抗肝癌中药有效组分优选配方的制作方法

专利名称：：抗肝癌中药有效组分优选配方的制作方法抗肝癌中药有效组分优选配方原发性肝癌(h印atocellularcarcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤，其发病隐匿、进展迅速、治疗难度大、生存期短，被称为"癌中之王"。全球范围内多发于经济技术欠发达的发展中国家，全世界每年新发肝癌约26万例，占全部恶性肿瘤的40%，而42.5%的肝癌分布在中国。据国家卫生部统计，20世纪90年代起我国肝癌死亡率已上升为20.40/10万，城市中居第二位，在部分农村占第一位且有上升趋势。肝癌的防治是本世纪乃至下一世纪我国恶性肿瘤的防治重点。在肝癌的治疗上，肝动脉导管介入、术中瘤内无水酒精注射、液氮冷冻治疗、电化学治疗等方法的兴起，不同程度取得了缓解症状、縮小瘤体的治疗效果，但由于肝脏血液供应丰富、侧支循环极易形成，治疗后癌细胞不能全部死亡，复发率高、远期效果仍然不佳。化学疗法是治疗肝癌的主要手段之一，但几乎所有的抗癌化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常组织，其毒副作用使得给药剂量有很大限制，甚至使患者的免疫功能降低而被迫中断用药，导致治疗失败[2]。研究及实践表明祖国传统中医中药在治疗肿瘤、减毒增效、预防复发、延长生存期、改善症状、提髙生存质量等方面均显示出良好的效果，日益在肝癌的临床治疗中显示出重要的价值。近年来，中药有效成分或有效部分制剂在临床的应用日趋增多，但研究层面单一，多为单独应用或一种中药与西药联合应用，联合应用缺乏中医理论的指导且多停留在疗效观察上，未能对其组合原理、剂量配比、抗癌机制进行深入系统的研究。中药复方研究的难点仍然在于如何从化学成分和药效作用机理及两者的相关性上用现代科学方法阐明其科学道理[3"]。现代中药理论及有效成分的研究给我们提供了中药更深层次的了解，有必要应用中药的现代知识，在传统中医理论的指导下，针对治疗目标，设计一定的中药复方，应用系统思维方法，结合数学优选方法，对组方进行优化研究，找出新的有效组合。均匀设计作为一种现代数理统计方法,用于方剂配伍的研究有其独特的优越性与正交试验设计相比它可以极大的提髙试验效益，与其他传统拆方方法相比如撤药研究法、析因试验设计、按药性或经验进行拆方研究等，均匀设计可以更充分反映各药物在全方中的作用、地位及药物之间的交互作用，可以通过软件的预报功能，充分利用现有实验数据进行数据挖掘整理，深入探讨方剂配伍规律，具有较髙的应用价值[8]。中药现代研究给我们提供了许多微观上的资料成为我们选方的依据。在临床和实验研究中发现许多中药有效成分或部分对肝癌有良好的抗癌效应。QHF方案即淸热解毒(Q)、活血化淤(H)、扶正固本(F)联合抗癌方案。通过文献研究及预实验初步确定从华蟾素、斑蝥素、三七总皂甙、人参皂甙Rg3、丹参酮、香菇多糖中进行筛选组合。淸热解毒华膽素、斑蝥素；活血化瘀三七总皂甙、丹参酮；扶正固本人参皂甙Rg3、香菇多糖。各药物抗癌机制中，抑制肿瘤细胞DNA合成是其主要交叉点，其次是影响肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡和提髙机体免疫功能，各机制之间形成一定的补充[7'8]。为了系统深入地研究抗癌中药化学成分配伍治疗肝癌的作用，在中医理论的指导下我们以清热解毒(Q)、活血化瘀(H)、扶正固本(F)为治疗大法，通过文献及单药实验筛选具有对应作用的中药成分，并以此作为因素，以抑瘤率、生存率为评价指标，采用均匀设计通过动物实验对其组合进行优选和分析，确定抗癌中药有效成分QHF的最佳组方和剂量配比，并进一步研究其抗肝癌作用和机制。实验结果表明，优选配方即QHF方案的组合及其配比具有良好的抗肝癌作用，显著性抑制H22肝癌移植性小鼠肿瘤生长和延长生存时间，且安全、低毒并能对化疗药物PPD起到增效、减毒作用，经临床证实治疗肝癌有显效。本发明所提供的抗肝癌中药有效组分优选配方即QHF方案的组方及最佳药量配比为QHF方案组成为华蟾素、三七总皂甙、人参皂甙Rg3、香菇多糖。QHF组合最优剂量配比为华蟾素800mg/kg,人参皂甙Rg314rag/kg,三七总皂甙5.5mg/kg，香菇多糖100mg/kg。实施例第一部分均匀设计筛选抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)的实验研究清热解毒(Q)、活血化瘀(H)、扶正固本(F)是肝癌的三大主要治则，本实验部分首先通过文献及单药实验筛选出具有对应作用的四种中药成分并以此作为因素，以抑瘤率和生命延长率为指标，采用均匀设计对优选配方即QHF方案进行优选和分析，筛选成分清楚的抗癌组合QHF,确定其组成及最佳剂量配比。材料和方法1实验材料1.1动物昆明(KM)雄性小鼠，体重1820g,由湖北省实验动物中心提供，合格证号为SCXK(鄂)2003-2005。1.2痛株小鼠肝癌H^瘤株(H22细胞)由本校免疫研究室保存。1.3药品顺铂锦州九泰药业有限责任公司，批号050301;华螗素安傲金螗生化股份有限公司生产，批号041103:参一胶瘻(人参皂甙Rg3):吉林亚泰制药有限公司生产，批号050302;三七总皂苷云南省玉溪市维和制药有限公司生产，批号050124:香菇多糖片浙江金华埃森药业有限公司生产，批号050202:丹参酮和斑蝥素由南京青泽医药科技开发有限公司提供，纯度99%:平消片陕西盘龙制药集团有限公司，批号050203。1.4仪器自动平衡离心机(北京医用离心机厂生产LDZ5-2型)电子分析天平(德国普公司SartoriusBP110S型)微量移液器(德国EPPEND0RF公司200ul、1000ul)2方法2.1单药初肺2.1.1药物选用选择标准化学成分基本清楚，药理机制比较明确，经实验或临床证实治疗肝癌有效。选用药物华搶素，斑螽素，三七总皂甙，丹参酮，人参皂甙Rg3、香菇多糖。2.1.2动物模型的建立颈椎脱臼处死传代7天的Ifc荷瘤小鼠，无菌取腹水癌细胞，台鼢蓝染色后，光镜下观察活癯细胞数095W,生理盐水稀释，调整细胞浓度为5X10B个/inl。小鼠140只，其中70只每只右侧腋窝皮下接种瘤液0.2ml，建立Ifc荷实体瘤小鼠模型另70只每只腹腔接种瘤液0.2ml,建立H荷腹水瘤小鼠模型。2.1.3动物分组及给药H22荷实体瘤小鼠随机分为7组，每组10只(1)生理盐水组(NS组)给予生理盐水0.4ml灌胃，1次/天(2)华據素组给予华條素0.4ml灌胃(剂量600mg/kg)，1次/天；(3)斑蝥素组给予斑蝥素0.4ml灌胃(剂量O.lmg/kg)，1次/天W)三七总皂甙组给予三七总皂甙0.4ml灌胃(剂量5mg/kg),1次/天(5)丹参兩组给予丹参酮0.4ml灌胃(剂量9邮/kg)，l次/天(6〉人参皂甙Rg3组给予人参皂甙Rg30.4ml灌胃(剂量6mg/kg),1次/天；(7)香菇多糖组给予香菇多糖0.4ml灌胃(剂量120mg/kg)，1次/天。接种后第二天开始，连续10天，每日l次灌胃药物治疗。H22荷腹水瘤小鼠亦随机分设7组，每组10只，给药剂量及方式同上。2.1.4抑癯率末次给药24h后，称小鼠体重，颈椎脱臼处死小鼠，完整剥离肿癯组织并称重，按下列公式计算抑瘤率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>2.1.5生命延长率从第ll天起停止给药，实验期间密切观察各组小鼠肿瘤生长情况、生存状态，并按下列公式计算生命延长期用药组平均生存天数一NS组平均生存天数生命延长率(ILS)=X100%NS组平均生存天数2.1.6数据统计处理以上检测结果通过SPSS10.0统计分析软件进行单因素方差分析，各组间均数的比较采用SNK-q检验。数据均以x±s表示。2.1.7初步确定OHF方案的组成据单药筛选的结果结合中医抗肝癌三大治则选定,与NS组比较有显著意义的药物入选,清热解毒，活血化瘀各选l种，扶正固本选2种，4种成份组成QHF方案。2.2剂置配比研究2.2.1确定因素和水平四种药作为考察因子，每因子取5水平，各因素水平范围依据数据的齐整性，临床常用剂量范围及文献中各有效成分的药效剂量3个原则设定，定为5个水平(10组)，见表一。表一考察因素及水平<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2.2建因亲水平表选用均匀设计表U10*(10'),取l、3、4、5列安排各因素和水平表二均匀设计表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注括号内为药物剂量，单位mg/kg2.2.3建立H22荷实体癯小鼠模型方法同2.1.2,随机分设12组，药物组10组采用U10+(10"设计表中剂量灌胃，阴性对照组予以生理盐水灌胃，均为0.4ml，每天1次，连续10天;阳性对照组予以顺铂(3mg/kg),隔曰腹腔注射O.lml，共5次。第ll天，处死小鼠，剥离肿癯组织计算抑瘤率。2.2.4建立H22荷腹水痫小鼠模型方法同2.1.2,随机分设12组，药物组10组采用1110*(10')设计表中剂量灌胃，阴性对照组予以生理盐水灌胃,均为0.4ml，每天1次,连续10天:阳性对照组予以顺铂(3mg/kg),隔日腹腔注射O.lml,共5次。第ll天停止给药密切观察小鼠生存状态，记录生存时间并计算生命延长率。2.2.5数据统计分析DPS数据处理系统对结果进行二次多项式逐步回归分析，得出最优剂量配比，2.3验证实验采用2.2得出的最优剂量配比进行验证实验，同时进行与组成中同剂量单药的比较。2.3.1建立Ha荷实体痛小鼠模型方法同2.1.2,随机分设6组生理盐水组、QHF组、华埯素组、人参皂甙Rg3组、三七总皂甙组、香菇多糖组，给药剂量为华输素800呢/kg,人参皂甙Rg314mg/kg,三七总皂甙5.5邮/1^,香菇多糖100mg/kg，各药物生理盐水稀释为所需浓度，等容(0.4ml)灌胃，每天1次，连续10天。第ll天，处死小鼠，剥离肿癯组织计算抑瘤率。2.3.2建立H22荷旗水瘤小鼠模型方法同2.1.2,分组及给药方式同2.3.1。第11天停止给药，记录生存时间并计算生命延长率。2.3.3数据统计处理SPSS10.0统计分析软件进行单因素方差分析，各组间均数的比较采用SNK-q检验。结果1单药初筛实验结果1.1六种药物对小鼠移植性肿痛生长的抑制率结果显示华維素，斑螯素，三七总皂武和人参皂甙Rg3组抑瘤作用明显，抑瘤率分别为34.90%、27.93*、24.25%、36.46%,与生理盐水组间的差异有显著的统计学意义(/<0.01)。见表l。表l对小鼠移植性肿癍生长的抑制率组别剂量(mg/kg)N瘤重抑瘤率生理盐水102.0360±0.2095华螗素600101.3255±34.恥0.1548"斑蝥素0.1101.4674±27.930.2054"二七总阜武35101.5423±24.250.3497**丹参酮9101.9157±0.34诉5.91人参皂甙Rg36101.2937±36.460.2208**香菇多糖120101.9326±0.22095.08注:与生理盐水组比较"/><().01,下表同.1.2六种药物对小鼠生存时间的彩响华蠊素，三七总皂甙，人参皂甙Rg3和香菇多糖组能明显的延长小鼠的生存期，生命延长率分别为32.30%、29.81%、32.30%、32.91%,与生理盐水组间的差异有显著的统计学意义(/<0.01)。见表2。表2对荷癍小鼠生存时间的影响组别剂量(mg/kg)N生存时间生命延长率生理盐水1016.1±2.2828华糖素6001021.4±1.646532.92斑螯素0.11018.1±1.286712.42二七总皂武351020.9±1.728829.81丹参酮91018.9±1.912017.39人参皂甙Rg361021.3±1.567032.30香菇多糖1201021.8±1.813535.401.3优选配方-QHF方案组成的初步确定选定Q清热解毒华蟓素；H活血化瘀三七总皂甙；F扶正固本人参皂甙Rg3、香恭多糖。2剂ft配比研究结果2.1以抑瘤率作为评价指标(见表3)结果输入计算机，使用DPS数据处理系统进行二次多项式逐步回归，得回归方程Y=2.5034-35.9373Xa+7.4425Xs+49.1543&2+0.0151X,X2-0.0014X皿Xr6.3074X2Xa+0.OlOOXJU复相关系数R=0.9恥51&40.7375/M).0242S=l.40353R,=0.98421计算机得出的优化结果为华據素798.1288mg/kg,人参皂甙rg314mg/kg，三七总皂甙5.6580mg/kg,香菇多糖101.1111mg/kg，抑瘤率56.98%。关联序为X2>X,>X,>X,.表3均匀设计表及结果药物组别华維素人参皂甙Rg3二七阜武香菇多糖微承11(600)2(8)2(7)3(120)忍必21画)3(10)4(11)5(160)必《32(800)5(14)1(5)2(100)57./《42(800)1(8)3(9)5(160)必.忍53(1000)2(10)5(13)2(100)必.7/63(訓)4(12)1(7)4(140)欲i774(1200)5(14)3(9)1(80)5"384(1200)1(8)5(13)4(140)".加95(1400)3(10)2(7)1(80)激57705(7柳4""4⑨<7柳必/《注括号内为药物剂量，单位mg/kg2.2以生命延长率作为评价指标(见表4)结果输入计算机，使用DPS数据处理系统进行二次多项式逐步回归，得回归方程Y=2.7639~25.2诉5Xj+4.8969X3+33.3621X^+0.0099X&-0.0009X皿Xj+0.0065XsX4-4.18743￡*复相关系数R=0.99674F=43.5791/*=0.0226S=0,90641R,-0.9肪24计算机得出的优化结果为华Ji素798.1287呢/kg，人参皂甙rg314mg/kg,三七总皂甙5.6580mg/kg,香菇多糖101.1110mg/kg,生命延长率为37.99%。关联序为X2>X，>X<>X，.表4均匀设计表及结果2药物组别华媳素人参皂甙Rg3三七皂甙香菇多糖全命屋长率11(600)2(8)2(7)3(120)W.邻21(600)3(10)4(11)5(160)犯M32(800)5(14)1(5)2(100)激"42(800)1(8)3(9)5(160)激"53(1000)2(10)5(13)2(100)叙W63(1000)4(12)1(7)4(140)忍"74(1200)5(14)3(9)1(80)加."84(1200)1(8)5(13)4(140)J汰/95(1400)3(10)2(7)1(80)705(7柳44卽(7加犯"注括号内为药物剂量，单位mg/kg2.3确定最优剂ft配比华螗素800mg/kg,人参皂甙Rg314mg/kg，三七总皂甙5.5mg/kg,香菇多糖100mg/kg。3验证实验结果采用组合华膽素800mg/kg，人参皂甙Rg314mg/kg，三七总皂甙5.5呢/kg，香菇多糖IOO邮/kg(配比l)对小鼠肿癯生长的抑制率及生命延长率的验证实验发现与优化结果基本相符，且抑瘤率和生命延长率均优于组方中各单药，差异有统计学意义(代O.Ol)。见表5，表6。确定QHF方案组成及配比为华蠊素800mg/kg，人参皂甙Rg314mg/kg,三七总皂甙5.5mg/kg,香菇多糖100mg/kg。表5对小鼠移植性肿癍生长的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6对荷癍小鼠生存时间的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>讨论1餘选方法的选择及评价方剂和药物的配伍研究通常采用的实验设计方法有撤药研究法、析因试验设计、按药性或经验进行拆方研究、按君臣佐使进行拆方研究、正交试验验设计、均匀试验设计。撤药研究法即单因素试验轮换法将全方中的各药味轮流减去,分为不同的试验组进行研究。按君臣佐使进行拆方研究是按照中医理论将方剂分为君、臣、佐、使药通过药效学指标分别评价其在全方中的作用探讨君臣佐使之间的相互关系。按药性或经验进行拆方研究是根据各药性不同进行分组它将方剂中的药味传统中医药理论为指导分解为不同部分进行研究探讨部分与部分部分与整体的关系。析因设计是用于多因素试验的一种试验设计方法，把各因素各水平的一切组合都进行试验，由于试验次数太多，工作量大而难以实现，近年来已少用。这些拆方研究只能孤立的反映单个药物或者药对的作用，难以充分的反映每个药剂量变化对药效的影响及各药物之间的交互作用，有一定的局限性。正交和均匀设计都是效率很高的部分因子试验设计。正交设计具有正交性，利用正交性来挑选部分水平组合，可以估计出因素的主效应，有时也能估计出它们的交互效应，且计算公式比较简单,计算器即可解决问题，同时直观性好，通常直接看就可以看出好条件来，用极差大小可以衡量相应因素作用的大小。它的试验次数为水平数的平方的整数倍仅限于研究药味组成较少的处方，当药物与效应之间的关系为高次多项式或非线性关系时就需要更高水平的试验，这时所霜求的试验次数使试验者望而生畏。均勾设计(uniformdesign)是加世纪70年代我国数学家方开泰和王元将数论方法用于多因素多水平试验创造出的一种新的试验设计方法。其思想是将试验点均匀的散布在试验范围之内，以求通过最少的实验数获得最多系统信息(强调几何格子点的均匀性，以偏差作为度量准则)。均匀设计首先在我国飞航式导弹的设计中得到有效的应用。近年来，它在中药制剂的提取工艺、成型工艺等方面的应用迅速增多，并开始运用于方剂、药物配伍的研究。均匀设计方法作为一种筛选研究手段，其优越性在于(D实验点少，实验点数即为水平数；一般说来，在一项实验中若有s个因素，每个因素有q个水平，全面实验需耍q'次，正交实验霈耍^次，均匀实验则只需q次。(2)实验结果可用计算机处理。因而均匀设计成为寻找最佳实验条件、最佳配比等优化条件的有力工具，大量运用于中药制剂的提取工艺、成型工艺，方剂和药物配伍的研究。均匀设计利用均匀性来挑选，试验次数等于水平数，可以反映因素和水平之间更为复杂的关系，极大的提髙了试验效益而不致使所反映的信息减少，可以通过计算机拟和，用数字模型描述大量数据中隐含的规律。均匀设计失去了整齐可比性不能用方差分析估计出主效应和交互效应，只能用回归模型来进行估计，但是它更加注重了均匀性，可以选到偏差更小的点，更重要的是实验次数从q2减少到q,实验大大降低了成本，从经济学和优化两个角度出发均匀设计有着很大的优越性，均匀设计采用逐步回归思想方法对数据进行处理分析:从一个自变量开始按其对因变量影响的显著程度从大到小一次逐个引入回归方程，每新引入一个自变量都要对方程进行F检验，把那些影响变得不显著的自变量随时剔除出去。这样使回归方程中包含的是对Y影响显著的自变量，直至再没有新的变量需要引入方程为止。逐步回归的迭代方法是对相关矩阵(即自变量xlx2x3xk与因变量y中两两之间的简单相关系数rij组成的矩阵)进行迭代而判断将哪个自变量引入冋归方程以偏回归平方和pi为标准将pi最大的那个自变量引入回归方程。逐步回归计算量大，一般采用计算机处理较为方便。2模型、瘤株选择及评价肿瘤实验研究通常有离体和活体研究两种方法,离体方法由于肿瘤细胞在体外培养其实验结果对人类肿瘤的指导意义相对不大，所以活体研究通常应用最多，研究者可以获得整体动物在荷瘤情况下的各种实验资料。实验动物的肿瘤模型大致分为自发性肿癯模型、诱发性肿瘤模型和移植性肿癯模型。本课题以移植性肿瘤小鼠为模型。动物移植性肿癯模型具有100總植成活率，动物成瘤稳定，均一性好，无自发缓解，容易施加干扰因素和人为操作等优点。至于在小鼠种系选择方面从临床角度考虑人群是由遗传体质各不相同的个体组成进行抗肿瘤药物筛选的时候杂种小鼠可能更具有代表性同时考虑到实验次数和动物来源问题本部分实验选用昆明种小鼠作为实验动物。本课题选用抗癌药物研究中常用的动物移植性肿瘤癯株肝癌H22。H22肝癌瘤种由中国科学院上海药物研究所建立来自于小鼠病理组织类型属肝细胞癌用昆明种小鼠进行传代发病率达100%。为防止瘤源重复体内传代可能导致的细胞表型异种型的减少和生物学特性的改变，本实验小鼠移植癯传5代，符合体内传代少于15代的要求。接种和传代过程均严格执行无菌操作。空白对照组实体瘤模型小鼠于接种后5天，右腋下均可扪及瘤结节，实验过程中逐渐长大，无不生长和自发消退现象，实验结束平均瘤重均大于lg;腹水瘤模型于7天可见腹部膨窿，逐渐增大，平均生存时间小于18天，表明移植瘤生长良好实验结果有效。3药物筛选结果分析对肝癌病因病机的认识，祖国医学认为其为邪毒稽留、湿热蕴结，气滞血瘀，正气虚衰所致。在治法方面，曾氏分析了建国以来中医药治疗肝癌的主要文献后得出结论活血化瘀，清热解毒，益气健脾，疏肝解郁，软坚散结等五类治法应用最多，其使用频率分别为73.1%、71.挑、67.抓、51.8%、50.696。中医理论结合中药现代研究给我们提供的许多微观资料成为我们选方的依据。在临床和实验研究中发现许多中药有效成分或部分对肝癌有良好的抗癌效应，通过文献研究及预实验我们初步确定从华維素、去甲基斑蝥素、三七总皂甙、人参皂武RG3、丹参爾、香菇多糖中进行筛选组合。清热解毒华據素、去甲基斑蝥素；活血化瘀三七总皂甙、丹参酮扶正固本人参皂甙RG3、香菇多糖。本实验中我们应用中药的现代知识，结合传统中医理论，针对治疗目标，首先初步筛选并设定了优选配方组合，为了更全面充分地剖析药物与效应的关系，之后结合数学优选方法(均匀设计法)，对组方进行了优化研究。多项式回归及优化结果表明优选配方(QHF方案)组成为华搶素800mg/kg，人参皂甙Rg314rag/kg，三七总皂甙5.5mg/kg，香薪多糖100mg/kg时抑癯率和生命延长率最佳，关联度分析表明人参皂甙Rg3、华蝤素对结果的影响较大，从回归方程还可以看出药物之间有交互作用，如人参皂甙Rg3和华螗素有正交互作用，三七总皂甙和香菇多糖有正交互作用，华據素和三七总皂武有负交互作用，人参阜武Rg3和三七总皂甙有负交互作用。利用均匀设计来筛选抗癌优选配方(QHF方案)，实验中考虑到水平数和因素数的适当比例，至少水平数(组数)大于因素数的2倍以上才能使实验结果正确的进行回归处理，所以选用1]10*(108)表，在减少了实验次数、节约了时间和费用的同时又能获得对实验对象较全面深入的认识，通过计算机辅助设计和对数据结果的统计分析处理，提髙了药物研究的客观评价程度和整体研究水平。均匀实际作为一种现代数理统计方法，用于方剂配伍的研究有其独特的优越性。与正交试验设计相比它可以极大的提高试验效益，与其他传统拆方方法相比它可以更充分反映各药物在全方中的作用和地位，及药物之间的交互作用因而具有较离的应用价值。通过软件的预报功能，充分利用现有实验数据进行数据挖掘整理，深入探讨方剂配伍规律，相当于从全面试验中挑选出了具有代表性的点，实施实验，所得数据通过计算机拟和，分别给出了对H移植性小鼠抑瘤率和生命延长率的回归方程，从回归方程中我们可以较清楚的看出，方中各药物与效应学指标的关联度以及药物之间的交互作用对药效的影响。1.刘倩，王文奇主编.肝癌[M].人民卫生出版杜，2000年7月2.(美)德维塔等主编徐从高译.癌肿瘤学原理和实践M.济南:山东科学技术出版社，2001年1月第5版406,11223.郑虎占等主编.中药现代研究与应用(第六巻)[M].北京学苑出版社，2003年1月第2版5987,5992,61364.许海琴等主编.常用天然提取物质量标准参考手册[M].北京化学工业出版社，2003年4月第l版31,109,2275.陈锐深主编.现代中医肿瘤学[M].人民卫生出版社，2003年1月第1版235,2站，2586.赵新先主编.中药注射剂学[M].广东科技出版社，2000年11月第1版7,6147.方开泰主编.正交与均匀实验设计[M].北京:科学出版社，2001年9月结论1.抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)组成为华蠊素、三七总皂甙、人参皂甙Rg3、香菇多糖。2.抗肝痛中药有效组分优选配方(QHF方案)最优剂量配比为华糖素800mg/kg，人参皂甙Rg314mg/kg，三七总皂甙5.5mg/kg,香菇多糖100mg/kg。3.各药物在配方组合中作用和地位不同，不同药物之间存在复杂的交互作用。4.抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)有明显的抑制H22肝癌移植性小鼠肿瘤生长的作用，抑瘤率为55.91%,5.抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)有一定的抑制H22肝癌移植性小鼠生存时间的作用，生命延长率为38.13%。第二部分药效比较初步研究本部分实验对第一部分研究结果优选方案进行药效学的初步比较研究,通过建立小鼠体内移植性肝癌模型，与抗肝癌经验方比较观察优选配方QHF对小鼠移植性肝肿瘤生长的影响，对荷瘤小鼠的毒副作用，肿瘤细胞形态学变化及诱导肿瘤细胞凋亡的情况，初步探讨其抗肝癌作用，为临床应用提供实验依据。材料和方法1实验材料1.1主要试剂和材料1.1.1动物Balb/c雄性小鼠，体重1820g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号为1丄2痛株小鼠肝癌Ifc癯株(Ifa细胞)由本校免疫研究室保存。1.1.3药品注射用顺铂锦州九泰药业有限责任公司，批号060302;华糖素安傲金維生化股份有限公司生产，批号041103;参一胶囊(人参皂甙Rg3):吉林亚泰制药有限公司生产，批号050602;三七总皂苷云南省玉溪市维和制药有限公司生产，批号050124;香菇多糖片浙江金华埃森药业有限公司生产，批号050202:平消片陕西盘龙制药集团有限公司，批号050203。均用生理盐水配置成所需浓度。1.1.4试剂AnnexinV/FITC双染试剂盒购自联科生物结合缓冲液4x(BindingBuffer4x):20ml(4倍浓縮液)，稀释后溶液中各组分浓度10mMH印es/NaOH,pH7.4,140mMNaCl,2.5mMCaC12碘化丙锭溶液(Propidi咖Iodide):1.0ml,20ug/ral重组人AnnexinV/FITC(rhAnnexinV/FITC):来源于大肠杆菌(E.coli)分子量35.8Kda,0.5ml,于50mHTRIS,lOOmHNaCl,1細SA,0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存70%乙酵(保存于4")，RNase-A(10rag/ml,-20"保存)，PI(650^/ml,避光保存于-20")，PBS(pH7.4，保存于4"C)1.2主要仪器超净工作台(苏州净化设备厂生产SW"CQ"IF型)流式细胞仪(美国Beckmancoulter公司生产EPICSXL-4型)图像分析仪(德国莱卡仪器有限公司生产LeicaQ500型)透射电子显微镜(日本日立公司生产H-7500型)低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂生产LDZ5-2型)恒温水浴箱(上海跃进医疗仪器一厂生产DZ-84型)自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂生产SZ-93型)商压灭菌器(日本三洋公司生产MLS-24加型)倒置显微镜(重庆光学仪器厂生产XSZ-D2型)生物显微镜(上海尖端光科技有限公司生产SJD-01B型〉超薄切片机(德国Leica公司生产ULTRACl)T-R型)多功能显微镜及测量系统(德国Leica公司生产020-525.024型)电子天平(上海第二天平仪器厂生产MA200型)2实验方法2.1对小鼠&移植性肝痛的抑制作用2.1.1&肝癌细胞悬液的制备无菌条件下操作，取接种7天的fe肝癌腹水型荷癯小鼠，消毒动物皮肤，用无菌注射器依次穿过腹部皮肤、皮下组织、肌肉、腹膜，进入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水(腹水应为乳白色浓稠液体，若为血性则弃之不用)，所抽腹水放入小烧杯置于冰盒上。取少量腹水台酚蓝染色后，光镜下观察活瘤细胞数(>站%),以生理盐水稀释，调整细胞浓度为细胞计数板下癯细胞数为5X105个/ni1。2.1.2肿瘤动物模型制作于无菌条件下，左手固定小鼠，将小鼠右侧腋部皮肤常规酒精消毒后，右手持lml无菌注射器，于右腋部皮下注射0.2ml(约含瘤细胞数1X10'个/ml)&2肝癌细胞悬液制成^荷实体瘤小鼠模型。2.1.3实验动物分组及给药实验用雄性昆明小鼠50只于接种H22肝癌细胞悬液24小时后称重，随机分为模型组、顺铂(PPD〉阳性对照组、平消组、QHF组、QHF+PPD五组。模型组给予生理盐水灌胃0.4m1/次，l天l次，连续10天，同时给予0.lml生理盐水腹腔注射，隔日l次，共5次。阳性对照组为腹腔注射给药PPDO.lml/次，隔日1次，共5次，同时给予0.4迈1生理盐水灌胃1天1次，连续10天，其余各用药组均为灌胃给药，0.4ml/次，1天1次，连续10天，同时给予O.lml生理盐水腹腔注射，隔日l次，共5次，各组药物剂量顺铂3mg/kg,华蟻素800mg/kg，人参皂甙Rg314mg/kg,三七总皂甙5.5mg/kg,香菇多糖100mg/kg。2.1.4观察肿痛生长悄况末次给药24h后，称小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离肿痼组织电子天平上称重，按下列公式计算抑瘤率(inhibitionrate,IR):模型组癯重(g)—用药组瘤重(g)抑痛率(IR)=X100%r重(g)2.2对小鼠生存时间的影响2.2.1肝癌细胞愚液的制备方法同2.1.12.2.2肿痛动物模型制作于无菌条件下，左手固定小鼠，将小鼠腹部皮肤常规酒精消毒后，右手持lml无菌注射器，于腹腔注射0.2ml(约含癯细胞数lX10-个/ml)HM肝癌细胞悬液制成Ha荷腹水瘤小鼠模型。2.2.3实验动物分组及给药方法同2.1.32.2.4观察小鼠一般状况，豕试生命延长率(ILS)从第11天起停止给药，实验期间密切观察各组小鼠肿瘤生长情况、生存状态，并按下列公式计算生命延长率用药组平均生存天数一模型组平均生存天数生命延长率(ILS)=-^100%模型组平均生存天数2.3对荷痛小鼠的毒副作用2.3.1肝癌细胞条液的制备方法同2.1.12.3.2肿痛动物模型制作于无菌条件下，左手固定小鼠，将小鼠腹部皮肤常规酒精消毒后，右手持lml无菌注射器，于腹腔注射0.2ml(约含癯细胞数1X10'个/ml)Ha肝癌细胞悬液制成Ha荷腹水瘤小鼠模型。2.3.3实验动物分组及给药同2.1.32.3.4对小鼠一般状况及体重的彩响在整个实验过程中观察各组小鼠的一般状况，并比较给药前后各组小鼠体重的变化。2.3.5白细胞计数处死荷癯小鼠前，自尾静脉取血，常规白细胞计数。白细胞计数①白细胞稀释液冰醋酸(破坏红细胞)1.5ml，1%龙胆紫(染白细胞，便于计数)lml,蒸馏水100ml。②于荷癯小鼠尾静脉取20ul的静脉血，吹入盛有0.38ml白细胞稀释液的试管中，轻轻摇匀，③用小吸管吸取摇匀的稀释液。将一小滴稀释液滴在计数板的盖玻片边缘，利用虹吸现象进入计数室。④按白细胞计数法计数四角大方格内的细胞总数(N)。计数时仅计数细胞核与胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算。将4角大方格内的细胞总数按公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数n。n=NK/4X10'个/ml,(式中K为稀释倍数)。2.3.6胸腺指数和脾指数腹水取毕，颈椎脱臼法处死小鼠，剥离胸腺和脾，电子天平称重。按下列公式计算胸腺指数和脾指数胸腺重量(邮)胸腺(脾)指数=-小鼠重量(g)2.4形态学观察2.4.1光镜观察肿瘤细胞形态结构的变化小鼠腹部皮肤常规酒精消毒后以无菌注射器抽吸腹水，离心，取沉淀物涂片，常规HE染色，树脂胶封片，光镜下观察。取小鼠半薄切片(制作见电镜超薄切片前6步)，进行碱性品红一亚甲基蓝染色，光镜观察并拍照。HE染色步骤1)涂片固定于诉％乙酵15~30分钟。2)蒸馏水洗。3)苏木素液染色510分钟，自来水洗，4)稀氨水(1%)返蓝数秒，蒸馏水洗l分钟。5)伊红染色5分钟。6)自来水洗，7)逐级脱水、透明、封固。碱性品红一亚甲基蓝染色步骤1)切片移至滴有蒸馏水载玻片上，70801C恒温板上干燥使切片展平粘牢。2)滴加鄉碱性品红，置于恒温板上30秒1分钟。3)蒸馏水冲洗。4)滴加2%亚甲基蓝水溶液，置于恒温板上30秒1分钟。5)蒸馏水冲洗。6)干燥后封片，光镜观察，摄片。2.4.2电锇观察肿痛细胞超微结构的变化缓冲液配制0.075mol/LPBS+0.19mol/L蔗糖缓冲液(PH值7.4):NaH2P04.2H200.198gNaH2P04.12H201.934g蔗糖6.504g双蒸水100ml固定液配制(1)2.5%戊二醛固定液25*戊二瞎1.0ml0.075mol/LPBS9ml(2晒氣化锇固定液A液2%锇酸储藏液四氧化锇lg双蒸水50迈1B液1%锇酸固定液A液l份0.24%nol/LPBS1份染液配制(1)Harris苏木素染液硫酸铝钾15g苏木素lg红色氧化汞0.5g(缓慢加入)无水乙酵10ml蒸馏水200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木素后再倒如已溶解的硫酸铝钾，蒸馏水中煮1分钟后稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g,继续加热至染液变为紫红色，冷水降温，用纱布盖住瓶口，滤纸过滤后加乙酸5ml。(2)水溶性伊红液伊红0.5g蒸馏水100ml先将水洛性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将其搅拌均匀后过滤，每100ml加乙酸一滴。(3〉醋酸铀染液醋酸双氣铀2g加50%乙醇100ml充分搅拌lOmin静置12天后取其上清液。密封避光冷保存。(4術槺酸铅染色液硝黢铅1.33g拧樣酸钠1.76g双蒸水30ml将上述成分放入50ml容量瓶中，用力振荡30分钟,至溶液呈乳白色混浊状后加入INNaO朋ml使溶液变为清亮透明，再加双蒸水至50迈1，染液冊值为12,置4冰箱保存。超薄切片术的基本实验步骤1)取材收集各组腹水癯细胞，离心(1500转，30分钟)，弃上清液沉集细胞。2)固定用2.5W的戊二醛溶液前固定2h,0.075mol/LPBS+0.19mol/L蔗糖缓冲液清洗数次后过夜，1%锇酸后固定2h,0.075mol/LPBS清洗数次。3)梯度乙醇脱水其流程见附图24。4)浸透100%丙酮:环氧树脂(1:1)浸30分钟，再用环氧树脂浸透251C烘箱过夜。5)包埋包埋板内注满环氧树脂用牙签移动样品到包埋板的中心.包埋后样品放入聚合器内，聚合温度及时间为351C，12h:45"，12h:6()lC24h。6)半薄切片将包埋聚合好的样品从包埋板中取出，人工在解剖镜下修成塔形。在超薄切片机下切卜2um厚度切片，将切片放在载玻片上，在70801C电热板上烤干。7)定位8)超薄切片安装好包埋块和玻璃刀，调节好样品与玻璃刀的位置、水槽液面及灯光位置，选择以5mm/秒速度从手动转换为自动，适当调整加热进尺使切片达到银白色为好，展片34秒，睫毛针将切片带轻拨成几段，以专用镊子夹住铜网边缘使带有支持膜的一面对准切片沾取，滤纸吸掉多余水分，放入培养皿滤纸上等待染色。9)重金属染色醋酸铀一柠樣酸铅染色铜载网以一定间隔插放于蜡盘蜡盒上，毛细滴管吸取醣酸铀染液浸透各铜载网，避光染色30分钟后，蒸馏水洗潘三次以上，滤纸吸去水份自然晾干。再以毛细滴管吸取拧襯酸铅染液浸透各铜载网，避光染色30分钟后，蒸馏水洗欲三次以上，滤纸吸去水份自然干躁。10)透射电子显微镜TEM观察2.5对肿痛细胞凋亡率和细胞周期的影响2.5.1流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检測细胞凋亡检测原理细胞凋亡比较早期时，细胞膜即出现了一些改变，其中最明显的变化是细胞膜瞵脂双分子层中的磷脂琉丝贫酸(PS)从细胞膜内翻转到细胞膜外，PS因此暴露于细胞膜外。AnnexinV是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，与PS有很高的亲和力，可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合。当AnnexinV被荧光素(如FITC,PE等)标记时,可在流式细胞仪上或荧光显微镜下检测到早期凋亡的细胞。细胞凋亡与坏死的最大区别为前者的细胞膜保持完整，而后者的细胞膜破碎，PI(碘化丙啶)作为一种可嵌入DNA双链的红色荧光物质，不能通过完整的细胞膜，因此对活细胞和凋亡的细胞不能染色，但可进入坏死细胞，因此能使坏死细胞发出红色荧光。实验步骤1)用去离子水按1:4稀释结合缓沖液(20ml结合缓冲液+60ml去离子水)；2)无菌注射器抽吸小鼠腹水瘤细胞，PBS充分洗细胞，取总数约为5-10X1(^的细胞待测3)用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为2-5X10s/ml;4)取l诉ul的细胞悬液加入5ulAnnexinV/FITC:5)混匀后于室温避光孵育10分钟；6)用190ul的结合缓冲液洗细胞一次7)用190ul的结合缓冲液重新悬浮细胞；8)加入10ul20ug/ml的碘化丙锭溶液(终浓度为lug/ml);9〉流式细胞仪(FACS)分析。2.5.2流式细胞术检測细胞周期实验原理细胞内的咖A含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。操作流程1)取小鼠腹水瘤细胞，离心15min去上清。2)PBS洗2次，加0.5mLPBS吹匀，务必吹散。3)加入0.5mL70%(预冷)乙醇，封口膜封口。4"C固定过夜(可长至2周)。4.800rpm15min收集固定细胞，PBS洗2次。4)用0.4mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)。5〉加RNase-A约3lC至终浓度约为50|ig/mL,37TC水浴消化30min。6)加PI约50叱至终浓度约为65Hg/mL，在冰浴中避光染色30min。7)用300目(孔径4(T50微米)尼龙网过滤，上机检测。8)样品分析测定及打印。3.统计学处理采用SPSS10.0统计分析软件分析实验结果，计量资料的数据以均数土标准差(S±s)表示，计数资料的数据以百分率(%)表示，计量数据资料采用单因素方差分析，各组间均数的比较采用tukey检验；计数资料采用卡方检验，两两比较采用卡方分割。结果1.对小鼠Ha移植性肝痛的抑制作用接种5天内，小鼠外观无明显改变，除每日灌胃后1小时左右，表现少动、拥挤在一起，其后逐渐恢复正常。1周后各组可触及右腋皮下肿块，模型组小鼠肿瘤生长迅速，局部肿胀，压迫症状明显.用药组小鼠肿癯生长缓慢，皮毛无光泽，竖毛现象明显，活动减少，迟缓，但明显好于模型对照组，其中PPD组小鼠毒副反应明显，出现厌食、腹泻、精神萎靡、消瘐被毛脱落等症状，而QHF+PPD组毒副反应不明显，小鼠一般状况良好。QHF、QHF+PPD、PPD组抑癯作用明显，抑癯率分别为55.53%、82.56%、74.28%,与NS组瘤重比较，差异有显著的统计学意义(/<0.01)。两两比较QHF组抑瘤率高于PX组，差异有显著性(代O.Ol)。实验结果见表l,各组荷实体瘤小鼠肝癌瘤重比较见附图1。表1各组荷实体痛小鼠肝痛痛重及抑痛率(JC±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注与NS组比较'P<0.05，"P<0.01,与PPD组比较a代0.05,AA0.01，下表同。2.对荷瘤小鼠生存时间的影响NS组、PX组接种6天后小鼠可见腹部膨窿腹水大量形成，行动迟缓，竖毛明显，活动减少，并呈现逐渐加重趋势，PX组稍好于模型组。PPD组和QHF组接种8日后可见腹水形成,但增长缓慢，PPD组小鼠日渐消瘦，精神萎靡。QHF+PPD组于停药后方见腹水形成，接种15日内腹水增长缓慢，小鼠未见消瘦，精神、饮食情况良好，15日以后开始出现少动，少食，竖毛明显，活动减少，腹水增长迅速。QHF、QHF+PPD组能明显的延长小鼠的生存期，生命延长率分别为38.46%、87.02%,与模型组生存时间的比较，差异有显著的统计学意义(P<0.01)。QHF组生存时间髙于PX组和PPD组，差异有显著性(P<0.01)。结果见表2,各组荷腹水瘤小鼠生存天数比较见附图2。表2各组荷腹水癯小鼠生存天数(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>3.对荷瘤小鼠的毒副作用3.1对小鼠体重的彩响QHF组明显升高荷癯小鼠的体重(P<0.01),而PPD组则明显降低荷瘤小鼠的体重(P<0.01),QHF+PPD组体重增加明显高于PPD组(P<0.01),表明QHF有显著提升化疗小鼠体重的作用。QHF组和PX组之间的差异无统计学意义。结果见表3，实验各组对荷瘤小鼠体重影响的比较见附图3。表3对荷瘤小鼠体重的彩响(x土s)组别剂量(mg/kg)n体重增加(g)取平方根NS103.12101.7270±0.3925AAPX600105.31702.2702±0.4259*AAQHF配方1107.46002.7113±0.3482—AAQHF+PPD配方1+3105.18002.2327±0.4653'AAPPD3100.74900.8415±0.2132"3.2对外周血白细胞的彩响与模型组(NS)比较，PX组、PPD组和QHF+PPD组白细胞数明显降低(P<0.01)，QHF组与NS组无差异，QHF+PPD组离于PPD组(P<0.05)。结果见表4,实验各组对小鼠白细胞数目影响的比较见附图4。表4对小覿外周血白细胞数的彩响(；土s)组别剂量(mg/kg)n白细胞数(ixioVl)NS1010.6580±1.8154AAPX600106.8240±1.821(TQHF配方l109.0750±0.9475AAQHF+PPD配方1+3107.8300±0.9764—aPPD3105.7700±0.9358一3.3对小鼠免疫器官重量的彩响仅QHF组可以提高荷癯小鼠的胸腺，脾脏的重量(P<0.05),而PPD组则明显降低荷瘤小鼠的胸腺(P<0.01),脾脏(P<0.05)。PPD组和QHF+PPD组之间的比较可以看出QHF可以提高化疗小鼠的胸腺(P<0.01)和脾脏重量(P<0.05)。结果见表5,各组小鼠胸腺及脾指数比较见附图5。表5各组小鼠胸據及脾指数比较(X±s)组别剂量(mg/kg)N胸腺指数(mg/g)脾指数(mg/g)NS100.8100±0.1997AA7.9600±1.8258AAPX600100.8700±0.1938AA9.0200±2.0756AA卿配方l101.0300±0.1560'AA10.5500±1.8333'AAQHF+PPD配方1+3100.8810±0.1297AA9.9100±1.9864APPD3100.4780±0.0800"5.5980±1.0592'3.4形态学观察结果3.4.1光镜下各组肿瘇细胞形态从光镜下NS组、PX组、QHF组、PPD组腹水瘤半薄切片碱性品红一亚甲基蓝染色(见附图6，7，8,9)可以看出NS组肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，核大而圆，大小不一，核内染色质增粗，核浆比例大，核仁多，可见较多病理性核分裂像。PX组和NS组差异不大。QHF组可见癌细胞体积小，核分裂相均少，部分细胞脂肪变性，表面有出芽现象，呈褪行性变或呈死细胞趋向。PPD组可见细胞广泛水肿变性，核染色加深，核碎裂，大量细胞坏死。3.4.2电镜各组肿瘤细胞形态见附图IO,11,12，13,14,15:NS组肿瘤细胞大而圆，染色质分布均匀，密度一致，核膜完整，细胞膜上微绒毛丰富，细胞器正常。PPD组肿瘤细胞表面微绒毛消失，染色质固縮，凝集成块状，分散于核膜周边呈半球状或沙丘状，部分细胞核碎裂，细胞浆浓縮，细胞膜皱縮外突，有出芽现象，胞浆内线粒体肿胀变形。PPD组染色质深染积聚、分解，核碎裂,部分细胞大量胞质脱落游离，细胞坏死。3.5实验各组对H22细胞凋亡率的影响表6实验各组对H22细胞凋亡率的彩响组别剂量(mg/kg)N凋亡率平方根转换NS105.85±2.8232.3421±0.6363PX6001019.47±4.32644.38卯±0.4787'QHF配方l1033.85±5.10585.8035±0.4345"PPD31039.04±8.50196.2109±0.7181**与模型组比较,QHF和PPD组有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的作用凋亡率33.肪%,39.04%(代O.01),两两比较中QHF组髙于PX组(代O.05),QHF组低于PPD组但差别无统计学意义(/M).05),流式细胞仪检测NS组、PX组、QHF组、PPD组对H^细胞凋亡率的影响分别见附图16,17,18，19。3.6实验各组对H22细胞周期的影响表7实验各组对Ha细胞细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>流式细胞仪检测NS组、PX组、QHF组、PPD组对Ifa细胞细胞周期的影响分别见附图20，21，22，23:NS组肿瘤细胞增殖旺盛，细胞主要停留在S/G2-M期，与NS组比较QHF组G0/G1期细胞比例增多(P<0.01),表明QHF可使G0"G1期细胞聚积，阻止细胞向S期的转换；PPD也可使细胞阻抑在G0"G1期，与NS组比较(P〈0.01):PX组与对照组比较差别无统计学意义(P>0.05)。讨论实验的第一部分我们通过均匀设计筛选出了成分及剂量配比清楚的抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)清热解毒华搶素800mg/kg:H活血化瘀三七总皂甙5.5mg/kg;F扶正固本人参皂甙Rg314mg/kg、香菇多糖100mg/kg。药理实验研究发现，这些成分对肝癌细胞的生长在体内外都具有抑制作用，其抗癌机制中，抑制肿瘤细胞DNA合成是其主要交叉点，其次是影响肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿癯血管生成、提高机体免疫功能，各机制之间形成一定的补充[l-8];此外它们作为制剂在恶性肿癯的临床治疗或辅助治疗中的应用日趋增多，但是其相关研究层面单一，多为单独应用或一种中药与西药联合应用，联合应用缺乏中医理论的指导且多停留在疗效观察上，未能对其组合原理、剂量配比、抗癌机制进行深入系统的研究[9，10]。因此，已筛选出的组合其抗肝癌的作用究竟如何，如果确有抗肝癌作用，其分子机制是什么，都值得进一步研究。1QHF对小鼠H22移植性肝痛模型的抗肿痛作用第二部分实验研究依然采用H22移植性肿瘤小鼠作为模型，考虑到纯种动物遗传上均一，药物反应性一致，重复性好，进行药效学比较的时候选用BALB/C小鼠。本研究通过体内给药，显示优选配方即QHF方案能在一定程度上改善荷瘤小鼠一般状况，减轻相应的症状；能够显著抑制移植性肝癌H22的生长，延长荷癯小鼠的生存率。同时，我们也发现QHF与化疗药物顺铂合用，可以对抗顺铂(PPD)所致厌食、腹泻、精神萎靡、消瘦、体重下降、白细胞降低、胸腺和脾的萎縮等毒性反应，增加QHF的抗肿瘤效果。体重是衡量药物毒性作用的综合性指标之一，QHF组使荷瘤小鼠体重增加，而PPD组则明显的降低小鼠的体重，甚至出现了负增长，有些小鼠在停药前就已经死亡，说明由于PPD的毒副作用，导致这些小鼠的化疗已经失败，而QHF组则未发生这种情况。QHF组能显著的增加荷癯小鼠的生存率，增加脾、胸腺的重量，改善机体的生存状态，提高荷癯小鼠的生存质量。外周血白细胞数的变化可反映药物对造血系统的影响。使用QHF的荷癯小鼠外周血白细胞数没有显著的变化，说明QHF没有PPD等细胞毒类化疗药常见的骨糖抑制作用。脏器系数也是用来评价药物毒性的一个常用指标。从我们的实验结果来看，PPD能明显降低荷癯小鼠的免疫器官重量，而QHF对实验组能增加小鼠的免疫器官的重量。2QHF诱导H22肝癌细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmedcelldeath)是在某些生理或病理情况下细胞受到某种信号的刺激后主动参与的由基因编码程序的细胞死亡过程。细胞死亡有两种形式细胞坏死及细胞凋亡。细胞坏死指在外来致病因子的作用下，细胞生命活动被强行终止的被动性死亡过程细胞凋亡是机体为保持自身组织稳定，保持细胞的增殖和死亡之间的平衡，在有关基因的调控下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的主动性死亡过程。细胞凋亡的概念于1972年由kerr正式提出[ll],其生物学意义是在发育过程中清除多余、突变的细胞，凋亡受阻是肿痼的发生机制之一[12]。1984年Columbano的研究小组发现肝脏肿癯组织中存在细胞凋亡的现象[13]。自此人们开始研究细胞凋亡在肿瘤发生中的作用，并试图用细胞凋亡理论来阐明肿瘤发生的机制。现代医学研究认为，多细胞生物体的细胞数量的恒定，取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡，肿瘤的发生和发展是这种平衡发生破坏的结果。据此，提出了诱导肿癯细胞凋亡的治疗新思路。研究表明，不少抗肿癯中药都可通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞凋亡来达到治疗肿瘤的目的[14],所以细胞凋亡亦成为评估疗效的一项新指标，进一步提高肿痼细胞凋亡与增殖的比值是临床治疗的新要求，此外，细胞凋亡实验也是一种筛选抗癌药的快速有效的方法。随着科学研究技术的提高和对细胞凋亡认识的不断深入，检测凋亡的方法从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟，常用的检测方法有细胞凋亡的形态学检测，流式细胞仪分析，DNA降解分析,凋亡细胞膜改变分析,细胞凋亡相关蛋白分析，细胞凋亡酶学分析等[15]。形态学观察是判断细胞凋亡最直观的方法。凋亡细胞在形态学上将发生特征性的变化[11]:首先是细胞的铍縮，细胞密度的增加，然后由于核纤层和细胞骨架的解体，染色质高度浓縮，浓縮的染色质可围绕于核周边(称为边聚)或形成新月体结构，浓縮的核还常常裂解为几个大的碎片，分散于细胞的不同部位随后通过细胞膜内陷或发泡、出芽等方式，细胞裂解为数个凋亡小体。可通过光镜、电镜等观察到上述的变化。本研究中，收集各组小鼠腹水瘤细胞，经固定、脱水、浸透、包埋、聚合后进行半薄切片,碱性品红一亚甲基蓝染色光镜下观察可看到QHF组和PPD组细胞呈现凋亡的某些形态特征QHF组可见癌细胞体积小，核分裂相均少，部分细胞脂肪变性，表面有出芽现象，呈褪行性变或呈死细胞趋向。PPD组可见细胞广泛水肿变性，核染色加深，核碎裂，大量细胞坏死。超薄切片电镜下可见NS组肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，体积较大，染色质分布均匀，密度一致，核膜完整，细胞膜上微绒毛丰富，细胞器正常。QHF组肿癯细胞表面微绒毛消失，染色质固縮，凝集成块状，分散于核膜周边呈半球状或沙丘状，部分细胞核碎裂，细胞浆浓縮，细胞膜继縮外突，有出芽现象，胞浆内线粒体肿胀变形，呈现凋亡的特征性形态改变。PPD组染色质深染积聚、分解，核碎裂，部分细胞大量M脱落游离，细胞坏死，尽管通过光镜、电镜下观察细胞的形态学特点来判断细胞凋亡直观且较为简单易行，但对于凋亡早期的识别不够敏感。流式细胞仪除有快速、灵敏、重复性好、结果真实、对活体细胞进行分析等特点外，最大的特点是可以定量的检测凋亡细胞数并测定凋亡细胞发生于某个特定的细胞周期时相，其他检测手段均不能很好的完成定量分析。为此，我们采用了流式细胞术对其凋亡情况作了进一步的分析。流式细胞仪将流体喷射技术、激光技术、空气计数、Y-射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合，具有高度的精密性，测定的数据准确可靠，可针对细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化，包括细胞铍縮、核染色质凝聚、细胞膜通透性改变、Caspases激活、膜磷酯酰丝氨酸外翻、胞质Ca2+浓度升离等特点进行定性、定量测试分析，从而实现对细胞凋亡的准确测定[16,17],本研究应用流式细胞仪选择AnnexinV/PI双染法[18]检测凋亡细胞比率，显示QHF和PPD作用于H22肿癯细胞有较明显的凋亡发生，细胞凋亡率为33.肪%与39.04%,与空白对照组相比有显著性差异(P〈0.0D,结合形态学观察结果，显示QHF确实有诱导H22肝癌细胞凋亡的作用。此外实验还以PI单染检测了肿瘤细胞周期情况细胞增殖周期可分为咖A合成前期(Gl),咖A合成期(S),DNA合成后期(G2)，有丝分裂期(M)四个期，在细胞分裂进入Gl期前，存在一个相对静止期(G0期)。应用流式细胞仪分析可见QHF组G0/G1期比例下降，S期比例增高，形成S期细胞堆积，使肿癯细胞分裂增殖能力降低，对肿瘤细胞生长有直接抑制作用，说明通过细胞周期阻滞诱导肿癯细胞凋亡是QHF抗肿瘤作用的可能机制之一。AnnexinV/PI双染法比常规的PI单染法能更精确地分析细胞凋亡[16]。细胞凋亡早期，细胞膜完整性尚未破坏，但细胞膜磷脂双分子层对称性消失，正常情况下分布于细胞膜内側的磷脂酰丝氨酸(Pho印hatidylserine，PS)转移到膜外侧，而AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，可与PS特异性结合，将Annexin-V进行荧光素(FITC)标记，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。坏死细胞的细胞膜破坏，Annexin-V也能进入胞内与PS结合而呈阳性，所以通常联合其它染色方法将其区分出来。碘化丙啶(pr叩idineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将正常细胞、凋亡早期细胞和坏死细胞区分开来。双染法比PI单染要精确，但此方法只能检测正在凋亡的细胞，而那些凋亡末期的细胞由于发生了细胞崩解，无法与坏死细胞区别。因此，通过这种方法检测的细胞凋亡比率比实际情况可能要小些。3QHF与PPD的协同抗肿痛作用肿癯化疗的生化调节是以一种药物调节一种抗肿癯药物的药理作用，旨在增强抗肿癯药物的活性，降低其毒性，以达到更好的疗效。寻找与现有抗肿瘤药物显示协同作用的药物及生化调节剂的研究亦成为肿瘤药理学令人感兴趣的课题。本实验研究发现，QHF+PPD组于停药后方见腹水形成，接种15日内腹水增长缓慢，小鼠未见消瘦，精神、饮食情况良好，15日以后开始出现少动，少食，竖毛明显，活动减少，腹水增长迅速。QHF与PPD联用不仅可显著提高对荷瘤小鼠移植癯生长的抑制作用，而且还可使荷癯小鼠的外周血白细胞数和胸腺指数脾指数升髙，降低PPD的毒副作用。提示QHF与PPD联用具有协同抗肿瘤作用，值得进一步研究，从而能为QHF方案在临床的应用开辟一条更为安全、有效的临床用药方案。肝癌的发生发展是多因素、多阶段、多位点的变化过程，其发生的病理、分子机制复杂而中医药与此相应具有多成分、多系统、多靶点综合抗肝肿癯效应的特点。优选配方即QHF方案是以四种有效成分配伍的中药新复方，成分复杂，初步研究该复方的药效结果表明QHF作用于小鼠H22肝癌细胞，肿瘤生长受到显著抑制并出现了不同程度的凋亡，阻滞癌G0/G1期细胞进入S期诱导细胞发生凋亡这可能是QHF抑制肝癌细胞生长的机制，至于QHF诱导肝癌细胞凋亡发生的分子机制,该组方是否还通过其他途径达到治疗肝肿痼的作用有待于进—步研究。结论本文通过对FI进行体内抑瘤实验，增效减毒实验和肿瘤免疫学实验，得出如下结论1.FI对肝癌H22具有一定的生长抑制作用；2.FI能提高荷癯小鼠体重，胸腺和脾脏的重量，且安全无毒副作用；3.FI对环磷酰胺具有良好的增效减毒作用，对治疗肝癌可起到降低用药量，减少毒性并能提髙疗效的作用；4.FI可增强机体的免疫力，具有提高T淋巴细胞的转化率、NK、IL-2和TNF-a活性的作用总之，优选配方(QHF方案)作为新型抗肝癌治疗药物及化疗辅助药具有广阔的开发前景,值得深入研究。参考文献1.胡聪,胡彬.中药复方及有效成分对肝细胞凋亡的影响[J].中医药学报，2001,29(1):24262.张振玉，张昆和，王崇文，等.华蠊素对三种消化系肿癯细胞杀伤机制研究[J].中药药理与临床，1999，15(5):28~293.蒋芹，卞保强，张为民，等.华據素治疗晚期原发性肝癌的临床研究[J].临床肿癯学杂志，2000,5(4):294~2954.孙中杰，潘承恩，王国俊.华蠊素配合TACE治疗肝癌的临床观察[J].肿癯防治研究，2002,29(1):6768.5.左小东，秦叔逵，王锦鸿，等.华雉素抗肿瘤作用的临床研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2003，8(3):2322356.曾小莉涂植光，人参总皂甙对人肝癌细胞胞浆中某些表型的逆转作用，癌症2000.08.05:19(8):776-7787.周建锋，王怡兵.不同扶正药物及其配伍对SMMC-7721人肝癌细胞的诱导分化作用[J].中国中医药科技2001,8(2):75~778.于广梅，郭继龙.中药及其有效成分抑制肿癯血管生长的研究近况[J].山东中医杂志2003，22(11):69469519.朱华，周春山，白燕远等.抗癌中草药有效成分的研究进展[J].时珍国医国药，2002,13(11):68268410.杜冠华.中药复方有效成分组学研究[J].中成药，2002，24(11):878S8011.KerrJF,Wyllie旭,CurrieAR.Apoptosis:abasicbiologicalphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics.BrJCancer,1972,26(4〉239-257.12-ThompsonCB-Apoptosisinpathogenesisandtreatmentofdiseases-Science,1995,26(7):1465,13.Col咖banoA,ledda~ColumbanoGM,RaoPH,eral.Occuranceofcelldeath(apoptosis)inpreneoplasticandneoplasticlivercells.Asequentialstudy.AmJPathol,1984，116(3):441-44614.邹夏S,张焜和.中药抗肿瘤分子机制的研究进展.国外医学肿瘤学分册,2005，32(1):17-19.15.彭黎明，王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床.人民卫生出版社，2000年7月，第一版16.VermesI,HaanenC,ReutelingspergerC.Flowcytometryofapoptoticcelldeath.JImmunolMethods,2000，243(1-2):167-l恥.17.Williams0.Flowcytometry~basedmethodsforapoptosisdetectioninlymphoidcells.MethodsMolBiol,2004，282:31-42.18.VermesI,Haa加nC,Steffens陽NakkenH,etal.Anovelassayforapoptosis.FlowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononearlyapoptoticcellsusingfluoresceinlabelledAnnexinV.JImmunolMethods,1995,184(1):39-51.附图1:各组荷实体癯小鼠肝癌癯重图2:各组荷腹水癯小鼠生存天数图3:各组对荷癯小鼠体重的影响图4:各组对小鼠白细胞数的影响图5:各组对小鼠胸腺及脾指数的影响图6:HE染色NS组肿癯细胞(放大400倍)图7:HE染色PX组肿癯细胞(放大400倍)图8:HE染色QHF组肿瘤细胞(放大400倍)图9:HE染色PPD组肿癯细胞(放大400倍)图11:电镜下QHF组肿瘤细胞(放大20万倍)图12:电镜下QHF组肿癯细胞(放大5000倍)图13:电镜下QHF组肿瘤细胞(放大6000倍)图14:电镜下PPD组肿瘤细胞(放大6000倍)图15:电镜下PPD组肿瘤细胞(放大8000倍)图16:NS组对H22细胞凋亡率的影响图17:PX组对H22细胞凋亡率的影响图18:QHF组对H22细胞凋亡率的影响图19:PPD组对H22细胞凋亡率的影响图20:NS组对H22细胞周期的影响图21:PX组对H22细胞周期的影响图22:QHF组对H22细胞周期的影响图23:PPD组对Hz2细胞周期的影响图24:梯度乙醇脱水流程图权利要求1.一种抗肝癌中药有效成分按Q(清热解毒)、H(活血化瘀)、F(扶正固本)组成的配方，其特征在于其成分为华蟾素、三七总皂甙、人参皂甙Rg3、香菇多糖。2.根据权利要求1所述的抗肝癌配方，其特征在于其配比为3.根据权利要求2所述的抗肝癌配方的配比，以抑瘤率作为评价指标，结果输入计算机，使用DPS数据处理系统进行二次多项式逐步回归,得出回归方程。3.1回归方程Y=2.5034-35.9373X2+7.4425Xs+49.1543X22+0.0151X,X厂0.0014X^-6.3074XA+0.0100X3复相关系数R=0.99651F=40.7375/MJ.0242S=l.40353R,=0.984213.2计算机得出的优化结果为华蟾素798.1288rag/kg，人参皂武rg314mg/kg，三七总皂武5.6580mg/kg,香菇多糖101.1111mg/kg，抑瘤率56.98%。关联序为X》X,>X4>X3.4.根据权利要求2所述的抗肝癌配方的配比，以生命延长率作为评价指标，结果输入计算机，使用DPS数据处理系统进行二次多项式逐步回归，得回归方程。4.1回归方程Y=2.7639-25.2955X2+4.8%9X3+33.3621X22+0.0099X,X厂0.0009X,X3+0.0065X3X4-4.1874XA复相关系数R=0.99674F=43.5791/MJ.0226S=0.90641R,=0.985244.2计算机得出的优化结果为华蟾素798.1287mg/kg，人参皂甙rg314mg/kg,三七总皂甙5.6580mg/kg,香菇多糖101.1110mg/kg，生命延长率为37.99%。关联序为X》X皿>X4>X3.组成华蟾素人参皂甙Rg三七总皂甙香菇多糖800mg/kg314mg/kg5-5mg/kg100mg/kg0全文摘要本发明系用药物均匀设计法筛选出的抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)。为了系统深入地研究抗癌中药化学成分配伍治疗肝癌的作用，在中医理论的指导下我们以清热解毒(Q)、活血化瘀(H)、扶正固本(F)为治疗大法，通过文献及单药实验筛选具有对应作用的中药成分，并以此作为因素，以抑瘤率、生存率为评价指标，采用均匀设计通过动物实验对其组合进行优选和分析，确定抗癌优选配方即QHF方案的最佳组合和剂量配比，并进一步研究其抗肝癌作用和机制。实验结果表明，优选配方(QHF方案)具有良好的抗肝癌作用，显著性抑制H22肝癌移植性小鼠肿瘤生长和延长生存时间，且安全、低毒并能对化疗药物PPD起到增效、减毒作用，经临床证实治疗肝癌有显效。本发明所提供的抗肝癌中药有效组分优选配方(QHF方案)及最佳药量配比为优选配方(QHF方案)组成为华蟾素、三七总皂甙、人参皂甙Rg3、香菇多糖。优选配方(QHF方案)剂量配比为华蟾素800mg/kg，人参皂甙Rg314mg/kg，三七总皂甙5.5mg/kg，香菇多糖100mg/kg。文档编号A61K35/56GK101164551SQ20061013587公开日2008年4月23日申请日期2006年10月16日优先权日2006年10月16日发明者涛陈申请人:三峡大学;陈涛