雌)，四组共处死48只(24雄24雌)。将每组分别处死12只大鼠(6雄6雌)取血并检查肝肾功能，并取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、十二指肠、睾丸、子宫、卵巢等脏器做病理形态学剖检。观察动物因连续用药而产生的毒性反应和严重程度。每组余下的12只大鼠(6雄6雌)按不同性别分别饲养于4个笼中，每笼3只，即余下的48只大鼠(24雄24雌)分别饲养于16个笼中。各组大鼠停药观察4周，全部处死后再次检测有关指标，以考察其停药后的发展和恢复情况。数据处理采用方差分析。部分结果如表2所示，结果表明对进食量的影响在给药26周及停药4周后，各组大鼠的行为活泼，皮毛色泽光润，进食饮水正常，大小便未见异常，未见有胃肠反应，各组无明显差异。从表2可见，各组间每笼内每只大鼠每日的平均进食量在给药期间和停药后进食量基本相同，没有明显的统计学差异(P＞0.05)。
表2.实施例1的药物对大鼠进食量的影响(单位克)


对体重的影响在给药26周及停药4周后，随着时间的延续，各组间的大鼠体重均逐渐增加，表3表明，各组间的大鼠在给药期间和停药后体重增长情况基本一致，没有明显的统计学差异(P＞0.05)。
表3.实施例1的药物对大鼠体重的影响(单位克)

对外周血常规的影响用日本NIHON KOHDEN公司产血液学分析仪测定大鼠的外周血象。服用实施例1制备的药物13及26周后，与对照组相比，各组间的红、白细胞和血色素含量都无明显差异，均在正常范围之内。停药4周后，各组指标与对照组比较亦无明显差异(P＞0.05)，同样在正常范围内，部分结果表4、5所示。各组的白细胞分类检查亦无明显差异(P＞0.05)，部分结果如表6所示。
表4.实施例1制备的药物灌胃26周对大鼠血象的影响


表5.实施例1制备的药物长期灌胃后停药4周对大鼠血象的影响

表6.实施例1制备的药物灌胃26周及停药4周对大鼠各类白细胞的影响

对肝功能的影响通过比色法，在Olympus650型生化自动分析仪上测定所处死大鼠血清的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)活性，以检测实施例1中制备的药物对肝功能的影响。结果表明，与对照组比较，灌胃给药13和26周及停药4周后各组的GPT、GOT、LDH活性无明显变化(P＞0.05)，部分结果如表7、8所示。
表7.实施例1制备的药物灌胃26周后对大鼠肝功能的影响(±SD)

表8.停药灌胃实施例1制备的药物4周后对大鼠肝功能的影响(±SD)


对肾功能的影响通过比色法，在Olympus650型生化自动分析仪上测定所处死大鼠血清的尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量，观察实施例1制备的药物对大鼠肾功能的影响。从表9可见，经13和26周灌胃给药的小、中、大剂量组大鼠BUN含量与对照组比较均无明显差异，都在正常范围之内；停药4周后三个剂量组与对照组比较亦无明显差别(P＞0.05)。从表10可见，经13和26周灌胃给药及停药4周的小、中、大剂量组大鼠血清肌酐含量与对照组比较均无明显差异，都在正常范围之内(P＞0.05)。
表9.实施例1制备的药物长期灌胃对大鼠肾功能BUN含量的影响

表10.实施例1制备的药物长期灌胃对大鼠肾功能肌酐含量的影响

对脏器组织的影响在对给药26周及停药4周大鼠的解剖过程中，肉眼仔细观察实施例1制备的药物对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、子宫、卵巢、胃、肠等脏器组织发育的影响，均未见异常，各组间无无明显差异。并对以上除胃和肠以外的其它脏器组织进行称重并计算相应大鼠的脏器系数，与对照组比较，均无明显差别(P＞0.05)。部分结果如表11所示。
表11.实施例1制备的药物对雄性大鼠脏器系数的影响(单位克/100克体重)


病理形态学检查(表12)将给药26周及停药4周后的大剂量组和给水26周及停药4周后的对照组大鼠处死后，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、十二指肠、胃、睾丸、子宫和卵巢等脏器，二组之间均无明显区别。取给药26周及停药4周后的大剂量组和给水26周及停药4周后的对照组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、十二指肠、胃、睾丸、子宫和卵巢等脏器，常规取材固定，H-E染色，制片后进行病理观察。显微镜下观察，所有大鼠不分组别及是否用药和药量大小，均无明显区别，未呈现明显的病理性改变或剂量依赖性的病理改变，表明该药在剂量范围内其病理组织学无明显毒性发现。对照组及大剂量组大鼠的肺组织均出现轻度感染和淤血病变，考虑为动物长期喂药呛入肺部等因素所致，与药物毒性无关；具体结果如表12所示，结果表明，实施例1制备的药物在限定剂量范围内使用，对服药大鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、十二指肠、睾丸、子宫和卵巢等脏器组织均未见毒、副作用。
表12.实施例1制备的药物对病理形态学的影响


注±为可疑变化，+为轻度变化，++为中度变化，+++为重度变化。
综上所述，实施例1制备的药物26周对试验动物的行为、皮毛、进食饮水、大小便、胃肠、体重和有关脏器系数及病理改变均无明显影响；对肝肾功能无明显影响；对血常规及白细胞分类无明显影响。停药4周后对上述指标进行可逆行变化观察，同对照组比较，各组间的各项指标无明显差异。大剂量组大鼠用药系动物能够承受的最大容积和最大浓度的剂量(为推荐临床用量34倍)。大鼠按小、中、大三个剂量组长期灌胃实施例1制备的药物未见明显毒副作用，说明实施例1制备的药物在正常的使用剂量范围内安全可靠。
包含山茱萸6-12份和何首乌4-10份和炙黄芪4-8份和阿胶2-6份的药物、以及该药物再加上重量份数为3-8份的党参和/或重量份数为4-8份的鸡血藤和/或重量份数为4-8份的鳖甲和/或重量份数为1-4份的砂仁和/或重量份数为6-10份的熟地和/或重量份数为4-10份的补骨脂和重量份数为4-8份的当归制备的药物，以及实施例2-5制备的药物的毒性实验表明，与实施例1制备的药物没有明显差别，未见明显毒副作用。
实施例7、本发明治疗地中海贫血的药物及其制剂的药效学试验治疗地中海贫血的药物主要药效学研究核心工作是疗效分子机理的研究。因β-地中海贫血症是遗传性溶血性贫血，其分子基础是β-珠蛋白基因缺陷，使β-珠蛋白不能合成，导致早期造血障碍。因此，主要药效学研究必须进行基因水平和分子药理的研究。鉴于至今没有成熟的β-地中海贫血症的动物模型，对β-地中海贫血症高发区现场临床实验及临床疗效机理研究是最直接，最具说服力的药效学研究，因此，针对β-地中海贫血症新药研究的特殊性，开展I期临床研究是必须的。
1、实施例1制备的药物的临床实验在广西南宁地区，于1997年10月至1998年1月用实施例1制备的药物治疗地中海贫血病例12例。男性9例，女性3例，平均年龄为8.5岁，14岁以下者占11例，临床上地中海贫血面容明显，肝脾肿大，血红蛋白23-101g/L，平均54.8g/L，网织红细胞4-27％，平均12％，抗碱血红蛋白16-63％，平均42％，3例HbA2加HbE36-52％，平均46％。重型β-地中海贫血9例，中间型3例，其中重型β-地中海贫血复合血红蛋白E3例。12例病例均用实施例1制备的药物治疗，每日3次，每次按2g生药/人的量服用，3个月为一疗程。12例服药后精神振奋，食欲增加，肝脾有一定程度缩小，血红蛋白增加11-23g/L，平均增加16.5g/L，网织红细胞增加2-9％，平均增加4％，HbF增加44-34％，平均增加22％。未观察到副作用。
治疗前后血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、网织红细胞(Ret)及抗碱血红蛋白(HbF)变化如表13所示。
表13.治疗前后血液指标(Hb、RBC、Ret、HbF)变化

结果表明，上述12例中Hb增加11-23g/L，平均增加16.5g/L，RBC增加(0.58-1.50)×1012/L，平均增加0.56×1012/L，Ret增加者11例，分别为2-9(％)，平均增加4.2(％)，HbF增加44-34(％)，平均增加22(％)。疗效维持时间60天2例，90天2例，120天1例，150天3例，180天4例。治疗过程中未见明显副作用。
2、实施例1制备的药物的疗效实验2004年9月15日至2005年1月30日在广西南宁周边地区及百色地区用实施例1制备的药物治疗，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，疗程三个月，以随机、单盲、安慰剂(安慰剂由糊精等组成，中国中医研究院广安门医院大兴制剂中心生产[批号20040527]10g/袋，服用方法用量与本发明的药物相同)平行治疗为对照。根据张之南主编《血液病诊断及疗效标准》(1991年版)中对β-珠蛋白合成障碍性贫血诊断标准，按临床观察方案入选病例68例，脱落剔除8例(失访)，计入符合方案统计分析60例(其中30例用实施例1制备的药物治疗，30例采用安慰剂治疗)。病例中男41例，女19例，年龄2-18岁，汉族17例、壮族40例、瑶族2例、布依族1例；中间型41例、重型19例，重型患者只在状况极差时才输血，无规律，均未使用去铁剂治疗，半年内未使用过任何抗贫血药物，患者均来自边远山区，并自愿按本研究条件签署知情同意书接受治疗。
观察实施例1制备的药物或安慰剂治疗前后临床中医症状、Hb、RBC、Ret、HbF等血液指标水平变化，肝肾功能(GPT、BUN、Cr)及不良反应。具体结果如下所述血液学指标检查结果按照本发明药物临床观察方案要求，经3个月对照观察后，实施例1中制备的药物治疗组、安慰剂组主要疗效性指标血液参数(Hb、RBC、Ret、HbF)动态检查结果如表14，15所示。表14的数据表明经实施例1制备的药物治疗三个月后血液指标有明显提高。从第一个月起至疗程结束，患者血清Hb、RBC、Ret、HbF均明显升高(P＜0.01)。表15的数据表明安慰剂组患者，服用安慰剂3个月后，血液学指标无明显改善。自服药一个月至疗程结束患者血清Hb、RBC、Ret、HbF与疗前比均无明显变化(P＞0.05)。
表14.实施例1制备的药物治疗组血液指标变化结果(x±s)

表15.安慰剂组(对照组)患者血液学指标变化结果(x±s)

中医证候评分量表分析结果中医辨证参照刘锋、麻柔主编《中西医结合临床血液病学》标准(1988年)和《中药新药临床研究指导原则》(试行，2002)，证型以脾肾两虚、精血不足为主，一部分患者兼挟肝肾阴虚或温热内阻。按中医辨证，符合脾肾两虚，精血不足证头晕目眩，面色萎黄，心悸，气短，倦怠乏力，食少纳呆，舌质淡，脉沉细。按CRF表量化评分结果如表16。结果表明经实施例1制备的药物治疗三个月后，患者临床中医证候评分量化分析六种症状中，除“食少纳呆”一项改善不具统计学意义外，“面色萎黄”、“头晕目眩”、“心悸”、“气短”、“倦怠乏力”等症状均有明显改善。从治疗第一个月起至疗程结束，患者临床症状均有明显改善(P＜0.05)；而安慰剂组患者临床中医证候量化分析结果显示，服药前后无明显改变。
表16.实施例1制备的药物治疗对患者中医证候评分量表统计结果(x±s)

将患者治疗前后中医证症候6项量化评分总和相减进行组间比较，则实施例1制备的药物治疗组服药第一个月为5.73±3.96，服药三个月为7.07±6.05，安慰剂组则分别为1.73±3.14和4.13±4.87，两组比较，治疗组中医临床症状改善有显著统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)(图1)。
疗效比较疗效定标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》并参考第四界国际血红蛋白基因开关会议提出的标准，以Hb、RBC、Ret、HbF上升并且Hb上升大于5g/L为有效，单纯Ret、HbF上升不作为有效病例。实施例1制备的药物治疗组30例中有28例有效，2例无效，有效率93.33％；安慰剂组有效3例，无效27例，有效率10％，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)(表17)。
表17.实施例1制备的药物治疗组与安慰剂对照组疗效比较

小结治疗组患者自疗程第一个月起至三个月结束，各项血液学指标均有提高，与疗前比差异显著(P＜0.01)，中医临床症状改善及动态变化与血液指标提高相一致；安慰剂对照组患者，血液学指标及临床中医证候量化分析结果显示，服药前后无明显改善。与安慰剂组比较，治疗组中医临床症状改善有显著统计学意义(P＜0.01)。两组患者治疗期间均未见肝、肾功能异常和不良反应。
3、服安慰剂后再给治疗实施例1制备的药物30例患者自身对照的比较研究2004年12月-2005年4月对南宁、百色、河池地区符合纳入条件的观察病例30例，男21例，女9例，年龄2-18岁，14岁以下23例，汉族8例、壮族21例、布依族1例，重型13例(重型复合血红蛋白E 2例)、中间型17例(中间型复合血红蛋白E 5例)，广西籍28例，贵州籍2例。患者均来自边远山区，并自愿按本研究条件接受治疗。采用自身对照方法，30例重型、中间型β-地中海贫血患者先口服安慰剂(安慰剂由糊精等组成，中国中医研究院广安门医院大兴制剂中心生产[批号20040527]10g/袋，服用方法用量与本发明的药物相同。要求纳入病例在观察期间不输血，坚持服药。)再服实施例1制备的药物，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，疗程均为三个月，于服药后动态观察两个阶段的患者临床症状、中医证候和血液指标(Hb、RBC、Ret、HbF)变化。结果如下所述1)血液学指标检查结果如表18所示，结果表明，患者自服安慰剂药一个月至疗程结束，主要疗效性指标Hb、RBC均无升高，Hb在口服安慰剂第一个月有明显降低(P＜0.05)，而改服实施例1制备的药物自第一个月起至疗程结束患者Hb、RBC与服安慰剂第三个月比均有非常明显提高(P＜0.001)；网织红细胞(Ret)和胎儿血红蛋白(HbF)口服安慰剂第一个月、第三个月有明显上升(P＜0.05，P＜0.01)，而改服实施例1制备的药物自第一个月起至疗程结束患者Ret与服安慰剂第三个月比均有非常明显提高(P＜0.001)；胎儿血红蛋白(HbF)在口服安慰剂第三个月有明显提高(P＜0.01)，而改服实施例1制备的药物自第一个月起至疗程结束患者HbF与服安慰剂药第三个月比均有非常明显提高(P＜0.001)表18.服安慰剂后给实施例1制备的药物治疗患者Hb、RBC、Ret、HbF动态变化结果(X±s) 2)中医证候评分量表分析结果如表19所示，结果表明，口服安慰剂三个月，患者临床中医症状无任何改善，经实施例1制备的药物治疗三个月后，患者临床中医证候评分量化分析，六种证候中，除“面色萎黄”一项无明显改善外，“头晕目眩”、“心悸”、“气短”、“食少纳呆”、“倦怠乏力”等症状均有明显改善。临床症状从治疗第一个月起至疗程三个月结束，均有明显改善；第一阶段服安慰剂患者中医证候量化分析结果显示，服药前、后无明显改变；而改服实施例1制备的药物治疗后临床症状均有明显改善。
表19.实施例1制备的药物治疗β-地中海贫血患者中医证候评分量表统计结果(x±s)

与口服安慰剂三个月后比较▲p＜0.05▲▲p＜0.01▲▲▲p＜0.0013)服药两个阶段β-地贫患者疗效比较如表20所示，结果表明口服安慰剂三个月后改服实施例1制备的药物治疗三个月，两个阶段β-地贫患者有效率比较有非常显著性差异(P＜0.01)。表明实施例1制备的药物治疗β-地贫疗效显著。
表20.服安慰剂后给实施例1制备的药物治疗30例β-地贫患者疗效统计

小结中医临床证候量表统计分析显示给服实施例1制备的药物后，患者临床症状除“面色萎黄”无明显改善外，“食少纳呆”、“头晕目眩”、“心悸”、“气短”、“倦怠乏力”等症状均明显改善(P＜0.05)。
4、实施例1制备的药物临床分析1989年7月至2005年1月在广西高发区收集符合条件的可治疗的β-地中海贫血病例，用实施例1制备的药物治疗156例，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，疗程三个月，其中符合重型β-地贫者63例(18例为β-地贫复合血红蛋白E型)，中间型93例(35例为β-地贫复合血红蛋白E型)。均按国际诊断β-地中海贫血标准和疗效标准评价，结果如表21、表22所示，表明用实施例1制备的药物治疗三个月后，重型、中间型β-地贫患者Hb、RBC、Ret、HbF均有显著升高(P＜0.005)，实施例1制备的药物对重型β-地贫患者有效率为80％，对中间型患者均有效，总有效率92.90％。
表21.156例β-地贫患者治疗前后Hb、RBC、Ret、HbF比较(x±s)

与治疗前比较*P＜0.05，***P＜0.001表22.实施例1制备的药物治疗156例β-地贫患者疗效统计

包含山茱萸6-12份和何首乌4-10份和炙黄芪4-8份和阿胶2-6份的药物以及该药物再加上重量份数为3-8份的党参和/或重量份数为4-8份的鸡血藤和/或重量份数比为4-8份的鳖甲和/或重量份数为1-4份的砂仁和/或重量份数为6-10份的熟地和/或重量份数为4-10份的补骨脂和重量份数为4-8份的当归制备的药物，以及实施例2-5制备的药物的疗效实验表明，与实施例1制备的药物没有明显差别。
实施例8、本发明治疗地中海贫血的药物及其制剂的临床疗效机理实验1、治疗β-地中海贫血症对患者血红蛋白组份和血红蛋白珠蛋白链比值影响24例病例均用实施例1制备的药物治疗，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，3个月为一疗程。治疗前后，分别采用等电聚焦电泳检测患者血红蛋白组份，用变性PAGE和改进圆盘电泳法，检测治疗前后血红蛋白(Hb)，血红蛋白F(HbF)和血红蛋白珠蛋白链比值(γ/β+γ)的变化。部分结果如表23(图3)，图4所示，表明经三个月治疗后患者血红蛋白(Hb)升高的同时，血红蛋白F(HbF)明显上升(P＜0.001)，实施例1制备的药物治疗后血红蛋白珠蛋白链比值即γ/β+γ(β和γ分别为血红蛋白组分)比治疗前明显上升(P＜0.001)。
表23 24例β-地中海贫血患者治疗前后血红蛋白组分的变化

2、本发明的药物治疗β-地中海贫血对外周血珠蛋白转录水平影响28例β-地中海贫血病例均用实施例1制备的药物治疗，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，3个月为一疗程。采用两两配对引物共扩增法分析治疗前后α、β、γ珠蛋白mRNA片段，检测γ/β+γmRNA的克分子比，计算γ/β+γmRNA的克分子比。
取治疗前后患者的溶血样品提取RNA，进行RT-PCR扩增，引物序列如下F1AAGACCAACGTCAAGGCCGCC和R1TGCACGCGCACAAGCTTCGGGT；F2ACTAGCAACCTCAAACAGACACCA和R2AGCAGCTTGTCACAGTGCAC；F3ACTCGCTTCTGGAACGTCTGA和R3GTATCTGGAGGACAGGGCACT。其中，用F3和R3，F2和R2引物共扩增γ与β珠蛋白基因，用F1和R1，F2和R2引物共扩增α与β珠蛋白基因，扩增的产物进行PAGE凝胶电泳，放射自显影，激光密度扫描，放射自显影图谱如图2所示，图2中泳道1-4为α与β珠蛋白基因共扩增结果，泳道5-8为γ与β珠蛋白基因共扩增结果。γ/β+γmRNA比值的测定部分结果如表24和图5所示。结果表明经实施例1制备的药物治疗3个月后，28例患者中血红蛋白γ/β+γmRNA克分子比与疗前比有明显提高(P＜0.001)，升高者占89.3％以上，表明患者外周血中γ珠蛋白、γ/β+γmRNA水平明显提高，表明实施例1制备的药物可通过激活γ-珠蛋白基因，促进γ-珠蛋白表达，使HbF合成增加，从而代偿了β-珠蛋白基因的缺陷，缓解贫血程度。
表24.治疗前后γ/β+γmRNA比值的测定结果

3、本发明的药物治疗β-地中海贫血症，对患者外周血GM-CSF mRNA表达影响的实验已证明，GM-CSF是具有广谱效应的多肽生长因子，GM-CSF主要促进造血祖细胞的增生与分化和增强成熟细胞的免疫功能，在免疫应答和炎性反应中起重要的调节作用。也可以刺激巨核细胞生长，对红细胞生长有辅助调节作用。下述实验从造血刺激因子表达水平，为阐述本发明药物治疗β-地贫分子机理提供了客观依据。
28例β-地中海贫血病例均用实施例1制备的药物治疗，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，3个月为一疗程。
从治疗前后患者外周血红细胞裂解液中提取RNA，进行RT-PCR扩增反应，引物为上述F1和R1(扩增α-globin)以及F4CCTGAACCTGAGTAGAGACACT和R4GCTGGCCATCATGGCAAGG(扩增GM-CSF)。将扩增产物进行电泳，放射自显影，然后激光光密度扫描，并以α-globin作为内标准，以GM-CSF与α-globin的相对比值的改变作为GM-CSF mRNA转录水平变化的指标。部分实验结果如表25和图6所示，结果表明表明实施例1制备的药物能明显促进β-地中海贫血症患者外周血GM-CSF mRNA表达。
表25.β-地中海贫血患者经中药治疗前后静脉血细胞中GM-CSF转录水平的变化

t＝5.4384p为1％时，t23＝2.807，t＞t23∴有非常显著的差异这一结果在动物实验中得到进一步的证实本发明的药物能明显提高60Co辐射损伤小鼠骨髓造血刺激因子GM-CSF mRNA表达。
4、本发明的药物治疗对β-地中海贫血症患者血淋巴细胞免疫功能的影响。
12例β-地中海贫血病例均用实施例1制备的药物治疗，用法为2-6岁0.5g生药/次，每日2次；6-10岁1g生药/次，每日2次；10岁以上2g生药/次，每日3次，3个月为一疗程。用流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜系统动态观察治疗对β-地中海贫血症患者外周血T细胞亚群，NK细胞、淋巴细胞、DNA荧光强度变化，结果表明治疗后患者外周血，淋巴细胞总数，辅助T细胞(TH)，抑制T细胞(TS)及TH/TS比值，均有一定升高，但不具统计学意义。治疗后外周血淋巴细胞核超于正常。DNA分布均匀，含量增加，DNA、RNA荧光强度增加，结果表明本发明的药物能维持淋巴细胞的正常结构和生理形态，促进其功能的恢复。
表26.实施例1制备的药物对β-地中海贫血患者外周血T淋巴细胞亚群的影响

5、本发明的药物对小鼠免疫功能影响用环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下模型，随机分成五组，分别为模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，生血丸组，每组10只。小、中、大三个剂量组按给药剂量分别是2.5、5.0和10g生药/kg分别灌胃实施例1中制备的药物，生血丸组为灌胃2.5g生血丸(天津达人仁堂制药厂生产，批号9610201)，对照组灌胃等量水。另外以10只正常小鼠组成正常对照组，灌胃等量水，每天一次，两周后观察实施例1制备的药物对造型小鼠免疫器官重量，腹腔吞噬细胞吞噬功能和对血中SIgA，IgG水平的影响，结果如表27、28、29所示，结果表明，实施例1制备的药物能明显提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫器官脾、胸腺重量，能明显提高巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数；能提高血中SigA、IgG水平。表明，实施例1制备的药物有较好的提高免疫功能作用，且表现一定的量效关系。
表27.实施例1制备的药物对小鼠免疫器官的影响

与模型对照组比*P＜0.05，**P＜0.01表28.实施例1制备的药物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数的影响


与模型对照组比*P＜0.05，**P＜0.01表29.实施例1制备的药物对小鼠免疫球蛋白含量的影响

与模型对照组比*P＜0.05，**P＜0.016、本发明的药物对溶血性血虚模型小鼠的治疗作用本项试验根据乙酰苯肼可以引起试验动物造血系统损害，以红细胞溶血为主要特征，与血虚病人的临床表现极为相似。
用乙酰苯肼造成溶血性贫血模型，随机分成五组，分别为模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，生血丸组，每组10只。小、中、大三个剂量组按给药剂量分别是2.5、5.0和10g生药/kg分别灌胃实施例1中制备的药物，生血丸组为灌胃2.5g生血丸(天津达人仁堂制药厂生产，批号9610201)，对照组灌胃等量水。另外以10只正常小鼠组成正常对照组，灌胃等量水每天一次，两周后，检测小鼠的红细胞数量、红细胞压积和血红蛋白含量，骨髓有核细胞数量等性状。
结果表明，实施例1中制备的药物对乙酰苯肼所引起的试验动物造血系统损伤有显著的防治作用能明显提高血虚小鼠的红细胞数量、明显提高红细胞压积和血红蛋白含量(表30)；能明显提高血虚小鼠骨髓有核细胞数量将小鼠处死后，剥取一侧股骨，用5ml生理盐水冲洗股骨腔，稀释后在显微镜下计数骨髓有核细胞数量。表31表明，与正常对照组相比，模型对照组的骨髓有核细胞数量明显降低，实施例1中制备的药物可使各试验组的骨髓有核细胞数量随着剂量的增加而明显提高。
实施例1中制备的药物可抑制乙酰苯肼引起血虚小鼠肝脾肿大；对造型小鼠肝、脾组织在形态学上有一定的恢复作用将小鼠处死后，称取小鼠肝、脾重量，计算小鼠肝、脾脏器系数。结果如表32所示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的肝脾明显肿大，实施例1中制备的药物可明显抑制血虚小鼠的肝脾肿大，使各试验组的肝脾肿大程度随剂量增加明显减低。其中，中剂量小鼠的脾脏器系数明显小于生血丸组(P＜0.05)。
表30.实施例1中制备的药物对小鼠红细胞的影响

方差分析与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01表31.实施例1中制备的药物对小鼠骨髓有核细胞数量的影响

表32.实施例1中制备的药物对小鼠肝、脾脏器系数的影响

方差分析与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01t-检验与生血丸组比较，#P＜0.057.本发明药物对小鼠肝、脾组织形态学的影响1)对乙酰苯肼造模小鼠治疗作用用乙酰苯肼造成溶血性贫血模型，随机分成五组，分别为模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，生血丸组，每组10只。小、中、大三个剂量组按给药剂量分别是2.5、5.0和10g生药/kg分别灌胃实施例1中制备的药物，生血丸组为灌胃2.5g生血丸(天津达人仁堂制药厂生产，批号9610201)，对照组灌胃等量水。另外以10只正常小鼠组成正常对照组，灌胃等量水，每天一次，半个月后，将小鼠处死后，取小鼠肝、脾脏器，用10％福尔马林液固定。切片后H-E染色，在显微镜下观察小鼠肝、脾组织形态学的变化。
①对肝组织形态学的影响同正常对照组相比，用乙酰苯肼造模的所有试验小鼠肝组织均出现明显的病理形态改变，其中模型对照组小鼠肝细胞浊肿，而实施例1中制备的药物小、中、大剂量组和生血丸组小鼠受损的肝组织形态得到部分恢复，表现为肝小叶结构基本恢复正常，肝细胞浊肿减轻，但各试验组间无明显区别。
②对脾组织形态学的影响；同正常对照组相比，用乙酰苯肼造模的所有试验小鼠脾组织均出现明显的病理形态改变，其中模型对照组小鼠脾小结结构明显萎缩，而实施例1中制备的药物小、中、大剂量组和生血组小鼠受损的肝组织形态得到部分恢复，表现为脾小结结构基本恢复正常，但各试验组间无明显区别。
2)对苯中毒骨髓损伤小鼠治疗作用用苯中毒造成的造血系统损害模型，然后按5g生药/kg的量灌胃实施例1中制备的药物，每天次，一周后，观察小鼠体重、骨髓有核细胞数量、肝、脾组织形态学等性状的变化。
结果表明，实施例1中制备的药物对苯中毒所引起的造血系统损害有显著的治疗作用。能明显改善苯中毒小鼠整体状态，增加体重，降低死亡率。能明显提高苯中毒小鼠白细胞和红细胞数量，能明显提高苯中毒小鼠的骨髓有核细胞数量，能明显提高苯中毒小鼠网织红细胞数量。对苯中毒小鼠肝、脾脏器系数无明显影响，对肝脾组织形态学上有一定的恢复作用。
3)对马利兰诱发骨髓造血障碍小鼠模型的治疗作用用马利兰诱发骨髓造血障碍，于造型13周后，随机分成五组，分别为模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，生血丸组，每组10只。小、中、大三个剂量组按给药剂量分别是2.5、5.0和10g生药/kg分别灌胃实施例1中制备的药物，生血丸组为灌胃2.5g生血丸(天津达人仁堂制药厂生产，批号9610201)，对照组灌胃等量水。另外以10只正常小鼠组成正常对照组，灌胃等量水，每天一次，10天后，观察实施例1中制备的药物的治疗作用；另采用造型同时预防给药，结果表明①马利兰造型13周后小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓有核细胞明显减少，红细胞、网织红细胞、血红蛋白变化不大。
②实施例1中制备的药物给药治疗三周后可明显提高造型小鼠红细胞、血小板、髓有核细胞数目，对红细胞、网织红细胞、血红蛋白变化不大。
③实施例1中制备的药物预防给药可以明显提高马利兰造型小鼠外周血白细胞、血小板及骨髓有核细胞数目，对红细胞、网织红细胞、血红蛋白影响不明显。
4)对小鼠骨髓早期造血祖细胞的增殖分化的影响本研究用半固体琼脂克隆形成法测定粒单系祖细胞(CFU-EGM)的方法及微量甲基纤维素法测定红系祖细胞(BFU-E，CFU-E)的方法，检测了实施例1中制备的药物对小鼠骨髓CFU-GM和CFU-E及BFU-E的作用。
实施例1中制备的药物灌胃对小鼠骨髓造血祖细胞的效应，实施例1中制备的药物在1.7-7.6g，kg-1，灌胃给药10天后，对骨髓粒单细祖细胞，(GM-CFU)，早期红系祖细胞，(BFU-E)晚期红系祖细胞(CFU-E)均有促进增殖分化作用。
表1显示实施例1中制备的药物在1.99-7.6g生药·kg-1，三个剂量给小鼠灌胃10天小鼠骨髓粒单细胞(CFU-GM)增殖活性明显提高与生血丸一样有促增殖作用；对早期红系祖细胞(BFU-E)也有明显的促进增殖作用，其中1.99g生药·kg-1，3.88g生药·kg-1剂量组有统计学意义；经10天给药后小鼠晚期红系祖细胞(CFU-E)三个剂量组均有非常显著的促进增殖作用。
上述试验提示实施例1中制备的药物能明显促进给药小鼠骨髓粒单系祖细胞(CFU-GM)早，晚期红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)增殖表33.实施例1中制备的药物灌胃对小鼠骨髓造血祖细胞的效应

包含山茱萸6-12份和何首乌4-10份和炙黄芪4-8份和阿胶2-6份的药物、以及该药物再加上重量份数为3-8份的党参和/或重量份数为4-8份的鸡血藤和/或重量份数为4-8份的鳖甲和/或重量份数为1-4份的砂仁和/或重量份数为6-10份的熟地和/或重量份数为4-10份的补骨脂和重量份数为4-8份的当归制备的药物，以及实施例2-5制备的药物的临床疗效机理实验表明，与实施例1制备的药物没有明显差别。
权利要求
1.一种治疗地中海贫血的药物，主要由以下重量份的原料制成山茱萸6-12份 何首乌4-10份炙黄芪4-8份阿胶2-6份。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所述原料中还包含重量份数为3-8份的党参和/或重量份数为4-8份的鸡血藤和/或重量份数为4-8份的鳖甲和/或重量份数为1-4份的砂仁和/或重量份数为6-10份的熟地和/或重量份数为4-10份的补骨脂和/或重量份数为4-8份的当归。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述治疗地中海贫血的药物，主要由以下重量份的原料制成山茱萸6-12份 何首乌4-10份 熟地6-10份补骨脂4-10份炙黄芪4-8份当归4-8份 阿胶2-6份 党参3-8份鸡血藤4-8份鳖甲4-8份 砂仁1-4份。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述治疗地中海贫血的药物，主要由以下重量份的原料制成山茱萸12份 何首乌8份 熟地8份 补骨脂6份炙黄芪6份 当归6份阿胶3份 鸡血藤6份党参6份鳖甲8份砂仁2份。
5.根据权利要求1-4任一所述的药物，其特征在于所述药物中还含有1-2重量份的矫味剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述药物中还包含3-12重量份的辅料；所述辅料为糊精、β-环糊精、HP-β-CD、DM-β-CD、α-CD、淀粉或γ-CD。
7.制备权利要求3或4所述的药物的方法，包括下述步骤1)在由6-12重量份的山茱萸和4-10重量份的何首乌组成的混合物中加入是山茱萸和何首乌总质量2-10倍的质量百分含量为30％-95％乙醇在70-90℃加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液，除去乙醇；2)在由4-8重量份的当归和1-4重量份的砂仁组成的混合物中加入是当归和砂仁总质量4-10倍量的水浸泡1-4小时，水蒸气蒸馏1-10小时，收集挥发油；3)在由6-10重量份的熟地、4-8重量份的炙黄芪、3-8重量份的党参、4-8重量份的鳖甲、4-10重量份的补骨脂和4-8重量份的鸡血藤组成的混合物中加入是熟地、炙黄芪、党参、鳖甲、补骨脂、鸡血藤总质量6-10倍的水，煎煮2-3次，每次1-2小时，合并煎液与步骤1)得到的提取液混合，减压浓缩至50℃相对密度为1.20-1.40的稠膏；4)将阿胶冷冻粉碎与步骤2)得到的挥发油和步骤3)得到的稠膏混合，即得治疗地中海贫血的药物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤2)的挥发油用是其1-10倍质量的β-环糊精或羟丙基倍他环糊精、2，6-二-O-二甲基-β-环糊精、β-环糊精或γ-CD包含。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述包含步骤为在20-60℃，在所述β-环糊精或羟丙基倍他环糊精、2，6-二-O-二甲基-β-环糊精、β-环糊精或γ-CD的水溶液中，加入所述步骤2)得到的挥发油，包含10-60分钟，1-8℃冷藏2-12小时，低温干燥，得到挥发油的环糊精包含物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤4中还加有1-2重量份矫味剂和3-12重量份的辅料，所述辅料为糊精、β-环糊精、HP-β-CD、DM-β-CD、α-CD、淀粉或γ-CD。
全文摘要
本发明公开了一种治疗地中海贫血的药物及其制备方法。该药物，是由以下重量配比的原料制成山茱萸6－12份、何首乌4－10份、炙黄芪4－8份、阿胶2－6份。本发明的药物治疗β－地中海贫血症临床实验取得了可重复的肯定疗效，并且，临床症状明显改善与外周血象的提高有很好的一致性，其中，血红蛋白(Hb)明显升高(P＜0.001)，疗效维持时间长，后效应好。本发明的药物治疗β－地中海贫血症能从不同的途径代偿β－珠蛋白基因功能缺陷。
文档编号A61P7/06GK1872182SQ20061007886
公开日2006年12月6日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者吴志奎 申请人:中国中医研究院广安门医院