专利名称：酿酒酵母细胞培养分泌液制备方法及其抗dna病毒和促肝细胞生长的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及酿酒酵母细胞培养分泌液制备方法及其抗DNA病毒和促肝细胞生长的用途， 属于生物医药领域。乙型肝炎病毒(HBV)属于DNA病毒，其造成的急慢性肝炎、肝坏死及肝细胞癌对人类 健康危害极大，每年死于肝癌的人数达100万以上。以往由于HBV受宿主范围狭窄和缺乏体 外培养系统的限制，阻碍了抗HBV药物的研究。近年来，随着HBV DNA转染细胞系的相继建 立，为抗HBV药物筛选提供了必要的条件。发明内容本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有药用价值的酿酒酵母细胞培养分泌液。本发明要解决的第二个技术问题是提供这种酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法。 本发明要解决的第三个技术问题是提供这种酿酒酵母细胞培养分泌液抗DNA病毒和促 肝细胞生长的用途。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案酿酒酵母细胞培养分泌液，采用以下方法制备挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml 的PD培养液中，3(TC振摇过夜取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28—3(TC (优选 28匸)振摇40—60小时(优选48小时)用0.2微米的滤膜过滤除菌即得。所述PD培养液的配方和制法为水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化钠7— 12克溶于灭菌水1000毫升高压8磅40分钟灭菌。调PH值7—8。最优选的配方为水解乳蛋白15克；葡萄糖10克氯化钠9克；溶于灭菌水1000毫 升。调PH值7.5。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 1001,培养温度为28 30^C。我们还发现其他来源的酿酒酵母也具有本发明公开的作用。酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法，挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml的PD培 养液中，30X:振摇过夜取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28—3(TC (优选28"C) 振摇40—60小时(优选48小时)；用0.2微米的滤膜过滤除菌即得。
所述PD培养液的配方和制法为水解乳蛋白10—20克葡萄糖5—15克；氣化钠7— 12克；溶于灭菌水1000毫升；高压8磅40分钟灭菌。调PH值7—8。本发明可以扩大规模 进行生产，例如使用工业化生产工艺，则培养基的用量和接种量均有适当比例的增加。最优选的配方为水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氯化钠9克；溶于灭菌水1000毫 升。调PH值7.5。酿酒酵母细胞培养分泌液具有抗DNA病毒的作用,可以用来制备治疗DNA感染引起的疾 病的药物。所述DNA病毒包括疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒等，其中肝炎病毒为乙型 肝炎病毒(HBV)。本发明提供的酿酒酵母细胞培养分泌液还具有促肝细胞生长的作用,尤其可促进和修复 人为造成的肝细胞机械性损伤，可以用来制备治疗肝细胞损伤相关疾病的药物。本发明药效学试验采用HBV DNA全基因组的重组质粒转染人的肝癌细胞HepG2获得的 2215细胞，该细胞能向培养上清中稳定的分泌HBsAg和HBeAg及完整的HBV颗粒， 是目前国内外公认的用于体外筛选抗HBV药物较理想的实验模型。本发明采用2215细胞测定酿酒酵母细胞培养液的毒性反应，证实该分泌液不仅没 有毒性作用，反而还对还具有促进作用，这可能是由于酿酒酵母细胞培养分泌液抑制了 HBV DNA的复制而使2215细胞趋向正常细胞所致。当酿酒酵母细胞培养液稀释1: 1000或1:2000时对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为52.11 %和59.85%， 提示本发明在体外达到一定浓度时有较好的抗HBV活性。以含有酿酒酵母细胞培养液的培养液培养大鼠原代肝细胞的实验证明，本发明具 有促肝实质细胞生长，延长培养时间，维持细胞正常形态和抑制肝细胞纤维化等作用。本发明的优点是本发明意想不到地发现经过PD培养基培养和简单纯化后的酿酒 酵母细胞培养分泌液具备显著的抗DNA病毒和促肝细胞生长的作用，为治疗乙型肝炎和肝 损伤性疾病提供了新的治疗药物。下面结合较佳实施方式对本发明作进一步说明,凡依照本发明公开内容所作的本领域任 何等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1.制备酵母细胞培养分泌液 一.材料PD培养基水解乳蛋白15克(购于北京双旋微生物培养基制品厂) 葡萄糖IO克(北京博大生物科技有限公司) 氣化钠9克(北京博大生物科技有限公司) 溶于灭菌水1000毫升，高压8磅40分钟灭菌。PH值7.5。 酿酒酵母CICCIOOI (购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)二.方法挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml的PD培养液中，301C振摇过夜；取l毫升转接到 500毫升的PD培养液中，28t:振摇48小时；用O. 2微米的滤膜过滤除菌即得。实施例2.体外抗病毒试验一. 材料酵母细胞培养分泌液按实施例l方法制备，进行10倍浓縮。人肝癌2215细胞(2.2.15细胞)美国西奈山大学医学院生化科赠送北京医科大学第一医院傅希贤教授转赠。培养液DMEM,内含380ug/mlG418(美国GIBCO公司)青、链每素各100IU/ml， 10%无支原体小牛血清(购于杭州四季青生物工程材料研究所)03%谷氨酰胺，pH值7.0左右。二. 方法1. 2215细胞分泌HBsAg和HBeAg规律的测定将2215细胞按lX105个/ml接种培养瓶(10ral/瓶)，每隔3天换液并收集上清液，置一20 "保存，共收8次，然后同时检测各上清液中的HBsAg和HBeAg。2. 细胞毒性试验培养至单层的2215细胞分别用酿酒酵母细胞培养分泌液和DEME培养液共同培养 5天(其中，酿酒酵母细胞培养分泌液与DEME培养液的体积比分别为1: 10, 1: 50， 1: 100， 1: 200),同时设不含该分泌液的DMEM培养液培养细胞作为对照，每日在 光学显微镜下观察细胞形态变化,取无细胞毒性作用的最低稀释度为抗HBV的起始浓度。3. 酿酒酵母细胞培养分泌液抗HBV活性试验2215细胞以1 X 105个/ml分瓶培养9天后用酿酒酵母细胞培养分泌液和DEME培养液 共同继续培养5天，收集细胞上清液测定HBsAg。以抑制率大于50。^为有效抑制浓度。对照孔P/N比值一试验孔P/N比值抑制率=-对照孔P/N比值
三.结果1. 2215细胞分泌HBsAg和HBeAg规律的测定试验表明2215细胞在接种后的第3天即可从培养上清中检测出HBsAg和HBeAg, 而且HBeAg的值略髙，当培养到第9天时，两种抗原的分泌量出现高峰，并在15天后 缓慢下降，见表1所示。表l:2215细胞分泌HBsAg和HBeAg规律的培养上清液P/N值培养时间(天)HBsAgHBeAg33.825.4167.459.56916.1021.311216.8321,851516.3221.791815.3720,922112.6218.61249.3216.142. 细胞毒性试验以不同稀释度的酿酒酵母细胞培养分泌液和DEME培养液共同培养2215细胞5天 后，未见细胞出现不良反应，出乎意料的是，用加入酿酒酵母细胞培养分泌液的DEME 培养基培养的细胞，其形态、立体感、致密度均优于未加该分泌液的。3. 酿酒酵母细胞培养分泌液抗HBV活性试验结果见表2，表明酿酒酵母细胞培养分泌液对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制 率与酿酒酵母细胞培养分泌液的浓度呈正相关。表2:酿酒酵母细胞培养液对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率(％ )酿酒酵母细胞培养液稀释度(l:)100200500100020004000HBsAg96.6288.5275.8352. n37.8126.27HBeAg99.1793.2287.5475.1359.8548.13
实施例3.酿酒酵母细胞培养分泌液促肝细胞生长及抑制肝纤维化细胞的作用一. 材料成年雄性Wistar大鼠，体重200土20g，本院实验动物中心提供， 1V型胶原酵，SIGMA公司产品，培养液DMEM，内含380u g/mlG418 (美国GIBCO公司)青、链雾素各100IU/ml， 10%无支原体小牛血清(购于杭州四季青生物工程材料研究所)03%谷氨酰胺， pH值7.0左右。二. 方法1. 分离肝细胞肝细胞的分离和培养大鼠肝细胞分离方法采用原位二步灌注法。取 Wistar大鼠，用0.594戊巴比妥钠麻醉，固定，无菌处理后开腹。门静脉插管。灌注先经37r 水浴并通氧气的无Ca Mg"离子的Hanks液，以洗去肝中血液。待肝颜色变白后，换用经37匸 水浴并通氧气的0.0296的IV型胶原酶继续灌注。约10min后取出肝脏，碎过滤离心 700卬m/min 3次。将细胞悬浮于含1096无支原体小牛血清的DMEM中。计数后，以lXl()S个/ral接种培养瓶，于37^含5% ca的孵箱中培养。2. 培养和观察用含不同浓度的酿酒酵母细胞培养液培养鼠肝细胞(酿酒酵母细胞培 养分泌液与DEME培养液的体积比分别为1: 10， 1: 50, 1: 100, 1: 200)，每隔4天 换液，每R镜检比较细胞生长情况。二.结果镜检结果表明，酿酒酵母细胞培养分泌液具有促肝细胞贴壁、生长和维持细胞正 常形态及延长培养时间等作用，尤其在人为造成肝细胞机械性损伤(吸管用力吹打) 后，酿酒酵母细胞培养液可有效促进肝细胞修复和再生。此外，酿酒酵母细胞培养分 泌液对肝贮脂细胞有明显的抑制作用，延缓了肝细胞的纤维化过程。
权利要求
1. 酿酒酵母细胞培养分泌液，其特征在于采用以下方法制备挑取酿酒酵母单克隆 菌落，接种于5ml的PD培养液中，30r振摇过夜；取1毫升转接到500毫升的PD培养液中， 28—30'C振摇40—60小时；用0.2微米的滤膜过滤除菌即得；PD培养液的配方和制法为水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化钠7 — 12克;溶于灭菌水1000毫升高压8磅40分钟灭菌，pH值为7-8。
2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母细胞培养分泌液，其特征在于所述PD培养液的配 方为水解乳蛋白15克；葡萄糖10克氯化钠9克；溶于灭菌水1000毫升，pH值为7. 5。
3. 根据权利要求1或2所述的酿酒酵母细胞培养分泌液，其特征在于所述酿酒酵母 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 1001。
4. 酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法，其特征在于挑取酿酒酵母单克隆菌落，接 种于5ml的PD培养液中，30TC振摇过夜；取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28—30 t:振摇40—60小时用0. 2微米的滤膜过滤除菌即得；PD培养液的配方和制法为水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化钠7 — 12克;溶于灭菌水1000毫升；高压8磅40分钟灭菌，pH值为7-8。
5. 根据权利要求4所述的酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法，其特征在于所述PD培养液的配方为水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氣化钠9克；溶于灭菌水1000毫升，pH 值为7.5。
6. 根据权利要求4或5所述的酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法，其特征在于所 述酿酒酵母购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 1001。
7. 酿酒酵母细胞培养分泌液制备治疗DNA感染引起的疾病的药物的用途。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述DNA病毒包括疱疹病毒、乳头状瘤 病毒或肝炎病毒。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒。
10. 酿酒酵母细胞培养分泌液在制备治疗肝细胞损伤相关疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了酿酒酵母细胞培养分泌液制备方法及其抗DNA病毒和促肝细胞生长的用途，属于生物医药领域。酿酒酵母细胞培养分泌液，采用以下方法制备挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml的PD培养液中，30℃振摇过夜；取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28-30℃振摇40-60小时；用0.2微米的滤膜过滤除菌即得。本发明的优点是本发明意想不到地发现经过PD培养基培养和纯化后的酿酒酵母细胞培养液具备显著的抗DNA病毒和促肝细胞生长的作用，为治疗乙型肝炎和肝损伤性疾病提供了新的治疗药物。
文档编号A61K36/06GK101121922SQ20061008919
公开日2008年2月13日 申请日期2006年8月8日 优先权日2006年8月8日
发明者洪 刘, 貌盼勇 申请人:中国人民解放军第三○二医院;王 涛