专利名称：猪喘气病活疫苗及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种猪的传染病预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。
背景技术：
猪喘气病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。
猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。
猪喘气病是养猪业面临的一个世界性难题，疫苗免疫是预防控制该病最有效的途径。然而，疫苗的研究虽然已在上世纪60年代就开始了，但直到90年代才开始出现希望，虽然中国兽医药品监察所将猪肺炎支原体强毒株在乳兔体内连续传代700多代，使其减毒，培育出了一株毒力低，免疫原性良好的猪肺炎支原体兔化弱毒株(中国发明专利ZL 86108515，猪肺炎霉形体弱毒疫苗的生产)，但是，由于该菌株长期在乳兔体内传代，几乎失去了在培养基中生长的能力，无法适应工厂化条件下规模化的疫苗生产。
发明内容
本发明的目的是通过使用不同的培养基和不同的分离培养方法使原已失去了在培养基中生长能力的猪肺炎支原体弱毒疫苗制苗菌株R790株能在培养基中生长并保持良好的免疫原性，以工厂化生产方法生产出预防猪喘气病活疫苗(又称猪肺炎支原体活疫苗)。
本发明是将我所培育的猪肺炎支原体兔化弱毒疫苗生产生产菌株R790株(中国发明专利ZL 86108515，猪肺炎霉形体弱毒疫苗的生产)适应培养基获得了培养基适应菌株，对该菌株进行了一系列鉴定，经生长特性，血清学特性鉴定结果表明该菌株符合猪肺炎支原体的各项特征，确定为猪肺炎支原体，并将其定名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)MR48株(本菌株已于2006年9月19日送交北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1816)。
具体实施方案1菌种培育将我所培育的猪肺炎支原体兔化弱毒R790株(中国发明专利ZL 86108515，猪肺炎霉形体弱毒疫苗的生产)通过在Lps培养基反复传代，获得培养基适应株，命名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)MR48株(本菌株已于2006年9月19日送交北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1816)。
2猪肺炎支原体MR48弱毒株的特性。
2.1形态和生化特性为环状、球状、丝状、杆状和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性，血清学与生化特性应符合细菌分类学中该菌的特性。
2.2培养特性 在液体培养基中呈现良好的生长，37℃培养4～10日后培养基下降0.5个pH值以上，呈现轻度混浊。培养物中猪肺炎支原体活菌滴度可以达到108～109CCU/ml(CCU——颜色变化单位)之间。接种Lps固体培养基，37℃培养7～14日后，可见油煎蛋样菌落。
Lps液体培养基配方(按1000ml计)PPLO 10.0～25.0g、NaCl 2.0～5.0g、KCl 0.2～1.0g、MgSO40.1～0.4g、KH2PO40.2～0.6g、Na2HPO4*12H2O 2.0～8.0g、葡萄糖5.0～10.0g、水解乳蛋白1.0～5.0g、2.5％乙酸鉈5～10ml、25％酵母浸出液100～200ml、10×MEM 10～50ml、牛心汤或肺汤100～200ml、FeSO40.001～0.01g、酚红1％0.5～2.0ml，补加蒸馏水至800ml，过滤除菌后加入新鲜猪血清100ml和新鲜马血清100ml，调pH至7.3～7.6备用；液体培养基中加入1.5％的琼脂成为Lps固体培养基。
2.3血清学特性2.3.1用代谢抑制试验鉴定 在加有猪肺炎支原体抗血清的液体培养基中，经37℃恒温培养15日，pH值不下降，呈现特异的葡萄糖代谢抑制。
2.3.2用生长抑制试验鉴定 在加有猪肺炎支原体抗血清的固体培养基表面，经37℃恒温培养10～20日，无菌落出现，呈现特异的猪肺炎支原体生长抑制。
2.4安全性检验2.4.1小鼠安检 取菌种用生理盐水稀释成107CCU/ml，皮下注射体重为18～22g清洁级小鼠3只，0.4ml/只，观察10日，均全部健活。
2.4.2猪安全检验 每批培养物以10倍的免疫剂量(5×106CCU)，分别胸腔接种30～50日龄健康易感猪3头，设空白对照3头，观察20日。试验猪均无临床症状，剖检后观察猪肺部正常，无猪喘气病病理变化。
2.5免疫原性检验 免疫方式(鼻腔喷雾和肺内注射)等共分为9个组进行免疫，同时设未免疫对照组。免疫后55日，采用猪肺炎支原体强毒F65株连同对照猪共计30头一起进行攻毒，攻毒后30日全部宰杀，检查肺部病变。试验结果显示胸腔肺内注射途径和鼻内喷雾免疫接种猪的保护效分别为90％和55％。
2.6分子生物学鉴定(P97基因序列的测定) 按照丁芳等人的方法(《畜牧兽医学报》2004.Vol.35 No6.698-701)对该菌株P97基因序列进行测定，结果表明，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)MR48株保留了猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)R659株的特性，即MR48株和R659株的P97基因的R1(AAKPV/E)重复序列同样为17个，明显的区别于其他菌株。
3.疫苗制备 将Lps液体培养基培养的猪肺炎支原体MR48株菌种子液以1∶10(容积比)接种于Lps液体培养基中。存37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养。一直到制苗所需的量(继代次不超过6代)，等比例加入冻干保护剂，充分混合，按规定头份定量分装，含活菌不少于108CCU/ml，经冷冻真空干燥后而成猪喘气病活疫苗。
4猪肺炎支原体活疫苗(MR48株)的质量标准4.1颜色变化单位(CCU)测定 按CCU测定方法测定，冻干苗每头份菌数≥5×106CCU。
4.2安全检验4.2.1小鼠 用体重18～22g的小鼠3只，用生理盐水将疫苗恢复到原体积，各皮下接种0.4ml，观察10日。应全部健活。
4.2.2猪 每批培养物以10倍的免疫剂量，即取15瓶(2头份/瓶)疫苗用生理盐水稀释成总体积15ml，分别胸腔接种30～50日龄健康易感猪3头，每头3ml，同时设空白对照3头，观察20日。安检猪应无任何临床症状。否则，应重检一次。
4.3效力检验(免体免疫反应) 用体重1.5～2.0kg的大耳白兔5只，取3瓶疫苗(2头份/瓶)疫苗用生理盐水稀释成总体积12ml，每只大耳白兔各肺内注射2ml，第30日采血，用间接血凝方法.检查血清凝集抗体，应至少4只为阳性(血凝价≥10++)，否则，应重检1次。
4.4免疫期 为6个月。
4.5用法与用量 右胸腔注射或鼻内喷雾，每头猪接种1头份。
本发明的优点本发明所涉及的一株猪肺炎支原体RM48株是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)兔化弱毒R790株经在本发明所设计的一种猪肺炎支原体疫苗培养基上反复传代而适应，并能进行工业化的活疫苗生产，该支原体菌株保留了原菌株的免疫原性和安全性，其该菌P97基因的R1(AAKPV/E)重复序列为17个这一分子生物学特性可用于区别其他菌株。本菌株生产的猪肺炎支原体活疫苗既可以用胸腔注射，也可用鼻腔喷雾接种法免疫猪。
权利要求
1一株用于生产猪喘气病活疫苗的猪肺炎支原体菌株，其特征在于该猪肺炎支原体是由猪喘气病活疫苗生产菌株R790株适应本发明所设计的Lps培养基获得的培养基适应菌株，对该菌株进行了一系列鉴定，经生长特性，血清学特性鉴定结果表明该菌株保留了猪肺炎支原体R659株的各项特征，且该菌P97基因的R1重复序列与R790株同样为17个，命名为MR48株，本菌株已于2006年9月19日送交北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1816。
2一种猪喘气病活疫苗，其特征在于该活疫苗是由MR48株猪肺炎支原体和冻干保护剂组成，本苗既可以用胸腔注射，也可用鼻腔喷雾接种法免疫猪。
3一种猪喘气病活疫苗的生产方法，其特征在于将猪肺炎支原体MR48株菌种子液以1∶10(容积比)接种于Lps液体培养基中，于37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养，一直到制苗所需的量，等比例加入冻干保护剂，充分混合，按规定头份定量分装，含活菌不少于108CCU/ml，经冷冻真空干燥后而成猪喘气病活疫苗。
4权利要求3所述的猪喘气病活疫苗的生产方法，其特征在于Lps液体培养基配方按1000ml计PPLO 10.0～25.0g、NaCl 2.0～5.0g、KCl 0.2～1.0g、MgSO40.1～0.4g、KH2PO40.2～0.6g、Na2HPO4*12H2O 2.0～8.0g、葡萄糖5.0～10.0g、水解乳蛋白1.0～5.0g、2.5％乙酸鉈5～10ml、25％酵母浸出液100～200ml、10×MEM 10～50ml、牛心汤或肺汤100～200ml、FeSO40.001～0.01g、酚红1％0.5～2.0ml，补加蒸馏水至800ml，过滤除菌后加入新鲜猪血清100ml和新鲜马血清100ml，调pH至7.3～7.6备用；液体培养基中加入1.5％的琼脂成为Lps固体培养基。
全文摘要
本发明涉及一种猪喘气病活疫苗及其生产方法。这种活疫苗是用一株适应在本发明所设计的一种猪肺炎支原体Lps培养基上生长的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneu moniae)RM48株经培养后加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制成活疫苗。该菌P97基因的R1(AAKPV/E)重复序列为17个这一分子生物学特性可用于区别其他菌株。本活疫苗安全有效，既可以用胸腔注射，也可用鼻腔喷雾接种法免疫猪。
文档编号A61K35/74GK1928076SQ200610152519
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者宁宜宝, 沈青春, 李继庚, 王桂敏, 丁庆猷, 丁芳, 覃青松 申请人:中国兽医药品监察所