专利名称：菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来自菊芋/Www^ L.块茎的糖结合蛋白，其 具有体外促进家兔离体回肠蠕动活性，具体地说是菊芋凝集素在制备治疗 便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。
背景技术：
菊芋(i/e//awAMl^w&m sL.)俗称洋姜、鬼子姜，原产于北美洲，系 属菊科(Compw/toe)向日葵属的多年生草本植物(能形成地下块茎的栽培 种)。菊芋是一个比较好的防风固沙、防止水土流失并具有一定开发利用价 值的植物种。其超强的繁殖能力以及在刻苦环境中生存的特性都归功于它 发达的根系和含有诸多成分的块茎。人们发现用牛羊在食用菊芋块茎后，会出现腹泻的症状，严重者还会 死亡。本专利首次通过实验发现向不同浓度的菊芋粗提物对回肠的蠕动都 有刺激作用。粗提物经过蛋白酶的酶解后，其蛋白质片断增强了刺激作用。 这种强烈的刺激作用很可能影响回肠的正常蠕动，造成牛羊的腹泻，严重 时还可能造成回肠痉挛，使牛羊死亡。发明内容本发明提供一种来自菊芋/w^ra^^ L.块茎的具有体外促进 家兔离体回肠蠕动活性的糖结合蛋白。具体地说是菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。所述的菊芋凝集素可参照文献1 (文献1.Characterization and molecular cloning of the lectin from Helianthus tuberosus ， E. J. M. Van Damme, Annick Barrel, Anne-Marie Mazardl, Peter Verhaert, Alistair Horman, Henri Debray, Pierre Rouge 1 and Willy J. Peumans， Eur. J. Biochem. 1999， 259， 135-142) 分离纯化。其N末端^ TVVTSLTFQTNKKVYGPFGT。 SDS—PAGE鉴定 纯度大于95%，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)测定 此活性蛋白的分子量为15.4KDa。所述的糖结合蛋白，其可按如下方法制备获得在3-5"C时，将200克 菊芋新鲜块茎用100毫升0.01 MTris-HCl， 0.15M NaCl缓冲液，pH7.4，抽 提。静置过夜后，80%硫铵沉淀，所得粗蛋白对二次水透析后冻干得粉末。 首先采用阴离子交换柱Sephacel-DEAE，柱温为室温，检测波长为280腿， 流动相为0.01M Tris-HCl无盐溶液到0.01M Tris-HCl， 1M NaCl线形梯度 洗脱。，脱液对二次水透析后冻干。将冻干粉溶于0.01MTris-HCl， 0.15M NaCl缓冲液，pH 7.4， 10毫升该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200 (1.8X98cm)上，流动相为0.01MTris-HCl， 0.15MNaCl缓冲液，柱温为室
温，检测波长为280nm，检测洗脱峰的体外刺激回肠蠕动的活性，将具有 体外刺激回肠蠕动活性的洗脱成份冻干燥，制得20毫克该糖结合蛋白。最 后用高效液相Hypersil C18柱，流动相为10%乙腈-水溶液，检测波长 205nm，柱温为室温，进样体积20pl，采用梯度洗脱，按时间收集。经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量约为17 000道尔 顿。基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)测定此活性蛋白的 分子量为15376道尔顿。所述菊芋凝集素可与充填剂形成的各种形式的散剂，颗粒剂，片剂，胶 囊，水溶液，悬浮液，乳化液，喷剂或粉剂，药物可为口服药物。所述药 物可以添加到各种食品当中，作为预防便秘和延缓胃肠衰老的保健食品， 食品的形态可以是液体的比如像清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，或 固体的奶酪，火腿，点心等。本发明应用现代生物技术对菊芋块茎粗蛋白进行分离纯化，对纯化得 到的蛋白质进行家兔离体回肠蠕动的活性筛选。结果表明该蛋白具有很好 的刺激回肠蠕动的活性。因此，可将此蛋白或者其衍生物作为治疗便秘患 者的药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。
图1为蛋白粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；图2为纯化蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 图3为回肠在加样前后的收縮振幅变化； 图4为不同浓度下回肠在加样前后的收縮振幅变化； 图5为胃蛋白酶加酶前后回肠平滑肌收縮的振幅变化； 图6为胃蛋白酶消化后，回肠平滑肌收縮的振幅变化； 图7为胰蛋白酶加酶前后回肠平滑肌收縮的振幅变化； 图8为胰蛋白酶消化后，回肠平滑肌收縮的振幅变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述 实施例1在3-5。C时，将200克菊芋新鲜块茎用100毫升O.OlMTris-HCl， 0.15M NaCl缓冲液，pH 7.4，抽提。首先采用阴离子交换柱Sephacel-DEAE，流 动相为0.01M Tris-HCl无盐溶液到0.01M Tris-HCl， 1M NaCl线形梯度洗 脱。洗脱液对二次水透析后冻干。将冻干粉溶于0.01MTris-HCl，0.15MNaCl 缓冲液，pH 7.4。 10毫升该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200 (1.8X98cm) 上。检测洗脱峰的体外刺激回肠蠕动的活性，将具有体外剌激回肠蠕动活 性的洗脱成份冷冻干燥，制得20毫克该糖结合蛋白。最后用高效液相 Hypersil C18柱，流动相为10%乙腈的水溶液，进一步纯化该蛋白。实施例2蛋白粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，文献2(汪家政，范明.蛋白 质技术手册[M].北京科学出版社，2000. 42-100).结果如图1所示。 实施例3经离子交换分离出的蛋白提取物SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳见图2，结 果如图2所示。 实施例4家兔禁食24小时，用木棒猛击家兔头部致昏，迅速剖开腹腔暴露小肠， 在距回盲部15 cm处取一部分回肠，去除肠系膜，剪成数段，每段约1.5 cm， 冲洗内容物，浸泡在台氏液中放于4"C的冰箱中备用。取一段回肠平滑肌标 本，将其下端固定，上端与机械电换能器相连，悬挂于装有25ml台氏液的 麦氏浴槽中，麦氏浴槽与37。C的恒温水浴锅相连，机械电换能器与生物机 能实验系统相连，用以记录回肠平滑肌的收縮情况。向麦氏恒温浴槽中通 混合气体(95%的02和5。/。的C02)，每20min更换一次台氏液，稳定平 衡lh后换新鲜台氏液开始实验。实验所用浓度均按最终浴槽浓度计算。文 献3 (H.D. Wang, C.Y.Tan, X.F.Bai， Y.G.D， B.C丄in， Pharmacological studies of anti-diarrhoeal activity of Gentianopsis paludosa, Journal of Ethnopharmacology, 2006,105， 114-117);回肠在加样前后的收縮振幅见图3。实施例5分别用浓度为0.00625 mg/ml， 0.0125 mg/ml， 0.025 mg/ml， 0.05 mg/ml， 0.1 mg/ml， 0.2mg/ml， 0.4mg/ml， 0.8 mg/ml和1.6 mg/ml的该蛋白加样， 同时对回肠平滑肌的收縮振幅进行检测。不同浓度下回肠在加样前后的收 縮振幅变化见图4。实施例6:经过胃蛋白酶处理的该蛋白对回肠平滑肌收縮的影响。开始只加入胃蛋白酶，加酶前后回肠平滑肌收縮的振幅变化见图5。然后再将胃蛋白酶和 该蛋白37'C下混合2小时后，将混合液加入试验体系，加样前后回肠平滑 肌收縮的振幅变化见图6。 实施例7经过胰蛋白酶处理的该蛋白对回肠平滑肌收縮的影响。开始只加入胰 蛋白酶，加酶前后回肠平滑肌收縮的振幅变化见图7。然后再将胰蛋白酶和 该蛋白37t:下混合2小时后，将混合液加入试验体系，加样前后回肠平滑 肌收縮的振幅变化见图8。
权利要求
1. 菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。
2、 按照权利要求l所述的应用，其特征在子所述菊芋凝集素可与充 填剂形成的各种形式的散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，水溶液，悬浮液，乳 化液，喷剂或粉剂。
3、 按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述药物为口服药物。
4、 按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述药物可以添加到各 种食品当中，作为预防便秘和延缓胃肠衰老的保健食品。
5、 按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述保健食品的形态可 以是液体的或是固体的。
全文摘要
本发明涉及一种来自菊芋Helianthus tuberosus L.块茎的糖结合蛋白，其具有体外促进家兔离体回肠蠕动活性，具体地说是菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。本发明应用现代生物技术对菊芋块茎粗蛋白进行分离纯化，对纯化得到的蛋白质进行家兔离体回肠蠕动的活性筛选。结果表明该蛋白具有很好的刺激回肠蠕动的活性。因此，可将此蛋白作为治疗便秘患者的药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。
文档编号A61K38/16GK101209342SQ20061013511
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者杜昱光, 熊川男, 王佳培, 白雪芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所