专利名称：治疗药的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用巨噬细胞的吞噬能力、实现功能异常巨噬细胞的正常化、或对各种的感染性病原体有效的治疗药。本发明的治疗药(药物或制剂)是根据治疗上和/或诊断上的目的所赋予的一切物质及这些物质的集合体为对象、其制剂是药物(有时含药物载体)与药物载体的合剂。
背景技术：
I.巨噬细胞首先，对在本发明的治疗药的作用中发挥主要功能的巨噬细胞进行简述。
对巨噬细胞的形态、功能，例如高桥洁等著“维持生命的巨噬细胞”(文光堂，2001年)中已有详细，但有关本发明的背景描述如下。所谓巨噬细胞是构成单核吞噬细胞体系(MPSMononuclear PhagocyteSystem)的细胞。血中的单核细胞(monocyte)来自骨髓细胞中的造血干细胞，在骨髓中分裂、分化流到血中，固定在各种的组织上向以各种名称命名的单核细胞(monocytic cell)分化。该细胞在结合组织中称组织细胞，在肝脏中称肝窦星形细胞(Kupper cell)，在肺中称肺胞巨噬细胞，在淋巴节/脾脏中称巨噬细胞，在体腔中称胸腔/腹腔巨噬细胞，在骨骼中称破骨细胞，在皮肤中称兰格汉斯细胞，在神经组织中称微胶细胞，在脑中称小胶质细胞细胞，在滑膜中称A型细胞，具有组织独特的性质。
1.一般特性(1)是直径约15～20μm的单核细胞，富含细胞质，易粘在玻璃或塑料表面上，利用伪足运动、具有强的异物吞噬作用。
(2)担当防御生物的细胞。
(3)具有排除异物功能和免疫功能。
(4)对T淋巴球提示抗原信息建立免疫。
(5)被干扰素活化形成细胞性免疫的效应物(effector)。
(6)比淋巴球耐X射线。
2.巨噬细胞的生理性意义(1)吞噬功能作为巨噬细胞的功能，最熟知的是吞噬作用。这种功能可视为生命诞生、生命进化时自单细胞的时代所具备的最基本的功能之一。因此，巨噬细胞的特征之一，是巨噬细胞的存在具有种横断(species-transversely)的普遍性。该特征估计提供研究巨噬细胞功能为对象的一大优点。即，假如是进行哺乳动物的疾病为对象的治疗药的开发研究时，哺乳动物以外的巨噬细胞也可以功能性地作为研究材料使用。这方面，取决于巨噬细胞是系统发育所保存的细胞。
(2)防御生物功能作为巨噬细胞的功能，次重要的是防御生物作用。这种作用称作非特异性防生物作用，近年的研究在逐渐搞清巨噬细胞的防生物作用也有特异性。原来非特异性的叫法是对T细胞赋予特征的抗原特异性或与免疫记忆相对应的叫法，由于现在还没证明严格意义上的抗原特异性或免疫记忆存在于巨噬细胞中，所以巨噬细胞的防生物作用称非特异性并不错。然而，例如根据病原体的种类，似乎巨噬细胞的应答呈现质的不同，而且该质的不同的应答的一部分，呈现与识别巨噬细胞表面病原体的受体的不同相对应的状态，如果从细胞应答对异物(或环境)的刺激角度考虑，则也可以说巨噬细胞的作用是特异性。
现在，根据上述观点，一般在不断地对巨噬细胞为中心的防生物作用寻找先天免疫系统(The innate immune system)，对T细胞为中心的防生物作用寻找获得免疫系统(The acqnired immune system)。此外，如果考虑巨筮细胞的系统发生的普遍性，虽然理所当然，但先天免疫系统也还是系统发生的高度被保存的防生物系统。
(3)先天免疫系统巨噬细胞为中心的先天免疫系统当然在不具有获得免疫系统的生物种，即使是具有获得免疫系统的生物种，也发挥称之为异物识别、排除系统的防生物系统的主要作用。既使是具有获得免疫系统的生物，病原体等的异物的识别、排除在大部分的情况下也由先天免疫系统的功能维持，但这种功能不充分的情况则动员获得免疫系统。这种情况，特异性异物识别也必须由巨噬细胞等的抗原提示，排除外来异物时，发挥排除系统主要作用的还是巨噬细胞等的构成先天免疫系统的细胞。
(4)排除异物另外，内因性的异物(例如，除去病毒感染细胞)等，虽然获得免疫是利用特征性的细胞伤害性T细胞排除，但该细胞伤害性T细胞的增殖与成熟两方，都必须是接受巨噬细胞等的抗原提示的另外的T细胞。即，获得免疫为了发挥充分的功能，则先天免疫系统以完全且按照目的起作用为前提。
(5)功能不全因此，巨噬细胞的吞噬或抗原提示等的功能不全，毫无疑问地变成免疫缺陷的潜在性的原因。具体地来讲，首先，作为与I.1(巨噬细胞的一般特性)中所述的诸点有关的功能不全与疾病已知以下所述的几点。即1)作为吞噬异物作用异常的吞噬功能异常症，已知白血球粘接缺乏症、谢迪亚克-东综合症等。任何一种情况吞噬功能均有异常，后者时，由于溶酶体酶向吞噬空腔的输送有异常，故杀菌能力降低，吞噬能力明显地亢进。
2)作为防生物功能异常的疾病，可列举慢性粘膜皮肤念珠菌病。患这种病患者的巨噬细胞移迁能力降低，念珠菌的杀菌能力也降低。
3)作为排除异物功能和免疫能力异常的疾病，可列举维-奥综合症(免疫力降低)。患者呈现巨噬细胞活动异常、抗体依赖性细胞伤害作用缺乏等复杂的免疫异常。
4)作为抗原信息提示功能异常，已知不论T细胞，B细胞正常还是重病引起免疫缺陷的主要组织适合(MHC)类别II抗原缺乏病。
5)作为被干扰来活化、有关细胞性免疫效应基因问题的功能异常，已知缺干扰素受体的幼儿成为不能防结核菌感染的结核菌感染致死的干扰素受体缺乏症。
此外，缺乏获得免疫细胞的哺乳动物虽然存在且可生存，但缺乏巨噬细胞，动物不能存在。而且，识别、排除异物为中心的防生物系统，在不断探明总称为进行细胞间的信息传递的细胞因子的生理活动物质起重要的作用。巨噬细胞进行产生分泌的细胞因子的种类极富有多样性。因此，就识别、排除异物来看，对个体的动态平衡性维持也必须有巨噬细胞的功能。
(6)解剖学的特征巨噬细胞解剖学的特征依具有固定在各种组织上固有性格的组织独特的巨噬细胞而不同。这也可由作为个体与环境接点的粘膜组织看出在呼吸器官、消化器官、泌尿生殖器官的粘膜下层分别存在独特的巨噬细胞。这些组织独特的巨噬细胞进行与组织独特的内外环境的生物应答。这显示巨噬细胞对超越异物的识别、排除而对生体动态平衡性的维持起重要的作用。组织独特的巨噬细胞生理上的意义大多是未知的问题。而从新的观点评价组织独特的巨噬细胞的存在意义时，当然在与各种病态的关系上会引人注目。
(7)与病态的关系因为，如果根据巨噬细胞与处于免疫系统重要位置的生理上的意义，则组织独特的巨噬细胞的功能异常是极大地显示关系到诱发组织特性的病态的缘故。事实上，作为炎症性肠疾病之一的克朗氏病(Crohn′sdisease)，还有很多类风湿病等的自身免疫疾病、骨质疏松症等的高令性疾病等难治性疾病，往往以某些形式伴有巨噬细胞的功能异常。与结核菌等的分枝杆菌的慢性感染、或分枝杆菌本身的问题不同，肺胞巨噬细胞的功能异常估计在于病态的背景。因此，开发治疗药以增大作为标的细胞的巨噬细胞的吞噬能力，结果增大巨噬细胞内治疗药的浓度，在提供包括现在没有有效治疗法的结核等感染病的难治性疾病的新型治疗法方面，可以称之为是极重要的且有合理性的课题。
II.巨噬细胞的功能异常与疾病(1)作为感染性病原体的巨噬细胞据世界卫生组织(WHO)调查，结核、艾滋病、疟疾等是世界性规模且最应该重视的慢性难治性感染性。据说，例如每年发生800万以上的人患结核病，死亡300万人。对这些疾病开发有效的治疗药(药物/制剂)是当急的课题，其社会意义极大。
然而，有关病原体感染的预防、除去，在人体内起最主要作用的细胞之一是巨噬细胞。实际上，巨噬细胞分布在生物体内的脏器、器官等的所有部位上。这些巨噬细胞其形态、功能根据所存在的脏器、器官而不同，但在发挥预防和除去病原体感染方面是共同的。
另外，感染性病原体在进化的过程中，获得回避巨噬细胞攻击的种种手段。此外，感染性病原体中，有很多潜伏在巨噬细胞中，宿主巨噬细胞的病原体。这样寄生在巨噬细胞中成功的病原体，当然成为慢性的且反复引起感染症的原因，导致致命的结果也不少。即，这种情况，本应当预防、除去病原体感染的巨噬细胞转变成为起感染性病原体媒体作用的细胞。
(2)巨噬细胞内的病原体在结核中可以发现其典型例。即，虽然病原体(结核分支杆菌、或牛分支杆菌)被作为初期感染途径的肺胞巨噬细胞吞噬，但仍稳定地存在于此时形成的吞噬体中。即，病原体本来应被消化的这些吞噬细胞可作为“掩蔽所”生存。此外，以往作为原因菌的麻风分支杆菌、作为非定型分枝杆菌症原因菌的鸟分支杆菌、或作为衣原体症原因菌的肺炎衣原体、沙眼衣原体、或鹦武热衣原体等尚未确立根治疗法，但发现担心漫延的难治性感染疾病的许多原因菌、或在巨噬细胞成为感染病原体媒体方面有共同性。
现在，对预防结核菌、艾滋病毒等倾注于极大的精力。然而，一旦出现了感染并不存在有效的治疗法。姑且，即使对感染病原体存在直接具有杀菌作用的化合物，但一般通过简单地给与适用的治疗药，对杀灭特定的病原体(本发明中的杀灭意味着杀死消灭病原体的全部或一部)要在保持病原体巨噬细胞内达到足够的浓度当然不容易。
发明内容
因此，通过给与有效的治疗药，即使可以杀灭细胞外的病原体，但作为病原体媒体的巨噬细胞依然作为病原体供给源存在，仍在继续供给病原体。对现在寄生在巨噬细胞内的病原体的没有完全根治疗法的理由可在如上所述的方面而知。本发明把这种问题作为课题，反之，如果可以杀灭作为病原体媒体的病原体感染巨噬细胞、或杀灭病原体感染巨噬细胞内的病原体，则可以从根本上治疗上述许多的慢性难治性感染症。因此，本发明的目的在于提供根据巨噬细胞的功能异常、或以巨噬细胞为媒体对所患疾病的治疗药。
本发明者们潜心进行研究的结果，把杀灭作为病原体媒体的病原体感染巨噬细胞、杀灭病原体感染巨噬细胞内的病原体、或对因疾病功能异常的巨噬细胞发生作用为目的，形成了全新的构想，从而完成了本发明。
本发明的治疗药，其特征在于使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，杀灭巨噬细胞内的病原体。
另外，本发明的治疗药，其特征在于使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，诱导保持病原体的巨噬细胞至细胞死亡。
此外，本发明的治疗药，其特征在于使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，对处于功能异常状态的巨噬细胞发生作用。
另外，期望本发明的治疗药是用于分枝杆菌症、艾滋病、衣原体症或弓浆虫病任何一种的药。因此，可以有效地治疗由巨噬细胞保持病原体造成的疾病。
此外，期望本发明的治疗药是用于克朗氏病、类风湿病、癌或免疫缺陷综合症的药。因此，可以有效地治疗巨噬细胞处于功能异常状态造成的疾病。艾滋病被包括在免疫缺陷综合症中。
另外，期望前述巨噬细胞是存在粘膜组织中的细胞。因此，可以有效地治疗在呼吸器、消化器或生殖器等的引起病原体初感染的部位的疾病。
此外，期望前述巨噬细胞是存在腹腔、大网膜、乳色斑、肺胞、肺间质、肺脏、门静脉区域、脾脏、骨髓、胸腺、消化管、腭扁桃体、肾上腺、脑垂体、甲状腺间质、胰岛、副甲状腺、松果体、睾丸、卵巢、输卵管、子宫、胎盘、皮肤、髓膜、脑质、脉络丛的任何一个部位的细胞，或者，期望前述巨噬细胞是小胶质细胞、小胶质细胞的前体细胞、小胶质细胞细胞、小胶质细胞细胞的前体细胞、前述存在巨噬细胞的前体细胞、存在巨噬细胞类缘细胞、或存在巨噬细胞类缘细胞的前体细胞。因此，可以有效地治疗在体内种种的脏器或组织中产生的疾病。
此外，本发明的治疗药，其特征在于含有PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)，是用于结核的药。
另外，还期望含有利福平。因此，可提供杀灭结核菌的治疗药。
此外，期望含分子量1500～150000的PLGA。因此，可以提供被巨噬细胞吞噬且生物降解性的微粒子制剂。
另外，期望含分子量1500～75000的PLGA。因此，可提供被巨噬细胞吞噬且在巨噬细胞内易放出药物的微粒子制剂。
此外，还期望再含有PVA(聚乙烯醇)、PEG(聚乙二醇)、PEO(聚环氧乙烷)、糖、蛋白质、肽、磷脂质或胆甾醇的至少一种。因此，可提供对应于巨噬细胞的种类而被急剧吞噬的微粒子制剂。
还有，还提供再含有PVA、PEG、PEO、糖、蛋白质、肽、磷脂质或胆甾醇的至少一种，其主要的粒径为1～6μm的微粒子制剂。因此，有效利用巨噬细胞的吞噬功能可有效地进行巨噬细胞内。
还有，优选通过吞噬使巨噬细胞的吞噬活性亢奋。
还有，优选是含有分子量5000～20000的PLGA、针对结核的治疗药。
还有，优选是通过膜乳化法制备的治疗药。
还有，特别优选是含有成团泛菌的脂多糖、针对艾滋病的治疗药。
还有，特别优选是含有成团泛菌的脂多糖、对于肺癌细胞具有细胞阻碍作用的治疗药。
本说明书也包含作为本申请优先权基础的特愿2002-247871的说明书和/或附图所述的内容。
图1是对比说明本发明与以往的治疗药的巨噬细胞内药剂浓度的图。
图2是表示本发明实施方案的微粒子制剂的粒径分布的图。
图3是对比说明利福平采用本发明给与和以往所用的溶液给予进入NR8383细胞的量为何种程度不同的图。
图4是说明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的组成不同所放出的利福平量不同的图(其1)。实验值包括误差5％。
图5是说明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的组成不同所放出的利福平量不同的图(其2)。实验值包括误差5％。
图6是说明吞噬结核菌的巨噬细胞通过吞噬RFP-PLGA微粒子可杀灭巨噬细胞内结核菌的图。生存率按5个等级进行评价、15％以下、25～25％、325～50％、450～75％、575％以上。再者，给与的利福平单独给与(图中用RFP表示)时为100μg/mL，利用RFP-PLGA给与(图中用RFP-PLGA表示)时为5μg/mL(估算值)。
图7是通过使用脂多糖使肺胞巨噬细胞NR8383的吞噬能活化，利用与佐藤肺癌细胞的共培养增强对处于功能异常状态的NR8383的佐藤肺癌细胞影响的细胞毒性效果的图。(□)表示没有进行脂多糖处理的NR8383对佐藤肺癌的细胞伤害效果、(■)表示脂多糖(1μg/mL)处理的NR8383对佐藤肺癌细胞的细胞伤害性效果(共培养4小时)。再者，细胞伤害效果(％)由培养液中放出的乳酸脱氢酶量算出，进行评价。
具体实施例方式
以下，边参照附图边对本发明的适用实施方案详细地进行说明。但本发明其技术范围不受这些实施方案限制。
全面地具备巨噬细胞，而且巨噬细胞的一种特异机能可例举吞噬作用。吞噬作用是使尺寸大约1μm左右以上的固体物积极地进入巨噬细胞内的功能。
然而，如果积极地吞噬人工制的固体物，则可能在巨噬细胞内以通常不能达到的浓度使固体物积累。这样的固体物虽然一般可制成粒子提供但要使之积极吞噬，必须将有利于吞噬的粒径、粒子的表面特性(应当带有电荷、应当具有一定的柔软结构等)等最优化。例如，聚乳酸酯与聚乙二醇混合的材料作为基材可以制备被巨噬细胞容易吞噬的粒子。
此外，如果混合作用于感染病原体或病原体感染巨噬细胞的药物制备的粒子，则随着粒子的吞噬，药物也积极地进入巨噬细胞内。
本发明的根本在于积极地利用巨噬细胞具有的吞噬功能，治疗巨噬细胞功能异常相关的疾病(I.2的(5)、(7)、II.(1)、分枝杆菌症、艾滋病、衣原体病、弓浆虫病或癌等)。此外通过制备使对这些病有效的药物含有巨噬细胞可吞噬的微粒子(药物载体)中的制剂，期望达到上述目的。
通常，作为药物载体与药剂的合剂的制剂，当然回避基于巨噬细胞的吞噬用的设计很必要。然而本发明基于与以往完全不同的构想，在积极地利用巨噬细胞的吞噬活性方面具有新颖性。
如前述巨噬细胞防御生物的一种功能是具有吞噬作用。吞噬作用是巨噬细胞特征性地识别的固有的功能，可以卷入巨噬细胞以外的细胞所不能卷入的大尺寸的粒子。细菌等的病原微生物被巨噬细胞吞噬在巨噬细胞内被分解。因此巨噬细胞的吞噬功能的生物学上的意义之一是对病原微生物给予伤害。但巨噬细胞因吞噬被活化，有时可能发生抗病原微生物。这是作为吞噬导致巨噬细胞活化所熟知的现象，因此，就连癌细胞，巨噬细胞也可进行伤害。所以，利用吞噬将巨噬细胞活化，如果能增强吞噬活性，则可以更有力地杀灭病原微生物。
被巨噬细胞吞噬的粒子，估计需要具备以下的性质(可吞噬性)。
即，ο粒径为1～6μm，把这样的粒子称微粒子。
ο粒子表面使用巨噬细胞培养液(生物体内巨噬细胞周边的体液)润湿，但不应立即溶解而作为一定时间粒子存在。
ο粒子在20～45℃的温度范围内是固体。
ο粒子的比重比巨噬细胞培养液(生物体内巨噬细胞周边的体液)的比重大。
ο粒子在表面具有可渗透水或离子的表面层。
另外，如果考虑向生物体内给与粒子，则粒子表面必须具有生物体适合性高的高分子层，至到进入巨噬细胞内一直保持粒子的形态，另外进入巨噬细胞后，或没进入的情况也必须在生物体内分解代谢变成对生物体无毒的成分(生物体内分解性)。
作为满足以上的2个条件、可容易地成型加工成粒子的高分子，聚(乳酸/乙醇酸)共聚物(以下称“PLGA”)或聚乳酸(以下称“PL”)成为候补对象。PL疏水性比PLGA高，分解需要的时间长。另外，PLGA分解速度依赖于单体的比例进行变化。分子量大的PLGA分解需要的时间长。PLGA的分子量在1000以下时，在20～45℃的范围有成为液体存在的可能性。因此，在20～45℃的温度范围内成为固体存在的PLGA的分子量优选1,500以上。
此外，PLGA粒子中含有的药物从粒子内的放出，在分子量20000左右PLGA的情况大致以0次放出药物。即，放出量往往保持一定。然而，观察到从分子量44000及75000左右的PLGA粒子中不是0次放出，一定时间后变成脉冲型放出药物。而且，观测脉冲型的药物放出的时间，使用分子量大的PLGA制剂时慢。即，从PLGA粒子中放出药物的方式依赖于PLGA的分子量。此外，与药物放出相关的PLGA的分解速度，不仅随着PLGA的分子量增加而变慢，而且由于预测巨噬细胞内等生物体内的分解速度比试管内快，因此估计如果是分子量到150000的范围可有效地在生物体内使用。
从以上的观点看出，由分子量1500～150000、乳酸与乙醇酸的摩尔比50∶50～75∶25的PLGA制的粒径1～6μm的微粒子制剂(容许范围)、由分子量5000～75000、乳酸与乙醇酸的摩尔比50∶50～75∶25的PLGA制的粒径1～6μm的微粒子制剂(适用的范围)容易被巨噬细胞吞噬，而且，估计对在巨噬细胞内从内包药物的微粒子制剂中边保持一定的持续性边放出药物的目的最适用。
提供可特异性地杀灭保持感染症病原体的巨噬细胞的新型治疗药积极地利用保持以结核菌为首的种种感染性病原体的巨噬细胞的特异性的吞噬活性，下述的治疗药对杀灭巨噬细胞内的病原体或保持病原体的巨噬细胞本身有效果。
(1)使巨噬细胞吞噬活性亢奋的治疗药(2)对巨噬细胞内的感染病原体有直接杀灭效果的治疗药(3)对巨噬细胞作用的治疗药(1)的治疗药优选对感染病原体保持/非保持的巨噬细胞选择性地有可吞噬的性质。以前，熟知存在使巨噬细胞的吞噬能力活化的物质(公知事项)。然而，完全没有开发积极利用这种性质作用于巨噬细胞内病原体的治疗药物的尝试(新型事项)。(2)、(3)的类型不仅直接作用于病原体的各种药物成为对象，而且具有改变病原体保持/非保持巨噬细胞生理功能作用的DNA或RNA等遗传基因本身也可作药物使用。以前完全没有开发(1)、(2)、(3)组合的对除去感染性病原体的有效的治疗药的探索，本发明的治疗药是针对感染性病原体的治疗有效的新型的治疗药(新型事项)。
例如，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998年第42卷第10号pp.2682-2689中，公开了PLGA中含有利福平的粒子的抗结核作用。然而，该论文中完全没有叙述有关利用PLGA粒子使吞噬活性亢奋。此外，含有利福平的PLGA粒子，由于作为抗结核药的药效并没有比单独的利福平提高，所以明确可知具有与本发明的粒子不同的性状。此外，如图4及图5所示，PLGA的分子量对控制利福平的放出很重要。但上述论文中没有记载制备PLGA时使用的PLGA的分子量。由于可能使用具有与本发明的粒子不同分子量的PLGA，因此推测不会达到具有作为抗结核药的功能。制备有抗结核药活性的PLGA粒子时，必须正确地使用有关PLGA的分子量、单体比及制得粒子的直径，必须评价利用吞噬细胞吞噬的粒子的进入和巨噬细胞内的抗结核活性。综述上述的各点，则上述论文中所述的PLGA粒子，并没有记载PLGA的单体比、粒子的直径处于本发明中的“适用范围”等，有关涉及材料确认一定的通用性的PLGA粒子的正确的性状，也没有抗结核药作用。因此，是不可能成为否定本发明的新颖性、进步性的引用文献的论文。
此外，Pharmaceutical Research 2000年第17卷第8号pp.955-961中公开了使用分子量82500的PLGA制的含利福平粒子的制备方法，但该粒子的制备方法与本发明不同。PharmaceuticalResearch2001年第18卷第9号pp.1315-1319中公开了使用分子量82500的PLGA的含利福平PLGA粒子的结核菌杀灭效果。观察该效果，含利福平PLGA粒子的抗结核活性也没到达到试管内利福平单独的效果，动物实验也不能说有明显的治疗效果。为了含利福平PLGA粒子呈现抗结核作用，粒子必须具有适度的分解性与高的利福平内包率。然而，上述论文中没有进行有关控制这种活性的性状的研究，仅调查了抗结核活性。众知由于分子量大的PLGA粒子其分解性与内包率降低，故估计使用82500这种高分子量的PLGA是不呈现抗结核作用的原因。如上所述以往虽然进行了与本发明公开的内容相类似的研究，但迄今还没有进行如本发明想到利用巨噬细胞的吞噬活性，且通过实现活化，谋求杀灭细胞内寄生病原体的探索。另外，虽然制备了含利福平PLGA，但没有进行有关可达到本发明的目的的制备方法或材料特性的适用的研究。只略微地在Pharmaceutical Research2001年第18卷第10号pp.1405-1410中有假想含利福平PLGA粒子进入巨噬细胞中的记载。然而，该情况并不是积极地使含利福平PLGA粒子进入巨噬细胞，或制备打算活化的制剂，实际上也没有研究含利福平PLGA粒子的吞噬率等。即，试管内使用该论文所述的含利福平PLGA粒子的利福平在巨噬细胞内浓度仅微量地停留在0.45μg/106细胞中。使用本发明的含利福平PLGA微粒子的情况不仅使吞噬活化，而且使利福平在巨噬细胞内的浓度达到6μg/106细胞，达到13倍以上。以上说明想对巨噬细胞诱导吞噬杀灭巨噬细胞内的病原微生物，只单一地使微粒子含药剂则难达到目的。而且迄今的任何论文也没有报道使用作为结核菌的标的细胞的肺胞巨噬细胞研究含利福平PLGA粒子杀灭细胞内结核菌。如参照前述的“维持生命的巨噬细胞”所知，巨噬细胞不能把使用组织特异性高、存在于血中的巨噬细胞得到的结果直接地对组织特异性巨噬细胞，例如，肺胞巨噬细胞作为可能适用的结果是众所周知的事实。即，本发明的新颖性不用说概念的新颖性，而且作为支持该概念的实施例，可列举使用肺胞巨噬细胞，而且诱导该细胞的吞噬活性，又实际上在肺胞巨噬细胞内保持高的药物浓度，且制造提供该制剂实际上杀灭肺胞巨噬细胞内结核菌比单一利福平明显优异的含利福平PLGA粒子。
另外，众知通过使巨噬细胞吞噬粒子，由巨噬细胞增强非特异性的抗菌物质，例如过氧化氢、氧自由基的产生。例如European Journalof Pharmaceutical Sciences2000年第15卷pp.197～207中公开了通过使巨噬细胞吞噬PLGA粒子，由性格与血中单核细胞类似的培养巨噬细胞增强过氧化氢的产生。然而，没有记载巨噬细胞通过吞噬PLGA增强吞噬活性。此外，由于巨噬细胞的活化极富多样性，所以利用吞噬增强过氧化氢的产生，不能立即直接地与吞噬增强相连系。
实际的感染症治疗时，使(1)型的治疗药含有(2)或(3)型的治疗药的制剂有效果。即，为了(2)、(3)型的治疗药在巨噬细胞内有效地发挥作用，(1)的治疗药使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，发挥将(2)、(3)型的治疗药运搬到巨噬细胞内的作用。即，本发明为对象的治疗药如图1所示，容易被巨噬细胞吞噬，由于通过吞噬使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，巨噬细胞内治疗药物的浓度比只单一地给与治疗药的情况高。即，与右边以往进入存在于药液中的巨噬细胞的药剂相比，左边本发明封入药剂的微粒子积极地进入巨噬细胞内使巨噬细胞内的药剂浓度升高。因此，权利要求书中所述的所谓“使巨噬细胞的吞噬活性亢奋”，意味着通过提高该治疗药的巨噬细胞的吞噬能力，巨噬细胞内的治疗药的浓度比单一地给与治疗药的情况高。
具体的适用例结核作为本发明所公开的有关治疗药有效性的一个例子，对结核加以描述。结核菌由于飞散通过呼吸道进入肺胞中，被肺胞巨噬细胞吞噬。通常被吞噬的病原体，处于在细胞内由于蛋白质分解酶的攻击而被分解命运。然而，结核菌回避蛋白质分解酶的攻击，在巨噬细胞内进行生存。该巨噬细胞内的结核菌移动到巨噬细胞外，继续地向宿主体内供给结核菌。作为现在抗结核菌药剂，使用雷米封、利福平、硫酸链霉素、乙胺丁醇等的药物。任何一种药物对巨噬细胞外的结核菌均有效，但对肺胞巨噬细胞内的结核菌没有效果。这可以得出主要原因是对杀灭肺胞巨噬细胞内的结核菌不能获得足够的药物浓度。
因此，利用肺胞巨噬细胞的吞噬作用要在肺胞巨噬细胞内杀灭结核菌，如果得到足够的药物浓度，也可以杀灭肺胞巨噬细胞内的结核菌。此时吞噬作用变成选择性地使巨噬细胞内的药物浓度升高而得到利用。
A.增强巨噬细胞吞噬能力的治疗药以PLGA为例，说明增强巨噬细胞吞噬能力的治疗药的制法及其效果。
I.利用PLGA微粒子制剂增强巨噬细胞的吞噬能力(本项中PLGA微粒子本身就是药效成分)1.PLGA微粒子制剂制备方法(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩尔比为75∶25、分子量20000(和光纯药公司PLGA-7520)(2)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)PLGA微粒子制剂的制备(1)把PLGA 500mg溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)使PVC溶解于水成为0.3％(w/v)。
(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中搅拌3分钟形成水包油型(o/w型)乳液。
(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，在520转/分钟的条件下，室温搅拌3小时。
(5)采用离心分离(3000转/分钟，15分钟)，使微粒子制剂沉降、分离，再加2次蒸馏水10mL，经离心分离进行洗涤。
(6)在干燥器内减压干燥一昼夜。
(7)把制得的微粒子制剂的粒径分布示于图2。由图2清楚地看出制得的微粒子制剂在直径约2μm有峰、在1～10μm之间具有分布。该粒子在常温下是固体。由制备使用的PLGA(500mg)与回收的制剂的总重量计算出收率为约90％。
(8)其他的例把其他制得的PLGA微粒子(分子量及组成)的性状归纳如下。
1.PLGA-5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)2.PLGA-5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.PLGA-5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.PLGA-7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.PLGA-7510(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸75∶25)PLGA微粒子制剂制备方法，除了PLGA的种类以外，其他与1.(b)(1)～(6)相同。
制得的微粒子制剂的平均粒径使用任何一种PLGA的情况均约为2μm。由制剂使用的PLGA(500mg)与回收的制剂的总重量计算的收率约为90％。
2.通过吞噬PLGA微粒子制剂的肺胞巨噬细胞的吞噬增强效果(1)在培养基(Ham F-12K、15％牛胎儿血清)中把肺胞巨噬细胞(NR8383细胞)制成1×106个/mL，加到24孔板中，然后添加PLGA-7520微粒子制剂0.04、0.4、4μg，在三氧化碳气体培养器(37℃)中进行培养。
(2)培养1小时后，除去培养液，添加含0.25％胰蛋白酶/磷酸缓冲液的生理食盐水(以下称PBS)0.1mL在室温下放置5分钟后，除去培养上清液，进行洗涤。
(3)然后，加0.1mL的培养基与80％硅石蚀态悬浮液(percoll)(Pharmacia公司制)0.1mL混合制备40％Percoll溶液，在1.5mL的样品管中重层成加有该溶液的70％Percoll 0.1mL，进行离心分离(8000转/分钟，10分钟).
(4)离心分离后回收界面上存在的细胞，用PBS对细胞洗涤后添加培养基1mL，添加用粒径2.0μl的荧光素硫代异氰酸酯(FITC)标记的聚苯乙烯胶乳粒子(FITC-PSLP)1×107个，进行培养1小时。使用荧光性的FITC进行标记是为了容易进行定量。
(5)培养后进行离心分离(700转/分钟，5分钟)，向沉降层的巨噬细胞中加入PBS 1mL，反复进行2次离心操作。
(6)除去PBS后，向细胞中添加10％甲醛水/PBS 0.1mL，固定5分钟后，加蒸馏水1mL，除去上清液，再加蒸饱水1mL，除去上清液。除去上清液后，加0.1mL的蒸馏水使细胞悬浮，取该悬浮液0.02mL，扩展在玻璃片上使之干燥。
(8)在荧光显微镜下进行多视野摄影，测定每100个细胞中有卷入了FITC-PSLP的NR8383细胞的数。
(8)巨噬细胞的FITC-PSLP吞噬量因使用PLGA微粒子制剂的变化如表1所示。低量添加PLGA微粒子制剂时对巨噬细胞吞噬能力的效果不显著，而添加0.4(μg/mL)使吞噬能力活化的效果特别明显。
表1PLGA微粒子制剂对吞噬细胞吞噬能力的增强作用
II.利用脂多糖增强巨噬细胞吞噬能力1.脂多糖制备方法(a)材料
(1)革兰氏阴性菌pantoea属成团泛菌(b)脂多糖的制备(1)在7L的肉汁培养基(胰胨10g/L，酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、葡萄糖1g/L、pH7.5)中加入成团泛菌，在35℃振动培养1夜，收集约70g的湿菌体。
(2)把约70g的菌体悬浮在500mL的蒸馏水中，添加500mL的90％热苯酚，在65～70℃搅拌20分钟、冷却、回收水层。将回收的水层透析1夜除去苯酚，使用分子量20万分离膜在2个大气压的氮气下对透析内液进行超滤浓缩。
(3)将得到的粗脂多糖冷冻干燥物溶解在蒸馏水中，装入阴离子交换层析(Pharmacia公司制，Q-Sepharose Fast Flow)中，使用含10mM三-HCl(pH7.5)及10mM的NaCl的缓冲液将试料溶液通入色谱柱，使用200～400mM NaCl/10mM三-HCl(pH7.5)使Limulus活性级分洗出。在与前述相同条件下对该洗出液进行超滤，脱盐及浓缩、冷冻干燥，可以由约70g的湿菌体得到约300g的精制脂多糖。
2.肺胞巨噬细胞利用脂多糖的吞噬增强效果(1)在培养基(Ham F-12k、15％牛胎儿血清)中制备肺胞巨噬细胞(NR8383)1×106个/mL，加到24孔板中，然后添加脂多糖使之成为1μg/mL，使用二氧化碳气体培养器(37℃)进行培养。
(2)培养1小时后，把细胞移到1.5mL的样品管中，采用离心分离(2000转/分钟，5分钟)除去培养液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS0.01mL在室温下放置5分钟后，进行离心分离(2000转/分钟，5分钟)除去培养上清液，使用PBS进行洗涤。
(3)然后，加入0.1mL的培养基与60％Percoll 0.1mL混合制备30％Percoll溶液，进行离心分离(8000转/分钟，10分钟)。
(4)离心分离后，回收液表面上存在的细胞，使用PBS将细胞洗2次后，添加培养基1mL，添加粒径2.0μm的FITC-PSLP 1×107个，培养1小时。
(5)培养后，除去上清液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室温下放置5分钟后，添加培养基1mL，进行离心分离(700转/分钟，5分钟)。
(6)向沉降层的巨噬细胞中加入PBS 1mL进行离心分离(700转/分钟，5分钟)，除去上清液，再添加PBS 1mL后，进行离心分离(700转/分钟，5分钟)除去上清液。
(7)除去上清液后，向细胞中添加10％甲醛水/PBS 0.1mL，固定5分钟后，加蒸馏水1mL，除去上清液，再加蒸馏水1mL，除去上清液。
(8)除去上清液后，加0.1mL的蒸馏水使细胞悬浮，取该悬浮液0.02mL，扩展在玻璃片上，使之干燥。
(9)在荧光显微镜下进行多视野摄影，测定每500个细胞中卷入了FITC-PSLP的NR8383细胞的数。
(10)利用脂多糖的巨噬细胞的FITC-PSLP吞噬量的增加如表2所示。由表2看出由于脂多糖，巨噬细胞的吞噬能力被活化。
表2利用脂多糖的巨噬细胞吞噬能力的活化
B.作用于巨噬细胞内病原体的治疗药利福平(抗结核菌药)利用吞噬RFP-PLGA微粒子制剂向巨噬细胞内的有效迁移1.内包利福平的PLGA微粒子制剂的制备(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩尔比为75∶25或50∶50，分子量5000、10000或20000，和光纯药公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。
(2)利福平(3)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制剂的制备
(1)将PLGA 500mg与利福平(0、50、100、200mg)溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)把PVA溶解于水使之成为0.3％(w/v)。
(3)向(1)的溶液中加入(2)的PVA水溶液8mL搅拌3分钟形成o/w型乳液。
(4)向(2)的PVA水溶液200mL中加入(3)，在520转/分钟的条件下，室温搅拌3小时。
(5)采用离心分离(3000转/分钟，15分钟)使微粒子制剂沉降分离，再加蒸馏水10mL 2次，经离心分离进行洗涤。
(6)在干燥器内减压和干燥1昼夜。
(7)把制得的RFP-PLGA粒子(分子量及组成)归纳如下。
1.RFP-PLGA 5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)2.RFP-PLGA 5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.RFP-PLGA 5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.RFP-PLGA 7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.RFP-PLGA 7510(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸75∶25)6.RFP-PLGA 7520(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25)制得的微粒子制剂的粒度分布与性状完全与单一PLGA微粒子制剂(A.I.1.(b)(7))相同。
(8)把500mg的PLGA中含有利福平0、50、100、200mg的微粒子制剂4mg溶解于二氯甲烷1mL中后，使用分光光度计测定475nm的吸光度。
(9)把RFP-PLGA微粒子制剂(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25制的微粒子PLGA-7520)中的回收利福平量示于表3。由该结果明显地看出利福平被高效地制剂化。
表3RFP-PLGA微粒子制剂的内包利福平量
2.其他的RFP-PLGA微粒子制剂的制备方法(膜乳化法公知)使用膜乳化法制备RFP-PLGA微粒子制剂膜乳化法是对两种不互混的液体的一方(分散相)进行加压，借助多孔玻璃膜(SPG膜)分散在另一方液体(连续相)中的乳化方法，采用这种方法可以制得具有均匀粒径的乳液。
(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩尔比为75∶25、分子量10000，和光纯药公司PLGA 7510(2)利福平(3)PVC(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制剂的制备(1)把PLGA 500mg与利福平100mg溶解于二氯甲烷10mL中。
(2)把PVA溶解于水中使之成为0.3％(w/v)。
(3)借助SPG膜(伊势化学工业、细孔径0.49μm)把(1)的溶液分散在(2)的PVA水溶液10mL中，形成水包油型(o/w型)。
(4)向(2)的PVA水溶液200mL中加入(3)，采用520转/分钟，在室温下搅拌3小时。
(5)采用离心分离(3000转/分钟，15分钟)，使微粒子制剂沉降进行分离，再加蒸馏水10mL 2次，采用离心分离进行洗涤。
(6)在干燥器内减压干燥1昼夜。
(7)制得的微粒子制剂的平均粒径是1.98μm。由制剂使用的PLGA(500mg)与回收的制剂的总重量计算的PLGA的收率是约90％。而，利福平的收率是约75％。该粒子在常温是固体。
3.采用膜乳化法的其他例把采用膜化法制备的RFP-PLGA 7510微粒子制剂以外的RFP-PLGA微粒子(分子量及组成)归纳如下。
1.RFP-PLGA 5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)
2.RFP-PLGA 5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.RFP-PLGA 5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.RFP-PLGA 7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.RFP-PLGA 7520(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25)这些的RFP-PLGA微粒子制剂的制备方法，除了PLGA的种类以外，其他与上述的膜乳化法相同。
制得的微粒子制剂的平均粒径，PLGA 5005为2.20μm、PLGA 5010为2.66μm、PLGA 5020为2.29μm、PLGA 7505为2.00μm、PLGA 7520为1.85μm。由制备使用的PLGA(500mg)与回收的制剂的总重量计算的PLGA的收率均是约90％。另外，利福平的收率，PLGA 5005为约87％、PLGA 5010为约78％、PLGA 5020为约67％、PLGA 7505为约91％、PLGA 7520为约58％。
4.从RFP-PLGA微粒子放出利福平(1)把采用膜乳化法制得的各RFP-PLGA微粒子50mg分散在保持于37℃(温度)的pH7.4磷酸缓冲液(离子强度0.154M)5mL中。
(2)经时地离心分离收集上清液，向残留的微粒子中加入pH7.4磷酸缓冲液(离子强度0.154M)5mL中。
(3)测定在上清液中溶出的利福平浓度。测定使用分光光度计在475nm的波长下进行测定。
(4)把从各RFP-PLGA微粒子中向上清液中放出的利福平的比例示于图4及图5。由本实验数据显示出利福平从PLGA分子量为5000及10000的PLGA 5005、PLGA 5010和PLGA 7505、PLGA 7510中放出的速度快。由这些结果显示出PLGA的组成其分子量为5000～10000、乳酸与乙醇酸的比为50∶50或75∶25借助了巨噬细胞吞噬的药剂的迁移优异。
5.通过吞噬RFP-PLGA微粒子制剂(PLGA 7520)细胞内利福平浓度的选择性增加(1)把制得的RFP-PLGA微粒子制剂再分散到PBS中，进行离心分离(400转/分钟，5分钟)除去大的粒子，把制成显微镜观察为约1～3μm尺寸的微粒子制剂(重量约30％)用于以下的实验。
(2)把在培养基中培养成5×105个/0.9mL的NR8383细胞加到24孔板上，然后添加各RFP-PLGA微粒子制剂0.12mg/0.1mL，进行培养12小时。
(3)培养后，除去培养液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室温放置5小时后，除去培养上清洗，进行洗涤。
(4)然后，加0.1mL的培养基与80％percoll 0.1mL混合成40％percoll，把该溶液与加到1.5mL样品管中的70％percoll 0.1mL进行重层，进行离心分离(8000转/分钟，10分钟)。
(5)离心分离后，回收界面上存在的细胞，使用PBS洗涤细胞后，使用二氯甲烷抽提进入细胞中的利福平。
(6)用475nm的吸光度确定利福平的量。
(7)作为对照，制备含于各RFP-PLGA微粒子制剂0.12mg中的同量的利福平的二甲亚砜(DMSO)溶液。把该溶液加到加有1mL培养基的24孔板上，然后添加NR8383细胞。
(8)培养细胞12小时后，回收细胞(5×105个)，使用二氯甲烷抽提细胞中的利福平。
(9)把利福平被巨噬细胞卷入的量示于图3。利福平的添加量在40(μg/5×105个/孔/mL)时，与过去的含利福平的培养基相比，本实施例的RFP-PLGA微粒子制剂的情况显示出卷入了约19倍的利福平。
C.增强巨噬细胞的吞噬能力作用于巨噬细胞内的病原体的药物(A+B)通过吞噬RFP-PLGA微粒子制剂的巨噬细胞的吞噬活性增强效果1.RFP-PLGA微粒子制剂的制备(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙酸酸)共聚物)摩尔比为75∶25或50∶50，分子量5000、10000或20000，和光纯药公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。
(2)利福平
(3)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制剂的制备(1)把PLGA 500mg与利福平100mg溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)把PVC溶解于水使之成为0.3％(w/v)。
(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中搅拌3分钟形成o/w型乳液。
(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，采用520转/分钟，在室温下搅拌3小时。
(5)采用离心分离(3000转/分钟，15分钟)使微粒子制剂沉降分离，再加蒸馏水10mL 2次，采用离心分离进行洗涤。
(6)在干燥器内减压干燥一昼夜。
(7)制得的微粒子制剂的粒度分布及性状与单一PLGA的微粒子制剂(A.I.1.(a)(7))相同。
(8)使微粒制剂分散在PBS中，采用离心分离(400转/分状，5分钟)除去大的微粒子制剂，把调整到用显微镜观察约1～3μm尺寸的微粒子制剂用于以后的实验。
2.利用吞噬RFP-PLGA微粒子(PLGA-7520)巨噬细胞增强吞噬活性(1)在培养基(Ham F-12K，15％牛胎儿血清)中制备肺胞巨噬细胞(NR8383)1×106个/mL，加到24孔板上，然后添加PLGA微粒子制剂0.012、0.12、1.2μg，在二氧化碳气体培养器(37℃)中进行培养。
(2)培养1小时后，把细胞移到1.5mL的样品管中，除去培养液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室温下放置5分钟，除去培养上清液，进行洗涤。
(3)然后加0.1mL的培养基和90％percoll 0.1mL使percoll浓度成为45％后，进行离心分离(8000转/分钟，10分钟)。
(4)离心分离后，回收液表面的细胞，用PBS将该细胞洗2次后，添加与(1)所用相同的培养基1mL，添加粒径2.0μm的FITC-PSLP 1×107个，进行1小时培养。
(5)培养后，除去上清液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室温放置5分钟后，添加培养基1mL，进行离心分离(700转/分钟，5分钟)。
(6)向沉降层的巨噬细胞中加入PBS进行离心分离(700转/分钟，5分钟)，除去上清液，再添加PBS 1mL后，进行离心分离(700转/分钟，5分钟)除去上清液。
(7)除去上清液后，向细胞中添加10％甲醛水/PBS 0.1mL，固定5分钟后，加蒸馏水1mL，离心分离(700转/分钟，5分钟)，除去上清液。然后，加0.1mL的蒸馏水使细胞悬浮，取该悬浮液0.02mL，扩展在玻璃气上，使之干燥。
(8)在荧光显微镜下进行多视野摄影，测定每500个细胞中卷入FITC-PSLP的巨噬细胞(NR8383细胞)的数。
(9)巨噬细胞通过吞噬RFP-PLGA微粒子制剂的FITC-PSLP吞噬量的增加如表4所示。表明巨噬细胞的吞噬能力被RFP-PLGA微粒子制剂活化。
表4吞噬RFP-PLGA微粒子制剂的NR8383细胞的FITC-PSLP吞噬增强作用
由以上的结果表明，(1)PLGA微粒子制剂及脂多糖使巨噬细胞的吞噬能力活化。另外，表明(2)利福平向巨噬细胞内迁移由于包含在PLGA微粒子制剂中格外增大。还表明(3)即使利福平被含在PLGA微粒子制剂内，巨噬细胞吞噬能力也被活化。因此，含利福平PLGA微粒子制剂，活化了巨噬细胞的吞噬能力，结果利福平在巨噬细胞内浓度增大，可以达到对保持在巨噬细胞内的病原体有效地作用的本发明的目的。上述的结果是表示利用作为本发明基本概念的“使巨噬细胞的吞噬活性亢奋”的构想，使作用于巨噬细胞内病原体的治疗药有效地进入巨噬细胞内的新型治疗药的一个实例。
3.吞噬RFP-PLGA微粒子制剂的巨噬细胞内结核菌杀灭效果(a)巨噬细胞内结核菌(BCG)的生存率测定法(1)用生理食盐水溶解干燥BCG疫苗(12mg/mL)进行搅拌后，把KRD培养基(3～4mL)移到T-25培养烧瓶中加入BCG悬浮液40μL，在干式温育箱37℃下进行培养。
(2)实验是按1∶4的比例把菌液与玻璃球珠加到样品管中，使用旋涡搅拌机搅拌1分钟后，再采用超声波洗涤机的5分钟超声波处理进行菌体的分散。
(3)把1×106个/mL浓度的NR8383加到6孔板上(总体积5mL)。把结核菌(BCG)按每个细胞10个(multiplicity ofinfection(MOI)＝10)添加到细胞培养液中。
(4)在37℃，二氧化碳气体培养器中使感染4小时后，进行离心分离2,000转/分钟，5分钟(SCT 15B)后，除去上清液。使用无血清培养基同样地重复2次离心分离，除去细胞外的菌。
(5)把浓度1×106个/mL的NR8383种到24孔板上。
(6)把各RFP-PLGA微粒子按每1个细胞10个的比例添加到NR8383的培养液中。
(7)在37℃，二氧化碳气体培养器中使吞噬4小时后，使用0.25％胰蛋白酶除去细胞外的粒子。
(8)加80％Percoll制备40％Percoll细胞液，再加70％Percoll形成密度梯度。进行10000转/分钟，5分钟(SORVALL Biofuge fresco)离心分离后，回收40％、70％Percoll间界面的细胞，分离细胞和RFP-PLGA。
(9)使用PBS同样地重复2次离心分离除去Percoll。
(10)使用氟二乙酸酯荧光素(FDA/Fluorescein diacetate)/乙啡啶硼化物(Ethidium bromide，EB)染色法测定活菌与死菌的比率。FDA按5mg/mL的浓度溶解于丙酮中，使用时将20μL用1mL的PBS进行稀释。EB按20μg/mL的浓度溶解于PBS中，使用时将50μL用1mL PBS稀释使用。染色是将FDA与ED等量混合使用。把该混合液1μL加到玻璃片上，在其上面再放1μL菌液，放在室温下2分钟用荧光显微镜进行观察。活菌利用菌产生的酯酶活性分解FDA，发出绿色的荧光。而死菌由于没有酯酶活性，故不出现FDA的染色，被EB染色发出橙色的荧光。
(b)利用吞噬进入巨噬细胞内的RFP-PLGA微粒子制剂杀灭结核菌的效果(1)为了研究巨噬细胞内RFP-PLGA微粒子杀灭结核菌的效果，把RFP-PLGA微粒子给与预先吞噬结核菌的巨噬细胞(感染结核菌巨噬细胞)，使巨噬细胞吞噬该微粒子。
(2)把研究吞噬移到巨噬细胞内的RFP-PLGA对巨噬细胞内结核菌呈现什么样的杀灭效果的结果示于图6。即使是含利福平约为单独利福平(100μg/mL)的1/20的RFP-PLGA微粒子给与量(MOI＝10，估计利福平是5μg/mL，故微粒子制剂中的利福平相当于单独给与利福平时的1/20量)，利福平在巨噬细胞内浓度有意义地增高。RFP-PLGA微粒子对感染结核菌肺胞巨噬细胞的给与，与单独给与的利福平相比，以20倍以上的效率杀灭细胞内的结核菌。即通过给予借助吞噬粒子的药剂，无论是药剂本身的抗结核作用，也都得到20倍以上治疗系数的提高。
提供使巨噬细胞的吞噬活性亢奋对处于功能异常状态的巨噬细胞发生作用的治疗药众知的是癌组织中通常多数的巨噬细胞进行浸润。这因为癌细胞对生物体来讲是异物，基于排除癌细胞的目的，巨噬细胞发生积累。巨噬细胞功能正常时，伤害消灭癌细胞，而巨噬细胞功能异常时不能伤害癌细胞，癌细胞成长以至形成肿块。然而如前所述，通过巨噬细胞的活化也可以对癌细胞给予伤害。因此，通过使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，使功能异常的巨噬细胞获得伤害癌细胞作用，可以有效地治疗癌。
另外，如表2所示肺胞巨噬细胞的作用通过脂多糖(1μg/mL)的处理也增强166％，肺胞巨噬细胞被脂多糖活化。而且，估计利用脂多糖活化吞噬能力的肺胞巨噬细胞对肺癌细胞呈现细胞伤害作用。在此，例示脂多糖活化肺胞巨噬细胞伤害肺癌细胞作用的例。
具体的适用例肺癌列举活化肺胞巨噬细胞的伤害肺癌细胞的效果作为适用例。
1.脂多糖活化肺胞巨噬细胞及肺胞巨噬细胞与佐藤肺癌细胞的共同培养(1)把NR8383按1×106个/mL的浓度加到24孔板上(总体积1.5mL)。进行控制，加5％牛胎儿血清、F-12K培养基159μL、10μg/mL脂多糖150μL。
(2)在37℃，二氧化碳气体培养器中放置24小时。
(3)把佐藤肺癌细胞调制成1×105个/mL的浓度，加到96孔板上，每孔加50μL。
(4)把(1)项处理NR8383调制成5×105、1×105、5×104、1×104个/mL的浓度，加到96孔板上50μL(总体积100μL)。
(5)在37℃，二氧化碳气体培养器中放置4小时。
2.对与佐藤肺癌细胞共同培养的巨噬细胞对肺癌细胞的伤害作用(1)为了由从细胞内向培养液中放出的乳酸脱氢酶量评价上述1所述的被脂多糖活化，与佐藤肺癌细胞共同培养的巨噬细胞对癌细胞的伤害效果，采用1000转/分钟离心分离5分钟后，分取上清液50μL加到另外的96孔板上。
(2)接着加入付属于试剂盒(Cyto Tox 96 Non-RadioativeCytotoxicity Assay，Promega，cat.G1780)的基质溶液50μL测定乳酸脱氢酶量。再者，作为阳性控制，使用付属于试剂盒的乳酸脱氢酶酯稀释液(5000倍稀释液50μL)。
(3)使用铝箔遮光、室温放置30分钟。
(4)加停止液50μL，使反应停止。
(5)使用微量反应板读数器(Model 550，BIO-RAD公司)测定495nm下的吸光度。
(6)由各吸光度算出细胞毒性(％)。
(7)把NR8383对佐藤肺癌细胞的毒性效果示于图7。与没有进行脂多糖处理的NR8383相比，脂多糖处理的NR8383吞噬亢进，结果对佐藤肺癌的细胞伤害效果显示出依赖于细胞比增大。
提供使巨噬细胞的吞噬活性亢奋、诱导保持病原体的巨噬细胞至细胞死亡的治疗药本实施方案的治疗药，其特征在于通过使巨噬细胞的吞噬活性亢奋、诱导保持病原体的巨噬细胞至细胞死亡。
如表2所示，熟知作为巨噬细胞活化剂的脂多糖使巨噬细胞的吞噬活性亢奋。另外，作为巨噬细胞活化因子的代表性细胞因子的干扰素γ也使吞食活性亢奋。即，巨噬细胞吞噬活性的亢奋是巨噬细胞活化的指标之一。本件所示的利用吞噬使吞噬活性亢奋，可以说所有的吞噬刺激诱导所有的称为吞噬亢奋的巨噬细胞的活化。另外，还知道随着巨噬细胞利用脂多糖或干扰素γ活化，而诱发巨噬细胞的膜结构变化，在巨噬细胞内诱导膜结合型肿瘤坏死因子(TNF)。因此，随着利用吞噬这种刺激活化巨噬细胞而变成诱导膜结合型TNF。
艾滋病受艾滋病毒感染，破坏了T细胞，由于免疫应答缺陷而发病。然而，艾滋病毒感染不仅是对T细胞感染，而且也对巨噬细胞感染。这种感染由于艾滋病毒吸附在共同出现在T细胞、巨噬细胞膜上的CD4蛋白质上而开始，感染艾滋病毒的巨噬细胞不陷于细胞死亡而继续地产生了艾滋病毒，如II.(2)中所述的成为感染病毒媒体。
因此，如果可以诱导感染艾滋病毒的巨噬细胞至细胞死亡，则实现消灭感染病原体媒体。
作为可实现这种可能性的一个例子，列举膜结合型TNF对感染艾滋病毒(HIV)的巨噬细胞作用，可特异性地诱导该细胞至细胞死亡。具体的适用例利用呈现膜结合型TNF细胞诱导HIV感染细胞死亡作TNF对感染病原体的细胞诱导细胞死亡的实施例，列举TNF对HIV感染MOLT-4细胞的作用。
1.呈现膜结合型TNF细胞的制备(1)为了稳定地呈现膜结合型TNF按照已经发表的论文(Journalof Virology 1889年，第63卷，pp.2504-2509)制备老鼠及人呈现膜结合型TNF质体(pMT 2β G/Hu-proTNF)。
(2)然后，按10∶1的比例把该质体与转换株选择用酯合耐新霉素遗传基因的质体混合，导入老鼠胎儿产生的纤维芽细胞(NIH3T3细胞)中。
(3)把上述进行转化操作的NIH3T3细胞，在作为标示物的新霉毒800μg/mL的存在下，在37℃，二氧化碳气体培养器内培养约2个星期。
(4)培养后，取得结合在细胞内的TNF的克隆。
(5)得到的克隆，采用酶免疫测定法确认呈现膜结合型TNF。
2.感染HIV的MOLT4细胞的制备(1)感染HIV细胞，在37℃，二氧化碳气体培养器内，在培养基(添加RPM11640，10％牛胎儿血清及青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)中，使用感染HIV细胞(HTLV-III B株)，按照已发表论文(Journal of Virology 1889年，第63卷，pp.2504-2509)使MOLT4感染。如果对MOLT4细胞感染艾滋病毒成立，则MOLT4细胞显示出持续地继续产生艾滋病毒的特征。因此，产生艾滋病毒的话，MOLT4细胞则是感染艾滋病毒巨噬细胞的模型。
(2)在这种感染条件下，感染HIV的MOLT4细胞的90％以上对HIV抗体成阳性。
(3)因此，借助HIV感染细胞，将HIV导入MOLT4细胞的全部中，制得HIV感染MOLT4细胞。
3.利用呈现膜结合型TNF细胞诱导感染HIV细胞至细胞死亡(1)在24孔培养板上培养导入TNF质体的NIH3T3细胞使之大致成板一面。
(2)然后，加一定量的HIV感染MOLT4细胞在37℃，二氧化碳气体培养器内混合培养3天。
(3)为了研究所发现的膜结合型TNF对感染HIV细胞的作用，采用锥虫蓝色素排除法测定感染HIV细胞的生存率。
(4)结果，利用HIV感染MOLT4细胞的40％与呈现膜结合型TNF细胞的混合培养确认细胞死亡。
由以上的例子清楚地说明膜结合型TNF对感染艾滋病毒(HIV)的细胞，特异性地诱导细胞死亡。由此可以看出，保持病原体功能异常的巨噬细胞，通过吞噬病原体而活化，结果诱导的膜结合型TNF诱导感染病原体的细胞至细胞死亡。
巨噬细胞带有病原体形成的疾病有分枝杆菌病、艾滋病、衣原体病、或弓浆虫病等，分枝杆菌病有结核分支杆菌或牛分支杆菌为原因菌的结核，麻风分支杆菌为原因菌的ライ或鸟分支杆菌等为原因菌的非定型分枝杆菌病，作为衣原体病的原因菌有肺炎、沙眼衣原体或鹦武热衣原体，任何一种均可有效地使用本发明。然而，本实施方案所示的RFP-PLGA微粒子杀灭巨噬细胞内结核菌的效果，必须至少通过2次细胞内小胞膜结构，即由吞噬进入吞噬体内的RFP-PLGA微粒子中游离出利福平，透过吞噬体膜，再透过含结核菌吞噬体的吞噬体膜才能实现。上述所示的原因菌在巨噬细胞内的保命战略多种多样。分枝杆菌病、军团病、弓浆虫病通过原因菌在吞噬体内保命而在巨噬细胞内进行生存。李斯特杆菌、衣原体病具有原因菌从吞噬体中脱出的特征。与原因菌在吞噬体内存在的情况相比，从药剂到达的观点来看，如果药剂一度透过巨噬体膜可期待药效，故估计这些原因菌的细胞内生存形态更容易。另外，艾滋病如果药剂到达存在于细胞内的原因菌中则在可期待药效方面与李斯特杆菌等同样。由以上看出本发明对上述所述的原因菌也是有希望的治疗。
以下，列举对各种疾病可有效地使用本发明的药品。
1)分枝杆菌病利福平、雷米封、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗衣原体药、卡那霉素、硫酸链霉素、恩维霉素、乙硫异烟胺、环丝氨酸、左氧氟沙星、氨苯砜。
2)艾滋病叠氮胸腺嘧啶、二去氧肌苷。
3)衣原体病二甲胺四环素盐酸盐、多西环素盐酸盐、克拉霉素、司氟沙星、罗红霉素、左氧氟沙星。
4)弓浆虫病乙胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、乙酰螺旋霉素。
5)疟疾磷酸氯喹、硫酸奎宁、磺胺多辛、甲氟喹。
6)癌5-氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂、依托泊甙、丝裂霉素、长春新碱、紫杉酚、喜树碱、长春碱、环磷酰胺、盐酸平阳霉素。
7)克朗氏病抑氮磺胺吡啶、糖皮质激素。
8)类类风湿病硫代苹果酸金钠、青霉胺、布西拉明、糖皮质激素。
本说明书引用的一切刊物、专利及专利申请写入说明书中直接作为参考。
产业上利用的可能性根据本发明可提供可有效地治疗因巨噬细胞功能异常，或巨噬细胞为媒体所患疾病的治疗药。
权利要求
1.治疗药，其特征在于含有成团泛菌的脂多糖，是针对艾滋病的治疗药，使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，诱导保持病原体的巨噬细胞至细胞死亡。
2.权利要求1所述的治疗药，其特征在于前述巨噬细胞是存在与粘膜组织中的细胞。
全文摘要
本发明目的是提供针对功能异常的巨噬细胞，或巨噬细胞为媒体所患疾病的治疗药，该治疗药含有成团泛菌的脂多糖，是针对爱滋病的治疗药，可以使巨噬细胞的吞噬活性亢奋，通过积极地被巨噬细胞吞噬有效地进入巨噬细胞内，由此，使功能异常的巨噬细胞正常化，杀灭感染病原体的巨噬细胞，或杀灭感染病原体的巨噬细胞内的病原体的治疗药。
文档编号A61P29/00GK1935155SQ20061011492
公开日2007年3月28日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年8月27日
发明者寺田弘, 牧野公子, 杣源一郎 申请人:寺田弘