专利名称：Ptd-酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和药学领域。具体地涉及蛋白转导域-酪氨 酸羟化酶催化区域融合蛋白和应用。
背景技术：
由于血脑屏障的选择性通透作用，使许多治疗脑部疾病的药物不
能直接到达脑部病变部位，限制了其对疾病的治疗。
帕金森病(Parkinson' s disease, PD)是一种老年人常见的慢性 进展性运动障碍性疾病，其临床表现以静止性震颤、肌强直、运动迟 緩和姿势反射障碍为特征。PD的病理改变主要为黑质致密部多巴胺 (Dopamine, DA)能神经元严重缺乏，其生化改变主要为黑质、紋状体 DA递质减少。目前最有效的治疗措施是口服补充DA的前体物质左旋 多巴，但一般服药3-5年后疗效显著下降并出现毒副作用。酪氨酸羟 化酶是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，其催化活性残基都位 于其C-端的330个氨基酸中，在N-端的氨基酸中没有与催化活性有关 的氨基酸。研究表明，蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)能够有效地通过生物膜，将外源蛋白质与PTD连接后，能够进入 细胞和通过血脑屏障。将PTD的转导特性应用于药物治疗疾病方面， 具有重要的临床价值。
本发明的目的，在于制备PTD-酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白， 以期在临床治疗中，提高药物到达病变部位的量，更好地发挥治疗作 用。
发明内容
在一方面，本发明提供一种蛋白转导域-人酪氨酸羟化酶催化区
域的融合蛋白，其中的蛋白转导域能引导人酪氨酸羟化酶催化区域通 过血脑屏障，从而使酪氨酸羟化酶催化区域在不需进行外科手术情况 下到达脑部发挥活性。
满足这一要求的蛋白转导域可以是HIV-1反式激活蛋白 (trans-activator transcription, TAT)中的蛋白转导区(protein transduction domain, PTD)、果蝇触角蛋白同源结构域(ANTP )和 单纯疱渗病毒(HSV)VP22蛋白的蛋白转导序列。特别是具有序列 YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO: 1)或其功能性片段的PTD,
本发明融合蛋白中的人酪氨酸羟化酶催化区域优选具有下述序列 ( THc ) :
(SEQ ID NO: 2)或其功能性片段。
更优选的，本发明的融合蛋白具有下述序列:
ELDTLAHALSAIG (SEQ ID NO: 3 )，其中
1) 残基1-11为HIV-1的反式激活蛋白的47-57位肽；
2) 残基12-14为连接序列；
3) 残基15-367为THc序列。
另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的核酸序列。在上述
公开的氨基酸序列基础上，本领域普通技术人员能很容易地确定编码
本发明融合蛋白的核酸序列。所述核酸序列优选具有下列序列
TATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTGAATTCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCA
GGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAG
TGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTG
GACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGAT
CGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGA
TTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGC
GGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAA
TATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGC
GGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTG
TTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGA
CTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGT
TCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTG
GGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGG AGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAG
CCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGAT 中
1) 残基1-33编码HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT );
2) 残基40-1101为TH催化区域序列；
3) 残基1102-1104为终止密码子序列。
此外，本发明也提供了含有上述核酸序列的表达载体。 本发明还涉及所述融合蛋白的表达、纯化及复性方法，包括将编 码所述融合蛋白和His标签的质粒如pET质粒转化宿主菌BL21 (DE3)， 培养在25X: 42C，取出活化菌液，以5% ~ 20%的比例在新鲜培养
基中培养至OD600值为0.5~2. 0，加入浓度为0. 4~lmM的i秀导剂 IPTG，诱导时间为3-24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用pH8. 5 ~ 11. 5的10mmol/LTris緩沖液重悬菌体，振荡混匀，置冰上超声10 ~ 15min破菌，然后回收包涵体。用6-10M尿素溶解，用镍柱或层析柱 纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。
还在另一方面，本发明提供了所述融合蛋白用于制备治疗帕金森 病或其他儿茶酚氨类缺乏疾病的药物中的用途。本发明特别涉及含有 所述融合蛋白的药物组合物，为选自适于静脉注射、肌肉注射、皮下 注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜、肛栓或皮肤吸收及其它给药方 式施用的剂型或滴眼液剂的剂型。
图1: pET-PTD-hTHc构建示意图2: pET-PTD-hTHc经BamHI和Sal I双酶切鉴定，其中 标签l:pET-TH; 2: pET-PTD-TH; 3: pET-THc; 4: pET-PTD-THc; M: DM标准；
图3: pET-PTD-THc表达结果,其中
标签l，含pET28a菌；2， pET-THc; 3， pET-PTD-THc; 4， pET-TH; 5， pET-PTD-TH; M，标准蛋白分子量；
图4: pET-PTD-THc Western结果，其中
标签1, pET-TH; 2， pET-THc; 3， pET-PTD-TH; 4， pET-PTD-THc图5: PTD-THc透过SH-sy5y细胞膜实验，其中
A:生理盐水对照；B: PTD-TH; C: THc对照；D: PTD-THc;
图6:尾静脉注射PTD-THc透过大鼠血脑屏障实验，其中
A:生理盐水对照；B: PTD-TH; C: PTD-THc;
图7: PTD-THc对PD大鼠旋转行为的影响。
实施例
本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说
明性的，不应当理解成限制本发明的范围。
实施例1制备THc基因 取人胎总mRNA lyg，按cDM synthesis system操作指南依次 加入反应成分，反应总体积20p 1，42匸反应15min后，95"C灭活5min， 作为PCR模板。以hTHPl: 5， GCAGAATTCATGCCCACCCCCGACG 3， ( SEQ ID NO: 4) 和hTHP2: 5， GCTGTCGACCTAGCCAATGGCACTCA 3， ( SEQ ID NO: 5)为引物，用PCR方法获取全长TH。
以全长TH为模板，以hTHcPl: 5， GGAGAATTCCTGCTCAGTGGTGTG 3， (SEQ ID NO: 6)和hTH P2为引物，PCR扩增THc基因。
分别取载体pET28a和TH、 THcPCR片段，用EcoR I和Sal I进 行双酶切，经1%凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收各片段。将pET载 体片段分别与TH、 THc片段以l:3的比例混合，加T4连接酶，16C反 应16h,将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的 菌落，提质粒PCR鉴定。阳性克隆分别命名为pET-TH、 pET-THc。将 pET-TH、 pET-THc质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。
实施例2制备PTD基因 为了在人获得性免疫缺陷病毒TAT蛋白PTD区(TAT-PTD)基因 片段中导入BamH I和EcoR I酶切位点，获得下列引物
PTD Pl: 5，GATCCTATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTG 3， (SEQ ID NO: 7 );
PTD P2: 5，AATTCACGTCTACGTTGGCGTCGCTTTTTACGACCATAG 3， (SEQ ID NO: 8 )。
将PTD PI链和PTD P2链各5 u 1在94C变性5min，然后冷却至 室温。
实施例3制备pET-PTD-THc融合蛋白基因栽体 分别取pET-TH、 pET-THc质粒用BamH I和EcoR I双酶切，再 用凝胶回收试剂盒回收载体片段。载体与PTD片段以1: 3的比例混合 后进行连接反应，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转 化成功的菌落，提质粒经PCR和酶切鉴定，阳性克隆分别命名为pET-PTD-TH、 pET-PTD-THc(图1、图2),将pET-PTD-TH、 pET-PTD-THc 质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。
实施例4制备PTD-THc融合蛋白 1 PTD-THc的表达
分别挑取转化pET-PTD-THc的阳性菌落置LB培养液中(含卡拉霉 素60 ug/ml)活化，再按5-20%接种于2YT培养液中，培养至OD600 为0.5 ~ 2.0，时，加入O. 4~lmM IPTG诱导表达(图3)。收集诱导 表达3 24h的菌体，PBS洗净。
2. PTD-THc的Western鉴定
经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分析表明沉淀中有目的蛋白，其分子量与理论值相符。经Western 印迹，用TH多克隆抗体鉴定分析为PTD-THc (图4)
3. 包涵体洗涤
用pH8. 5 ~ 11. 5的10mmol/L Tris緩冲液重悬菌体，振荡混匀， 置水上30min,超声10 15min破菌，4X: 10000 rpm离心，沉淀部 分用0. 5-4M尿素，100 mmol/L NaC1，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 洗涤4C过夜。
4. 包涵体溶解及复性
以10000转/分离心15分钟，收集沉淀，用6-10mol/L尿素(溶 于20mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH8 12.0)溶解，緩慢加入等 体积复性液(含20mmol/L Tris ， lmmol/L EDTA， 0. lmmol/L GSH; 0. 01mol/L GSSG) ， 12000转/分离心15分钟，取上清液装入 8000-12000透析袋，置4-12X:中采用连续梯度透析法彻底透析，再 用PBS或生理盐水透析3次。
实施例5 PTD-THc的活性测定 1.PTD-THc过细胞膜实验
将实例4获得的PTD-THc融合蛋白加入SH-sy5y中，2h后以抗 TH为一抗做免疫组织化学检测，对照组用THc加入SH-sy5y中，结果 入细胞内，并以胞浆中分布为主(图5)。
2. PTD-THc过血脑屏障实验
将实施例4获得的PTD-THc融合蛋白通过尾静脉注入大鼠体内， 2h后处死动物，取脑组织进行冰冻切片，以抗TH为一抗做免疫组织 化学检测，对照组以生理盐水代替，脑组织中棕色斑点分布增多，结 果表明PTD-THc可进入脑内(图6 )。
3. PTD-THc对PD大鼠的作用
1) 应用6-0HDA制备PD大鼠模型
雄性Sprague-Dawley大鼠(200-230g)，预先给予去甲丙咪溱 (25mg/kg， i.p.)封闭去甲肾上腺素转运体。水合氯醛 (400mg/kg， i.p.)麻醉后，将动物固定于脑立体定位仪 (NARISHIGAN， Japan)。沿颅顶正中矢切开皮肤、暴露前囟(Bregma )， 开颅后以微量进样器插入左侧前脑内侧束(Bregma,-4. 0 mm; ML, 1.65mm; DV，8.0mm)。在给予去甲丙咪嗪30min后，用微量蠕动泵自 动注入6-OHDA溶液4 l(含20 |i g 6-OHDA. HBr， s igma;抗坏血酸0. 02%， 速度0.5 1/min)。注射完毕，留针5-8min后退出进样器，缝合处 理创面。
2) 行为检测
手术3周后以阿朴吗啡(Apomorphine， APO， 2 mg/kg， i.p.) 预选能够产生旋转行为的PD模型大鼠。随后，再以APO (0.2mg/kg， i.p.)复筛2次，间隔3天。筛选时，APO注射后将动物放于40cm直 径的圆底锅内，计数30min内动物向前侧旋转的圏数(旋转360度计 为一圏)，旋转大于150转/30min的大鼠用于后继实验。
3) 药效观察
PD大鼠模型稳定2月后，将动物分为3组，分别为PTD-TH组， PTD-THc组及生理盐水组。给药前检测一次，给药后第1、 5、 17、 31 天各检测一次(图7),给药剂量为8mg/kg体重。
实验结果表明，生理盐水对照组大鼠在检测期内旋转次数差异无 显著性。PTD-TH组大鼠的旋转次数比治疗前明显减少，PTD-THc的比
治疗后更加明显地减少，
发明效果
利用基因工程、蛋白质纯化等手段，制备具有穿膜活性及其他生 物学活性的双重活性肽，并指导制备出具有药用价值的生物栽体药物，
PTD-THc生物学效应较PTD-TH更持久，应用于疾病的治疗，具有重要 的医学研究及临床使用价值。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 <120> PTD-酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白及其应用 <腸9
<210> 1
<211> 11
<212>氨基酸序列
<213> PTD核心序列
<400> 1
YGRKKRRQRR R 11
<210> 2
<211> 354
<212〉氨基酸序列
<213〉人酪氨酸羟化酶催化区域
<400> 2
LLSGVRQVSE DVRSPAGPKV PWFPRKVSEL DKC冊LVTKF DPDLDLDHPG FSDQVYRQRR KLIAEIAFQY RHGDPIPRVE YTAEEIATWK EVYTTLKGLY ATHACGEHLE AFALLERFSG YREDNIPQLE DVSRFLKERT GFQLRPVAGL LSARDFLASL AFRVFQCTQY IRHASSPMHS PEPDCCHELL GHVPMLADRT FAQFSQDIGL ASLGASDEEI EKLSTLSWFT VEFGLCKQNG EVKAYGAGLL SSYGELLHCL SEEPEIRAFD PEAAAVQPYQ DQTYQSVYFV SESFSDAKDK LRSYASRIQR PFSVKFDPYT LAIDVLDSPQ AVRRSLEGVQ DELDTLAHAL SAIG 354
<210〉 3
<211> 367
<212>氨基酸序列
<213>蛋白转导域一人酪氨酸羟化酶催化区域的融合蛋白 <400> 3
YGRKKRRQRR REFLLSGVRQ VSEDVRSPAG PKVPWFPRKV SELDKCHHLV TKFDPDLDLD HPGFSDQVYR QRRKLIAEIA FQYRHGDPIP RVEYTAEEIA TWKEVYTTLK GLYATHACGE HLEAFALLER FSGYREDNIP QLEDVSRFLK ERTGFQLRPV AGLLSARDFL ASLAFRVFQC TQYIRHASSP MHSPEPDCCH ELLGHVPMLA DRTFAQFSQD IGLASLGASD EEIEKLSTLS WFTVEFGLCK QNGEVKAYGA GLLSSYGELL HCLSEEPEIR AFDPEAAAVQ PYQDQTYQSV YFVSESFSDA KDKLRSYASR IQRPFSVKFD PYTLAIDVLD SPQAVRRSLE GVQDELDTLA 亂SAIG 367
〈210〉 <211> <212〉 <213〉 <400>
4
25 隠
引物hTH PI 4
GCAGAATTCA TGCCCACCCC CGACG 25
<210> 5 <211> 26 <212〉 DNA 〈213〉引物hTHP2 <400〉 5
GCTGTCGACC TAGCCAATGG CACTCA
<210> 6
<211〉 24
<212> DNA
<213〉 引物hTHc Pl
<400〉 6
GGAGAATTCC TGCTCAGTGG TGTG
<210> 7 〈211〉 39 <212> DNA <213>引物PTDP1 <400> 7
GATCCTATGG TCGTAAAAAG CGACGCCAAC GTAGACGTG
<210> 8 <211> 39 <212〉 醒 <213> 引物PTD P2 <400〉 8
AATTCACGTC TACGTTGGCG TCGCTTTTTA CGACCATAG
<210〉 9
<211> 1104
〈212〉 DNA
〈213〉编码蛋白转导域--人酪氨酸羟化酶催化区域的融合蛋白的核酸序列<400〉 9
TATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTGAATTCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAG
GTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTG
TCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGAC
CACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCC
TTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCC
ACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAG
CACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCC
CAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTG
GCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGC
ACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCAC
GAGCTGCTGG GGCACGTGCC CATGCTGGCC ATTGGCCTGG CGTCCCTGGG GGCCTCGGAT TGGTTCACGG TGGAGTTCGG GCTGTGTAAG GGGCTGCTGT CCTCCTACGG GGAGCTCCTG GCCTTCGACC CTGAGGCTGC GGCCGTGCAG TACTTCGTGT CTGAGAGCTT CAGTGACGCC ATCCAGCGCC CCTTCTCCGT GAAGTTCGAC AGCCCCCAGG CCGTGCGGCG CTCCCTGGAG CATGCGCTGA GTGCCATTGG CTAG
GACCGCACCT TCGCGCAGTT CTCGCAGGAC GAGGAAATTG AGAAGCTGTC CACGCTGTCA CAGAACGGGG AGGTGAAGGC CTATGGTGCC CACTGCCTGT CTGAGGAGCC TGAGATTCGG CCCTACCAAG ACCAGACGTA CCAGTCAGTC AAGGACAAGC TCAGGAGCTA TGCCTCACGC CCGTACACGC TGGCCATCGA CGTGCTGGAC GGTGTCCAGG ATGAGCTGGA CACCCTTGCC
110权利要求
1、 一种融合蛋白，其由蛋白转导域(PTD)和人輅氨酸羟化酶催化 区域(hTHc)组成。
2、 如权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白转导域PTD 选自HIV-1反式激活蛋白(TAT)中的蛋白转导区、果蝇触角蛋白同源 结构域和单纯疱疹病毒VP22蛋白的蛋白转导序列。
3、 如权利要求l的融合蛋白，其特征在于所述蛋白转导域PTD具有 SEQ ID NO: l的序列。
4、 如权利要求l的融合蛋白，其特征在于，所述人酪氨酸羟化酶催 化区域具有SEQ ID N0:2的序列。
5、 如权利要求l的融合蛋白，其具有SEQ ID N0:3的序列。
6、 核酸序列，其编码权利要求l-5中任一项的融合蛋白。
7、 权利要求6的核酸序列，其具有SEQ ID N0:9的序列。
8、 权利要求l-5中任一项的融合蛋白在制备治疗和预防各种儿茶酚 胺类物质缺乏或失调所致疾病的药物中的用途。
9、 权利要求l-5中任一项的融合蛋白在制备预防和治疗帕金森病的 药物中的用途。
10、 一种药物组合物，其含有权利要求l-5中任一项的融合蛋白， 优选为适于进行静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含服、肺吸入、 鼻腔粘膜、肛栓或皮肤吸收及其它给药方式施用的剂型或滴眼液形式。
全文摘要
本申请涉及蛋白转导域-人酪氨酸羟化酶催化区域的融合蛋白，以及编码该融合蛋白的核酸。本申请也涉及所述融合蛋白的表达纯化及复性方法。本申请也提供含有所述蛋白转导域-人酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白的药物组合物，所述组合物可以用于治疗帕金森病。
文档编号A61K38/43GK101121751SQ20061011491
公开日2008年2月13日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日
发明者吴少平, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所