专利名称：防治神经精神疾病和损伤的神经干细胞裂解液的制作方法
防治神经糖神疾病和损伤的神经干细胞裂解液发明背景神经精神疾病，如神经系统发育障碍、神经退行性疾病、周围神经疾病、癫 痫、儿童注意力缺陷多动症、抑郁症、神经官能症和精神分裂症等，以及脑缺氧 缺血和中枢、周围神经损伤，已经发展成为人类公共卫生的重大难题之一。神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheiraer's disease)、帕金森病 (Parkinson's disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's chorea) 、 HIV-相关的痴 呆、多发性硬化、肌萎縮性侧索硬化、青光眼等，其病程缓慢，呈进行性发展，主 要病理表现为神经元的大量丧失。随着人口的老龄化，神经退行性疾病，特别是 阿尔茨海默病的发病率日渐升高。预防和治疗阿尔茨海默病的药物有胆碱能前体物质，胆碱酯酶抑制剂、胆碱 能激动剂、儿茶酚胺类药物、5-羟色胺能药物、多种类型的神经递质、神经肽类 鸦片类拮抗剂(如纳络酮)、抗氧化剂和神经保护剂、神经营养物、激素(如他 克林、雌激素)、代谢增强药、生物膜调节剂、抗炎药、解毒剂、抗淀粉样蛋白 药物等，中药有效成分如石杉碱甲、银杏叶提取物、儿茶酸、芹菜甲素、人参皂 苷、绞股兰皂苷等。但迄今为止，尚没有任何药物、任何疗法取得满意的疗效。 因此，寻找新的有效预防和治疗阿尔茨海默病的疗法或药物是一项迫切的任务。儿童注意力缺陷多动症(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD)以多 动、注意力不集中、参与事件能力差为主要症状，并伴有冲动任性、情绪不稳定 和各种行为障碍(如逃学、说谎、偷窃、打架)等表现，但智力基本正常为其特 点。患儿亦常出现不同程度的人格缺陷、社会适应能力下降和学习困难。14岁 以下儿童的患病率为7%~9%，半数患儿小于4岁发病，男女为4 6: 1。鉴于 ADHD对儿童身心健康成长的严重危害，已经引起教育、医务工作者，心理学 家等社会各界的普遍关注。ADHD的病因尚不清楚，目前也无好的预防措施。至于ADHD的治疗，临 床常用的有利太林(Retalin)又称哌醋甲酯(methylphenidate)、地昔帕明(去甲3
丙咪嗪)、苯丙胺、苯异妥英(pemoline)又称匹莫林、三环类抗抑郁药如丙咪 嗪等药物。然而，上述药物的疗效殊不能令人满意，更重要的是它们都有不同程 度的毒副作用，如广泛使用的地昔帕明，就有中毒致死的病例，而利太林则被美 国食品和药物管理局(FDA)列为与鸦片、可待因、吗啡等同的二类限制药品， 三环类抗抑郁药可导致心电图改变，苯异妥因的副作用有失眠、厌食、体重下降 等。利太利、苯丙胺的不良反应则是应激性升高、抽搐、厌食、腹痛和失眠。总 之，目前还没有预防和治疗ADHD的安全、有效、可靠的药物，开发防治ADHD 的新药是医药界的一项迫切任务。抑郁症(depression)的特征性症状是悲观心境，自身感觉很坏；睡眠障 碍，失眠或早醒；食欲很差，动力不足；缺乏活力，兴趣和愉快感消失；自责自 罪，消极想死；体重下降；性欲降低。抑郁症常有便秘、各种疼痛，焦虑、恐怖 的申诉，疑惑或强迫症状很普遍，抑郁性的先占观念尤为常见。抑郁症可分为原 发性抑郁症(双相或单相抑郁症)和继发性抑郁症(继发于其他精神疾病或躯体 疾病)。抑郁症正成为全球第五大疾病，预计到2020年，将跃升为第二大疾病，并 将成为致命疾病。世界卫生组织己将抑郁症、癌症及艾滋病并列为21世纪的三 大疾病及卫生教育预防重点工作。镇静剂或安眠药，副作用大，容易造成药物依 赖，治疗效果也不好，不适用于抑郁症。目前流行的抗抑郁症药物，包括有名的 Prozac(氟西汀)、Celexa (西普兰)和Effexor(怡诺思)，都得在服用几周后才开 始见效，而且有副作用，其中包括降低性功能等。此外，这些药对大约三分之 一的病人不起作用。血清素调节剂属新一代抗抑郁药，效果较好且副作用小，但 国内尚未生产。脑组织不能储存能量，也不能进行糖的无氧酵解，因此其对氧和血供的要求 特别高。缺氧缺血4分钟即可造成神经元的死亡。脑缺血的组织病理学变化在缺 血12小时以后才较明显神经元出现中央性Nissl小体溶解和坏死(红色神经元)； 髓鞘和轴突崩解。脑缺氧缺血、创伤及再灌注损伤引起脑细胞死亡，再灌注损伤 主要与Ca2+超载和氧自由基损伤有关。谷氨酸通过激活 NMDA(N-methyl-D-aspartic acid receptor)受体等途径引起细胞内〔&2+超载，进而 诱导氧自由基生成，在脑缺氧缺血及创伤等中枢神经系统损伤过程中起重要作
用。高氧液用于脑血管病的治疗。高氧液使脑组织和脑脊液氧含量增加，有利于 改善脑缺氧缺血，促进意识状态和肢体功能的恢复。谷氨酸受体拮抗剂及通过多种途径拮抗谷氨酸兴奋毒性的抑制性递质？氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA )，可使突触后神经元处于保护性抑制状态，减少缺血区域神经元的 死亡，从而对脑缺血性损伤产生保护效应。先天遗传和围产期一些原因所引起的各种脑疾病，是由于神经系统发育受 阻，神经细胞参加脑的功能活动数量不足，或神经细胞发育不良、神经元功能低 下所致。中老年人因脑的老化、退化所引起的神经系统退行性改变，如脑萎縮、 老年性痴呆、帕金森氏病等，均属脑神经细胞功能减退、过早凋亡所致，但受损 伤神经细胞并没有完全死亡， 一部分受损细胞处于半死亡状态，称之为"休眠状 态"。由于中枢神经系统具有一定的再生能力，只要我们给这些受损神经细胞通 过脑的各个环节提供营养，改善缺氧缺血状态和代谢障碍，增加磷脂类等营养物 质，就可促进残存神经元的再生及恢复功能，提高神经细胞活性及对外界刺激的 敏感性，使处于休眠状态的神经细胞和受损的神经细胞重新复活。20世纪80年代以前一般把"脑细胞在成熟后只有死亡不会再生"或"中枢神 经细胞没有再生能力"列为哺乳动物中枢神经系统的基础特征。但20世纪80年 代以后，学者们先后发现纹状体、丘脑、黑质、皮层腹侧区、未定区、海马区、 杏仁区、屏状核、室区、嗅觉区、延髓等不同部位的脑神经元都可以再生。因此， 关于中枢神经元保持一定程度的再生能力就已经没有什么疑问了。自20世纪90年代初提出神经干细胞的概念以后，神经干细胞在治疗人类神 经系统发育障碍、中枢神经损伤、神经退行性疾病等各种疾病中的潜在作用成为 人们关注的焦点。成年动物和人中枢神经系统中的干细胞可增殖并分化为神经系 统中的各种细胞。神经干细胞移植后能在宿主的神经组织中生存、增殖、迁移、 整合及分化。神经干细胞移植是修复和代替受损脑组织的有效方法。移植到帕金 森病模型鼠脑的神经干细胞，在其脑组织中迁移并修复损毁的鼠脑组织，且震颤 症状亦明显减轻。鼠胚胎干细胞移植入瘫痪鼠体内，恢复鼠的行走能力。神经干 细胞移植治疗小儿脑瘫已有成功的病例。成人神经干细胞自体移植己试用于临 床。移植神经干细胞培养增殖体系已经建立。
神经干细胞产生一些神经干细胞因子(neural stem cell factors)，这些神经 干细胞因子有的是已知的，如神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、碱性 成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生长因子 (印idermal growth factor, EGF)等，有的则是未知的。这些已知和未知的神经 干细胞因子具有使神经干细胞增殖、迁移、分化的潜能。 发明概要本发明涉及神经干细胞裂解液的无细胞滤液及其制备方法。本发明涉及神经干细胞裂解液的无细胞滤液的药物组合物及其制备方法，该 药物组合物包括神经干细胞裂解液的无细胞滤液和可药用的载体。本发明涉及神经干细胞裂解液的无细胞滤液作为预防和治疗多种神经精神疾 病和神经损伤以及脑缺氧缺血的药物的用途。本发明涉及神经干细胞裂解液的无细胞滤液的药物组合物作为预防和治疗多 种神经精神疾病和神经损伤以及脑缺氧缺血的药物的用途。本发明涉及神经干细胞因子作为预防和治疗多种神经精神疾病和神经损伤以 及脑缺氧缺血的药物的用途。本发明涉及神经干细胞因子的药物组合物作为预防和治疗多种神经精神疾病 和神经损伤以及脑缺氧缺血的药物的用途。神经干细胞裂解液的无细胞滤液或神经干细胞因子可在实验室或工厂制备后 即刻供临床使用，或以液体形式短期冷藏(4 °0保存后供临床使用，或较长时间 冷冻(-20，-80 。C)保存，应用时再解冻。神经干细胞裂解液的无细胞滤液或神经 干细胞因子可与可药用的载体，如乳糖、葡萄糖、甘露醇、盐酸普鲁卡因、盐酸 利多卡因及抗坏血酸等，混合或溶解，按各生物制品工艺制备药物。神经干细胞 裂解液的无细胞滤液或神经干细胞因子也可分装安瓿，冷藏或冷冻保存。神经干 细胞裂解液的无细胞滤液或神经干细胞因子制剂还可冷冻干燥后冷藏或冷冻保 存。神经干细胞裂解液的无细胞滤液或神经干细胞因子或其药物组合物可注入静 脉、颅内、脑室或蛛网膜下腔，也可局部直接应用到损伤的脑、脊髓和神经组织 周围。神经干细胞裂解液的无细胞滤液含己知的和未知的神经干细胞因子。 神经干细胞因子可自胚胎神经干细胞或成年神经干细胞分离、纯化，也可用组 织、细胞和基因工程技术工业化生产。下面列举实验研究的内容及其结果，作为神经干细胞裂解液的无细胞滤液及 神经干细胞因子或其药物组合物可用于预防和治疗多种神经精神疾病和神经损 伤以及脑缺氧缺血药物的用途的证据。 材料和方法动物SPF级NIH小鼠，8周龄，实验室词养3天后，腹腔注射5IU孕马血清促性 腺激素，48h后腹腔注射5IU人绒毛膜促性腺激素。雌雄(2:1)合笼。翌日晨检 査雌鼠，有阴道拴的记为受精后第1日。至第15日时，根据腹部隆起及乳头发 育情况，确定为孕鼠者备用。SPF级Wistar大鼠，90日龄，参考上述方法促雌鼠 排卵，合笼交配，准备孕鼠。试剂Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) 、 F12、 DMEM/F12培养基、2%B27、 D-Hanks液、胰蛋白酶、HEPES液(25 mM, pH 7.4)、丝裂霉素C、小牛血 清、胎牛血清、神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体，白血病抑制因子(LIF, Sigma) ，bFGF (基因公司)，l-甲基-4苯基-1， 2， 3, 6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2，3，6- tetrahydropyridine, MPTP)，等。 仪器Y-迷宫，自主活动程序自动控制仪等。小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)的分离和培养早期胚胎的收集 与培养小鼠受精后第4日用含有5 X小牛血清的DMEM从子宫中冲胚，获得发育至 囊胚期的早期胚胎,接种在铺有饲养层的4孔板中。饲养层细胞的制备:无菌取孕 14曰鼠胚，去头和四肢,剪碎,按常规胰酶消化法制备原代鼠胚成纤维细胞。向培 养基中加入IO pg/ml的丝裂霉素C ，作用2 3h ，充分洗涤后，接种在涂有明胶的4 孔板中。使用前更换新鲜培养基。胚胎干细胞的分离小鼠囊胚贴壁、内细胞团 增殖后，用胰蛋白酶和E日TA消化离散成小的细胞团，接种于新的铺有饲养层的4 孔板中。培养4 5日后获得胚胎干细胞样集落。挑取胚胎干细胞样集落,消化离 散后接种于新的铺有词养层的4孔板中。培养(培养基含LIF)8-10日后，选生长旺 盛的胚胎干细胞集落消化成单细胞悬液。小(大)鼠胚胎神经干细胞(neural st柳cells, NSCs)的分离和胚胎神经干细胞裂 解液无细胞滤液(filtrate of neural stem cell lysates， FNSCL)的制备取上 述妊娠15日的小(大)鼠，颈椎脱臼法牺牲。无菌条件下剖腹取出妊娠子宫。以 预冷的PBS (—)液反复冲洗血污后，剪开子宫壁一一取出胚胎，放入盛有D-Hanks 液的无菌瓶中。再用D-Hanks液冲洗2-3次。胚胎经酒精消毒后，剪开头皮，去 除颅骨，剥离硬膜，分离胎鼠脑组织，放入盛有DMEM/F12培养液的无菌瓶中。 用眼科剪剪成约lmm3组织小块，以微量加样器反复轻柔吹打。再加0.25%胰酶， 混匀，倒入培养皿中。放入37。C培养箱消化。15分钟后用含10%小牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化。吸取消化液，通过250目不锈钢筛网过滤到无菌瓶 瓶中。然后将滤液移入离心管，1000r/min，离心5min。弃上清，加入上述培养 基6-7ml,计数细胞，调整细胞数。将计数后的细胞取出一半，冰浴下超声波破碎 (100W/cm2， 5min)。显微镜下观察，细胞完全破碎后滤膜过滤。细胞悬液及无 细胞滤液无菌分装备用。参考上述方法分离大鼠胚胎神经干细胞并制备大鼠胚胎 神经干细胞裂解液的无细胞滤液。脑室内移植神经干细胞及注射神经干细胞裂解液无细胞滤液各种动物模型的 NSCs与FNSCL组动物，于适当时间向脑室内分别注射一定量同种动物胚胎神经干 细胞悬液或一定量同种动物胚胎神经干细胞裂解液的无细胞滤液。 一.小鼠兴奋毒性脑损伤模型方法SPF级雄性NIH小鼠，8周龄，随机分为对照、谷氨酸单钠(MSG) 、 NSCs+MSG、 FNSCL+MSG组，每组10只动物。除对照组外，其他组动物MSG (3. 0 g/kg体重) 灌胃，每日1次，共计10日。MSG处理后第I，IO日NSCs+MSG组小鼠脑室内移 植2xlOS神经干细胞(10^d细胞悬液)各1次，FNSCL组注射2xlOS神经干细胞裂 解液无细胞滤液各1次(10nl)。对照及MSG组脑室内同时注射同体积DMEM培养 液。移植神经干细胞或注射神经干细胞裂解液无细胞滤液后第12日进行Y迷宫 学习记忆试验，第15日进行爬绳能力等行为学试验。行为学试验后进行组织病 理学检査。Y迷宫实验将小鼠放入Y型迷宫，黑暗中无电适应lmin后开始实验。电击小 鼠引起逃避反应，立即逃至灯光安全区作为正确反应。小鼠受电击后逃到有灯光 安全区，灯光继续作用10秒，熄灯后结束一次测定。安全区无规侓变换，以训 练小鼠辨别灯光及安全方位的能力。每日训练20次，训练时房间保持黑暗、安 静。每天同一时间段进行实验，连续6日。结果以均
用重复测量资料的分析方法进行统计分析。爬绳实验将小鼠逐一放置于一条2米长，距地面高1.5米的绳子中间，观察在3 分钟内小鼠的握绳爬行情况。能握住绳且四肢协调爬绳的，记为会爬；握不住或 四肢不能协调爬绳的记为不会爬。记录小鼠在3分钟内從绳上掉下来的次数。每 天的同一时间段进行实验。结果用卡方检验法进行统计分析。 组织病理学检査行为学实验结束后给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻 醉，拉脱颈椎牺牲动物。取全脑，迅速置于10%中性福尔马林溶液中固定、脱水、 透明、浸蜡、包埋、全脑冠状面切片(厚度4nm)、贴片、H.E染色，光镜下检査 脑海马区组织病理学变化。结果较之正常对照组，MSG组小鼠的学习记忆、爬绳能力显著降低，差异显著 (P<0.05)。 NSCs+MSG和FNSCL+MSG组小鼠的学习记忆、爬绳能力接近正常对 照组。图1显示Y迷宫实验的结果。表1显示爬绳实验的结果。病理检査结果 显示，MSG组小鼠海马区神经细胞明显变性、坏死和增生，而NSCs+MSG和 FNSCL+MSG组小鼠海马区神经细胞形态与正常对照组无明显差别(图2)。表1脑室内注射神经干细胞裂解液滤液对MSG所致成年小鼠高空协调运动能力 损伤的恢复作用时间组别动物数会爬绳动物数P值-(FNSCL注射后)(只)(只)15曰对照109MSG(3.0g/kg)103<0.01MSG+NSCs106>0.05MSG+簡CL106>0.0530曰对照1010MSG(3.0g/kg)10<0.01MSG+NSCs108>0.05MSG+FNSCL108>0.05*与对照组比；MSG+NSCs组vs. MSG组PO.05; MSG+FNSCL组vs. MSG组: P<0.05。重复上述实验，但增加bFGF+MSG组，即小鼠随机分为对照、MSG、 NSCs+MSG、 FNSCL+MSG、 bFGF+MSG组，每组10只动物。MSG处理后第1， 10日bFGF+MSG组
组小鼠脑室内注射bFGF液(2.0 |_ig, 10 pl DMEM培养液溶解)各1次，其他处理 同上。行为学试验和病理检査结果表明，bFGF对MSG造成的脑损伤也有显著的 修复作用，但效果逊于NSCs和FNSCL。二. FNSCL和bFGF诱导胚胎干细胞向神经干细胞分化方法胚胎干细胞的诱导分化实验小鼠胚胎干细胞的分离和培养方法同前。(1) 对照组:在胚胎干细胞常规培养基(不含LIF)中培养。(2)FNSCL组:在胚胎干细胞 常规培养基(不含LIF)中加入FNSCL培养。每2日换液1次。(3)bFGF组在胚胎干细 胞常规培养基(不含LIF)中加入bFGF培养。用形态学和NSE免疫细胞化学染色法对 细胞分化进行鉴定。结果FNSCL组细胞贴壁培养第24h，大部分细胞的胞体拉长，从细胞的两极长出两 条短小且无分支的突起(图3) 。NSE免疫细胞化学染色法实验结果表明，FNSCL组神 经干细胞诱导分化率达50%以上。bFGF也有显著的诱导分化作用，但效果逊于 FNSCL。三. 小鼠脑偏瘫模型方法45mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠不动后，用眼科剪剪开头 部正中线处皮肤，暴露颅骨。找出矢状缝、冠状缝及人字缝，于矢状缝上冠状缝 及人字缝中点旁开2-3mm处(左或右)垂直进针，穿过颅骨损伤脑组织，造成对 侧脑偏瘫。除正常对照组外，术后偏瘫者再随机分为偏瘫、NSCs治疗、FNSCL 治疗组，每组10只动物。术后第1,10日NSCs组小鼠脑室内移植2xlOS神经干 细胞(10pl细胞悬液)各1次，FNSCL组注射2xlOS神经干细胞裂解液无细胞滤液 各1次(10pl)。对照和偏瘫组脑室内同时注射同体积DMEM培养液。脑室内移植 神经干细胞和注射神经干细胞裂解液无细胞滤液后密切观察动物行为。 结果脑室内移植神经干细胞或注射神经干细胞裂解液滤液后3-7日，NSCs和 FNSCL治疗组分别有5/10和4/10小鼠偏瘫恢复，能进食、饮水，并自由行动， 2/10和3/10小鼠部分恢复，能勉强进食、饮水。对照组小鼠无异常，而偏瘫组小鼠则未见恢复，之后悉数死亡。四. Meynert基底核损毁模型方法SPF级雄性Wistar大鼠，体重260-280g。腹腔注射氯胺酮(80-100mg/kg) 麻醉。固定于立体定位仪上，调节固定平面使门齿比内耳连线中点低2nm。清洁 头顶皮肤作正中竖切口，拨开皮下筋膜暴露顶骨，在两侧冠状缝后钻出小孔，取 出碎骨屑，保持硬脑膜完整。定位坐标前囟后0.9mm，中线外侧2.6mm，硬 脑膜下6.8mm。每侧用微量注射器分别注入25nmo1鹅膏蕈氨酸，0.1 pl/min ，每 侧总体积lpl。注完后留针5-10min。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤。3天内 每日肌肉注射IO万单位青霉素G。除对照组外，Meynert基底核损毁大鼠再随 机分为Meynert基底核损毁、NSCs治疗、FNSCL治疗组，每组10只动物。术后 第1, 10日NSCs治疗组大鼠脑室内移植2xlOS神经干细胞(10pl细胞悬液)各1 次，FNSCL组注射2xl05神经干细胞裂解液无细胞滤液各1次(10pl)。对照和 Meynert基底核损毁组大鼠脑室内同时注射同体积DMEM培养液。脑室内移植神 经干细胞或注射神经干细胞裂解液无细胞滤液，15日后进行被动逃避反应、学 习记忆等行为学试验。结果Meynert基底核损毁大鼠表现为一次性被动逃避反应潜伏期縮短，但操作 性行为不受影响。Y迷宫实验结果显示，学习记忆能力显著降低。NSCs和FNSCL 治疗组大鼠的被动逃避反应和学习记忆能力，大部分大鼠(6/10， 5/10)接近对照 组，小部分大鼠(4/10， 5/10)不如对照组，但优于Meynert基底核损毁组。 五.小鼠帕金森病模型方法10-12周龄，体重25-30g的成年C57/BI褐小鼠。小鼠随机分为对照、MPTP 损伤组、NSCs治疗组和FNSCL治疗组，每组10只动物。除对照组外，每日每次 腹腔注射MPTP4mg/kg，持续20日。MPTP损伤后第1， 10日NSCs组小鼠脑室 内移植2xlOS神经干细胞(10^U细胞悬液)各1次，FNSCL组注射2xlOS神经干细 胞裂解液无细胞滤液各1次(10pl)。对照和MPTP损伤组小鼠脑室内同时注射同 体积DMEM培养液。脑室内移植神经干细胞、注射神经干细胞裂解液无细胞滤液 20日后进行爬杆、悬尾和游泳等行为学试验。爬杆试验将一直径为25cm的软木固定于一根长50cm粗lcm的木杆顶端，木 杆上缠纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下几个时间(1) 小鼠从小球上下来所需的时间；(2)小鼠爬完杆子上半部分所需时间；G)小鼠 爬完杆子下半部分所用时间。然后按以下标准记分3s内完成上述某一动作的 记3分，6s内完成的记2分，超过6s完成的记l分，最后计算得分情况，并做 统计学分析。
悬尾实验将受试小鼠悬挂于一根水平电线上，如小鼠用两后爪抓住电线则记3 分，如用一后爪抓住电线则记2分。如果小鼠两后爪均抓不住电线则记1分，最 后计算得分情况，并做统计学分析。游泳实验将受试小鼠放入一个20cmx30cm规格的水箱中，水温为22 25°C。 评分标准如下在受试时间内连续不断游泳者记3.0分；大部分时间游泳仅偶尔 漂浮者记2.5分；漂浮时间占整个受试时间50%以上者记2.0分；偶尔游泳者记 1.5分；偶尔用后肢游动并漂浮在一边者记1.0分。最后计算得分情况，并做统 计学分析。结果MPTP损伤组小鼠的爬杆、悬尾和游泳试验结果显然不及对照组，而NSCs 和FNSCL治疗组则接近对照组，。六. 大鼠(利血平)帕金森病模型方法SPF级、雄性、体重200-300g的Wistar大鼠，随机分为对照组、利血平组， NSCs和FNSCL治疗组，每组10只动物。除对照组外，每日皮下注射利血平(l mg/kg 体重)l次，连续10天。利血平处理后1,10日NSCs组大鼠脑室内移植3xlOS神 经干细胞(10pl细胞悬液)各1次，FNSCL组注射3xlOS神经干细胞裂解液无细胞 滤液各l次(l(Hil)。脑室内移植神经干细胞、注射神经干细胞裂解液无细胞滤液 后每日测量体温，并观察大鼠毛发、体型、体态、步态及行为学的变化。 结果利血平组大鼠眼睑下垂，尾及四肢震颤，尾张力增加，躯体僵硬，曲背， 前肢腕关节弯曲并贴近躯干，步态失常，行动迟缓，脱毛，体温下降；而脑室内 移植神经干细胞、注射神经干细胞裂解液无细胞滤液组大鼠的体温，毛发、体型、 体态、步态及行为接近对照组大鼠。七. 大鼠嗅球切除模型方法。SPF级、雄性、体重300-350g的Wistar大鼠，随机分为对照组、假手术 组、NSCs治疗组和FNSCL治疗组，每组10只动物。经过4天每日数次的抚摸之 后，用三溴乙醇(250mg/kg, ip)麻醉大鼠。从大鼠囟前lcm至前囟后lcm正中线 处纵切头皮，暴露颅骨。在距离前囟前面8mm、正中线两侧2mtn处分别钻通颅 骨，使出现两个2mm直径的小孔。用连在水泵上的钝的皮下注射针，借助负压 将嗅球吸出。嗅球吸出后即向NSCs组大鼠脑嗅球部位移植106神经干细胞(1(^1 细胞悬液)、向FNSCL组大鼠脑嗅球部位注射106神经干细胞裂解液无细胞滤液(10pl)。用止血海绵填充小孔，四环素粉末洒在伤口上，缝合皮肤。假切除大鼠 手术方式同上，只是不吸除嗅球。术后每日抚摸动物数次。术后第5、 10日再向 NSCs组大鼠脑室内移植106神经干细胞(10|11细胞悬液)各1次，FNSCL组注射 106神经干细胞裂解液无细胞滤液各1次(10pl)。术后20日后进行下述实验。 开场活动实验采用自动记录分析摄像仪。观察记录3min内大鼠运动量。 跳台被动回避实验在电击箱内放一个木制平台，平台高出电击箱底大约5cm左 右。将大鼠先置于电击箱(不予电击)中使之熟悉环境lmin。然后将大鼠放于 平台上，只要其4个爪全部接触到电击箱底部就给予一次2s 0.6mA左右的电击， 观察3min，记录大鼠遭电击的总次数。结果嗅球切除大鼠活动量和遭受电击次数都明显多于假切除组大鼠和对照组，而脑嗅球部位移植神经干细胞或注射神经干细胞裂解液无细胞滤液组大鼠的活动量和遭受电击次数都明显减少，接近假手术组和对照组大鼠。八.新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型方法缺氧缺血脑损伤模型SPF级7日龄体重12克以上的Wistar新生大鼠。乙醚吸 入麻醉，75%酒精消毒皮肤，仰卧位，行颈部正中切口，长约l-1.5cra。依次分 离皮肤、皮下脂肪及肌肉，分离出左侧颈总动脉并用7.0灭菌丝线双线结扎，缝 合伤口并再次消毒皮肤。整个手术过程在15min内完成。休息2h后，将大鼠置 于有机玻璃低氧舱内(30 cmX40 cmX50 cm)，两侧各有一直径为1 cm小孔与外 界相通， 一侧通氮氧混合气，另一侧与测氧仪相通，底层铺有钠石灰以吸收C02 及湿气。按8%02/92%&比例输入氧气和氮气，测氧仪监测氧浓度在7 %-9%。舱 内温度控制在(36士2)。 C，湿度为(70士5H。缺氧时间持续lh。实验结束后将 大鼠放回鼠笼由母鼠行母乳喂养。分组除对照组外，按上述方法造缺氧缺血脑损伤模型，将造模成功的大鼠再随 机分为缺氧缺血脑损伤模型组和NSCs、 FNSCL治疗组。于术后1, 10日向NSCs 组大鼠脑室内移植3xl()S神经干细胞(l(Hd细胞悬液)各1次，向FNSCL组大鼠脑 室内注射3xlOS神经干细胞裂解液无细胞滤液(l(^l)各l次。21日龄时断奶，断 奶后按性别分笼饲养。脑室内移植神经干细胞或注射神经干细胞裂解液无细胞滤 液20闩后进行行为学实验和肉眼观察。肉眼观察取出鼠脑，肉眼观察将脑病变 分为正常、轻度、中度及重度改变。正常肉眼未见明显异常；轻度:左脑病变范 围〈1/3，中度1/2>左脑病变范围>1/3;重度:左脑病变范围>1/2。 结果缺氧缺血脑损伤模型组部分动物(6/10)提起鼠尾时向患侧旋转；部分动 物(4/10)处于精神抑制状态，不能自发活动。肉眼观察发现左脑病变范围〉1/2。 NSCs治疗组部分动物(5/10)行为接近正常，部分动物(5/10)提起鼠尾时健侧前 肢不能前伸。肉眼观察发现本组部分鼠(5/10)，左脑接近正常，部分鼠(5/10)左脑 病变范围〈1/3。FNSCL治疗组小部分动物(4/10)行为接近正常，左脑接近正常；大 部分动物(6/10)提起鼠尾时健侧前肢不能前伸，左脑病变范围〈1/3。九.神经干细胞裂解液的临床应用自体和异体干细胞移植治疗神经系统损伤和疾病是一种有广阔应用前景的新的治疗途径。目前应用最多、治疗效果最好的是脑组织神经干细胞移植治疗帕 金森病。从患者受损脑组织中提取神经干细胞，体外培养、扩增后再植入损伤部 位，患者可恢复部分认知功能。患者自体骨髓间质干细胞亦可作为干细胞来源。 人类胚胎干细胞的培养成功和体外定向诱导人类胚胎干细胞分化为神经细胞的 研究和开发为长期困扰医学界的难题，如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎縮性侧 索硬化的治疗，脑和神经损伤后的修复，带来了希望。鉴于l)在人类羊水、毛囊、骨髓和其他一些组织中发现了干细胞,就研究和 开发新药而言，成年干细胞比胚胎干细胞快得多；2)胚胎干细胞移植可能有潜在 的副作用；3)神经干细胞裂解液具有使神经干细胞增殖、迁移、分化的潜能;4) 神经干细胞裂解液中起作用的一些神经干细胞因子可被分离、纯化,进而人工制 备、批量生产;5)神经干细胞裂解液及神经干细胞因子的研发不涉及伦理、道德、 法律，因此，神经干细胞裂解液的无细胞滤液及神经干细胞因子的制剂有可能在 预防和治疗多种神经精神疾病和神经损伤以及脑缺氧缺血中广泛应用。
图1.脑室内注射神经干细胞裂解液无细胞滤液对成年小鼠MSG灌胃所致Y迷宫 学习和记忆能力损伤的修复作用图2.脑室内注射神经干细胞裂解液无细胞滤液对成年小鼠MSG灌胃所致海马损 伤的修复作用A:对照(HE，x50) ; B: MSG(HE, x50) ;C: MSG+NSCs(HE, x50) D: MSG+FNSCL(HE, x50)图3.神经干细胞裂解液无细胞滤液诱导胚胎干细胞向神经干细胞分化 A:对照(x50); B: FNSCL(x50)
权利要求
1.神经干细胞裂解液的无细胞滤液的制备方法。
2. 神经干细胞裂解液的无细胞滤液作为预防和治疗多种神经精神疾 病和神经损伤以及脑缺氧缺血的药物的用途。
3. 神经干细胞裂解液的无细胞滤液的药物组合物及其制备方法。
4. 神经干细胞裂解液的无细胞滤液的药物组合物作为预防和治疗多种神经精神疾病和神经损伤以及脑缺氧缺血的药物的用途。
5. 神经干细胞因子作为预防和治疗多种神经精神疾病和神经损伤以 及脑缺氧缺血的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及防治神经精神疾病和损伤的神经干细胞裂解液的制备及其药用。胚胎神经干细胞分离自胎脑，成年神经干细胞分离自成年动物的神经组织。神经干细胞经超声波破碎后过滤制得神经干细胞裂解液的无细胞滤液。神经干细胞裂解液的无细胞滤液含已知的和未知的神经干细胞因子。这些已知和/或未知的神经干细胞因子具有使神经干细胞增殖、迁移、分化的潜能。神经干细胞裂解液诱导胚胎干细胞向神经干细胞分化。神经干细胞裂解液对小鼠兴奋毒性脑损伤、脑偏瘫，大鼠Meynert基底核损毁所致的阿尔茨海默氏病、小鼠和大鼠帕金森病、大鼠嗅球切除所致的抑郁症和新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型，都具有与神经干细胞移植相似的治疗效果。
文档编号A61K38/18GK101156944SQ20061013583
公开日2008年4月9日 申请日期2006年10月7日 优先权日2006年10月7日
发明者于廷曦 申请人:于廷曦