无标记的生物传感器和细胞的制作方法

专利名称：无标记的生物传感器和细胞的制作方法
无标记的生物传感器和细胞
I. 相关申请的交叉参考
本申请要求2005年4月5日提交的美国临时申请系列号60/668,908、标 题为"无标记的生物传感器和细胞"的优先权，并将其纳入作为参考。
II. 背景
最终会为市场带来新药的药物研究和开发过程是一个复杂和费用很大的 过程。此外，药物开发的最初阶段利用亲和结合检测，此检测通常在体外进行， 提供有限的潜在药物化合物对感兴趣靶标产生作用的能力的信息。许多这样的 潜在前导物在基于细胞的检测或临床前/临床实验中的基于动物模型有效性的 检测中都以失败告终，导致高的损耗率。最近，包括高含量筛选技术在内的创 新的细胞基技术已在药物和生物技术工业普及。这些检测技术为靶标-化合物 相互作用的细胞结果提供了功能性的、动力学方面的细胞基信息。所获得的数 据包括信号传导途径、药物作用机制、药效、选择性和毒性的信息。需要使用 荧光标记或发光标记以进行基于图象的检测的大多数现有细胞基技术通常着 重于评估离散的胞内事件(如Ca2+流、c細P产生和积累、靶标迁移、报道子 基因产生等)。由于细胞功能的复杂性，细胞响应通常产生自多种信号的集合， 因此基于给定的单细胞响应或信号的检测技术往往无法产生针对药物刺激的 全部综合细胞应答的信息。标记物的使用、或者人工增强行为的采用(如转染 或RNAi剔除)或报道子基因系统的使用可产生一种不同的阐明感兴趣靶标的 真实细胞生理学的途径。基于这些原因，仍需要能够检测分子对活细胞的影响， 如检测分子是否影响到特定的信号途径，如G蛋白偶联的受体(GPCR)或表皮 生长因子受体(EGFR)，或分子是否引起细胞增殖，或引起细胞死亡或停止生 长。无标记或非标记依赖性检测(LID)生物传感器的使用是有利的，因为该 生物传感器满足了通常很复杂的标记策略和检测机制的需求。无标记生物传感 器对于高通量方法而言更为便利。所公开的是使用无标记生物传感器进行任何 类型的细胞检测的方法和系统，包括检测信号传导途径和细胞增殖和死亡。ni.概要—-
本发明公开了涉及无标记的生物传感器和它们在细胞方面的用途的方法 和组合物。
iv.


纳入本文并构成本说明书一部分的附图阐述了几个实施例，并与说明书一 起阐述了所公开的组合物和方法。
图1显示肝细胞粘附在传感器表面后光学波导光栅(0WG)微板的一个具 体检测方案的例子。图象显示采用阵列式角度(arrayed angular)讯问系统 获得的细胞培养获得 95%细胞覆盖率后5行(7个/行)传感器的共振带图象。 该阵列式角度讯问系统由用于产生光束阵列、使各光束照射OWG传感器的发射 系统和用于接收从这些传感器反射的光束所产生的所有响应的接收系统。此系 统允许同时测量多个系统中贴壁细胞的响应。此实施例是5X7，但可使用6X7、 或7X7，或者任何与该光产生和接收系统相适应的配置。这些测量值可以实时 获取，时间分辨率例如是 3秒。不连续的环表示，如光显微镜图象所证实的， 细胞密度在此传感器上不是一致的。
图2a显示用于细胞检测的基于细胞贴壁层内刺激诱导的定向物质再分布 的光学生物传感器。所示的实施例是一种光学波导光栅传感器，由位于折射率 nA=l. 50的玻璃基底之上的高折射率(nF=2. 36)、厚度为dF (75mm)的Nb205 薄膜，位于波导管薄膜之上的总折射率nA=1.37的细胞贴壁层，以及折射率 为 1.33 (nC)的周围介质构成。该OWG生物传感器是一种攸逝波传感器，以 光通过衍射光栅谐振耦合到波导之中为基础。激光以各种角度照射该波导，光 仅在特定角度耦合到波导中，取决于导向模式的有效折射率(N)。配体诱导 的耙标激活导致与靶标相互作用的组分向该靶标集合、所产生的靶标复合物的 移动、以及潜在的细胞骨架结构的重构(即形态学变化)。当这些移动或变化 发生在非常靠近OWG传感器表面的边缘时(细胞在在该表面上培养)，在某个 时间就会产生DMR信号(如箭头所指)，可对此信号进行实时监控。细胞贴壁 层内配体诱导的定向物质再分布导致有效折射率的改变，这又会使出耦合的光 (out-coupled light)发生角度偏移。图2b显示检测传感体积范围内的刺激 介导的纵向物质再分布的三层构型。细胞底部被表示为由多个相同间隔和均质 的薄层组成，各层各自的折射率为ni，蛋白质浓度为Ci，距离为Zi (与传感器表面之间的距离)。周期为A的光栅嵌埋在折射率为nF、厚度为dF的波导 膜中。波导膜放置在折射率为ns的基底是上表面上。
图3显示作为刺激介导的细胞内容物的不对称横向再分布的函数的相变。 在平面波导中传播的被导光显示为Z字形的波。传感体积范围内不均匀的横向 物质分布导致给定模式的共振峰的扩大，甚至分裂。
图4显示作为与传感器表面之间的距离的函数的传感器一导向模式的攸逝 波的强度。
图5显示0WG传感器的另一种对称性。这种所谓的反对称波导管构型由波 导膜(如Nb2(U构成，该膜由通常为1一100微米厚的纳米孔二氧化硅(有或 没有玻璃底部支持)支持。该纳米孔二氧化硅的有效折射率为 1. 1，它的折 射率低于覆盖介质的折射率，该覆盖介质通常是用于本发明的水溶液。
图6显示一些参数，基于这些参数可使用OWG生物传感器进行细胞检测。 图6A显示的是示范性的用8nM EGF诱导的 95%覆盖率的静息态A431细胞贴 壁层的时间依赖性响应，采用角度讯问系统获得。如图6A所示，可定义细胞 内刺激诱导的定向物质再分布的动力学的6个参数是1)总动态特征(即形 状)；2)响应阶段(如，在此具体实施例中有三个阶段正向物质再分布(P-DMR)、 净零定向物质再分布(net — zero DMR)和逆向物质再分布(N-DMR) ) ; 3) 各阶段的动力学；4) P-DMR阶段和N-DMR阶段两者的总持续时间；5) P-DMR 阶段和N-DMR阶段两者的总振幅；和6) P-DMR阶段到N-DMR阶段的过渡时间 t 。图6B显示 90%覆盖率的示范性A431细胞的典型的共振峰，采用TM。模
式获得，该图阐述了以下另4个参数7)峰位置；8)强度；9)形状；和IO)
最大值一半的宽度(PW服)。图6C显示在示范性A431细胞在其上培养到覆盖 率 95%的传感器貼的典型的TM。共振带图象。使用阵列式角度讯问系统获得
这些数据，它们阐述了另5个特征11)带的形状；12)位置；13)强度；14) 分布；和15)宽度。所有这些参数可独立或一起用于使用本文所揭示的传感器 的任何细胞检测的任何给定应用中。可用这些参数的亚组合或组合来为一特定
检测或特定检测的特定变化提供一特征，例如细胞受体实验特征，如基于EGF 受体的实验的特征。
图7显示EGF诱导的静息态A431细胞的剂量依赖性响应。(A)并行采用 我们的系统获得的不同浓度EGF诱导的细胞响应的实时动力学。EGF的最终浓 度显示在图中。(B)基于图7A所示的过渡阶段和终了阶段之间的差异而计算
22得到的N-DMR信号的振幅，它是EGF浓度的函数。获得了典型的饱和曲线。(C) 从P-DMR到N-DMR时间的过渡时间t ,它是EGF浓度的函数。(D)采用非线 性回归获得的N-DMR事件的k值，它是EGF浓度的函数。
图8显示一种基于定向物质再分布的筛选和归类针对特定靶标或信号途径 的化合物的方法。在此图中，标记物可以是特定靶标或信号途径或细胞功能的 活化剂或灭活剂，它导致或阻止定向物质再分布或信号。虚箭头指示两个步骤 可以互换，或组合在一起。步骤804和806可以视为是本文所讨论的一种刺激 事件。
图9显示具有各种典型组分的生物细胞的示意性图。该细胞由含有大量细 胞器官的细胞质(通常10 — 30pM)构成。最大的细胞器官是细胞核，其大小通 常为3—10iira。细胞核里有蛋白质，最重要的蛋白质是染色质。线粒体是小细 胞器，它含有一系列的折叠的膜，大小通常为0.5 — 1.5pm。其它细胞组分包括 内质网(ER)(通常为0. 1 —lfim)、溶酶体(lysome)(通常为0. 2-0. 5|im)、 过氧物酶体(通常为0.2-0. 5km)，和内含体(通常 100nm)。
图10显示显示了光学LID系统的图，该系统用于根据本文所公开的方法 和系统监控活细胞中的物质再分布(如GPCR迁移)。
图11显示分别具有不同的穿透深度100、 200和300nm的三种类型的传 感器的攸逝场(即相对响应)，它作为与生物靶标与传感器表面的距离的函数。 这证明了不同穿透深度对细胞传感的重要性，尤其对于探测细胞内的移动或 DMR事件。
图12显示一种基于定向物质再分布而鉴定和评估靶标的方法。注意(1)
在此种情况中标记物是具体靶标的活化剂或灭活剂，它能导致或阻止定向物质 再分布事件或信号；(2)所获得的响应可用于鉴别具体细胞中的靶标水平，
或评估具体信号途径或给定的疾病细胞类型中的靶标；和(3) 1206可视为是 本文所公开的一种刺激事件。
图13显示基于定向物质再分布鉴别和评估靶标的另一种方法。注意(1)
在此种情况中标记物是具体靶标的活化剂或灭活剂，它能导致或阻止定向物质 再分布事件或信号；(2)所获得的响应可用于鉴别具体细胞中的靶标水平， 或评估具体信号途径或给定的疾病细胞类型中的靶标；和(3) 1304和1304两 者都可视为是本文所公开的一种刺激事件。
图14显示可用于例如图13所述的另一种方法中的光学LID生物传感器微板。这种特定的微板是一种多区室平板，在各孔中有嵌埋有光学生物敏感器的
多区室。在此96孔微板中，各孔含有4个区室，各区室嵌埋有一个波导光栅 基片，可用于容纳一个类型的细胞或感兴趣的靶标。四个区室被内壁分开，内 壁的高度(优选100微米到2毫米)要比各孔的高度(通常是给定微板的高度) 低得多，不论各区室的不同靶标是什么，具有4个区室的各孔可用于同时检测 一种药物候选物对多个靶标或多种细胞类型的作用。灰色的线条表示基于波导 光栅的生物传感器。
图15显示基于定向物质再分布鉴别和评估靶标的另一种方法。注意(1)
在此种情况中标记物是具体靶标的活化剂或灭活剂，它能导致或阻止定向物质 再分布事件或信号；(2)所获得的响应可用于鉴别具体细胞中的耙标水平，
或评估具体信号途径或给定的疾病细胞类型中的靶标；和(3) 1503、 1504、 1508和1509都可视为是本文所公开的一种刺激事件。
图16是显示与刺激事件导致的细胞调节相关的不同状态的图，所示细胞 调节例如是可通过分析光学LID系统(如图10所示的系统)的时间依赖性光 学响应输出来鉴别的生物细胞中的GPCR迁移。
图17显示阐述实时监控刺激事件的方法的基本步骤的流程图，所述事件 例如是使用本文所述的光学LID生物传感器获得的激动剂诱导的细胞受体的物 质再分布，包括活细胞内的GPCR迁移。1706和1708可以视为是本文所述的一 种剌激事件。
图18显示基于定向物质再分布的鉴别靶标的一个例子。注意(1)此图 所示的实施例是癌细胞系A431的EGF-诱导的DMR响应与另一细胞系CH0之间 的比较。(2)在如图中所示的三种不同条件下培养的 95%覆盖率的A431细 胞贴壁层的EGF-诱导的DMR响应与在0. 1X胎牛血清(FBS)培养了 20小时的 95%覆盖率的中国仓鼠卵巢细胞贴壁层的EGF-诱导的DMR响应比较。在加入 50[U 4x的EGF溶液(32nM)之前，用25^1的正规Hanks平衡盐溶液(HBSS) 处理被100|il培养基覆盖的细胞至少2次，间隔15分钟，这样细胞达到一种 稳定的状态，表现为长时间的net-zero响应。(3)刺激事件是导致定向物质 再分布事件或信号的特定靶标(EGFR)的活化剂(如同源配体，EGF)。和(4) A431细胞内源性地过表达表皮生长因子受体(EGFR)(每个细胞 1700000拷 贝)。相反，CHO细胞不内源性地表达EGFR。 1801表示CH0细胞的输出数据。 1802表示在0. 1%胎牛血清(FCS)培养20小时的A431的输出数据。1803表示10%FCS中的A431细胞的输出数据。1804表示在0. 1%FCS中培养4小时的A431的输出数据。
图19是阐述使用本文所述的光学LID生物传感器基于活细胞内的物质再分布来筛选针对靶标(如GPCR)的剌激事件(如激动剂事件)的方法的基本步骤的流程图。
图20是阐述使用本文所述的光学LID生物传感器基于活细胞内的物质再分布来筛选针对细胞耙标，如受体，如GPCR的刺激事件(如拮抗剂事件)的方法的基本步骤的流程图。2006和2008可视为是本文公开的刺激事件。
图21是阐述产生可用于本文所述的任一方法的自参考(self--referencing)光学LID生物传感器的方法的基本步骤的流程图。
图22是阐述产生自参考光学LID生物传感器的另一种方法的基本步骤的流程图，该自参考光学LID生物传感器在同一传感器的空间上分开的区域中容纳两种细胞类型的贴壁层，该方法可用于本文所述的任一种方法中。2212可以视为是本文所公开的剌激事件。
图23是阐述使用本文所述的光学LID生物传感器基于多种类型的活细胞内的物质再分布来筛选刺激事件(如激动剂诱导的受体活动，所述受体例如GPCR)的方法的基本步骤的流程图。2306和2308可视为是本文公开的刺激事件。
图24是阐述使用本文所述的光学LID生物传感器基于物质再分布来筛选一系列化合物(如特定受体的潜在激动剂或拮抗剂，所述受体例如一个类型活细胞中的多种GPCR)的方法的基本步骤的流程图。2406和2408可视为刺激事件。
图25显示显示筛选干扰细胞骨架结构的调节剂的方法。2506、2508和2510
可以视为是刺激事件。
图26显示筛选干扰胆固醇外溢的调节剂的方法的一个例子。2606、 2608和2610可以视为是刺激事件。
图27是显示体内脂质信号传递和通信的示意图。
图28 (A)显示甲基-p-环糊精(mpCD)对LID传感器上静息态A431细胞和Hela细胞贴壁层的时间依赖性响应。图28 (B)显示化合物(20nM EGF或1000nMH7)对m(3CD诱导的静息态A431细胞响应的作用。在加入mpCD溶液之前预先用相应的化合物处理该静息态A431细胞至少40分钟。
25图29显示粘附在波导生物传感器上CH0细胞层的DMS0诱导的剂量响应和 时间依赖性响应。在20XDMS0，观察到4个事件(A)由于DMSO溶液刚加入 之后指数明显变化而产生的大的响应信号；(B)可能由于两种液体在孔中混 合而产生的小的减弱的信号；(C)可能由于DMSO渗入并替代细胞内的生物液 体而导致的缓慢而稳定的增强的信号；和(D)由于高浓度DMSO的毒性引起的 细胞蛋白质或其它生物分子的损失而导致的长时间的减弱的信号。
图30显示粘附在波导生物传感器上的A431细胞层的DMSO诱导的剂量响 应和时间依赖性响应。所观察到的响应与在CHO细胞层上观察到的类似。
图31A显示培养于他205光学波导生物传感器上具有不同覆盖率(30%、 50%和90%)的CHO细胞层的入射耦合光的强度，它是入射角的函数。耦合模 式是横向磁场(TM。)模式。图31B:使用TM。模式计算了半最大值峰宽，并作 为CHO细胞覆盖率的函数作图。
图32A和32B显示培养在波导光栅传感器上覆盖率分别为5%和75%的CHO 细胞层的TM。模式共振峰。图32B:加入DMSO (最终浓度为18%)后不同时间 记录的共振峰谱。右图中的虚箭头显示DMSO处理后25分钟峰变宽并开裂。
图33显示全部传感器的TM。模式共振带图象，其中各传感器覆盖有不同覆 盖率的CHO细胞层(如图中所示)。所示图象为用缓冲液(第2栏)和18% DMSO (第l栏)处理25分钟后获取。
图34显示全部传感器的TM。模式共振带图象，其中各传感器覆盖有相同覆 盖率( 95% )的CHO细胞层。该图象在用缓冲液(第2栏)和不同浓度的腿SO (第1、 3栏，如图所示)处理25分钟后获取。环表示 15%的DMSO对CHO 细胞的毒性所诱导的峰分裂。
图35A和35B显示培养在波导光栅传感器区域上和该区域之外的CHO细胞 的相衬度成像(phase contrast image)。
图36A显示CH0细胞(培养在恥205光学波导生物传感器36小时)的TM0 模式的入射耦合光(incoupled light)的强度，它是入射角的函数。初始接 种的细胞数量不同，用以研究CH0细胞的增殖速率。耦合模式是横向磁场(TMo) 模式。图36B显示使用TM。模式计算得到的半最大值的峰宽，并将其绘制成CHO 最初接种数量的函数。
图37显示波导管光栅生物传感器上，不同最初细胞接种数量，CH0细胞增 殖的监测。观察到全部传感器TM。模式共振图象的形状和位置是最初接种细胞数量依赖性的，表明CHO细胞的增殖速率依赖于最初接种的细胞数量。
图38显示表皮生长因子受体(EGFR)信号途径。酪氨酸激酶的表皮生长 因子(EGF)受体家族由四种受体组成RGF-R (ErbBl) 、 ErbB2 (Neu) 、 ErbB3 和ErbB4。 EGFR家族的成员包括细胞质酪氨酸激酶结构域、单一跨膜结构域、 和涉及配体结合和受体二聚作用的胞外结构域。配体与EGFR的结合导致该受 体与其它家族成员形成同型二聚体或异型二聚体。各二聚体受体复合物将通过 召集不同的含Src同源物2 (SH2)效应蛋白来启动不同的信号途径。二聚体化 导致自磷酸化，从而启动不同的一系列的下游细胞信号途径。活化的EGF-R二 聚体复合物与衔接蛋白质Grb (偶联于鸟嘌呤核苷酸释放因子S0S)复合。该 Grb-S0S复合物可直接结合到受体中的磷酸化的酪氨酸位点或通过She间接结 合。这些蛋白质相互作用使SOS非常接近Ras，使得Ras被活化。这然后活化 ERK和JNK途径，继而活化促进基因表达和细胞增殖的转录因子如c-fos、 AP-1 和Elk-l。 EGF^表皮生长因子；EGFR二表皮生长因子受体；Shc = src同源结 构域共有序列；grb2二生长因子受体结合的蛋白2; S0S二哺乳动物"无七之子" (mammalian son of sevenless) ; Raf = Ras活化的因子；MEK=MAP激酶激 酶；MAPK二有丝分裂原活化的蛋白激酶；PI3K二磷脂酰肌醇3，激酶；PIP2 = 磷脂酰肌醇3，4-二磷酸；PIP3二磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸；PIOy二磷脂酶-Y; DAC^二酰基甘油；IP3二肌醇3，4,5-三磷酸；PKC二蛋白质激酶C。
图39显示，与静息态CHO细胞(以CH0表示)相比，EGF-诱导的增殖(以 A431表示)和静息态A431 (以A431-S表示)的P — DMR和N-DMR净响应。
图40显示用不同化合物对饥饿的A431细胞层进行30分钟的预处理对加 入16nMEGF后的时间依赖性响应的作用。化合物的最终浓度为生长激素(GH) 0. 5pg/ml、 PD 98059 0. lraM、 PP1 l(iM、渥曼青霉素0. ljxM和发动蛋白抑制肽 (DIP) 50pM。
图41显示培养在波导生物传感器上的饥饿A431细胞层应答16nM EGF剌 激的P-D服和N-DMR净响应。
图42显示AG1478诱导的静息态A431细胞的EGF-诱导应答的剂量依赖性 抑制。(A)不同浓度的AG1478预处理静息态A431细胞导致32nM EGF诱导的 响应出现剂量依赖性改变。(B) N-D服信号的振幅与AG1478浓度相关。
图43显示Src激酶抑制剂PP1对EGF-诱导的A431细胞的DMR响应的作用。
图44显示Ras/MAPK途径调节物对32nM EGF-诱导的A431细胞响应的作用。
27图45显示蛋白激酶抑制剂对32nM EGF-诱导的A431细胞响应的作用。 图46显示细胞骨架调节物对32nM EGF-诱导的A431细胞响应的作用。 图47显示磷酸二酯酶和其它抑制剂对32nM EGF-诱导的A431细胞响应的 作用。
图48显示使用光学生物传感器观察到的EGF诱导的静息态A431细胞全部 DMR信号的两种主要作用物。细胞在室温(22°C)条件下，EGF在A431中诱导 EGFR内化、细胞形态变化和定向质量再分配。(A)用8nM四甲基若丹明标记 的EGF (TMR-EGF)染色、接着用4'C酸性溶液去掉表面结合的TMR-EGF之后得 到的增殖A431 (10%FBS)的荧光图象。(B)用TMR-EGF染色后的静息态A431 (0. 1XFBS)的荧光图象。(C)染色并用4。C酸性溶液除去表面结合的TMR-EGF 之后的静息态A431 (0. 1%FBS)的荧光图象。(D)使用放大倍数为32倍的荧 光显微镜检测(固定和用得克萨斯红标记的鬼笔环肽染色后)经16nM EGF处 理指定时间的静息态A431细胞。
图49显示EGF诱导的DMR信号的一种可能机制-受体内吞作用的示意图。
图50显示加入皂苷之前和之后粘附在LID传感器表面上中国仓鼠细胞 (CHO)的剂量依赖性响应。
图51显示用不同化合物预处理、接着用皂苷处理之后CHO细胞的实时响应。
图52显示加入化合物之前和之后中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的时间依赖性 LID响应。
图53显示激动剂诱导的GPCR活化导致的物质再分布的不同动力学特征。 图54显示图16所示的阶段3中激动剂诱导的质量变化的化合物依赖性总 响应。
图55显示化合物加入之前和之后中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的时间依赖性 LID响应。所有化合物的使用浓度是lOpM。
图56显示化合物加入之前和之后过表达大鼠毒蕈碱性受体亚型l(因此将 该细胞系称为Ml CHO)的经遗传改造的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的时间依赖 性LID响应。
图57比较了图16所示两种不同细胞系的阶段3的化合物依赖性同响应。 图58显示加入氧化震颤素M (oxotremorine M) (IO幽)之前和之后两种 类型的细胞(CHO和Ml CHO)的时间依赖性LID响应。加入化合物之前，用冊SS
28缓冲液(Invitrogen)("无DIP")或浓度为50|iM的发动蛋白抑制肽(DIP) 预先培育细胞45分钟。
图59显示加入可乐定(IO刚)之前和之后两种类型的细胞(CHO和Ml CHO) 的时间依赖性LID响应。加入化合物之前，用HBSS缓冲液(Invitrogen)("无 DIP")或浓度为5(^iM的发动蛋白滩制肽(DIP)预先培育细胞45分钟。
图60显示加入NECA (IO幽)之前和之后两种类型的细胞(CHO和Ml CHO) 的时间依赖性LID响应。加入化合物之前，用HBSS缓冲液(Invitrogen)("无 DIP")或浓度为50pM的发动蛋白抑制肽(DIP)预先培育细胞45分钟。
图61显示静息态A431细胞贴壁层内GPCR激动剂诱导的定向物质再分布。 与EGF (8nM)诱导的相比，三种GPCR激动剂缓激肽UOOnM)、卡巴胆碱(10 幽)和可乐定(1幽)诱导了静息态A431细胞的时间依赖性响应。(F) IO^iM AG1478预处理对GPCR激动剂和EGF诱导的响应的影响。
图62是显示EGF诱导的EGFR活化机制和G蛋白偶联的受体(GPCR)激动 剂诱导的EFGR转激活的一种可能机制。GPCR激动剂诱导的EGFR转激活还可通 过其它机制实现例如蛋白激酶C途径，或PI3K途径。图61所示的静息态A431 细胞的缓激肽诱导的DMR响应可通过蛋白激酶C途径实现。
图63显示GPCR激动剂诱导的四类光学特征。据使用共振波导光栅生物传 感器实时监测，该光学特征与静息态A431细胞下部的动态物质再分布相关。
(a) Gq型DMR特征，以凝血酶诱导的为例(40单位/ml) 。 (b) Gs型D服特 征，以肾上腺素诱导的为例(25nM) 。 (c) Gi型DMR特征，以a—MSH (oc— 黑素细胞刺激激素)诱导的为例(40nM) 。 (d)净-零D服特征，以神经降压 肽诱导的为例(40nM)。实心箭头(其余图中亦然)表示加入激动剂溶液的时 间。
图64显示腺苷酸环化酶活化剂毛喉素和NKH447诱导的静息态A431细胞 的光学特征。
图65显示用毛喉素和NKH447预处理静息态A431细胞完全消除了 25nM肾 上腺素介导的DMR响应。纯HBSS预处理用作阳性对照。
图66显示启动Gq型特征的激动剂的有效性。分别为ATP (a、b)、 SLIGLR-酰胺(c、 d)、凝血酶(e、 f)和SLIGKV-酰胺(g、 h)作剂量依赖性动力学 响应和相应的饱和曲线。最终的浓度显示在图中。
图67显示启动Gs型信号的激动剂的有效性。分别为肾上腺素(a、 b)、腺苷胺类(adenosine amine cogener) (c、 d)、和NECA (e、 f)作剂量依 赖性动力学响应和相应的饱和曲线。
图68显示a—MSH (ot—黑素细胞刺激激素)诱导的静息态A431细胞的剂 量依赖性动力学响应和饱和曲线。
图69显示低剂量(a)到高剂量(b)的LPA (油酰基-L-oc-溶血磷脂酸) 诱导的光学特征的转变。
图70显示低剂量(a)到高剂量(b)的HTMT诱导的光学特征的转变。将 P-DMR的总振幅绘制成HTMT浓度(c)的函数，从而展示该转变。
图71显示胞内Ca2+水平的最大百分比增加，绘制成PAR激动剂的函数，该 百分比增加根据采用Fluo-3测定的Ca2+的荧光强度测得。
图72显示细胞骨架调节物对lOOnM胰蛋白酶(a)和40单位/ml的凝血酶 (b)介导的D服信号的作用。用于预处理细胞的这些调节物包括红海海绵素A (latrunculinA)、松胞菌素B、鬼笔环肽和诺考达唑(nocodazole)，各自 浓度为lOmM。仅用载体(即HBSS)预处理的细胞用作对照。
图73显示激酶抑制剂对200nm胰蛋白酶(a)和40单位/ml的凝血酶(b) 介导的DMR信号的作用。激酶抑制剂是GF109203x (lOmM)和KN-62 (10mM)。
图74显示YFFLNRP对凝血酶(40单位/ml) 、 SFFLR-酰胺(20mM)和SLIGKV-酰胺(20mM)介导的D服响应的作用，体现为P-DMR振幅，绘制成YFFLNRP浓 度的函数。
图75显示PAR介导的Ca2+信号传递的交叉去敏作用。胰蛋白酶在先处理 后，用凝血酶(a) 、 SFFLR-酰胺(b) 、 SLIGKV —酰胺(c)和缓激肽(d)刺 激A431细胞。另一方面，在用胰蛋白酶刺激前，先用凝血酶(e) 、 SFFLR-酰 胺(f) 、 SLIGKV —酰胺(g)和缓激肽(h)预先刺激A431细胞。凝血酶、胰 蛋白酶、SFFLR-酰胺、SLIGKV—酰胺和缓激肽的最终浓度分别为40单位/ml、 200nM、 20mM、 20mM、和100nM。两次刺激之间的时间间隔大约是6分钟。实心 箭头表示加入溶液的时间(其它图中也指同样的意思)。
图76显示PAR介导的动态物质再分布信号的交叉去敏作用。胰蛋白酶在 先处理后，用凝血酶(a) 、 SFFLR-酰胺(b) 、 SLIGKV —酰胺(c)和缓激肽
(d)剌激A431细胞。另一方面，在用胰蛋白酶剌激前，先用凝血酶(e)、 SFFLR-酰胺(f) 、 SLIGKV —酰胺(g)和缓激肽(h)预先刺激A431细胞。凝 血酶、胰蛋白酶、SFFLR-酰胺、SLIGKV—酰胺和缓激肽的最终浓度分别为40
30单位/ml、 200nM、 20mM、 20mM、和100nM。两次刺激之间的时间间隔大约是1 小时。
图77显示mpCD导致的胆固醇流失对40单位/ml凝血酶(a)和200nM胰 蛋白酶(b)介导的P-和N-DMR信号的振幅的作用。为了比较，图中也包括ocCD (oc-环糊精)的作用。
图78显示PAR信号传递的功能性恢复。在用mpCD除去细胞表面的胆固醇， 并将细胞洗涤后，在各指定时间分别将凝血酶溶液加到孔中。实时记录丽R信 号。各图是7次独立响应的平均值。
图79显示EGF在先刺激对PAR信号传递的影响。(a)胰蛋白酶介导的Ca2+ 活化。(b)胰蛋白酶介导的D服信号。(c)胰蛋白酶介导的DMR响应。最终 的浓度是100nMEGF、 lOOnM胰蛋白酶、和40单位/ml凝血酶。还包括仅用HBSS 预处理的细胞响应，作为对照。
图80显示作为时间的函数的应答lmM过氧化氢的静息态A431细胞的多个
参数。(A)入射角的移动；(B)归一化PWHM; (C)归一化峰值强度；(D)
归一化峰面积。箭头指加入溶液时的时间。
图81显示加入过氧化氢之前和之后粘附在LID传感器表面上的静息态 A431细胞的剂量依赖性响应。
图82显示six抑制剂对lmM HA介导的静息态A431细胞的D服信号的影响。
图83显示静息态细胞的不同氧化还原态对4mM HA介导的DMR响应的影响。
图84显示静息态A431细胞对EGF刺激的响应。(A)作为时间的函数的 入射角的动态移动。(B)作为时间函数的归一化PWHM。 (C)未用TR-鬼笔环 肽处理的A431的肌动蛋白丝的染色模式。(D)用16nM EGF处理15分钟、接 着用得克萨斯红-鬼笔环肽(phalloid)染色的A431的肌动蛋白丝的染色模式。 标杆表示40mM。
图85显示由缓激肽通过缓激肽B2受体信号传递介导的静息态A431细胞 的光学特征TM。模式的共振峰的PWHM (A)和强度(B)。箭头指示加入缓激 肽溶液时的时间。
图86显示作为化合物的函数的检测过程中两个时间点之间的波长改变。 这两个时间点是恰在加入化合物之前(基线点)和加入化合物后5分钟(测量
31点)。两个终点之间的不同反映了缓激肽---种缓激肽B2受体激动剂介导
的P-DMR事件的总振幅。B2受体在A431细胞中内源表达。缓激肽刺激前细胞 已转为静息态。此实施例使用384孔Coring Epic生物传感器平板。各孔含有 覆盖率为 90%的A431细胞。半数孔用100nM的缓激肽处理，而另外半数孔 仅用缓冲液HBSS处理。
图87显示作为化合物的函数的检测过程中两个时间点之间的波长改变。 这两个时间点是恰在加入化合物之前(基线点)和加入化合物后5分钟(测量 点)。两个终点之间的不同反映了凝血酶——一种PAR1受体激动剂介导的P-丽R 事件的总振幅。PARI受体在CHO细胞中内源表达。凝血酶刺激前在DMEM培养 基中培育细胞4小时，这些细胞部分静息态。此实施例使用384孔Coring Epic 生物传感器平板。各孔含有覆盖率为 90X的CH0细胞。半数孔用40单位/ml 的凝血酶处理，而另外半数孔仅用缓冲液HBSS处理。
图88显示作为凝血酶浓度的函数的检测过程中两个时间点之间的波长改 变。这两个时间点是恰在加入化合物之前(基线点)和加入化合物后5分钟(测 量点)。用不同剂量的凝血酶处理CHO细胞。
V.详细描述
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、设备和/或方法之前，应 理解它们并不限于具体的方法或具体的生物技术方法，除非另有说明，或者它 们也不限于具体的试剂(除非另有说明)，因此，它们当然是可以变化的。还 应理解本文所用的术语是仅仅是为了描述具体实施例的目的，而不是为了限 定。
I.定义
在本说明书和附带权利要求书中，单数形式"一"、"一种"和"该"包 括复数形式，除非相关的内容已明确指出不包括。因此，例如，"一种标记物 或剌激事件"包括两种或多种这样的标记物或刺激事件等。
在本文中，范围可以表示为"约" 一个特定值和/或"约" 一个特定值到 "约"另一个特定值。当表示这样一个范围时，另一实施例包括从一个特定值 起算和/或到另一个特定值。类似地，当以近似值表示数值时，通过使用先行 词"约"，将应理解该特定数值构成了另一实施方式。还应理解的是，各范围
32的端点都与另一端点有明显关联，且不取决于另一端点。还应理解的是，本文 公开了大量的数值，各数值在本文中包括该数值本身以及用"约"限定该具体 数值的形式。例如，如果公开了数值"10"，那么"约10"也被公开。还应理 解的是，当一数值公开为"低于或等于"该数值，则"大于或等于该数值"或 这些数值之间的可能范围也被公开，如本领域技术人员所能适当理解的那样。 例如，如果数值"10"公开了，那么"低于或等于10"以及"大于或等于10"
也被公开。还应理解的是，在整篇申请中，数据以不同的形式提供，这些数据 代表了终点和起始点，以及这些数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了
具体的数据点"10"和"15"，那么应理解大于、大于等于、小于、小于等于 以及等于10和15以及10和15之间的数值也应当认为己被公开。还应理解的 是，范围之内的任何数值以及形成该范围的数值也公开，例如，对于10到15 的范围，则认为10、 11、 12、 13、 14邻15都己被公开。
"任选的"或"任选地"指接下来描述的事件或情况可能或可能不发生， 说明书包括所述事件或情况发生的例子以及所述事件或情况不发生的例子。
"粘附(adhere)"和"粘附的"或者这两个词的其它形式指两个物品相 互接触，在它们之间相互具有亲和力，例如粘贴。基底上的细胞贴壁层指一层 细胞，该细胞层例如粘附到该表面上，这样当用缓冲液轻柔洗涤该细胞时，细 胞不会变成不粘附。应理解接触(contact)或此词的其它形式指两种或多种 物品相互接近，以致被视为相互触碰。接触通常不要求粘贴。例如，在没有粘 附的情况下也可发生接触。连接(attach)或此词的其它形式指两种或多种物 品之间的一种比粘附更持久的状态。它并非必须是例如共价连接，但可以是共 价连接。因此，根据两种或多种物品之间的结合的所需强度，接触低于粘附， 而粘附低于连接。应理解这些词具有不同的含义，但除非有明确的相反说明或 本领域技术人员能清楚理解其相反含义，否则这些词语可在本说明书中在它们 所出现的地方交替使用。例如，如果一句子包括"细胞粘附到生物传感器"， 应理解"细胞接触到传感器"和"细胞连接到传感器"也被公开。还应理解存 在多种粘附的、接触的或理解的物品，如细胞或蛋白。
"振幅"可指特定响应的量或大小。例如，生物传感器的输出数据可产生 具有特定振幅如强度的共振峰。
"生物学扩散限制的"指被溶液中分子扩散，和/或分子渗透或被摄取到 细胞中并在到达靶标前在细胞内接着扩散限制的过程。例如，当含有化合物或刺激物的溶液被加到预先存在的用于覆盖粘附在生物传感器表面上的细胞的 培养基中时，该化合物或刺激分子不得不扩散到所产生的混合物(该培养基和 溶液)中，并花费一段时间到达该细胞。之后，根据该化合物或刺激物将与之 相互作用的靶标，该化合物或刺激分子可能不得不花费额外的时间来达到该靶 标，这取决于分子渗入细胞或被细胞所摄取。
"整体系数(bulk index)"指溶液或培养基的绝对折射率，由该溶液或 培养基的组成决定。"整体系数变化"指当两种混合物混合在一起、或者一种 溶液加到一种培养基或另一种溶液中并与之混合时该混合溶液的折射系数(折 射率)所产生的变化。
"导向模式"或"耦合模式"指光耦合进入波导基片的特定模式。在平面 波导中存在两种基本类型的导波(或模式)TEm (横向电场或s-极化)和TMm (横向磁场或p-极化)，其中ra=0、 1、 2……，它是模式编号。由于光学波 导光栅(OWG)生物传感器是一种攸逝波传感器，并且是基于用衍射光栅将光 共振耦合到波导中。两种基本模式可能有不同数量的模式，例如TM。、TM!、TM2…… 和TE。、 TE,、 TE2……。可耦合到波导基片的具体模式依赖于波导的结构和给定 模式的有效折射率，这取决于该模式的攸逝尾随脉冲(evanescent tail)之 中的细胞材料和整体溶液的折射率来测定。
"剂量依赖性响应"通常指随着剌激时间如化合物的加入的变化而变化的 生物传感器输出或生物传感器参数的响应。
"入射耦合光"指用来照射生物传感器从而被耦合到波导膜中的某个带宽的光。
"无标记生物传感器"所公开的组合物、方法和技术的许多方面都涉及 到无标记生物传感器的使用。在本文中，无标记生物传感器指在不需要标记物 如荧光分子的情况下可检测和/或产生产生自细胞内的事件或变化(如物质再 分布)的信号的任何传感器。无标记生物传感器通常包括将细胞中的事件转换 成可定量的信号的光学传感器。这些信号产生可通过多种途径实现。例如，直 接表面传感法包括表面等离子体振子共振(SPR) (Jordan & Corn,"吸附到 化学修饰的金表面上的静电生物聚合物的表面等离子体振子共振图像测量" (Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces) ， Anal. Chem. ， 1997， 69:1449—1456)、光栅耦合器(Morhard等，"在微模式中固定
34抗体以通过光衍射进行细胞检测"(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction) ， Sensors and Actuators B， 2000， 70, 232-242)、 椭圆光度法(Jin等，"基于图像椭圆 光度法以使生物分子相互作用可视化的生物传感器概念"(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions) ， Analytical Biochemistry, 1995， 232， 69-72)、攸逝波 设备(Huber等，"直接光学免疫传感(敏感性和选择性"(Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity) ) ， Sensors and Actuators B， 1992， 6， 122-126)、和反射测定法(Brecht & Gauglitz，"光学探针和 传感器，，(Optical Probes and Transducers) ， Biosensors and Bioelectronics: 1995， 10， 923-936)。通常用于讯问SPR或波导光栅传感器的仪器使用具有 适当光谱或角度内容(angular content)的光束，这样，当该光束被传感表 面反射时，共振角度或波长响应成为输出响应的主要内容。
许多无标记生物传感器是己知的，在本文其它地方描述了它们的例子。无 标记生物传感器的例子包括非接触型生物传感器、不依赖标记的检测性生物传 感器、无标记光学生物传感器、光学非接触型生物传感器、基于光学的生物传 感器、光学生物传感器、不依赖标记的光学检测性生物传感器、基于波导光栅 的生物传感器、光学波导光模式(lightmode)光谱学生物传感器、攸逝波设 备。本文描述并涉及到各种无标记生物传感器及其应用。在涉及具体无标记生 物传感器的内容中描述了无标记生物传感器的一些具体使用方法和模式，以提 供无标记生物传感器及其应用的一些具体实施例。为了避免不必要的重复，涉 及每种类型的无标记生物传感器时不重复提及这些描述。但是，应理解，当在 特定的方法或模式中使用特定的生物传感器时，该使用表示任意无标记生物传 感器都可用于这些方法或模式，除非该使用的相关内容或性质排除了一种或多 种类型的无标记生物传感器。本文所述的任意和所有生物传感器在任意和所有 方法或模式中的这些用途(除非该用途的内容或性质排除了一种或多种类型的 无标记生物传感器)都应视为是具体考虑和已被具体公开。因此，例如，如果 记载了使用特定光栅耦合器生物传感器分析细胞中EGF诱导的EGFR信号传递， 那么应视为也公开了使用任何其它合适的无标记生物传感器分析细胞中的EGF 诱导的EGFR信号传递。因此，例如，使用基于表面等离子体振子共振的生物 传感器分析细胞中的EGF诱导的EGFR信号发出也应当视为己被公开。
35"时间依赖性响应"通常是随着时间而变化的生物传感器输出或生物传感 器参数的响应。
"饥饿培养基"指减弱细胞培养物的繁殖能力的任何培养基。当使用饥饿
培养基培育或培养细胞时，所产生的细胞是静息态的。
本申请参考了各种出版物。这些出版物的公开内容全文纳入本申请作为参
考，以更全面地描述本申请所述领域的技术水平。所公开的参考资料也被单独 或独自纳入本文，包括这些参考资料中包含的该资料所依赖的句子中所讨论的 材料。
II.组合物和方法
所公开的组合物、方法和技术涉及无标记光学生物传感器领域，包括用于 基于细胞的检测和技术的波导光栅基生物传感器。总的来说，这些方法和系统 可涉及直接的光学传感器领域，具体而言，涉及使用不依赖标记的光学检测 (LID)生物传感器(如波导光栅基生物传感器)的系统和方法，用于例如实 时监控活细胞中化合物诱导的物质再分布，包括G蛋白偶联受体(GPCR)激动 机制和拮抗机制、表皮生长因子受体活性、细胞骨架重构、细胞死亡和细胞增 殖，以及细胞信号传递、失敏，和活细胞内的移位，以及贴壁细胞的形态学变 化、细胞脱粘附(deadhension)、细胞移动，和在生物传感器上培养的细胞。 直接光学传感器(DOS)技术指利用光学转换器将分子识别或细胞活动转换成 可定量的信号而不需激活荧光或发光标记物的技术。依赖于这些标记的激活和 然后发射或发光的技术被称为间接光学技术，在所公开的方法的某些实施方式 中也可采用这些技术。还公开的是筛选作用于细胞(如抗细胞上的受体，如GPCR 或EGFR或PDGFR或细胞因子受体)的化合物的活性的方法。
公开了利用无标记生物传感器(如波导光栅基生物传感器)监控和测量定 向物质再分布(DMR)的组合物和方法，该组合物和方法可将此簡R与特定的 细胞状态或细胞时间或细胞活性相关联。应理解，所公开的"细胞-生物传感 器"和"细胞-生物传感器-制剂"可以是本文所公开的任意组合物的组合。例 如，在此公开了一种含有A431细胞、生物传感器和EGF的细胞-生物传感器-制剂组合。
例如，在某些公开的检测中，可使用无标记的光学生物传感器来检测化合 物或化合物或组合物对细胞的毒性或增殖影响，测量例如细胞表面受体(例如受体酪氨酸激酶(RTK)，如表皮生长因子受体(EGFR)或血小板衍生的生长 因子受体(PDGF)、或G蛋白偶联的受体(GPCR))介导的或通过内部信号传 递(如各种信号传递途径或细胞骨架重构)介导的细胞信号转导事件的发生。 本文公幵的无标记生物传感器可用于检测刺激介导的蛋白质靶标移位或底物 聚集，例如向细胞核中，或到膜中，或到细胞质中，或到其它细胞器(如内含 体、内质网(ER)或高尔基体或核)，或在各种再循环途径中，或从胞外被摄 取(如配体结合、基因转染或蛋白质转导、吞噬、内吞等)的移位或聚集。在 其它实施例中，无标记生物传感器可用于监控不同功能性区室中和/或特定微 环境中应答刺激时特定靶标或靶标复合物的再分布，或用于测量特定靶标的从 头合成，或用于检测刺激介导的特定区室或位置的物质释放(如由于激动剂诱 导的Gq偶联受体或Ca离子载体导致的Ca动员)。就此而言，靶标指将被追 踪或作为检测的一部分的分子或细胞组分。在其它实施例中，无标记光学生物 传感器可用于监控靶标分子或靶标复合物(如细菌、病毒、噬菌体、脂质颗粒 或外体颗粒等等)从一个细胞转运到另一个细胞(如通过间隙连接或离子通 道)，或通过例如己知称为胞吞的过程或控制释放过程如凋亡或通过细胞表面 膜上的人造孔的扩散而从周围环境中转运出或转运到该周围环境。某些实施方 式中，采用和鉴定数据收集过程中某时间点，由此可通过收集例如仅仅一个、 两个或三个分开的时间点的数据来完成测定，这些时间点的数据反应预测监控 过程中发生的可能是例如刺激引起的某类细胞事件，这样，可将这些组合物和 方法适用于高通量方法。
在某些实施例中，所公开的组合物、方法和技术涉及基于波导光栅的生物 传感器用于监控作用于生物传感器上贴壁活细胞的化合物的吸附、分布和/或 毒性的的用途及使用方法。
在某些实施例中，所公开的组合物、方法和技术涉及使用给定导向模式的 光学波导光模式光谱学(OWLS)或共振峰谱、或共振带成像与角度的或波长讯 问相组合的筛选细胞增殖的抑制剂或活化剂的方法。这种方法可用于高通量筛 选。
在某些实施例中，所公开的组合物、方法和技术涉及使用给定模式的光学 波导光模式光谱学(OWLS)或共振峰光谱学或的给定模式的共振带成像继续高 通量筛选化合物毒性的方法，以及涉及本文所述的其它方法。
所公开的组合物、方法和技术可使用基于光学的生物传感器来监控作用于
37生物传感器上贴壁活细胞的化合物的吸附、分布和/或毒性。在另一实施例中， 所公开的组合物、方法和技术提供了筛选或监控作用于粘附在光学传感器上多 个可空间寻址区域之上或单个孔中的多个生物传感器之上的多种类型的细胞 的化合物的吸附、分布和/或毒性的方法。
所公开的组合物、方法和技术公开了一种实时的和无标记的检测，用于化 合物吸附、分布和/或毒性筛选和表征。这些方法可用于多种不同检测(如 ADME/Tox、功能性检测)中，且实际上可将多种不同的检测整合成一个检测模 式。
在某些实施例中，所公开的组合物、方法和技术提供了无标记的测量，这 种测量适用于高通量筛选化合物对细胞增殖的作用。在某些实施例中，所公开 的组合物、方法和技术利用给定模式的光学波导光模式光谱学(OWLS)或共振 峰光谱学或给定模式的共振带成像而不是单独使用波长或角度改变来高通量 地筛选细胞增殖的抑制剂或活化剂。这种方法利用了一给定传感器的入射耦合 峰的半最大值峰宽(PWHM)依赖于细胞密度的关系。在所公开的组合物、方法 和技术的某些实施方式中，微板内所有传感器的入射耦合共振带的图像可在同 一时间采集，并作为高通量手段用于根据它们对细胞增殖的作用而筛选化合 物。
公开了使用光学生物传感器筛选细胞信号发出途径的调节物的方法。这些 方法可用于细胞表面(例如RTK或GPCR)以及用于细胞内发生的信号发出事件。
公开了使用光学生物传感器筛选细胞骨架组分的调节物的方法。这些方法 以测量细胞骨架组分的调节物诱导的大分子从透化细胞中释放为基础。具体而 言，这些方法利用特定的化学物质或生物物质(如皂苷、链球菌溶血素0等) 使活细胞的质膜具有足够孔隙，从而使细胞内的可溶性蛋白质散逸。用破坏细 胞骨架的调节物处理细胞导致生物分子进一步释放，其中包括随后被细胞骨架 封锁蛋白质和RNA，结果导致可由光学生物传感器检测到的物质流失。
提供了光学生物传感器以及怎样以不同的配置和组合使用它们的讨论，所 述光学生物传感器如无标记光学生物传感器，如光学波导光模式光谱学和波导 光栅及生物传感器。接着讨论了物质再分布和这种物质再分布是如何与光学生 物传感器相关。还提供了关于可使用本文所述的光学生物传感器进行示例性细 胞检测的讨论，以及这些检测的增加和修改，如首先使用无标记光学生物传感 器进行检测，但接着将特定类型的标记物偶联到检测中的一种或多种试剂，之
38后可将该试剂用于第二个或另外的检测。
公开了可用于进行可进行化合物筛选和表征的无标记功能性细胞检测(如
基于GPCR的细胞检测)的方法。所公开的方法允许技术人员在不需要遗传工 程加工细胞以使其过表达感兴趣的受体的情况下研究活细胞内的内源性GPCR， 虽然在某些实施方式中优选使用过表达感兴趣GPCR的细胞以获得高敏感性和 最佳的检测结果。
所公开的方法能够使用单个传感器或多个传感器实施多个基于细胞的检 测，以比较化合物对源自不同亲代细胞或相同亲代细胞的至少两种不同类型的 细胞(即给定的特定类型的细胞)的功能。这些方法的优点包括提高了通量。
公开了可使用单个传感器或多个传感器实施多个检测的方法，以证实在特 定细胞靶标参与了所测量的刺激引起的信号传递或细胞事件。这些方法可使用 具有至少两个不同区域的单个传感器 一个没有修饰，而另一个具有修饰；或 者可使用在相同区室或分开的区室中的至少两个传感器 一个没有修饰，而另 一个具有修饰。传感器的修饰区域例如可具有印刷或沉积的点，该点含有试剂 /基因或干扰RMA (RNAi)或反义寡核苷酸或反义/反基因肽核酸(PNA)或蛋白 质或抗体，这样当细胞在这些区域上培养并覆盖这些区域时，粘附的细胞或摄 取这些试剂/物质，并被转染。这些方法被称为定位表面介导的转染。 一旦被 这些物质转染，细胞中的特定靶标就会通过表面介导的基因转染或蛋白质送递 过表达，或通过反义/反基因抑制或RNA干扰或剔除或抗体阻断而被下调。本 文至少将US2004/0023391A1和US 6， 544, 790中细胞送递方法中所涉及的物质 纳入本文作为参考。定位表面介导的转染使得可检测具有或不具有特定靶标的 特定类型细胞的刺激诱导的响应。定位表面介导的转染可视为是一种刺激事 件。因此，本方法可用于证实特定细胞靶标是否参与到使用无标记光学生物传 感器测量的信号或细胞事件中。可采用现有技术的方法将物质沉积或印刷到传 感器表面上，这些现有技术方法包括但不限于接触型印刷，如针式印刷技术 (US5807522 A或US6101946 A)或微印记方法(美国专利5， 731， 152)、毛细 分配设备(美国专利5,807,522)和微滴定设备(美国专利5,601,980)，或 非接触型印刷，如压电驱动的印刷或微米/纳米分配设备(US6656432 Bl、 EP0895082 Bl或US6399396 Bl)。
公开了利用多个穿透深度实施基于无标记生物传感器的细胞检测的方法。 此外，公开了可让技术人员以单一或多项检测模式进行这些检测的设备。根据0WLS， TM模式的PWHM变化要比TE模式的PWHM变化对表面不均匀性 更敏感。当细胞开始在表面上普展时，PWHM增加，在约50%细胞覆盖率时达 到最大值，之后衰减到最初水平。
如本文所公开的，已显示可实时监控化合物对接近细胞一传感器界面的高 度铺满的细胞层的吸附、分布和毒性，如使用光学生物传感器测量得到的化合 物毒性诱导的波长或角度改变所证明。
公开了研究用光学生物传感器测量的反应性氧物质(R0S)的细胞功能的 方法。此外，公开了评估培养的细胞的氧化还原状态的方法，以及筛选影响培 养的细胞的氧化还原状态以及ROS信号传递的调节物的方法。反应性氧物质是 诸如过氧化物之类的分子、诸如次氯酸盐离子之类的离子、诸如羟基之类的基 团，以及同时是离子和基团的过氧化物阴离子。具有氧化其它物质的能力的物 质被认为是氧化性的，称为氧化剂。氧化剂通常是具有高氧化数元素的化学物 质(如H202、 Mn04—、 Cr03、 Cr2072—、 0s04)，或者是可通过氧化物质而获得一个 或两个额外电子的高负电性物质(02， 03， F2， Cl2， Br2)。反应性氧物质通过 几种不同的机制形成(1)离子化辐射与生物分子的相互作用；(2)作为细 胞呼吸的不可避免的副产物(如一些电子通过呼吸链从主通道中逃逸(尤其在 它们通过辅酶Q时)而直接将氧分子还原成过氧化物阴离子)；(3)在噬菌 细胞如嗜中性粒细胞和巨噬细胞(如NADra氧化酶(在两种类型的噬菌细胞中)； 或髓过氧物酶(仅在嗜中性粒细胞中))中由指定的酶合成。R0S是必需的， 但重要的是限制R0S生产不能过度，因为R0S在细胞中执行重要的功能。例如 (1)甲状腺细胞必须生产过氧化氢，以在甲状腺素的合成中将碘原子连接到 甲状腺球蛋白上。(2)巨噬细胞和嗜中性粒细胞必须产生ROS，以杀死它们通 过噬菌作用吞噬的一些类型的细菌。(3)嗜中性粒细胞(而不是巨噬细胞) 也通过使用髓过氧物酶而将吞噬的致病原杀死，该酶催化过氧化氢(产生自过 氧化物阴离子)与氯离子的反应，产生强的杀菌剂次氯酸盐离子。(4)许多 生物能量通过氧化还原反应被保存和释放。光合成涉及二氧化碳还原成糖，和 水氧化成分子氧。逆反应，即呼吸，则将糖氧化，产生二氧化碳和水。作为一 些中间步骤，还原的碳化合物被用来还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)， 后者则对质子梯度的产生有贡献，该质子梯度驱动了三磷酸腺苷(ATP)的合 成，并通过氧的还原得以维持。在动物细胞中，线粒体执行类似的功能。术语 氧化还原态通常用于描述生物系统如细胞或器官中NAD+/NADH和NADP+/NADPH
40的平衡。氧化还原态表现为几组代谢物(如乳酸和丙酮酸、0-羟基丁酸和乙 酰乙酸)的平衡，这些代谢物的相互转换依赖于这些比例。多种有害的情形下 会产生异常的氧化还原态，如缺氧、休克和脓毒症。应理解，此段落所讨论的 所有分子、化合物和组合物的流动和作用都可用本文所述的方法鉴定，或将它 们用于本文所公开的方法中。
公开了检测靶标家族成员(如CPGR、 RTK和其它)之间以及不同靶标类别 之间(如CPGR和RTP之间)的交叉通话(cross communication)的方法。细 胞相互之间需要沟通，而不管它们离得近还是远。胞外信号传递分子调控细胞 之间的相互作用。基本的机制需要一个配体(信号传递分子)与其受体相互作 用，从而将胞外信号转化成胞内信号。此过程被称为信号转导，可以几种形式 出现。首先，如果信号需要传遍整个生物体，则信号传递分子被分泌到血液中。 例如，内分泌信号传递要求细胞合成和分泌激素到循环系统中。然后，该激素 被质膜上或胞质内的特定靶细胞蛋白(受体)识别。其次，在其它情形中，信 号需要在局部发挥作用。例如，旁分泌信号发出分子(局部介体)可由相邻的 细胞释放，通过ECM局部扩散，然后刺激邻近的靶细胞。例如，生长和分化因 子被认为主要作为旁分泌信号分子起作用。沟通的第三种形式是神经信号发 出。这种类型的信号传导可长距离发生，但其传递是通过称为轴突的长细胞过 程实现。神经元信号可作用于靶细胞或其它神经元细胞。信号通过轴突如电脉 冲一样传递，到达轴突末端后，它被转换成称为神经递质的化学信号。第四类 信号转导是所有信号转导中距离最短的。它通常不需要释放分泌的分子。例如， 接触依赖性信号传递要求在锚定于信号传递细胞的质膜上的信号传递分子与 嵌埋于靶细胞的质膜内的受体分子结合时完成转导。接触依赖性信号发出还可 以以细胞与胞外基质相互作用的形式发生。由于其特化的功能以及其有限的受 体，各细胞能够对有限的一组信号作出应答。此外，各细胞对信号分子可作出 不同的应答。在这种情况下，例如，神经递质乙酰胆碱可刺激一种类型的肌肉 细胞收縮(骨骼)或抑制另一类型的细胞的收縮(心脏)。乙酰胆碱还可刺激 某些细胞分泌它们分泌小泡的内容物。或者，类似的受体可激活不同的胞内信 号传递途径，或着，配体结合不同的受体。在一线性模型中可以看到信号传递 途径是这样的信息的主流连续地从受体通过中间步骤的线性链到达特定的功 能细胞。但是，由于细胞生物学很复杂，信号传递不是线性的信息流，取而代 之的是，由刺激介导的信号传递由大量的指令构成，这些指令由涉及扩散步骤的反馈(可扩散反馈系统)相连接，或与信号发出蛋白和/或支架蛋白的复合 物物理连接。例如，可在正反馈环和负反馈环中看到可扩散反馈指令，钙和肌 醇三磷酸受体籍此调节胞质钙浓度。这些正反馈环和负反馈环在信号传递的交 叉沟通中起重要作用。例如，已证明许多促有丝分裂GPCR的信号传递以负反 馈途径或正反馈途径与EGFR信号发出交叉沟通。这些GPCR的活化也导致相同 细胞中EGFR通过蛋白激酶C或作为衔接蛋白质的P —抑制蛋白而活化。
公开了基于至少两个终点测量值高通量筛选抗特定靶标或一类靶标的调
节物的方法。
a) OWLS在监测细胞死亡中的应用
本发明组合物、方法和技术公开使用给定模式的光学波导光模式光谱学或 共振峰谱或共振带成像来高通量筛选化合物毒性。公开了适用于使用基于光学 的生物传感器高通量筛选化合物毒性的测量方法。可使用所公开的方法、组合 物和技术来监测细胞或细胞群的健康状况。术语"健康状况"指细胞生存能力 和细胞功能方面的总体状态。当其健康状态受损时，细胞有多种表现行使如 细胞分裂下降，细胞功能如蛋白质或mRNA生产下降，细胞信号传递下降，和/ 或例如与细胞死亡相关的蛋白质增加。以往，采用检测细胞膜完整性，或特定 耙蛋白(如线粒体脱氢酶)的功能，或特定基因产物的合成，或DNA或RNA中 标记核苷酸的惨入，或细胞核中染色体完整性的荧光染色方法或其它方法来评 估细胞健康。在某些实施方式中，这些方法利用了给定传感器的入射耦合峰的 半最大值宽度(P冊M)依赖于细胞密度、细胞死亡情况和由于化合物毒性而被 改变的细胞层不均匀性的关系。化合物毒性导致在波导膜表面上形成三种细胞 种群，分別是活的、受影响的和死亡细胞。所产生的表面不均匀性增加导致共 振峰变宽，甚至分裂。共振峰变宽和分裂可作为化合物毒性的特征。可在细胞 接触化合物后的某个时间收集共振峰谱或整个传感器共振图形，并进行分析。
所公开的组合物、方法和技术提供了监测作用于培养于光学传感器上的细 胞层的化合物的吸收、分布和毒性的方法。这些方法可涉及使用光学生物传感 器实时测量细胞层在应答给予细胞或与细胞一起培养的化合物时由于物质再 分布而发生的角度或波长改变。这些方法可用于研究细胞毒性和凋亡的动力学 和机制。还公开了高通量方法。
422. 监测细胞死亡的髙通量方法
在某些实施方式中，这些方法利用可同时监测多个波导光栅生物传感器， 和/或可获得多个生物传感器的给定导向模式的共振峰谱，和/或可展示多个生 物传感器的给定导向模式的共振带图像的光学讯问系统。例如，对于光学角度 讯问系统，可参见2003年6月24日提交的美国专利申请号10/602,304 (2004 年12月30日公开，公开号为US-2004-0263841) 、 2004年12月21日提交的 美国专利申请11/019,439和N. Fontaine等的美国专利申请"光学讯问系统 和2 — D传感器阵列方法"(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) (2005年4月5日提交)，所有这些文献的全文(至少 关于生物传感器及其用途方面的内容)被纳入本文作为参考。
美国专利申请号10/602,304 (公开号US-2004-0263841) 、 2004年12月 21日提交的美国专利申请11/019， 439和N. Fontaine等的美国专利申请"光 学讯问系统和2 — D传感器阵列方法"(2005年4月5日提交)提供了一发射 系统和一接收系统，该发射系统用于产生一阵列的光束，各光束以 200WnX 3000Wn的照射面积照射RWG传感器，该接收系统用于接收由这些传感器反射的 光束的角度显示的所有响应。此系统允许例如7X7孔传感器以3秒的速率同 时釆样(图l显示了一个例子)。这意味着96孔微板中96份样品的细胞健康 评估可在几秒内完成。2004年11月18日N. Fontaine等提交的美国申请 10/993， 565和Y. Fang等于2005年4月5日提交的"消除位于微板中的波导 光栅基生物传感器和所得的微板之间的色亮度干扰的方法"(METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE)(两者的全文(至 少涉及生物传感器、扫描设备以及微板的内容)纳入本文作为参考)的另一示 例性系统使用阵列式光纤来产生阵列式光，这样各束光照射一个生物传感器， 并从接收来自该生物传感器的响应；且该系统使用受控扫描模块依次收集来自 单个传感器内多个区域以及来自多个生物传感器的响应。该系统可在约30秒 内完成细胞健康状态评估。
3. 基于光学的生物传感器
基于光学的生物传感器已被用来检测各种生物分子之间的相互作用，包括 寡核苷酸、抗体-抗原相互作用、激素-受体相互作用、和酶-底物相互作用。描述使用光学无标记技术进行基于细胞的检测的报告相对较少。例如，已使用 光学波导光栅基生物传感器来研究动物细胞的粘附可扩展(J.J. Ramsden，等，
"动物细胞的粘附和扩展动力学"(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells) ， Biotechnol. Bioeng. 1994， 43， 939-945);和已使用表 面等离子体振子共振(SPR)来研究配体诱导的活细胞的胞内反应(M. Hide,等，
"使用表面等离子体振子共振基生物传感器实时分析活肥大细胞的配体诱导 的细胞表面禾口胞内反应，，(Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface ancMntracellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor) ， Anal. Biochem. 2002， 302， 28-37)。 基于光学的生物传感器通常由两个组件构成高度特异的识别元件和将分 子识别事件转换成可定量的信号的光学转换器。直接表面传感法包括表面等离 子体振子共振(SPR) (Jordan & Corn,"吸附到化学修饰的金表面上的静电 生物聚合物的表面等离子体振子共振图像测量"(Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces) ， Anal. Chem. ， 1997， 69:1449-1456)、 光栅耦合器(Morhard等，"在微模式中固定抗体以通过光衍射进行细胞检测"
(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction) ， Sensors and Actuators B， 2000， 70， 232-242)、 椭圆光度法(Jin等，"基于图像椭圆光度法以使生物分子相互作用可视化的 生物传感器概念，，(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions) ， Analytical Biochemistry, 1995， 232， 69-72)、衰减波设备(Huber等，"直接光学免疫传感(敏感性 禾口选择性，， (Direct Optical Immimosensing ( Sensitivity and Selectivity) ) ， Sensors and Actuators B， 1992， 6， 122—126)、禾口反身寸 测定法(Brecht & Gauglitz，"光学探针和传感器"(Optical Probes and Transducers) ， Biosensors and Bioelectronics, 1995， 10， 923-936)。 通常用于讯问SPR或波导光栅传感器的仪器使用具有适当光谱或角度含量
(angular content)的光束，这样，当该光束被传感表面反射时，共振角度 或波长响应成为输出的响应中的主要内容。 一个共有特征是SPR和光栅耦合器
(即0WG或RWG)技术都对传感器表面上或附近的折射率变化敏感。
这种技术作为生物传感器的一个主要应用是原位监测不同表面特征和不
44同溶液特征条件下特定分析物的界面行为。此技术允许无标记检测，这与大多 数需要特异性标记以读出相互作用的信号的当前技术不同。与标记相关的缺点 是标记不仅仅需要大量的劳动和成倍，而且还潜在地干扰靶生物物质或化合物 的生物学性质，使数据解译困难，而且还可能在检测中产生错误信息。但是， 如本文所公开的，当使用无标记展示技术时，或当标记与本文所公开的无标记 技术结合使用时，可减少这些缺点。还应理解的是，本文所公开的任意传感器 可以各种方式使用，包括例如以多路复用的方式使用，当使用多孔板如修饰的 96孔微板时就可实现多路复用(multiplexing)。如本文所公开的，无标记生 物传感器如RWG或OWG生物传感器可与细胞结合使用，并监测细胞的活动。细 胞可培养在生物传感器上，这样所培养的细胞粘附到生物传感器，与细胞在常 规的平板上培养并粘附到平板的底部表面非常相似。当细胞培养在所公开的传 感器上时，生物传感器的输出会改变。图1显示一例培养在该系统上的细胞的 输出。图2显示光学波导光栅传感器。在此图中，细胞培养在传感器的上面。 当光源如激光以各种角度射向传感器时，在一组特定的角度，光将耦合到传感 器中。在其它角度，光将直接反射，或者透过传感器。如本文所述，在细胞操 作如刺激细胞表面上的受体之后，在细胞内发生物质再分布。这种物质再分布 引起许多事情，其中之一是改变光耦合到传感器中的角度。这种角度变化可用 来鉴定细胞中发生的事件，且应理解，如本文所描述的，基于细胞内发生的物 质再分布，就生物传感器相关的输出而言，特定的事件具有特征特征。
与通常需要标记和长的培养步骤的常规细胞增殖检测不同，所公开的组合 物、方法和技术的某些实施方式提供了不需要任何标记物的基于给定导向模式 的光学波导光模式光谱学(OWLS)或共振峰光谱学或给定导向模式的共振带成 像的方法。此外，在某些实施方式中，所公开的组合物、方法和技术消除了任 何额外处理步骤，包括试剂反应和洗涤步骤。此外，在某些实施方式中，所公 开的组合物、方法和技术如细胞增殖检测可在不存在或仅存在感兴趣的化合物 的标准培养条件下实施，而不会有几乎所有常规方法通常所需的任何其它试剂 的干扰。其它试剂的存在可导致检测结果的错误解读(J.J. Ramsden，等， "动物细胞的粘附和扩展动力学"(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells) ， Biotechnol. Bioeng. 1994， 43， 939—945);因为这些试 剂本身可能对细胞增殖有直接的影响(M. Hide,等，"使用表面等离子体振 子共振基生物传感器实时分析活肥大细胞的配体诱导的细胞表面和胞内反应"(Real—time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntracellularReactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance—BasedBiosensor) ， Anal. Biochem. 2002， 302， 28-37)。待筛选的化合物可能对这些试剂而不是细胞增殖有影响。例如，直接抑制细胞线粒体脱氢酶的化合物可能抑制MTT转化，从而在使用MTT筛选针对另一感兴趣的特定靶标时导致假阳性。
在某些实施方式中，所公开的组合物、方法和技术提供了超高通量筛选方法，用于找出抑制剂和活化剂，这与当前其它的无标记细胞增殖检测不同(包括涉及实时测量细胞增殖导致的角度和波长转移的光学波导传感方法)。由于细胞增殖通常是个缓慢的过程(如这个过程需要许多小时、天甚至周)且通常需要在37'C培养，除了本文公开的检测之外的无标记增殖检测(通常在室温采集信号)难以实现高通量筛选。
本文公开的方法可提供准确的测量值，而不需要额外的试剂，且这些方法易于使用，并易于与其它功能性筛选整合。例如，可能不需要保存或操作放射性物质或其它物质(如光敏感性荧光化合物)。
虽然其他人已使用光学波导基生物传感器来进行细胞增殖检测，但他们使用光学波导基生物传感器来监测，就给定数量的起始细胞，不同浓度化合物存在下的粘附而导致的传感器波长改变(Cunningham, B.T.等，"BIND系统的无标记检测，，(Label-Free Assays on the BIND System) ， J. Biomol. Screening2004， 9， 481-490，和美国专利申请出版物US20030068657 Al，"进行使用比色共振反射光学生物传感器的检测的无标记方法"(Label-free methods forperforming assays using a colorimetric resonant reflectance opticalbiosensor) ， SRU Biosystems LLC的Lin， Bo等)。在某些情况下可使用这些方法检测化合物对细胞增殖的ICs。值。但是，这些方法并不像本文所公开的方法那样适用于高通量筛选。如本文所公开的，基于波导的生物传感器可不仅可用于监测活细胞中由G蛋白偶联的受体(GPCR)或受体酪氨酸激酶如EGFR的活化导致的激动剂诱导的定向物质再分布，而且还可用于研究导致定向物质再分布的信号传递途径或细胞机制。
a) OWLS和细胞毒性
根据0WLS，波导表面上的模式和不均匀性可导致入射耦合峰谱变宽，并产生细微结构。不再是传感器上均匀表面固定化所产生的各模式的尖锐共振峰，实验上和理论上观察到的具有生物物质或材料不均匀附着的传感器的细微结构包括但不限于与各模式的主共振峰一同出现的至少一个肩峰(即第二个峰)，和各模式的明显分开的双(或更多个)峰(见Horvath, R.等，"用于光学波导光模式光谱学应用的波导表面上的模式和不均匀性的影响"(Effect ofpatterns and inhomogeneities on the surface of waveguides used foroptical waveguide lightmode spectroscopy applications) ， Appl. Phys.B. 2001， 72， 441-447; Voros， J. 、 Graf, R.等，"基于光学波导技术的在线毒理学传感器的可行性研究"(Feasibility Study of an OnlineToxicological Sensor Based on the Optical Waveguide Technique)，Biosensors & Bioelectronics 2000， 15， 423-429，这些文献纳入本文作为参考)。先前，研究者已观察到，细胞在波导上附着和铺展期间，入射耦合峰变宽，同时光栅上规则的微结构造成峰的迁移和分裂。共振峰的变宽已被用作为细胞粘附和扩展的指印。
4.光学生物传感器和细胞中的物质再分布
通常用于讯问SPR或波导光栅传感器的仪器使用具有适当光谱或角度含量的光束，这样当该光束被传感表面反射时，共振角度或波长响应在输出响应中是占优的。具体而言，用作传感器的平面光学波导由基底、波导膜和覆盖介质构成，其中该覆盖介质是将通过测定折射率而表征的物质。该基于平面波导的生物传感器可用来检测随着在该波导中传播的电磁场延伸到周围介质中成为攸逝电磁场时该波导周围介质中的变化(深度指渗透渗透或感测容积)。当在传感容积内发生物质再分布时，观察到响应变化，反映为反射光束中的角度或光谱变化。可测量角度变化以获得物质再分布响应信号的动力学。此外，由于上述原因，不同的细胞响应将对总的物质再分布信号作出不同的贡献。例如，在传感器表面上或附近细胞与胞外基质脱离，因此，这种脱离所产生的响应明显大于发生在细胞内而产生的响应。
生物细胞是复杂的结构，其组分的大小范围从几纳米到几十微米，如图9所述。细胞由含有各种细胞器的细胞质(通常为5-30幽)构成。最大的细胞器是细胞核，其大小通常为3—10pM。细胞核里具有DNA —蛋白复合物和蛋白质，最重要的是染色质。线粒体是小的细胞器，含有一系列折叠的膜，大小通
47常为0. 1-1. 5jim。其他细胞组分包括内质网(ER)(通常为0. 1 —l|im)、溶酶 体(通常为0. 2-0. 5pm)、过氧物酶体(通常为0. 2-0. 5^)，内含体(通常 100nm)，和高尔基体。
a)基于光学波导光束的表面传感技术
可交换使用共振波导光栅传感器(RWG)和光学波导光栅(0WG) 。 RWG生 物传感器是一种攸逝波传感器，以光通过衍射光栅谐振耦合到波导之中为基 础。基于RWG的表面传感技术利用了攸逝场的优点，它在波导表面之外的穿透 不超过一个波长，从而在给定谱带宽上对固定化的化学或生物分子的吸附作出 选择性应答。
光学LID生物传感器的一个例子(如图10的1004)是SPR传感器1004或 基于波导光栅的传感器1004。也可使用其他基于光学的生物传感器，例如椭圆 光度法设备、衰减波设备和反射测定法设备。关于这两者类型的光学LID生物 传感器的结构和操作的更详细的讨论在美国专利4,815,843 ("选择性检测气 体、液体、固体和多孔样品中的物质和/或折射率变化的光学传感器"(Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples)) 和K. Tiefenthaler等的"集成光学开关和气相传感器" (Integrated Optical Switches and Gas Sensors, Opt. Lett. 10， 第4期， 1984年4月，pp. 137-139)提供，本文将他们的全文，至少是关于生物传感器 的材料，纳入作为参考。尤其是2005年7月20日提交的美国专利申请 60/701,445 ("无标记高通量生物分子筛选系统和方法"(Label-Free High Throughput Biomolecular Screen System and Method))禾口 N. Fontaine等 于2004年12月21日提交的美国专利11/019,439 ("光学讯问系统和2 — D传 感器阵列方法"(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) ) (2005年4月5日提交)中公开的光学生物传感器，所有这些都被 全文(至少关于生物传感器及其用途)纳入作为参考。 一
(1)对称波导光栅生物传感器
对称波导光栅生物传感器的一个例子是光栅耦合器或耦合的生物传感器。 光栅耦合的生物传感器的例子可见Jordan & Corn,"吸附到化学修饰的金表面上的静电生物聚合物的表面等离子体振子共振图像测量"，Anal. Chem.，1997， 69:1449-1456; Morhard等，"在微模式中固定抗体以通过光衍射进行细胞检测"，Sensors and Actuators B， 2000, 70, 232-242;和Tiefenthaler,K.和W. Lukosz，"作为集成光学化学传感器的光栅耦合器的灵敏性"(Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemicalsensors) ， J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220。所有这些文献的全文(至少涉及光栅耦合的生物传感器的材料)纳入本文作为参考。
光栅耦合器生物传感器是以光通过衍射光栅谐振耦合到波导中为基础的攸逝波传感器。光栅耦合器传感器由波导和衍射光栅构成。图2a显示了一种典型的四层波导生物传感器，它由位于较低折射率XI737玻璃的ns=1.50)的基底之上的高折射率(NbA的np^2.36 )、厚度为dF的薄膜构成。固定在波导膜上的是折射率(nA)在1.4左右、厚度为dA的生物物质贴壁层，在整个传感器结构顶部的是覆盖介质，为折射率(ne)大约为1.5的生物溶液。在此常规构型中，波导薄膜的折射率至少比低折射率基底的折射率高1%，例如，高1%、 5%、 10%、 20°/。、 30%、 50%、 70%或100%。低折射率基底的折射率比覆盖介质的折射率高(例如)5%、 7%、 10%、 15%、 20%、 30%或50%。用于细胞基检测的覆盖介质(通常是水性介质)的折射率通常大约为1.32、 1. 35和1.38。
平面波导中的导波或模式是TEm (横向电场或s-极化)和TM (横向磁场或P-极化)，其中m二0、 1、 2……，它是模式编号。给定导向模式指例如TM。、TE。、 TMh TEt等。激光以各种角度照射波导，光仅在导向模式的有效折射率所确定的特定角度(称为N)耦合到波导中。由于光模式的攸逝尾随脉冲在基底和覆盖介质中传播(但仍沿着该膜)，光模式同时经历并感知所有介质。这意味着行进中的光模式所经历的折射率是三种折射率的加权混合值。有效折射率N可根据以下四层波导的模式方程计算出数值，假设薄贴壁层的厚度低于光的波长(必《入)(Tiefenthaler, K.和W. Lukosz，"作为集成光学化学传感器的光栅耦合器的灵敏性"J. Opt. Soc. Am.B， 1989， 6， 209-220)，则该方程可写成以下形式
49<formula>formula see original document page 0</formula>(1)
其中，k=27t/L X是导向光的真空波长，CJ是模式类型数，对于TE等于1，对于TM模式则等于O。
如果通过表面起伏光栅(surface-relief grating)耦合到波导中，N可由入射耦合角度计算
(±)W = iV。,.r sin(6>)+/A/A ( 2 )
其中，Nair=1.003，指空气的折射率；e指空气中测量的入射角；入指波长；
A指光栅周期(grating period) ; /=±1、 ±2……，为衍射级。此方程左侧
的加减号分别指导向模式以+ z和-,方向传播。
150.光栅区域中波导内的诱导的有效折射率变化AN导致Ae变化，如以下
方程所述
腊Uos(丰6f (3)由于激光耦合到波导膜的平面并平行于该平面传播，这就在邻近界面的液体中产生了电磁场(即攸逝波)。攸逝波的振幅(Era)随着与该界面之间的距离d的增加而指数性减弱
、A2V J
其中，
^ 1-(T ,如 )2+(W/"c)2-1「 (5)
是高强度波导模式进入覆盖介质中的穿透深度。
如果满足两个条件，那么，给定模式类型仅作以导波形式传播(a)波导膜的折射率得至少不周围基底和覆盖介质折射率大1%;和(b)波导膜的厚度大于很好限定的值，即阈值厚度dc:
《=—
鹏+arctan
f"L-"L、 J 〔"》-"L
、05、、 (6)
*《J5 , ,其中，Nmin=min{ns，nc;^。 nmM=max{ns,nc}。已知当膜厚度接近阈值厚度时，模式的有效折射率N接近nmax。此外，方程5暗示，在阈值厚度，具有较大折射率的膜那一侧穿透深度趋向无穷大，而在另一侧穿透深度将是有限的。在这种情况下，dw也是无限的。
50再次，当波导光栅生物传感器为常规的波导构型时，光在波导传感器中传播产生的指数性衰减的攸逝波场仅能以高强度渗透到覆盖介质50-200nm的深度。这一数值依赖于界面上存在的介质的折射率、照射波长以及光栅结构。当入射角等于临界值(critical value)时，c^趋向无穷大，折射光的波阵面与表面垂直。
考虑到四层波导具有以下参数nF=2.37 (Nb20s层)，ns=1.51 (1737玻璃)，nc=1.333 (水溶液)，nA=1.37 (细胞)，dA = 500nm (培养的细胞的平均厚度)，dF=157nm,波长830nm，光栅周期530nm，我们得到(1) TE。模式的阈值厚度为27nm、TM。的为69nm, TM^莫式的为252nm、 TM1模式的为294nm，表明这种传感器仅支持TR。和TM。模式；(2) TEO的穿透深度为78nm、 TM0模式的为112nm。这意味着(1)我们仅监测细胞贴壁层底部，如图2a细胞内部的虚箭头所指示的；(2)当靶标或复合物较接近传感器表面时，与它们与传感器表面较远相比，某些质量的靶标和复合物更能影响到总响应，如图4所示。图4显示渗透到介质中的攸逝波的强度随着距离增加而指数性减弱。由于较高敏感性的缘故，本申请中大多数示例采用TM。模式，除非另有说明。
(2)反对称波导光栅生物传感器
在前述具有常规构型的波导传感器中，基底折射率(如玻璃基底，通常ns 1.5)通常高于水性覆盖介质的折射率(通常 1.33)。在这种对称波导传感器中传播的光的指数性衰减的攸逝波场渗透入覆盖介质不深(通常 50-200nm)。基底一侧的攸逝波尾随脉冲比覆盖介质一侧的更长更强。这限制了对分析物的响应，因为敏感性依赖于分析物粘附层中传播的模式能所占的分数。将模式的特征(profile)反转有可能克服这种限制，并允许较大(较长)的穿透深度，从而可分析形态学或胞内组分。Horvath等(US20030109055A1和Horvath， R. 、 Lindvold， L, R.和Larsen， N. B.的"水溶液中反对称波导传感的证明，，("Demonstration of Reverse Symmetry Waveguide Sensing inAqueous Solutions" ， Applied Physics B， 2002， 74， 383—393，其中的文献纳入作为参考)已证明所谓的反对称波导的可行性。反对称波导的原理以使波导基底的折射率低于覆盖波导膜的介质的折射率(即，对于水溶液，通常为1.33)为基础，如图2a所示。如图5所示，可通过三种不同的几何构造实现反对称(1)沉积在具有微观结构的支持物上的薄的波导薄膜；(2)沉积在中孔或纳米孔支持物上的薄波导薄膜，其中这种纳米孔基底的折射率大约为 1.15;和沉积在纳米结构化的支持物上的薄波导薄膜。通过使用这些反构型， 当膜厚度接近这两种波导的阈值厚度时，覆盖介质穿透深度明显超过常规波导 的穿透深度。此外，通过控制膜厚度，探测深度可以得到控制，且可无限增大。
(3)光学检测系统
在某些实施例中，当使用光学波导生物传感器时，光学检测系统可以是角 度讯问、波长讯问或由它们的变形而来的系统，例如阵列式角度讯问系统或扫 描波长讯问系统(2004年11月18日N. Fontaine等提交的美国申请10/993， 565 和Y. Fang等于2005年3月31日提交的"消除位于微板中的波导光栅基生物 传感器和所得的微板之间的色亮度干扰的方法"，两者的全文(至少涉及生物 传感器、扫描设备以及微板的内容)纳入本文作为参考)。2003年6月24曰 提交的美国专利申请号10/602,304 (2004年12月30日公开，公开号为 US-2004-0263841) 、 2004年12月21日提交的美国专利申请11/019,439和 N. Fontaine等的美国专利申请"光学讯问系统和2 — D传感器阵列方法" (OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) (2005 年4月5日提交)，所有这些文献的全文(至少关于生物传感器及其用途方面 的内容)被纳入本文作为参考。
可用于构成微板中含特定构型0WG生物传感器的平板的例子是96孔康宁 Epic生物传感器微板，其中各孔含有嵌埋于玻璃支持基底底部表面中的光学波 导光栅(OWG)生物传感器。
由于受导模式的攸逝波场投入到覆盖的液体中的缘故，波导模式对覆盖环 境极度敏感。当在波导表面上发生细胞事件时(例如生物材料从能透过的细胞 中控制释放)，由于质量损失，导致覆盖介质的折射率发生变化，根据Maxwell 电磁方程，波导模式的传播常数也必然变化。因为上述波导光栅结构的相期匹 配(phase matching)条件，入射光的优选耦合角度(或波长)必然随着波导 传播常数的变化而变化。可监测这些宏观的物理变化来指示微观的细胞事件。
b)光学波导光模式光谱学(OWLS)理论
光栅耦合器生物传感器是以光通过衍射光栅谐振耦合到波导中为基础的 攸逝波传感器。受导模式完全通过内部反射在平面波导中传播，可将此描述为Z型波。在通过一个完整Z字形后，只有对给定波导结构和固定的极化和波长，
普通波与两次反射波之间的相差才是膜中光的波矢((3)的5C要素的函数。通过自洽性标准测定，P值可根据以下模式方程计算(Horvath, R.等，"用于光学波导光模式光谱学应用的波导表面上的模式和不均匀性的影响"，A卯l. Phys.B. 2001， 72， 441—447):
<formula>formula see original document page 53</formula>(7)
其中，A-》r/丄；i是导向光的真空波长；p是导向类型数，TE模式中等于1， TM模式中等于0。 nF、 ns和n。分别是膜、基底和覆盖介质的折射率。波导中模式传播方向是X， m = 0、 1、 2……，它是第m种波导模式的模式指数。在Z形波长模型中，各光线代表一个平面波(P.K. Tien.，"检测光路和光线波导中新的波现象，，(Integrated Optics and New Wave Phenomena in OpticalWaveguides" ， Rev. Mod. Phys. 1977， 49， 361)。如果光耦合到波导中，则仅需要考虑Z形波击中膜表面的那些点的耦合，以及可使用简单的光线光学的那些点的耦合。
如图3所示，假设一个Z字波期间的相移是$ (p) ， n个Z字形之后的波振幅(An ( P ))将是几何级数的
(8)
其中
和
表示虚数单位，和G(y )=
_i
0(aj二2加，ot = 0,1,2…,.
(9)
(10)
假设整个光栅长度都被照射，则耦合长度L等于光栅长度，完整Z字波的总数n可用下式计算以角度OC。照射光栅，则产生具有P。的波导模式
A) =H',sin("o)+2"/A (12)
其中n&是空气的折射率，A是光栅周期。由于光栅和激光束的限定宽度， 当用平面波以角度oc。照射光栅时，可使用平面波分布来描述衍射的光。由此达 的到在P。处的一个峰，根据光学不确定性原理计算得到其半最大值峰宽(PWHM) 约为2tt/L (Tiefenthaler, K.和W. Lukosz，"作为集成光学化学传感器的光 栅耦合器的灵敏性"，J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220)。
n个节段之后的耦合光的强度(/n (P ))与光的振幅的绝对平方成正比
|G () |2=IG ()。耦合光强度/ (a)和入射角(也可使用光学波导光模
式光谱学(OWLS)技术测定)之间的关系可使用下述方程计算
/(")=J/d(y9，or)/GWK (13)
其中/a (P,oO是一级衍射的强度分布。
sin(0.5Z</ - z 、 2"、、 ,m(") + 丁))(14)
sin(c、2-、 。+s
c)纵向物质再分布和横向物质再分布
活细胞高度活跃，大多数细胞器，例如响应信号传递分子或途径的活化， 在细胞内广泛运动。例如，微管可长距离转运细胞器。 一个刺激可导致被致密 包裹的细胞器在细胞于其上培养的传感器表面的很外围的区域做亚微米级的 移动，这种移动导致细胞内的物质再分布。可将应答信号刺激的这种移动称为 "转运"或"移位"或"再分布"。这种转运或移位或再分布事件通常与物质 再分布有关。可使用光学生物传感器检测物质再分布，并将与物质再分布相关
的信号称为定向物质再分布(DMR)信号。
由于刺激可导致细胞内容物在三维方向动态再分布，因此通过入射角或波 长的变化来监测细胞响应对于使用生物传感器进行细胞传感而言可能是不够
的。为了简化分析，可将动态物质再分布分成两种类型纵向物质再分布，发
生在与传感器表面垂直的方向上；和横向或水平物质再分布，发生在与传感器 表面平行的方向上。应理解，特定的刺激事件可引起这两种物质再分布之一或两者。
如入射角或共振波长的动态变化所暗示的，DMR信号主要是由于发生在垂
直于传感器表面的方向上的细胞内容物的再分布，因为传感器对平行于传感器
攸逝波方向的物质再分布最敏感。这种DMR也称为纵向物质再分布。具体而言， 在平行于传感器表面且垂直于传感器攸逝波方向上发生的刺激事件诱导的物 质再分布可导致细胞层内质量均匀性发生变化，从而导致共振峰、共振带图像 和/或0WLS谱发生变化。可检测这些变化，并用作刺激事件或化合物对刺激事 件诱导的细胞响应的作用的特征。该物质再分布被称为横向物质再分布。
如图2和3所示，细胞直接在共振波导管光栅(RWG)生物传感器表面上 培养。外源信号介导了特定细胞信号传递的活化，在许多情况下导致细胞内容 物的动态再分布，相当于动态物质再分布。当D服发生在传感容积(即攸逝波 的穿透深度)范围内时，它会被显示出来，从而被RWG生物传感器实时监测
到---种对传感器表面附近局部折射率变化敏感的无标记技术。由于其可测
量多个参数的能力，生物传感器具有为细胞传感提供高信息内容的潜力。这些 参数包括角度变化(最常见的输出中的一种)、强度、半最大值峰宽(PWHM) 和共振峰的面积。此外，由于我们的角度讯问系统的独特设计(该系统使用 200WnX3000um的光束照射各传感器)，各传感器的共振带图像可提供其它有 用的信息整个传感器不同位置上的细胞的细胞状态(如密度和粘附程度)的 一致性以及细胞响应的均匀性。
RWG生物传感器利用光通过衍射光栅共振耦合到波导中而产生的攸逝波。 由于只有基底-膜和介质-膜界面上的内部反射，被导光可视为传播方向都平行 于波导的一种或多种光模式。波导的折射率比其周围基质的折射率高。因为被 导光模式具有覆盖所有层的横向振幅，各模式的有效折射率W是所有层的折射 率的加权和
W = /w("F,"s,"c,"w,A，《d,义，M,cr) (15) 其中，nF、 ns、 ne和r^分别是波导、基底、覆盖基质和细胞贴壁层的折射
率。dp和cU分别是波导膜和细胞层的有效厚度。X是所使用的光的真空波长。M
=0、 1、 2……，它是模式数。a是模式类型数，对于TE (横向电场或s-极化)
它等于l，对于TM模式(横向磁场或p-极化)它等于l。
由于细胞与表面相互作用的性质和细胞结构和功能的复杂性的缘故，贴壁
细胞的光学传感是独特的和非常有挑战性的。已知一些类型的细胞可粘附在表面上，主要通过三种类型的接触焦点接触、邻近接触和胞外基质(ECM)接 触。焦点接触是粘附的细胞膜的狭窄区域(如0.2 pMX10 nm)与基底表面的 距离在10—15nm。邻近接触指细胞膜区域与基底的距离在l一50nm，而ECM接 触指细胞膜区域与基底的距离为100nm或更远。因此，人们可以理解传感器仍 可感测覆盖基质，即使细胞覆盖率很高( 95%)。但是，已知活细胞含有 70%的水，并且，在哺乳动物细胞内，大多数胞内生物大分子通过丝状网络而 高度组织化，它们在空间上被限制在适当位点上。此外，细胞的高度通常超过 入射光的波长(在此 i二830mn)，而穿透深度通常远小于细胞的高度。因此， 用于细胞传感的生物传感器可视为是一种三层构型基底、波导和细胞层。
可由三层波导管的给定模式的模式方程计算有效折射率N的数值 (Tiefenthaler， K.和W. Lukosz，"作为集成光学化学传感器的光栅耦合器 的灵敏性"，J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220):
-卜')2+ arctan—ro2—《-
U，-w2j」("cj u，-H —
(16)
其中，波矢a-^t辺/;l。
被导光模式平行于平面波导管的表面传播，产生延伸进入膜两侧低折射率 介质的电磁场(即攸逝波)，该电磁场的特征是指数性衰减。攸逝波的振幅(&)
随着与界面的距离Z增加而指数性衰减
(17)
g巾
、7 _ i-",如"J2+(W/"J—(18)
是波导管模式的攸逝波尾随脉冲深入覆盖介质的穿透深度。基于所使用的 生物传感器的构型和细胞性质的独特性，本文所用的TM。模式的穿透深度是 120nm，意味着我们仅监测细胞的底部。
蛋白质和/或分子集合体的移位常见于许多外源信号启动的细胞响应。移 位使得可对特定靶标引起的细胞信号发出的振幅、持续事件以及动力学进行准 确控制。此外，有时，外源刺激还可引起细胞状况例如粘附程度和细胞骨架结 构发生变化。当这些变化在传感容积范围内时，模式折射率N由于覆盖介质和 攸逝波尾随脉冲之间的相互作用被改变。
对垂直于传感器表面但平行于导向模式的攸逝波尾随脉冲的方向上的细 胞内容物再分布(称为纵向物质再分布)，假定给定时间用光探测的细胞的粘
56附程度和构型相似，则可将贴壁细胞的底部分成多个相同间隔且均匀的薄层。 各层具有各自的折射率仏，且离传感器表面的距离为&(图2b)。因为单位面 积^视为是恒定的，并由光学生物传感器的空间分辨率所确定，因此所有的层 可视为具有相同的体积，其中该空间分辨率受限于入射光的物理大小以及被导 波在波导中的传播长度。细胞内给定体积的折射率主要由生物分子(主要是蛋
白质)的浓度决定(Beuthan J， 0. Minet， J. Helfmann， M. Herrig和G. Muller. ， 1996，"生物细胞中折射率的空间变化"(The spatial variation of the refractive index in biological cells ) ， Phys. Med. Biol. 41:369-382):
",="。+ C, (19)
其中n。是溶剂的折射率，它是恒定的，大约等于细胞中的水的折射率。a
是比折射系数增量，对于蛋白质而言大约是0.0018，对于细胞中的其他溶质如
钠而言是0.0016。 G是层i中的溶质的浓度(g/100ml)。虽然蛋白质和其他
溶质的折射系数增量类似，但是各层的折射率仍主要受到蛋白质的影响，这是
因为蛋白质的浓度(以每体积重量计)远远大于其他溶质。因此，均匀层i的
折身寸率变化A'近似形成一个分片连续函数(piece-wise continuous function):
A",=aAC, (20)
传感容积内的加权折射率变化」仏是J仏与加权因子exp (-z/AZ。)的积分
乂Jz
(21)
从z二0到Z二①积分，在用式(7)取代A"(z)并进行重排后，我们得到
Awe = AC,
CC 一C C
(22)
由于在大多数情况下Z1"。是生物传感器传感的细胞的折射率的一小部分
(通常低于20%)，因此对于第一阶(order)，有效折射率的变化是
AA^S(C)A"c (23)
其中，S (C)是对覆盖介质(即细胞)的敏感度
TV
c 一w广
JV2 《
(24)
dw是有效波导厚度，由下式计算:
57《# = A十Z
(25)
将方程9和ll代入方程12，得到以下检测信号的方程:
A -Zw
緒=&
TV
Az广
2
JV2
.1
(26)
方程26表明(i)有效折射率的变化以及由此导致的与所测入射角变化相关的光学特征主要对传感容积内的纵向物质再分布敏感；(ii)有效折射率的变化直接是刺激介导的蛋白质重新定位而导致的蛋白质浓度变化的函数，而不是离子运动如Ca2+流入和Ca2+流出的函数；(iii)与远离传感器表面相比，
靶标或某些物质的复合物向传感器表面的重新定位对总响应贡献更大；(iv)
光学特征是一整合的信号，它是离开传感器表面不同距离处发生的物质再分布的作用之和。由于细胞信号传递的复杂性，同不同靶标介导的不同细胞信号传
递的活化可能产生类似的总DMR信号。但是，由于参与特定信号传递的是一组独特的细胞靶标，用一组预定选择性抑制剂组介导进行抑制的方案提供了一种将特定刺激活化的细胞信号传递的特异性进行分类类的方法。
如上面所讨论的，当细胞应答刺激时，入射角度或共振波长的改变主要由传感容积内纵向物质再分布来决定。由于生物传感器的横向分辨率差的缘故，横向物质再分布可能难由这些改变来分辨。但是，因为光束和激光束的限定宽度，因此当用平面波以角度oc。照射光栅时，可使用平面波分布来描述衍射的光，如RWLS理论部分所讨论的。当没有任何贴壁层存在时，由此发现P。处一个PWHM约为2兀/L的峰(根据光学不确定性原理计算)。使用这些方程构建的模型获得了有趣的发现，这些发现表明共振峰(或谱)的形状带有关于物质分布的横向不均匀性的有价值的信息。这种横向不均匀性不强烈扰乱覆盖介质的折射率，但明显改变了共振峰的形状。
已知某些外源信号可引起单细胞和多细胞水平的显著的不对称横向物质再分布。例如，不同群体的细胞可对对细胞有毒性的化合物发出不一致的应答，而单个贴壁细胞在一些细胞过程中(如细胞迁移和浸润)可经历某些细胞靶标或分子集合体的不均匀分布。我们假定，当不对称横向物质再分布发生时，该再分布还可导致共振峰的细微结构和形状发生改变。
d)细胞信号传递和细胞生理学中的动态物质再分布
活细胞由复杂的和动态的蛋白质丝状网络构成，该网络称为细胞骨架，在
58真核生物细胞的整个细胞质中延伸。细胞骨架参与执行不同的细胞活动，例如为维持细胞形状提供抗张强度，为信号传递和通信提供"途径"或"泊位"，和为细胞运动、胞内转运和细胞分裂提供力量。有三种细胞骨架纤维肌动蛋白纤维、中间纤维和微管，各自执行不同的生物学功能。在这些纤维中，肌动蛋白纤维高度集中在质膜之下，因为它们保持细胞形状、形成细胞质凸起，并参与-一些细胞与细胞或细胞与基质的连接、信号转导和肌肉收缩。
已知在哺乳动物细胞中，大多数的胞内生物大分子通过纤维网络基质高度组织化，并在空间上定位于相应的位置。此外，细胞蛋白质的定位受到紧密控制，以调节蛋白质相互作用的特异性和效率，从而在空间上隔开蛋白质活化和灭活机制，并确定特定的细胞功能和应答。在应答刺激时，根据信号传递的性质及其网络相互作用、细胞状况和细胞内容物，常常会发生细胞蛋白质的再定位，这种再定位有时是显著的。蛋白质和分子集合体的再定位不仅对于细胞信号传递是重要的(通过实现精确控制信号的振幅、持续时间和动力学)，而且对于细胞功能如迁移、侵入、生长、周期、分化、生存和死亡也是重要的。
一个很好的例子是G蛋白偶联受体(GPCR)信号传递。GPCR是膜结合蛋白质超家族。在未刺激细胞中，内源GPCR主要位于细胞表面上。在接触配体后，细胞作出应答，产生受到胞内信号传递和调节机制紧密和精确控制的一系列时空事件。这些事件导致GPCR信号发出周期期间有序的、有引导的、定向的和动态的细胞内容物再分布。监测细胞内容物的动态再分布已提供了关于GPCR信号传递方面的认识，并提供了一个有力的筛选GPCR的手段。例如，激动剂刺激后P2-肾上腺素受体-GFP偶联物再定位的直接展示引起了将这种方法作为直接筛选策略的兴趣。这些通信试验(trafficking assay)中的一种是得自Xsira Pharmaceuticals Inc (其前身是Norak Biosciences) 的Transfluor技术。这种技术使用高分辨率荧光成像来监测响应某化合物的荧光标记的抑制蛋白的胞内定位。荧光标记的抑制蛋白的再定位可视为是激动剌激的指示。
许多这类事件在细胞的底部发生(这可由光学生物传感器得以证实)，结果产生了与动态这类再分布(DMR)相关的光学信号。DMR信号是活细胞的新的生理学响应。理论分析表明，由入射角或波长转移所示的光学特征主要对传感容积中的纵向物质再分布(称为DMR)敏感，而涉及共振峰的形状(如半最大值峰宽、强度和面积)的光学输出参数则对剌激诱导的横向物质再分布敏感。由于透入细胞层的攸逝波尾随脉冲的指数性衰减，与靶标或某些物质的复合物远离传感器表面相比，当这些靶标或某些物质的复合物更接近传感器表面时，
它们对总响应的贡献更大。此外，向着传感器表面移动的靶标或某些物质的复
合物的再定位导致信号增加，而远离该表面移动的靶标或复合物的再定位则导
致信号下降。 -
已发现，通过特定靶标介导的D服信号依赖于细胞状况如粘附程度，和细
胞状态(state)(如增殖和静息态状态)。由于传感器共振峰的宽度或位置
对细胞密度和活力敏感，因此可检测可能显著影响检测结果的细胞的生物学状
况(status)(如细胞活力、细胞密度和粘附程度)，由此提高检测的再现性。定性评价一种给定方法是否适合系统生物学应用的三项主要内容是多元
化能力、多参数分析的能力以及定量系统应答特征(profile)的能力。由于光学生物传感器是无标记的和非侵入性的，因此基于生物传感器的细胞检测能够多元化。例如，A431中，激动剂诱导的内源缓激肽B2受体(P2Y受体)以及蛋白酶活化受体(PAR)的活化产生类似的Gq-型光学特征(图66)。此外，由于光学生物传感器提供了多响应的整合，特定靶标介导的DMR信号传递还可用于表征其下游的信号传递靶标。例如，A431中EGF诱导的DMR可用来表征耙向其下游耙标之一的MEK1的化合物(图44)。这些结果表明基于生物传感器的细胞检测具有多元化特性。
光学生物传感器为分析配体诱导的DMR响应提供了多个参数。这些参数包括对纵向物质再分布敏感的反射光角度或波长改变、和定义主要对横向物质再分布敏感的共振峰形状的参数。这些参数的组合还可提供关于配体对所检测的细胞的作用的详细信息(例子显示在图80、 84和85中，其中图80涉及反应性氧物质信号传递，图84涉及EGFR信号传递，图85涉及缓激肽132信号传递)。此外，由于生物传感器是非侵入性的，因此基于生物传感器的细胞检测可容易地与其它技术整合，例如与质谱和荧光成像整合。这些技术还可证实化合物或配体对细胞的作用。
特定靶标介导的DMR信号是一种整合的可定量的信号，它是得自离传感器表面不同距离的位置上发生的物质再分布的作用之和。由于细胞信号传递的复杂性，不同靶标介导的不同细胞信号传递的活化可能产生类似的总DMR信号。但是，由于参与特定信号传递的是一组独特的细胞靶标，用预定选择性抑制剂介导抑制的方案提供了一种将特定刺激活化的细胞信号传递的特异性进行分类的方法。因此，可将DMR响应视为独特的和理想的读出数据，用于活细胞的系统生物学研究(例子显示在涉及EGFR信号传递的图38-47和涉及A431细胞PAR信号传递的图71-79中)。这些研究显示，对不同靶标的调节导致EGF诱导的DMR信号的不同减弱。在应答表皮生长因子(EGF)刺激时，发现静息态A431细胞的DMR响应对于EGF浓度是可饱和的，且能够完全被特定的强效EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478所抑制。各种已知抑制剂/药物对静息态A431细胞的DMR响应的作用主要将细胞响应与主要通过MEK进行的Ras/有丝分裂原活化的蛋白(MAP)激酶途径联系起来。
5.细胞检测
公开了光学无标记生物传感器进行任何细胞检测的用途和方法，例如检测细胞死亡、检测细胞增殖、检测受体活化或抑制、检测细胞膜完整性、检测脂质体信号传递、检测细胞信号传递、检测反应性物质信号传递、评估细胞氧化还原态的检测、研究不同靶标之间的交叉通话的检测、使用终点测量值的高通量化合物筛选试验、以及检测核信号传递或活性，或者例如检测细胞骨架重构。这些检测使用到一个或多个生物传感器输出参数，所述参数可用于形成该检测的特征或可用来根据检测以及一个或多个步骤作出决定。
生物传感器可产生的不同形式的输出值，例如像素、角度改变或波长改变。该输出值可是输出数据的形式，该输出数据是一种输出信息，是就一组特定条件采集的数据，可保存或实时分析。当使用时，生物传感器产生数据输出，该数据输出通常以图形的方式呈现，例如响应单位与时间相关的图(作为一个例子，可见图6A以及本文公开的许多其它附图)。当使用角度讯问检测系统时，响应单位可以是角度变化(以度计)，或当使用波长讯问检测系统时，响应单位是波长改变(以皮米计)，或当使用利用CCD照相机的角度讯问检测系统来采集生物传感器的共振带图像时，响应单位是像素位置迁移(以像素计)。此外，当采用给定模式的共振峰谱时，响应单位可以是作为入射耦合角(见图6B)或波长的函数的入射耦合光的强度。在另一实施方式中，当使用利用CCD照相机的角度讯问检测系统来采集生物传感器的共振带图像时(见图6C)，响应单位可以像素中的位置或位置强度。生物传感器输出参数或生物传感器输出数据参数分别是生物传感器输出值或输出数据的任意特征，可测量这些特征，并可使用它们分析生物传感器输出值或生物传感器输出数据。在某些实施方式中，生物传感器输出参数还可以是可鉴定的并可在多个检测中通用的特征。特征可
61以是任意的生物传感器输出参数或参数组合，可作为特定检测的表征。例如，特征可采用刺激事件后峰值强度，或可以是刺激事件后峰值强度的位置，或可以是半最大峰值强度的位置。该信号然后可用于例如比较两种不同化合物对细胞培养物的影响，或单个化合物对两种不同的细胞培养物的影响，而不是用于比较全部输出数据。因此，特征可出现在单个时间点或单个波长或单个波角度或它们的任意组合，这取决于所检测的是什么(见上述关于响应单元的讨论)。
a)生物传感器输出参数
图6描述了可使用的大量不同的生物传感器输出参数。例如，定义细胞内刺激诱导的定向物质再分布的动力学的六个参数可以是总动态(即形状)，响
应阶段(在此具体实施例中，有三个涉及细胞响应的主要阶段正向物质再分
布(P-DMR，图6A的C点到D点)、净零定向物质再分布(net— zero DMR，图6A的D点到E点)和逆向物质再分布(N-DMR，图6A的E点到F点到G点))，各阶段的动力学、总持续时间，P-画R阶段和N-鹿R阶段两者的总振幅，和P-D服阶段到N-D服阶段的过渡时间t (图6A)。其它生物传感器输出参数可由共振峰获得(图6B)。例如，可使用峰位置、强度、峰形状和半最大值峰宽(P冊M)(图6B)。生物传感器输出参数还可从生物传感器的共振带图像获得。使用阵列式角度讯问系统获得数据，这些数据阐述另外5种特征带形状、位置、强度、分布和宽度。对于使用本文所公开的生物传感器的任意细胞检测的任意给定应用，所有这些参数可分别或一起使用。任意亚组或组合中这些参数的使用可为给定检测或特定检测中的给定变化提供一特征，如细胞受体检测的特征，以及为之后的基于EGF受体的检测提供特定的特征。
(1)与剌激诱导的定向物质再分布动力学相关的参数
有大量的生物传感器输出参数与刺激阶段的DMR的动力学相关。这些参数着眼于对细胞施加刺激事件时生物传感器数据输出发生变化的速率。刺激事件是可改变细胞状态的任何事件，如将分子加到培养基中、从培养基中除去分子、温度变化或pH变化、辐射细胞。刺激事件可产生刺激效果，这种效果可以是刺激事件导致的细胞的任意效果，如定向物质再分布。刺激事件可以是化合物、化学的、生化的或生物学的以及聚合物。生化的或生物学的刺激事件可以是肽、合成肽或天然肽。例如，许多不同的肽以信号分子起作用，包括促炎肽缓激肽、紧张肽。虽然这三种蛋白质的序列和生理学不同，且通过不同的细胞表面受体起作用，但是它们具有同一类细胞表面受体，即G蛋白偶联的受体(G0CR) 。 GPCR的其它多肽配体包括血管升压素、催产素、促生长素抑制素、神经肽Y、 GnRH、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺素、增食因子(orexins)、硬骨鱼紧张肽II、内啡肽、脑啡肽以及其它配体。GPCR是一广谱且多样的基因家族，它们不仅应答肽配体，还应答小分子神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺和肾上腺素)、光、臭气物质、味道、脂质体、核苷酸和离子。GPCR使用的主要的信号传递机制是与与下游次级信使系统(包括胞内钙释放和cAMP生产)相连的G蛋白GTP酶蛋白相互作用。肽GPCR使用的胞内信号传递系统与所有GPCR使用的那些系统类似，通常根据它们与之相互作用的G蛋白以及所活化的次级信使系统将它们归类。对于Gs偶联的GPCR，受体引起的G蛋白Gs的活化刺激了下游的腺苷酸环化酶活化和cAMP的生产，而Gi偶联的受体则抑制cAMP的生产。cAMP生产的一个关键结果是蛋白酶A的活化。Gq偶联的受体刺激磷脂酶C，释放IP3和二酰基甘油。IP3结合ER中的受体，引起胞内钙释放，结果活化了蛋白激酶C、钙调蛋白依赖性途径。除了这些GPCR次级信使信号传递系统外，GPCR途径还表现出与包括酪氨酸激酶生长因子受体和map激酶途径在内的其它信号传递途径的串话。受体酪氨酸激酶如EGF受体或粘着斑复合物(focal adhesion complex)的转激活可通过衔接蛋白Shc、 Grb2和Sos以及下游Map激酶活化的Erkl和Erk2来刺激ras活化。Src激酶还可在ras和map激酶途径中通过GPCR起到必需的中间角色作用。
发生一些剌激事件而数据输出没有发生变化是可能的。这种情况仍旧是一种刺激事件，因为细胞的状态已经以某些可能已导致定向物质再分布或导致细胞或细胞培养物发生变化的方式发生了改变。
应理解，可如本文所公开的测定任意检测或任意细胞状态的特定特征。本文公开了许多不同检测的"特征"，但对于本文所实施的任意检测，该检测的"特征"可被测定。任意给定的检测可存在一种以上的"特征"，而各特征都可如本文所述被测定。在采集生物传感器输出数据并考虑一个或多个参数后，可获得给定检测的信号。可能需要进行多个实验，以鉴定最佳的特征，且也可能需要在不同条件下进行实验，以找出最佳的特征，但这都是可以实现的。应理解，本文所公开的任意方法可具有"鉴定"或"测定"或"提供"例如加给
63这些方法的特征的步骤。
(a) 总体动态
可以考虑的一个参数是数据输出的总动态学特征。该总动态学参数观察数 据收集的全部动力学图像。可观察的总动态学的一个方面是数据输出随时间而 产生的曲线形状的改变。因此，数据输出产生的曲线形状在发生剌激事件后可 能变化或维持不便。
变化的方向表明整个物质分布；例如，正向DMR (P-DMR)阶段表明在传感 器的攸逝波尾随脉冲内的质量增加；净-零DMR表明传感器攸逝波尾随脉冲内 质量几乎没有净值变化；而逆向DMR表明传感器攸逝波尾随脉冲内质量净值降 低。使用光学生物传感器获得的刺激诱导的细胞响应的总态可由单阶段(P-DMR 或N-DMR或净-零DMR)、或两阶段(如两个阶段可以是这三个阶段的任意组合)、 或三阶段、或多阶段(如在时间过程中可出现一个以上N-DMR)组成。
(b) 响应阶段
可观测到的作为时间的函数的另一参数是数据输出中出现的阶段变化。无 标记生物传感器产生可作图(将是一曲线)的数据输出。该曲线将在例如数据 从增加状态转变为减少状态或从减少转变为增加的数据处具有拐点。这些变化 称为阶段过渡，发生的时间以及它们的形状可用作例如生物传感器输出参数。 例如，存在正向物质再分布(P-DMR)、净零定向物质再分布(net — zeroDMR) 和逆向物质再分布(N-DMR) 。 P-DMR、 N-画R和NZ-DMR的振幅可分别测量为生 物传感器输出参数(例如可参见图6A和图7)。
(c) 动力学
另一生物传感器输出参数可以是数据输出的任意方面的动力学，例如，完 成阶段过渡的速率；例如，阶段过渡多快能够完成或数据输出花费多长时间结 束。可测量的动力学的另一例子是全部阶段的数据输出所花费的时间长度。另 一例子是一个或两个P-DMR和N-DMR阶段的总持续时间。另一例子是获取一个 或两个P-DMR和N-DMR阶段的总振幅所需的速率或时间。另一例子是从P-D服 到N-D服阶段的过渡时间T (图6A，其它图也提供了所有这些类型的动力学参 数的许多例子)。也可测量P-DMR和N-DMR事件或阶段两者的动力学。例如，用表皮生长因子(EGF)刺激人静息态人表皮样癌A431产生了由至少三个阶段 组成的动力学响应，如图6A和7A所示。如图6A和7A所证明，EGF浓度越高， P-DMR和N-函R两者的信号振幅越大，P-DMR和N-DMR事件也都越快，从P-DMR 到N-DMR事件的过渡时间也越短。当P-DMR事件的振幅显示与EGF浓度具有复 杂的关系时，N-DMR信号的振幅清楚显示对EGF浓度是可饱和的，产生 1. 45nM 的EC5。(见图7B)。发现以秒计的过渡时间T随着EGF浓度C的增加而指数性下 降(见图7C)。此外，N-画R信号的衰减可用非线性回归拟合。所获得的单阶 段衰减常数K也是可饱和的，产生5. 76nM的Kd (见图7D)。
(2)共振峰相关的参数
给定导向模式的共振峰是一类通过观测例如光强度与光耦合到生物传感 器中的角度，或光强度与光耦合到生物传感器中的波长而产生的数据输出。光 学波导光模式谱是一类观测光强度与光耦合到传感器中角度而产生的数据输
出，这是如下测得的使用多种角度的光照射生物传感器并监测作为角度函数 的耦合光的强度。在此光谱中，多个导向模式的多个共振峰同时出现。由于共
振峰和OWLS光谱所基于的原理相同，因此可交替使用给定导向模式的共振峰 或多个导向模式的OWLS光谱。在生物传感器中，当发生特定波长的光或产生 了以特定角度撞击生物传感器的光时，从光源发出的光耦合到生物传感器中， 这种耦合增强了生物传感器产生的信号。作为耦合光角度或波长的函数的这种 强度变化被称为共振峰(例如参见图6B)。传感器的不同给定模式可产生具有 不同特征的类似共振峰。有大量的定义给定模式的共振峰或共振光谱的不同参 数，这些参数与这种峰相关联可用来评估DMR或细胞效应。下文讨论和这些参 数的一个亚组。
(a)峰位置
当绘制数据输出图时，在例如光耦合进入生物传感器的特定波长或特定的 入射角处出现共振峰的最高峰。由于应答刺激事件而发生的物质再分布或细胞 事件的缘故，峰出现的角度或波长的位置可能发生改变。例如，在特定受体如 EGF受体的潜在生长因子的存在下，培养细胞的共振峰的位置可增加或降低耦 合的角度或耦合的波长，这将导致共振峰的中心位置发生改变。应理解，可测 量峰值强度的位置，而且这个位置也是个很好测量的点，也可测量该共振峰上的任意点的位置，例如测量75%峰值强度或50%峰值强度或25%峰值强度或 66%峰值强度或45%峰值强度(应认为公开了 1一100%峰值强度范围内的所 有水平的峰值强度)的位置。但是，当使用除峰值强度之外的一个点时，总会 有一个在峰值强度之前和一个在峰值强度之后的例如45%峰值强度的位置。因 此，对于任意强度，除了峰值强度之外，峰内总是会存在两个该强度的位置。 可使用这些非峰值强度的位置作为生物传感器输出参数，而人们仅需要知道该 强度的位置是在峰值强度之前还是之后即可。
(b)强度
与共振峰特定强度的位置可用作生物传感器输出参数一样，强度自身的量 也可作为生物传感器输出参数。 一个特别相关的强度是给定模式共振峰的最大 强度。与位置一样，最大强度的大小在对细胞或细胞培养物具有特定作用的刺 激事件存在下可发生变化，且这种变化可可测量并用作特征。与共振峰值位置 一样，也可测量峰内任意强度或位置的共振峰强度。例如，最大强度的50%或 最大强度的30%或最大强度的70%或最大强度的1一100%之间的任意百分数 的强度可用作生物传感器输出参数。同样地，与强度的位置类似，如果使用最 大强度之外的强度，例如45%最大强度，在共振峰内也总会存在两个此强度位 置。与强度位置参数相同，可也使用非最大强度而仅需考虑该强度是最大强度 之前还是之后的强度。
例如，原细胞覆盖率约为50% (在 50%的覆盖率，传感器表面上的细胞 往往产生最大PWHM值)时，抑制剂和活化剂的存在并培养后都会导致覆盖率 覆盖率半最大值峰宽(PWHM)下降；但是，另一生物传感器输出数据，例如总 角度变化(即共振峰中心位置)可用来区分是抑制剂，是活化剂还是根本没有 作用的分子。PW丽是峰上最大强度(高度)的一半处两点之间的连线的长度， 如图6B所示。当所有传感器上的细胞密度基本相同或近乎相同时，与细胞根 本没有被处理的传感器相比，抑制剂(例如细胞增殖的抑制剂)引起的角度改 变往往小于根本没有处理的细胞的角度改变，而活化剂引起的角度改变则往往 大于无处理细胞的改变。如果所有化合物的浓度都相同，则可通过它们对PWHM 值的影响而确定它们抑制(作为抑制剂)或刺激(作为活化剂)细胞增殖的潜 力或能力。结合共振峰中心位置的变化，PWHM变化的预定值可用于筛选出抑制 剂或活化剂。根据用于检测给定模式的共振峰的讯问系统，PW腿值的单位可以
66不同。PWHM变化的程度可以是例如一千分之一、二千分之一、三千分之一、五
千分之一、七千分之一、或万分之一。
(c)峰形状
可使用的另一生物传感器输出参数是整个峰的形状或某些强度之间或某 些强度处的峰的形状。例如，最大峰强度一半处的峰的形状或任意其它强度(如
30%、 40%、 70%或88%，或20—100%之间的任意百分数)的峰形状可用作 生物传感器输出参数。该形状可通过特定强度之下或之上的峰面积来表征。例 如，在最大峰强度一半处有一个峰值强度之前的点和一个峰值强度之后的点。 可在这两个点之间画条线，可确定共振峰内这条线之上的面积或共振峰内这条 线之下的面积，形成生物传感器输出参数。应理解，给定峰的积分面积也可用 来分析化合物对细胞的作用。
另一与性质相关的生物传感器输出参数是特定峰强度的共振峰宽度。例 如，通过测量共振峰上峰值强度之前的50%峰值强度点峰值强度之后的50% 峰值强度点之间连线的长度来确定最大峰强度一半处的共振峰宽度(HMPW)。 然后可将该测量值用作生物传感器输出参数。应理解，可通过这种方式测定20 %到100%峰值强度之间的任意强度的共振峰宽度。(这方面的实施例可见全 部的附图，例如图6B)。
(3)涉及生物传感器共振带图像的参数
迄今为止，大多数的光学生物传感器监测靶分子与固定在传感器表面上的 探针分子之间的结合、传感器表面上细胞附着或或细胞活力(一次一种监测)。 对于多个生物传感器上的结合事件或细胞附着或细胞活力，研究者通常在时间 上依次监测这些事件。因此，很难进行不同传感器之间的直接比较。此外，不 论是波长讯问还是角度讯问，这些检测系统都使用小光点(small spot)( 100 — 500^im直径)激光来照射传感器。响应或共振峰代表了照射区域细胞响应 的平均值。对于96孔生物传感器微板(如康宁的Epic微板)，各RWG传感器 大约是3X3mm2，并位于各孔的底部，而对于384孔微板形式，传感器的直径 通常为lXlmm2。因此，使用当前的传感器技术获得的响应仅代表少部分的传 感器表面。理想的是，检测系统应不仅允许同时监测粘附在多个生物传感器上 的活细胞的响应，还应允许来自各个传感器上相对较大区域或多个区域的信号问询。
通过成像光学讯问系统(如CCD照相机)获得的共振带是一类观测例如单 个传感器上确定的位置处反射(如出耦合)光的强度与物理位置而获得的数据 输出。将反射光直接与入偶合光相关联。或者，可通过扫描讯问系统以使用小 激光光点照射传感器、以一维或二维扫描整个传感器、然后收集给定导向模式 的共振峰的方式收集共振带。作为传感器内位置的函数的共振峰或光强度最终 可重新组合，形成传感器的共振带。在生物传感器中，当出现光的特定波长， 或当产生以特定角度撞击生物传感器的光时，出耦合(outco叩led)的光作为 传感器表面上/附近的折射率变化的函数而改变，这种改变导致成像系统采集 的各传感器的共振带的特征发生改变。此外，使用共振带可直接展示培养后细 胞在整个传感器表面上的不均匀附着(例如，见图l所示的环状共振带)。在 理想的多孔生物传感器微板中，各传感器的位置的相对关系便于与其它生物传 感器标准化(归一化)，即各传感器依微板上各孔的中心行对齐、列对齐。因 此，所获得的共振带图像可用作细胞粘附或应答刺激的细胞变化的内部参考。 因此，给定模式的各传感器的这种共振带提供了另额外与共振带相关的参数以 用来评估DMR或细胞作用。下文讨论了这些参数的一个亚组。
(a) 带形状
可使用的另一生物传感器输出参数是给定模式的各生物传感器的共振带 的形状。该形状有各传感器大面积上的强度分布来限定。如图l和本文其它附 图所示，可使用该形状指示大面积上附着细胞的均匀性或应答刺激的细胞变化 (例如，如图1所示，各共振带代表 200mmX3000mm的整个传感器的响应。
(b) 位置
与给定模式的各传感器的共振峰的位置类似，可将各共振带的位置作为生 物传感器输出参数。可使用成像软件定量强度，以产生各带最大强度的中心位 置。该位置可用来检测应答刺激或化合物处理的细胞变化。
(c) 强度
与共振带的位置一样，使用成像系统采集的出耦合光的强度可作为生物传 感器输出参数。整个带的平均强度或各成像带中各像素的绝对强度可用来检测
68细胞附着的质量和评估细胞响应。
(d) 分布
采用成像系统采集的具有特定角度或波长的出耦合光的分布可作为生物 传感器输出参数。此参数可用于评估没有固定细胞或探针分子时传感器自身的 表面特征，并用于检测传感器表面整个照射面积上细胞附着的质量。此外，当 整个区域的细胞密度相同时，此参数可用于检测化合物对细胞的影响的一致 性；或当在照射面积中一个区域的细胞密度不同于另一个区域的密度时，此参 数可用于检测细胞密度对化合物诱导的细胞响应的影响。
(e) 宽度
与给定模式的共振峰的PWHM相同，使用成像系统获得的共振带的宽度可 用作生物传感器输出参数。此参数具有几乎与共振峰的PWHM值完全相同的特 征及有用的信息内容，但与共振峰仅存在一个P冊M不同的是，人们可获得该 传感器照射面积多个区域的多个带宽。与采用共振带图像获得的其它参数类 似，该宽度可用于上述应用。
对于使用本文所公开的生物传感器的任何细胞检测的任何给定应用，所有 这些参数可独立或一起使用。参数以各种亚组合或组合形式的使用可为给定检 测或特定检测的给定变化提供特征(如细胞受体检测特征)，以及为之后的基 于EGF受体的检测的特定特征。
b)细胞和细胞内容物操作
细胞是生物系统的基础结构单元。因此，理解细胞对于理解亚细胞现象(如 细胞生物学、生物化学和分子生物学)和多细胞现象(如生理学)是必需的。 通过分析细胞，生物学家已认识到不同靶分子之间的许多复杂的功能性关系。 靶分子可以是任意生物学分子，包括DNA、 RNA、脂质体、蛋白质和碳水化合物 等，以及这些分子的集合体。此外，生物学家也已知道使用细胞来理解基本细 胞生物学原理和筛选治疗人类疾病、提高人健康的药物候选物的价值。
使用光学生物传感器可分析细胞或将细胞用于分析。本质上，待分析的细 胞可以是任意细胞类型。可在所公开的任一方法中分析任意类型的细胞。待分 析的细胞可直接获得自生物体或体外培养的细胞。具有耙标的细胞可以是任意从生殖细胞系或体细胞系、全能或多能细胞、分裂或未分裂细胞、软组织细胞 或上皮细胞、无限增殖或转化的细胞。迄今为止，已有许多现成稳定的无限增 殖细胞系。这些稳定的细胞系衍生自许多不同的生物体、组织和发育阶段。可 从美国典型培养物保藏中心以及其它保藏中心获得这一大类细胞的样品。细胞 通常包括所有至少部分被膜双层结构所包围并能复制和分裂成两个或多个实 体的生物体或其后代。
细胞的例子包括真核生物细胞，即具有细胞核的细胞，包括从动物、植物、 真菌、酵母和原生动物的细胞；无核细胞或其突变衍生物或后代，如网织红血 球和成熟的红血球等；其去核衍生物；以及前述任意细胞的融合细胞。此外， 细胞可包括配子，如蛋、精子等。细胞还可包括原核生物，如细菌和结构菌 (archactacteria)。
合适的细胞可来自任何合适的生物体，包括为了研究(如基础的、临床和 生物技术研究)、药物设计、药物开发、和/或其它经济、政治或人道主义理 由而进行研究的任意生物体。示例性的生物体包括哺乳动物，如猿、猫、母牛、 狗、马、人、猴、小鼠、猪和绵羊等。示例性的生物体还包括非哺乳动物类脊
椎动物，如鸟、爬行动物、两栖动物(如青蛙，如爪蟾(Xenopus laevis))， 和鱼(如kout、鲑鱼、金鱼和斑马鱼)等。示例性的生物体还不堪非哺乳动物 无脊椎动物，如果蝇物种(如D. melanogaster和D. simulans)、线虫类(如 C. elegans)、海月旦类(如Strongylocentrotus purpuratus)禾口粘液菌类(如 Dictyostelium discoideum)。示例性的生物体还不堪单细胞真核生物，如酵 母(如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)禾口白色念球菌(Candida albicans)) 和原生动物(如致病性或非致病性原生动物)。示例性生物体还包括植物，如 拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻米、玉米、马铃薯、豆、火炬松以及非 脉管植物。
合适的细胞可以是直接获自野生型、突变型、转基因、嵌合受精卵、桑椹 胚、囊胚、胚胎、胎儿、新生儿、青少年、成年或任何生物体的其它发育阶段 的初级细胞(primary cell)。初级细胞可起源自不同的细胞类型、组织、器 官或生物体的各区域，或可以是它们的混合物。例子包括血液干细胞、B-和T-淋巴细胞、红血球、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、粒细胞、巨核 细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、胶质细胞、星形细胞、成神经细胞、神经元、骨骼成肌细胞或肌小管。平滑肌成肌细胞、心脏成肌细胞、成纤维细胞、成骨细 胞、骨细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、内皮细胞、角化细胞、软骨细胞、衍 生自内胚层、中胚层或外胚层的细胞，和/或胚胎外衍生物，如滋养层。
合适的细胞可得自任何来源的一种或多种组织。组织通常包括生物体中临 时或稳定地空间上接近的各种细胞群体，或其培养的外植体。这种空间接近可 天然发生和/或人工形成，可代表天然或正常的状态和/或诱导的或患病状态 等。人工形成的接近可包括移植、植入的和/或移植的组织(包括器官或组织 移植、异种移植物、同种异体移植物等)和从个体生物体内取出的组织，如皮 肤移植物等。患病组织包括由于(1)遗传缺陷；(2)环境损害，如污染物、 毒素或辐射；(3)生长失控；(4)异常分化；(5)异常细胞迁移；(6)感 染，如被病毒、细菌、原生动物、酵母、真菌和/或寄生虫的感染；或(7)它 们的任意组合而导致异常的组织。
适用于本发明的示例性患病组织是采用外科手术获得的或从液体吸出物 (针刺活组织检査)获得的肿瘤材料。组织可以是获自野生型、突变型、转基 因、嵌合受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成年生物体 的任意组织。合适的出生后组织例子包括(1)肌肉，包括心肌、平滑肌和骨 骼肌；(2)获自中枢神经系统或外周神经系统如脊髓或脑的神经组织；(3) 其它心脏组织；(4)肾；(5)肝；(6)脾；消化系统的任意部分，包括食 道、胃、小肠和大肠，和结肠；(a)胰腺；(9)膀胱；(10)循环系统组织， 包括心脏、静脉、动脉和造血系统的细胞；(11)免疫组织，如胸腺和淋巴结； (12)肾上腺；(13)骨；(14)软骨；和(15)各种上皮组织，如乳房上皮 等等。组织还包括上述各种组织的天然或人为的组合。
在将其用于光学生物传感器之前，可将组织部分或完全分散成单个细胞， 或者可将涂布在整个传感器上或某些部分上。
本发明的一些应用适用于使用得自出生前或出生后的人或其它动物的细 胞进行的临床诊断。出生前细胞的例子包括得自羊水、卵裂球、绒毛膜绒毛、 胎儿血和其它胎儿组织的细胞。出生后的细胞例子包括得自骨髓吸出的淋巴细 液、全血、血清、血浆、胸腔积液、皮肤活检组织、肿瘤活检组织或外科手术 的细胞。出生后细胞的其它例子包括得自体液和/或分泌物如尿、粪便、唾液、 粘液、痰、眼泪、汗液、精液、脊髓液、乳液、唾液等的细胞，或从前述组织 获得的细胞。除从原代细胞和组织或其培养衍生物获得外，合适的细胞还可得自已建立 的细胞系。这些己建立的细胞系可采用任何合适的方法制备，包括病毒、致癌 的、物理的、化学的、突变的、自发的和/或转基因(kansgenic)转化。此外， 细胞可包括经合适方法改变的已建立的细胞系的已鉴定或未鉴定的衍生物，所 述方法例如遗传改造(如通过物理的和/或化学的处理、辐射、转介 (transaction)、传染或注射)和外遗传的修饰(如通过甲基化或其它分子 修饰、kansposon功能、染色体印记、酵母杂交类型转换和/或端粒沉默)。
细胞可以是干细胞或巳分化细胞。已分化细胞类型包括脂肪细胞、成纤维 细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质、血细胞、巨核细胞、 淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细 胞、白细胞、粒细胞、角化细胞、软骨细胞、造骨细胞、破骨细胞、肝细胞、 以及内分泌或外分泌腺的细胞。干细胞可以是最近从捐献者获得的干细胞，在 某些优选实施例中，干细胞是自体干细胞。干细胞还可以得自已建立的体外繁 殖的干细胞系。合适的干细胞包括胚胎干细胞和成人干细胞，不论是全能、多 能还是较低发育能力的干细胞。干细胞优选得自哺乳动物的干细胞，如啮齿动 物(如小鼠或大鼠)、灵长类动物(如猴、黑猩猩或人)、猪和反刍动物(如 母牛、绵羊和山羊)。
通常，根据其起源、基因型、无限增殖化方法、培养条件和曾经所在的环 境，各细胞系具有不同的特征。因此，没有一个细胞系适用于所有的实验或化 合物筛选。例如，特定靶标的表达水平在不同细胞类型中可能明显不同；在一 些例子中，通过特定靶标(如EGFR)的信号传递途径在不同细胞类型中明显不 同。因此，可以看到，通过特定靶标产生效果的调节物可能产生极其不同的细 胞响应(包括物质再分布)。由于某些原因，可能需要对特定类型的细胞进行 遗传再造从而使得特定靶标能够被受控表达或减少或剔除，在一些情况下，可 对特定的信号传递途径进行干预。有许多现有技术可产生这种遗传再造的细 胞。例如，在转染试剂或其它物理方法的帮助下，用靶基因或耙分子转染可使 特定靶标的表达水平增加，而用抗靶标抗体或反义、反靶标基因寡核苷酸及其 衍生物，或肽抑制剂，或干扰RNA (RNAi)转染细胞则可抑制靶标分子。此外， 需要新的技术来确定依赖于细胞环境的细胞信号传递或细胞响应。受体酪氨酸 激酶信号传递很好地阐述了细胞信号传递对细胞环境的依赖性。因应答RTK刺 激而在细胞表面产生的信号强烈依赖于细胞环境。当在不同的细胞或在特定细
72胞系的不同分化阶段中表达时，相同的RTK将诱导完全不同的响应(见J. Schlessinger的综述"受体酪氨酸激酶引起的细胞信号发出"(Cell signaling by rec印tor tyrosine kinases) ， Cell 2000， 103， 211-225)。例如，在 早期发育阶段，FGFR1在控制细胞迁移(中胚层模式形成(patterning)和原 胚层形成起关键作用的一个过程)等方面起到重要作用。另一方面，刺激成纤 维细胞中的FGFR1将导致细胞增殖，而刺激神经元细胞中表达的FGFR1则诱导 细胞生存和分化。对于这些观察结果，最合理的解释是不同细胞表达介导这些 不同响应的细胞类型特异性效应蛋白和转录因子。根据这一观点，RTK及其信 号传递途径能够加入到多个过程中，从而在不同细胞环境中调节不同的效应蛋 白和转录因子的活性。换言之，获得了 RTK活化的信号传递盒，用于应它们的 激活，将信息由细胞表面传递到细胞核和其它细胞区室。
术语"培养"包括将细胞置于各种条件下。虽然"培养"细胞常常指使一 个或多个细胞活着或生长，但在某些情况下，在一种或多种条件下培养细胞可 实际上杀死一个或多个细胞。
c) 一般方法步骤
进行本文公开的细胞检测的一般方法可参见图8。在此一般方法中，人们 可提供无标记光学生物传感器(801)。然后，直接将细胞培养在此生物传感 器上(802)，直到获得所需的覆盖率(从1%到100%以及这两个数值之间的 各百分比的覆盖率)。然后，任选地，可添加缓冲溶液(803)。还可将待测 的化合物或组合物加到培养在生物传感器上细胞中。这是一个刺激事件(804)。 然后，使用本文所述的各种生物传感器输出参数，可讯问该生物传感器，并收 集数据，从而可监测细胞对刺激事件的响应(504)。
总的来说，在此公开的是使用无标记生物传感器(如光学非标记依赖性检 测(LID)生物传感器)实施基于活细胞的检测，以监测粘附在该光学LID生 物传感器上的活细胞内物质再分布。总的来说，所公开的方法可包括大量的不 同的步骤。例如，该方法可包括提供无标记光学生物传感器，如光学LID生物 传感器。该方法一般还涉及在本文所讨论的生物传感器上培养细胞。细胞的培 养通常在可覆盖光学生物传感器的细胞培养基中进行。在某些实施方式中，细 胞可附着到生物传感器的表面，就象它们附着到例如培养皿上一样。当细胞培 养在生物传感器上时，它们可生长到如本文所讨论的任何覆盖率，然后可对这些细胞实施各种检测。例如，可将细胞与测试化合物或一组测试化合物或组合 物(如调节物，如受体的激动剂或拮抗剂或信号转导途径的活化剂或抑制剂， 或潜在的调节物、激动剂、拮抗剂、活化剂或抑制剂) 一起培养，以测定这些 化合物或组合物对细胞或对细胞内的特定靶标的影响。调节物可以是任何增强 或降低特定事件的分子。激动剂是诸如化合物或组合物之类的分子，它以天然 配体影响该受体的方式的相关方式影响该受体。通常，这会启动该受体或将其 活化。拮抗剂是一种分子(如化合物)或组合物，它以导致天然配体的作用减 弱或消除的方式作用于受体。通常，拮抗剂是受体的抑制剂或阻遏物。应理解， 有些激动剂在天然配体或配体类似物不存在的情况下起作用，而另一些则在配 体或配体类似物的存在下起作用。例如，拮抗剂可以是天然配体的竞争性抑制 剂，或者可以是非竞争性抑制剂。
在细胞培养过程中的任意时间点，可按照预先设定使用生物传感器检测细 胞，例如提供特定光谱或特定角度的光。可以各种方法收集生物传感器的输出， 包括时间依赖性方式。例如，可实施这样的步骤讯问光学LID生物传感器以 获得指示活细胞内物质再分布的时间依赖性光学应答，由此可监测活细胞内激
动剂诱导的GPCR活化。
可在各种方法实施过程中的任意时间点实施至少一次将缓冲溶液加到光 学LID生物传感器上的细胞培养基中的步骤。这些缓冲液可用来使培养基或生 物传感器或细胞稳定。通常根据调节物一靶标相互作用或刺激事件一靶标相互 作用来选用缓冲液，以实现最佳的检测结果。
还应理解，可采用这些方法来筛选调节(即活化或抑制)活细胞信号转导 途径、调节特定细胞表面受体如GPCR或EGFR的分子。
还应理解，在某些实施方式中，可以平行或依次的方式进行用一种以上化 合物的孵育。例如，可将一种生物传感器-细胞培养物复合物与一种已知调节 物一起培育，由此产生本文所述由一组参数的组成的特定特征，然后可将另一 化合物或组合物与该生物传感器-细胞-调节物混合物一起培育，通常在讯问 后，通过寻找该生物传感器的特征或其输出数据的变化来确定该化合物对调节 剂活性的影响。应理解，涉及化合物或缓冲液的所有步骤可以逐渐增量的方式 进行，以找出组合物的浓度对生物传感器输出的影响。
可使用本文所述的各种生物传感器实施这些方法，但可将一特定生物传感 器制成自参考的生物传感器，这种生物传感器是一种不仅能够收集细胞检测的输出数据，而且还能够收集相对于从该生物传感器上收集到的数据的对照数 据。这可通过许多方式实现，包括使用阻止培养细胞附着的粘贴物(stamp) 封闭光学LID生物传感器的一部分表面，然后将包含在细胞培养基中的活细胞 加到该光学LID生物传感器上未被封闭的那部分表面，使活细胞能够附着到这 部分未被封闭的表面；然后从该光学LID生物传感器表面上移除所述粘贴物。
自参考方法的一个变化形式是在第一次培养的细胞已粘附到生物传感器 之后移除该粘贴物，然后将加入第二细胞培养基，以在生物传感器上之前被粘 贴物所保护的位置上产生第二细胞培养物。第二种细胞可以是不同类型的细 胞，或可以是相同类型但处于不同阶段的细胞等，但第二种细胞的培养与第一 种细胞不相关。应理解，有多少粘贴物，这样的操作就可以进行多少次。因此， 例如，如果在生物传感器上已使用了四个分开的粘贴物，那么如果依次去除这 些粘贴物并依次向该传感器添加另一细胞种群的话，则最多可在该生物传感器 上获得5种细胞培养物。自参考方法和系统可减少或消除对环境温度、压力波 动和其它环境变化的不利的敏感性，且能提供关于特定耙标或细胞类型的确认 信息。
应理解，不仅能够分析多种化合物对不同细胞类型的影响以及单个化合物 对不同细胞类型的影响，还可以分析例如具有不同受体的细胞以及它们是如何 被调节的，并将其相互比较。还可以通过提供具有多个生物传感器的设备如具 有不同生物传感器的室来实现多元化。
还应理解，如果例如生物传感器上培养的不同细胞中存在多种不同的受 体，则可提供特异性的分子，如特异性拮抗剂，然后例如可测试一种或多种化 合物。这类方法将提供关于例如哪种受体拮抗剂受到哪种化合物影响的信息。
公开了系统，该系统包括讯问系统；和光学非标记依赖性检测(LID) 生物传感器；其中所述讯问系统向所述光学LID生物传感器发出光束，并接收 来自所述光学LID生物传感器的光束，该讯问系统由此能够监测该光学LID生 物传感器表面上的活细胞内的物质再分布。
还公开了这样的系统，其中所述讯问系统还能够在实施了以下步骤后监测 活细胞内的细胞调节，如激动剂诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)活化提供光 学LID生物传感器；将包含于细胞培养基中的活细胞覆盖到该光学LID生物传 感器上以使细胞能够附着到该光学LID生物传感器的表面；施加含有化合物的 溶液到光学LID生物传感器表面上的细胞培养基中；讯问该光学LID生物传感器，获得时间依赖性光学响应，该响应指示活细胞的物质再分布，使得人们能 控制活细胞内激动剂诱导的GPCR活化导致的物质再分布。还公开的是包括向 光学LID生物传感器溶液表面上的细胞介质施加至少一次缓冲溶液的系统。 应理解，本文所讨论的任意方法步骤可用于实施这些步骤的系统。 还应理解，可实时监测光学输出信号，但时间间隔不同(例如，1秒、3 秒、5秒、10秒、15秒、30秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、 30分钟、60分钟、2小时、5小时、IO小时、24小时)。
还应理解，在将化合物加到细胞中之前和之后，检测过程中仅测量两个点。 分析光学输出参数的不同。
d)细胞增殖检测中生物传感器的应用
表征促进或阻滞细胞阻滞的试剂是细胞生物学和药物开发研究中极其重 要的领域。过去已采用了几种方法。锥虫蓝染色是评价作为细胞存活的指示的 细胞膜完整性的一个简单方法，但该方法需要在显微镜下计算死亡细胞的数 量，且不能用于高通量筛选。许多细胞增殖检测要么通过在增殖(即细胞分裂) 期间加入3H—胸苷或5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU，胸苷类似物)到细胞中，要 么通过测量裂解细胞的总核酸或蛋白含量来估算细胞的数量。将5-溴-2'-脱 氧尿苷加到新合成的DNA中使得可使用荧光标记的抗-BrdU抗体或某些核酸染 色(如Hoechst 33342、 TO-PRO-3和LDS 751)间接检测快速增殖的细胞，从 而促进己在BrdU标记期间经历了细胞周期的S-期的细胞的鉴别。另一最常见 的检测是MTT细胞增殖检测。比色MTT检测以黄色四唑盐(MTT)转换成不溶 的紫色甲膘晶体为基础，由仅在活着的和存在代谢活动的细胞中起作用的细胞 线粒体脱氢酶的还原作用实现该转换。将细胞与MTT试剂培养大约2 — 4小时 后，将去污剂溶液加到细胞中，使有颜色的甲腊晶体增溶。使用平板阅读器在 570nm波长下读取样品。所产生的颜色的量与存活的细胞数量直接成正比。活 细胞数量的扩大导致线粒体脱氢酶活性增加，结果导致形成的甲腊染料的量增 加。
之前的检测类型很费时，因为它们需要长时间的培养步骤。例如，许多常 规的基于BrdU的方案需要DNA变性，以使抗BrdU抗体能够接近BrdU表位。 DNA变性通常通过加热(〉90° C)或用酸(2-4 M HC1)来实现。这种苛刻的 处理通常使多参数分析难以实施，因为其它的细胞结构和抗原在这种处理过程中也难以保存。此外，这些常规检测可用于检测某些细胞类型；不同细胞类型 需要不同的培养方案，以获得最佳的检测结果。
e)高通量筛选的特征
公开了适用于高通量筛选调节或影响细胞或细胞增殖或细胞死亡中的一 个或多个信号传递途径的化合物的方法。这些高通量方法基于这样的理解即 可如本文所讨论，使用多种不同参数评估生物传感器输出数据。如本文所讨论 的，特定细胞或细胞内特定受体或特定细胞事件如死亡、增殖或信号发出途径 的调节可具有特定的特征。这种特征可有本文所述的一种或多种生物传感器输 出参数组成。重要的是，对于高通量方法，在方法进行期间有这样一个时间点， 在该时间点采集到的生物传感器输出参数数据是细胞状态表征，所述状态例如 即信号传递途径已被激活或灭火或细胞已死亡或细胞正在增殖。此时间点可以 是这样一个时刻，此时有一组生物传感器输出参数可用来定义所述特征。
可在例如具有许多生物传感器的设备(如达49孔，或96孔或更多)中采 用高通量方法。还应理解，可具有生物传感器输出参数事件的这些方法收集1 小时、30分钟、12分钟、ll分钟、IO分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、 5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、59秒或59秒内或各秒内到1秒内 的生物传感器上细胞培养物的刺激事件。还优选的是，所有整板的生物传感器 的信息收集也在这些时间内完成，但这不是必须的。
除了与数据收集持续时间和平行检测的样品数量相关的特征之外，使用本 文所公开的方法和系统的数据分析或所得结果的集合展现可以是，例如，可就 地收集和呈现的共振带图像和预定的时间点。
(1)细胞覆盖率
对于本文公开的这些方法，尤其是高通量筛选，它们的一个关键性参数是 所使用的起始细胞的数量。起始细胞的数量应当在一个临界范围内，这样，正 常培养条件下波导基底上所产生的细胞密度可使人们能够检测细胞数量的变 化，包括增加和减少。应理解，细胞密度越大，生物传感器产生的输出信号越 多，因为平板上存在越多的细胞，则在任意给定事件如刺激事件后所测得的DMR 事件也越多。因此，细胞的数量可改变例如共振峰的特征(如强度、PWHM、形 状和/或位置)，禾B/或共振带图像的特征(如带形状、宽度、强度、分布和/
77或位置)，和/或DMR事件的幅度(如P-画R禾n/或N-DMR)。例如，覆盖率可 以是30-100%、 30-70%、 40-60%、 45-55%或约50%，但是，覆盖率可以是30 — 100%之间的任意百分数，例如38、 57、 63、 88、 75、 95或99%。对于不同的 应用，可改变优选的覆盖率，以获得最佳的性能。例如，对于细胞增殖检测， 通常，优选的覆盖率是约50%，但不同细胞类型或不同检测的覆盖率可稍微不 同。在这些条件下，正常条件下培养的细胞的P冊M接近最大值，这样可结合 相同时间角度/波长改变或共振峰/带位置测评干扰细胞增殖的调节物，不管该 调节物对细胞增殖是促进剂还是抑制剂。在此，两种调节剂都导致PWHM下降， 但是与未处理的细胞相比，促进剂加大了角度变化，而抑制剂则减小角度变化。 对于受体检测或其它涉及细胞信号发出和网络相互作用的应用，细胞的覆盖率 可在30%到 99%范围内变化，取决于将监测的细胞事件。例如，对于细胞凋 亡研究，细胞覆盖率可以为 10%到 99%。对于GPCR筛选或EGFR筛选，细 胞覆盖率优选在50%到 99%的范围内。
(a)对细胞增殖的干扰
本发明方法可用整板的探测在短时间，例如在60秒，50秒，40秒，30秒， 20秒，10秒内或每秒至1秒内影响细胞增殖的化合物。在一个实施例中，揭 示了检测化合物影响细胞增殖的效果的方法，包括(a)提供第一和第二无 标记光学生物传感器；(b)在所述第一传感器上放置特定接种数量的细胞， 这样，在细胞生长条件下经最佳培养，附着的细胞达到理想的覆盖率 (confluency) ; (c)将相同与接种数量的相同细胞放置在含特定浓度本发明 化合物的所述培养基中；(d)在相同条件下培养细胞至所述第一传感器的细 胞密度达到理想密度；(e)用光学查询(interrogation)系统收集光输出参 数。理想密度优选为40%-70%;特别优选为45%-55%。光查询系统优选平行查 询系统或扫描查询系统。另一方面揭示了作为抑制剂或活化剂的化合物，它们 影响特定类型细胞增殖速度，得到不同数量的附着于传感器的细胞。所附细胞 密度的不同引起不同的光学波导光模光谱。根据角度改变(angular shift) 和P丽H两个参数，可以区分抑制剂和催化剂。
f)生物传感器在细胞毒性筛选中的应用
药物发现已经成为工业化过程，针对作用于选定靶点的活性在大量化合物
78库中进行筛选。这些初级筛选出的大量活性化合物形成了药物发展的一个瓶 颈。第一轮的中标者经常不能满足人类治疗学要求的安全和功效标准，因此需 要后续的优化筛选，指导获得可用于人的产品。优化需要化验吸收，分布，新 陈代谢，排出(排泄)，和毒性特征，即(ADME/Tox) 。 ADME/Tox筛选，目前 占据30亿美元的市场份额，由于大部分首选化合物(lead compound)和药物 因毒性而无法通过，它在药物发现和发展背景中成为主角。开发过程中，新药 总数的30%因毒性和副作用而被废弃。ADME/Tox筛选本可以阻止几种市售或处 方药引起的死亡(Zechnich, A. D. etal。 (1994) West. J. Med. 160， 321-5 )。 鉴于目前市场上安全抗组胺剂的数量和药物学家对早期A謹E/Tox筛选中越来 越多的关注，上述意料之外的毒性提供了一个很好的案例教学。由于大部分首 选化合物和药物因毒性被废，ADME/Tox筛选在药物发现和发展背景中成为主 角。化合物库包含的化合物有一系列积极和消极作用，这种假设是ADME/Tox 筛选的基础。其中候选药物的有益特点包括高特异性，低毒性，好的口服吸收 和半衰期。早期高通量ADME/Tox筛选的目的是在早期开发过程中从毒性方面 区分"好的"和"坏的"化合物。药物筛选过程中的问题的早发现 (identification of problems)为目前的制药工业提供了 一个极大的成本节 约机会。
ADME/Tox筛选是通常用于描述测试肠道吸收，在器官的分布，肝脏新陈代 谢，肾脏排泄和毒性特征等化合物性质的成套测试的术语。ADME/Tox筛选通常 在药物开发过程的晚期开展， 一在发现"中标化合物"的初期阶段之后的过程 的绝对后期。当药物开发目标数量少，且制药企业间高通量筛选化验点的较少 时，这种设定是可行的。随着药物发现空间规范的变化，药物耙点数量和高通 量筛选化验点增加了。因此，业界迫切希望能够快速有效的优选(triage)或 确定可能无法通过ADME和毒性筛选的"潜在中标者"。这样，ADME/Tox筛选 需要在药物发现和发展过程中较早阶段进行，例如初次筛选(高通量筛选)和 次级筛选。此外，预测药物吸收，毒性和生理效果的集成方法(integrated approach)将非常有助于药物发现和发展过程。
(1)实时监测化合物吸收，分配和毒性
ADME/Tox筛选包括测试关于肠道吸收，器官分布，肝脏代谢，肾脏排泄和毒 性特征的化合物性质。传统HTS筛选中与化合物吸收和毒性相关的信息一般被
79放弃或缺失；另外，化合物吸收和毒性引起的效应会使数据分析复杂化。不断 增多的高容量筛选技术的应用开始将毒性筛选和功能性筛选直接相连。
所揭示的成分，方法和技术的一方面是为了消除目前ADME/Tox筛选和采 用以无标记光学传感器进行的细胞实验进行的功能筛选之间的断口 。
在一个实施例中，公开了实时监测细胞吸附和毒性的方法，包括(a) 提供基于光学的无标记生物传感器；(b)放置包含在培养基中的细胞，其中 该细胞附着到该生物传感器的表面上；(c)将含有化合物的溶液施用到细胞 培养基中；(d)监测培养在该生物传感器上的细胞的响应。所公开的方法的 特征还包括(c)任选地给该细胞介质施加至少一次缓冲溶液。此外，所公开 的方法还可在分析中加入本文所讨论的一个以上生物传感器输出参数。实际 上，可实施使用至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15 或更多个生物传感器输出参数的方法，且在某些实施例中，可能需要使用一个 以上参数来精确获得例如检测或细胞状态的特征。此外，在某些实施方式中， 该特征的生物传感器数据输出参数可在刺激事件或生物传感器事件输出收集 后少于l小时、50分钟、40分钟、25分钟、IO分钟、9分钟、8分钟、7分钟、 6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、l分钟、59秒或59秒内的各秒到1 秒内出现。
g)用生物传感器监测细胞活性
公开了与无标记光学生物传感器(包括基于波导光栅的生物传感器)领域 相关的组合物、方法和技术。公开的组合物、方法和技术还与基于细胞的试验 领域相关。因为可用的传感器的穿透深度小以及攸逝波的特性，只有发生在邻 近传感器表面处的细胞粘附层中刺激诱导的服R导致有效折射指数的改变，这 种改变继而造成从传感器中发出的折射光的角度改变。可检测这种角度改变以 获得DMR响应信号的动力学。此外，正因如此，不同的细胞响应对总物质再分 布信号的影响也不同。例如，细胞脱离细胞外基质发生在传感器表面处或其附 近，因此比发生在细胞内部产生的响应大得多。公开了利用光学生物传感器基
于传感器的传ii体积内质量的再分布来检测细胞活性和化合物-/刺激物-诱导
的细胞变化的方法。例如，公开的组合物、方法和技术与以下用途和方法有关 利用基于光学的生物传感器监测配体与受体酪氨酸激酶(RTKs)的结合以及相 继的(sequential)信号传递事件，包括信号内化、实时分子运动或细胞内的组装、和/或细胞骨架重构和细胞形态变化。公开了筛选可在活细胞中干涉这 些信号传递事件之一的化合物或调节剂的方法。
本发明利用基于光学的生物传感器(包括基于波导的生物传感器)监测或 研究配体与受体酪氨酸激酶(RTKs)(—个细胞表面受体家族)的结合以及活
细胞中的几种相继信号传递事件。公开了筛选有可能干涉这些信号传递事件 (例如，结合、相继的磷酸化、内化/细胞骨架重构和细胞解吸附)的化合物 或调节剂的方法。在另一种实施方式中，公开了确认一种化合物针对活细胞中 一种特定受体的生理或药理作用的方法。
公开了用于化合物筛选和表征(profiling)的、基于细胞的、实时和无 标记的功能性受体酪氨酸激酶检测方法。公开的方法允许人们同时研究受体信 号传递途径中三种主要事件的动力学配体结合、磷酸化和内化/细胞骨架重 构。根据本发明的方法还可用于筛选可干涉这些信号传递事件的化合物或对其 进行分类。在又一种实施方式中，公开了基于(调节剂)独特的特性(如光学 输出参数所定义的)来筛选信号途径中多个靶标的调节剂的方法，所述调节剂 干扰检测到的DMR信号。
已证明EGF受体系统的计算机模型在理解受体途径不同部分的复杂相互作 用中非常有用。然而，对于细胞内的这些信号传递和运输的动力学的直接检测， 现在只有有限的试验数据。缺少对信号传递事件动力学的直接检测限制了对这 些模型的验证。因此，需要可同时研究细胞信号传递事件的方法和技术以进一 步理解EGFR信号传递。
(1)物质再分布监测
如此处所公开的，可实时监测化合物在接近细胞-传感器界面的某个铺满 度的细胞层的吸收、分布和毒性。因为基于光学的生物传感器固有的有限穿透 传感特性(50-500 nM)(即，传感体积)，该体积内发生的传感器可感知的 物质再分布导致响应变化，这种变化可被观察为折射光束中角度或光谱的变 化。这种传感器响应可被记录为时间的函数和溶液组成变化。以这种方式，可 分析导致在传感体积内的物质再分布的任何剌激事件的动力学或由刺激事件 引起的效果。应理解，待检测细胞的铺满度对高灵敏度检测很重要。对本文所 述的光学检测，所需的灵敏度越高，所允许的细胞铺满度越重要。对于刺激事 件诱导的物质再分布监测，细胞铺满度优选在30-100%范围内。或者可为
8170-99%。本文公开的方法应用于不同用途时(细胞增殖、化合物毒性、细胞凋
亡、化合物吸收和代谢、细胞信号传递途径激活、细胞形态变化、细胞解吸附 和运动、受体和靶标(分子组装)活化和运动，等)可能需要不同的细胞覆盖 率(即细胞密度)以获得最佳试验结果。另外，不同的细胞类型和不同的耙/ 信号传递途径活化可能需要不同的细胞覆盖率以获得最佳的细胞响应和功能。 应理解这种覆盖率不限制试验步骤或方法。
h)细胞组分和生物传感器
生物细胞，如图9的示意图中所示，是复杂的结构，其组分的大小在纳米 到几十微米范围内。细胞，如图10所示的1008，通常有含有各种细胞器的细 胞质(通常在5-30幽范围内)。通常，最大的细胞器是细胞核，其范围可在 3-10 Wn。核含有DNA、 RNA、蛋白质和核酸-蛋白质复合体，如DNA-蛋白质或 RNA-蛋白质复合物。 一种很重要的DNA-蛋白质复合物是染色体。线粒体是由一 系列折叠的膜(大小通常在0.5-1.5 Wn范围内)组成的小细胞器。其它细胞 组分包括例如内质网(ER)(通常0.2-l陶)、溶酶体(通常0. 2-0, 5Wn)、 过氧化物酶体(通常0. 2-0. 5陶)、内含体(通常约100nm)和高尔基体。活 细胞，例如1008，是高度动态的，大多数细胞器在细胞内广泛运动。例如，微 管可在很长距离内运输细胞器。刺激物可导致密集的细胞器在培养细胞(如 1008)的传感器表面(如1010)的恰好边缘处做亚微米运动；这种运动导致细 胞(如1008)内物质再分布，如1006。物质再分布(如1006)可被光学生物 传感器(如1014)待测；与物质再分布(如1006)有关的信号称为定向物质 再分布(DMR)信号。由于的生物传感器(如光学LID传感器1014)传播的作 为瞬逝电磁场的电磁场可伸入周围介质(例如贴壁细胞1008)的范围有限(几 十到几百纳米)，在某些情况下，只可检测到一部分物质再分布(如1006)， 因为穿透深度不足以穿透整个细胞或多个细胞(例如在细胞层中)。电磁场可 延伸的具体称为穿透深度或传感体积。某些情况下，只可检测与生物传感器表 面(如1010) —定距离内的下层贴壁细胞。
(例如)当分泌型细胞器占据其位于质膜下的对接位点，或质膜处的细胞 内小泡到达其细胞溶质中的加工位置时，可发生细胞运输。在任一方向上，细 胞器通常必须穿透质膜下所谓的肌动蛋白皮层， 一种达几百纳米厚的肌动蛋白 丝密集网状组织。肌动蛋白丝总是组装和分解，因此这种网状组织是动态的，可透过细胞器。调控组装和分解的控制机制也调控肌动蛋白皮层的可透过性。
胞泌小泡可将受体插入到质膜中并将配体释放到胞外空间。胞内小泡携带 已结合配体的受体至内部加工位置。质膜穴样凹陷是质膜结合的载体，猜测其 在细胞信号传递中发挥作用。脂类伐被认为作为小漂浮岛位于质膜中，在脂类 伐中选择性的膜蛋白私下交换信号。最后，如本文公开的，膜受体是相同的。 它们可嵌在大分子复合物中，这些复合物不停募集和释放下游效应器分子。
细胞组分或细胞外刺激物的运输不仅发生在质膜处，还通过信号传递发生 在细胞内和多个细胞内区室和细胞器中。这些事件包括(1)蛋白质靶标或底 物向核、膜、细胞溶质，通过再循环途径，至或自其它细胞器，从胞外空间摄 取(配体结合、基因转染、传染和蛋白质递送)募集；(2)各种功能性区室 内新合成的细胞内组分在确定的微环境内以及介导的释放位置的再分布。这些 细胞事件可导致在信号传递循环中某些时间发生定向物质再分布。
(3)细胞监测的多种穿透深度
大多数或所有细胞区室是高度动态的，在毫秒至分钟的时间范围内发挥功 能，有时在发挥功能后迅速分散。为了观察由单个细胞器和信号传递复合物介 导的信号传递事件，通常需要体内方法使单个细胞器显影、检测少数分子并在 时间和空间上以髙解析度报告它们的功能。荧光显微术是迄今为止的一个很自 然的选择，因为一些细胞器可被染料特异性染色，并且越来越多的蛋白已与荧 光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)偶联而不影响其功能。然而，很多质膜事件 涉及与瞬时募集到质膜上的胞质蛋白的相互作用。因为即使当共聚焦显微镜聚 焦于质膜时可观察到细胞内将近半微米的深度，这些和更经典的荧光显微镜显 示出来自细胞溶质的强"背景"荧光，使来自靠近质膜的微小结构或分子组 件的较弱荧光变得模糊。
经刺激，活细胞可经历非常多的细胞事件，包括但不限于，配体/化合物 结合到受体或细胞内靶标，细胞组分的运动和移位，细胞信号传递分子的相互 作用，细胞器或分子组件的活性改变甚至移动，第二信使的产生，细胞骨架重 构和甚至显著的细胞形态变化。例如，GPCR参与一系列的细胞信号传递途径。 配体结合启动一系列细胞内和细胞信号传递事件，包括受体构象变化，受体寡 聚化，G蛋白活化(GDP-GTP在G。亚单位上互换，G。和Gh解离，G蛋白与受 体分离，产生G。-和G"信号传递复合物)，和导致产生第二信使(C移动，产生肌醇三磷酸，和/或细胞内CAMP水平的调节)并最终导致具体基因表达变 化的下游信号传递活化。配体介导的GPCR活化还导致GPCR从细胞表面脱敏、 很多细胞内蛋白的运输，以及靶细胞的表型、形态和物理特性的变化。这些变 化可以是静态的、长久的或动态的(例如，循环或摆动)。不同的信号传递事 件显示出显著不同的动力学，从毫秒(例如GPCR构象变化)至几十秒(例如 Ca2+流)至甚至几十分钟(例如基因表达或形态变化)。虽然它们的特征(例 如动力学)不同，这些事件可导致物质再分布。而且，用光学生物传感器获得 的光学输出参数一般代表大量细胞事件的总体平均响应，不同的细胞事件对总 输出参数的贡献不同。细胞总的DMR响应对穿透深度的依赖将是何处和何时发 生DMR信号的极为有用的指示。
如上所述，光学生物传感器，依赖于传感器结构和性质，在表层介质产生 有限的穿透深度(通常50-500nm)，并且只可检测高(tall)细胞(直径约 IO微米)或细菌(直径约l微米)的底层部分。因此，检测质量主要与生物体 和表面的接触区、近质膜区和传感器表面附近发生的形态变化有关。为了探测 与质膜相距较远的细胞内不同区室或细胞器的运动或活性、或整个生物体的折 射率，需要将穿透深度延伸到(能够检测)这些变化。图11显示了依赖于穿 透深度的传感器攸逝波的行为。它强调了穿透深度对细胞监测的重要性。因为 光学输出信号或参数是对刺激诱导的细胞响应的一种整合的(intergrated) 和代表性读数，多种细胞事件如受体胞吞或靶复合物移动或细胞形态变化或细 胞解吸附或移动对用光学生物传感器获得的总体响应的贡献可能不同。这些事 件可发生在与传感器表面相关的不同位置。因此，通过利用多种穿透深度来监 测由同一种刺激事件诱导的细胞响应，可了解各事件对总体响应的贡献，并因 此了解细胞响应的机制。
公开了可用于监测响应于刺激(而产生)的细胞DMR信号的方法。在一种 实施方式中，该方法包括传感器的不同模式以检测特定细胞类型响应于具体刺 激(而产生)的总DMR信号。传感器的不同给定模式产生灵敏度不同的不同穿 透深度(例如，TM。模式倾向于比TE。模式产生更长的穿透厚度，例如对于给定 的传感器TM。模式的穿透深度为120咖，对于同一传感器TE。模式约为90nm)。 在另一种实施方式中，公开的方法可将具有不同波导和光栅结构及性质并产生 不同穿透深度的至少两种生物传感器用于给定的模式以检测细胞的总匿R信 号。在另一种实施方式中，公开的方法可用传统的对称和反相对称波导光栅生
84物传感器来检测细胞的总DMR信号。运输信号或定向物质再分布(DMR)信号对穿透深度的灵敏度可用作特征(signature)来鉴定特定的细胞运输事件。本发明方法包括对生物传感器构型和结构的修饰，或对具体波导传感器的穿透深度进行"细调"，提供了以高灵敏度和细胞内区室特异性监测或检测具体细胞运输事件的有用手段。具体说，应用具有不同穿透深度的多个传感器可描述各细胞D服或运输事件的特征标记。对于具体的运输或DMR事件，本发明允许
人们以更高的z-轴空间解析度和更高的灵敏度监测或检测该事件。
(4)用光学生物传感器进行多路(multiplexed)细胞试验
标准的筛选方法， 一次检测一种靶标，已成功用于鉴别有效的药物候选物。然而，产生的关于化合物选择性的信息非常之少。当前，在药物开发过程的下游进行选择性研究；由于不良结合在该阶段排除一些化合物，使药物开发过程费钱费时。需要平行检测化合物对多个靶标的活性的多靶标筛选以在药物开发过程的早期解决化合物选择性的问题。基于这些考虑，以及靶标鉴定脚步的加快和化合物文库的扩充，需要可进行多靶标筛选的新技术。
公开了可进行多靶标和多细胞筛选的方法。 一种实施方式中，本发明方法利用整合的光学输出参数作为针对多类靶标或同类靶标的多个家族成员筛选化合物的手段。例如，EGF介导的通过EGFR的人A431细胞Ras/MAPK途径的活化产生独特的DMR特征；多类靶标包括EGFR、 Src激酶、MEK1/2、地那明和肌动蛋白丝在总DMR特征中发挥不同作用。此外，在另一个例子中，在A431细胞中，Ras/MAPK途径的活化可通过几个GPCR激动剂诱导的EGFR转活介导，导致与EGF诱导的响应类似的DMR特征；因此，可筛选和检测GPCR类耙标的多个家族成员。
另一种实施方式中，本发明公开了在单个传感器的不同区域上顺序培养至少两种类型细胞的方法，这些细胞可用于用光学生物传感器进行的多路细胞试验。所述细胞可以是不同类型的细胞，或生理相关的、或疾病相关的、或病理相关的。细胞也可以起源于同类型的细胞，或未修饰的，或经遗传再工程化或类似的在工程化，如敲除或抑制或过度表达特定的感兴趣靶标的细胞。例如，可用中国仓鼠卵巢(CH0)细胞和经再工程化的CHO细胞。如图12所示，可提供生物传感器(1201)，然后可物理隔离(block)该生物传感器的一部分(1202)，从而即使将细胞放置在该生物传感器上，细胞也不会在该部分生物传感器上生长。然后可将A细胞类型的细胞培养基放置在未隔离区域(1203)并允许其在上面生长。然后不再隔离生物传感器上被隔离的区域，可施加第二种细胞，例如细胞类型B的培养基，从而细胞类型B在曾经被隔离的区域生长(805)。然后可提供含有能够产生刺激事件的分子的溶液(1206)。然后运行该生物传感器，从两个区域(起初未隔离的区域和曾被隔离的区域)收集数据并比较。可通过放置橡皮图章(rubber stamp)覆盖一部分传感器来实现隔离，或通过放置具有给定数目的柱形结构(posts或columns)的盖板来实现隔离。柱形结构的末端可由软材料如橡胶制成的末端组成，从而当柱形结构的末端接触部分传感器表面时不会破坏传感器的性质或对其不利。柱形结构的数目和位置与给定传感器微板的形式相适应。或者，可将一个装置放入传感器微量滴定板中来实现隔离，从而各传感器可被分为至少两个区室。例如，所述装置可以是具有给定数目微柱体的盖板；在各柱体(或总柱体)末端可具有挠性材料如聚合物制成的薄壁(通常lmm)。 一旦将柱体置入各孔中，微柱体的底部接触传感器的中心区域，两边均接触各孔的内壁。盖板优选含有给定数目的流体通道；各通道与各微柱体或部分微柱体连接。
在又一实施方式中，公开了利用物理上分离的多个生物传感器的方法，各生物传感器可用于容纳一种类型的细胞。最初的细胞贴壁之后，可将通用培养基加到含有多个生物传感器的小室中。如图13和14所示的方法提供所公开方法的一种改进形式，此改进与生物传感器位于小室(例如微板的孔)中具体的位点有关。如果采用含有多孔微量滴定板(各孔中有多个区室，各区室有生物传感器)的装置，则可将不同类型的细胞置于各个不同小室中，允许对各孔或生物传感器分析不同的细胞或条件设置(1302)。然后可任选将通用培养基放入各孔以覆盖所有生物传感器，或各区室可用不同介质，所公开的这两种方式可任意组合(1303)。溶液1303可含有标记物，如可产生刺激事件的分子，或可施加含有可产生刺激事件的一种或多种分子的第二溶液(1304)。然后可监测并询问生物传感器(一个或多个)，收集并比较各区室或传感器产生的结果。在一种具体实施方式
中，本发明提供一种独特类型的生物传感器微量滴定板，如图14所示的例子， 一种嵌有光学生物传感器的多区室多孔微量滴定板，其中各孔中含有四个区室，各区室可具有嵌入的一种波导光栅基材。各区室可用于容纳单一类型的细胞。可用内壁分隔四个区室，内壁高度(优选在100微米和2毫米之间)通常比各孔高度(任何给定微量滴定板的典型高度)低得多，从而具有四个区室的各孔可用于同时检测一种药物候选物对多个靶标或多种细胞类型的作用。可用物理屏障分隔小孔中的区室，从而当一种细胞介质溶液施加于一个区室时，从而当一种细胞介质(medium)溶液施加于一个区室并在所述区室停留时不与相邻区室交叉污染。应理解区室可以是2、 3、 4、 5、 6或更多个。可用更高的物理屏障分隔具有多个区室的各孔，例如用常规微量滴定板的塑料壁，从而可将相对大体积的共用溶液加入各孔覆盖所有区室并用于单个试验。
在另一种实施方式中，公开了一种方法，该方法可利用位置和表面介导的转染在单个传感器或单个小室或单个孔中的多个传感器来产生多种类型的细胞。对于单个传感器，选择预定的区域沉积材料，从而一旦细胞生长并贴壁，细胞可摄取所述材料并因此产生修饰的或再工程化的细胞，这种细胞有别于生长并粘附在没有沉积所述材料的其它区域的原始细胞。所述材料可优选是靶基因，或反义寡核苷酸和其衍生物，或反基因寡核苷酸和其衍生物，或干扰RNA(单链或双链或任何类型)，或抗体，或蛋白，或蛋白结构域，或药物，或肽。对于待被细胞递送或摄取的不同类型的材料，可用具体的转染试剂来达到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US 6， 544， 790中所述实现这些方法或组合物，这两篇文献以全文纳入本文，但至少纳入与递送入细胞的方法有关的材料。
在另一种实施方式中，公开了一种方法，该方法可利用位置和表面介导的转染在单个传感器或单个小室或单个孔中的多个传感器来产生多种类型的细胞。对于单个传感器，选择预定的区域沉积材料，从而一旦细胞生长并贴壁，细胞可摄取所述材料并因此产生修饰的或再工程化的细胞，这种细胞有别于生长并粘附在没有沉积所述材料的其它区域的原始细胞。所述材料可优选是靶基因，或反义寡核苷酸和其衍生物，或反基因寡核苷酸和其衍生物，或干扰RNA(单链或双链或任何类型)，或抗体，或蛋白，或蛋白结构域，或药物，或肽。对于待被细胞递送或摄取的不同类型的材料，可用具体的转染试剂来达到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US 6， 544， 790中所述实现这些方法或组合物，这两篇文献以全文纳入本文，但至少纳入与递送入细胞的方法有关的材料。可用接触印刷技术(如针印刷技术)、戳记装置或非接触印刷技术如分配器装置或系统实现材料的沉积。对于物理屏障分隔的同一孔中的多个生物传感器，可用微量滴定板分配器实现含有材料的溶液的直接沉积。可如US5807522 A、US6101946 A、美国专利号5,731,152、美国专利号5， 807， 522、美国专利号5， 601， 980、 US6656432 Bl、 EP0895082 Bl或US6399396 Bl中所述实现这些方法，这些文献全文纳入本文，但至少纳入与将所述材料递送到基材表面的方法有关的材料。
另一种实施方式中，公开了一种方法，该方法可将定位溶液(positionsolution)转染技术用于位于不同传感器上的细胞，所述不同传感器在同一小孔中但被物理屏障分隔。这些方法可将与转染试剂混合的材料直接引入各区室中，在区室中细胞被预先培养并粘附到传感器上。例如，将含有DNA的转染试剂溶液加入各区室，区室中的细胞已被放置在底部基材上。
(5)用光学生物传感器鉴别靶标
药物靶标包括在具体疾病的发生和发展中发挥重要作用的大多数蛋白。直到最近，药物研究者们只限于研究约500个生物学靶标(Drews，丄，"DrugDiscovery: A Historical Perspective" Science 2000， 287, 1960—1963)。随着人类基因组测序的完成，可用和潜在的生物学靶标的数目正急速增加。基于基因组学方法发现的潜在靶标的数目使人们非常需要靶标评价技术。然而，传统的药物发现方法已经并且也只能解决有限数目的靶标家族。这种情况提示传统方法已变得非常局限。也就是说，这些方法不能迅速产生满足大药物公司商业目标所需数目的新药(例如，每年三至五种)。传统的方法不可能为重大疾病(例如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症和2型糖尿病)或其它远未满足的药物需要提供突破性治疗。基于这些原因，靶标评价已称为基因组学研究中增长最快和最重要的领域之一。在靶蛋白和疾病之间建立更强的联系将使药物进展到临床试验时的失败率更低，已证明有价值药物靶标的靶标数目更少将使成功率更大。此外，获得对蛋白质功能了解的更快速的手段将縮短靶标评价过程。
在药物发现中，靶标评价一般包括三个主要的、重要阶段1)靶标筛选，
2)靶标鉴定，和3)靶标确认。作为靶标评价中的第一和/或早期阶段，靶标筛选阶段包括鉴定可能与疾病过程相关的分子(例如通过基因表达分析鉴定到特定基因的上调)。靶标鉴定包括鉴定非常清楚地在疾病过程中发挥作用的分子。这样，这种方法提供了更大的确定性，但仍然存在这样一种可能，即鉴定到的靶标不是最好的或不连接于最好的结合位点以干扰疾病过程，或者它们不是"可作药的"，亦即这种靶标不适合作为药物靶标，因为它们不在疾病或癌症中发挥支配性作用，或者药物对该耙标的修饰可产生不利副作用。如果这些(前面两步)都成功了，则可进入靶标确认阶段，该阶段确定在所选分子中哪个分子如果被调节则导致表型改变，从而暗示其可能具有治疗性靶标的价值。
在一种实施方式中，公开了一种方法，该方法可用于基于光学生物传感器监测的物质再分布的靶标鉴定和评价。(例如)与信号传递途径活化、细胞运动性和表型改变相关的物质再分布可用作与特定靶标相关的疾病的指征，因为这些改变中的很多涉及肿瘤进展和转移。 一种实施方式中，该方法包括比较两种类型细胞的通过特定靶标产生的刺激事件介导的DMR响应。如图15所示，可提供光学生物传感器(1501)。然后，可将含有特定类型细胞(细胞A( 1502))的细胞培养基置于该传感器上。然后任选提供缓冲溶液(1503)。可加入例如配制在溶液(1504)中的具体标记物，该标记物是刺激事件，如特定途径或受体或细胞的调节剂或潜在调节剂。然后可用生物传感器监测细胞响应(1505)。可用第二种细胞类型或细胞培养物(1507)在第二传感器(1506)上进行同样的一组步骤。询问第二生物传感器(1510)后，可对两种响应(1505)和(1510)进行比较(1511)。
图12显示基于定向物质再分布进行靶标鉴定和评价的另一种可选方法。可提供生物传感器(1201)，然后可物理隔离一部分该生物传感器(1202)从而即使将细胞置于该生物传感器，细胞也不会在该部分生物传感器上生长。然后可将具有细胞类型A的细胞培养基置于未隔离区(1203)并使其在上面生长。然后任选不再隔离生物传感器上被隔离的区域，施加第二种细胞，例如细胞类型B的细胞培养基，从而细胞类型B在曾经被隔离的区域生长(1205)。然后可提供含有能够产生剌激事件的分子的溶液(1206)。然后运行该生物传感器，从两个区域(起初未隔离的区域和曾被隔离的区域)收集数据并比较(1207)。
图13显示基于定向物质再分布进行靶标鉴定和评价的另一种可选方法。图13提供所公开方法的一种改进形式，此改进与生物传感器位于小室(例如微板的孔)中具体的位点有关。如果采用含有多个小室的装置并使用多个生物传感器，则可将不同类型的细胞置于各个不同生物传感器上，从而能对各孔或生物传感器分析不同的细胞或不同条件设置(1302)。然后可任选将通用培养基放入各孔以覆盖所有生物传感器，或各小室可用不同培养基，所公开的这两种方式可任意组合(1303)。溶液1303可含有标记物，如可产生剌激事件的分子，或可施加含有可产生刺激事件的一种或多种分子的第二溶液(1304)。
然后可监测并询问生物传感器(一个或多个)，收集并比较各区室或传感器产
生的结果(1305)。
与图2a所示类似，图IO提供的图显示示范性无标记生物传感器及其基本组件。光学LID系统1000包括询问系统1002和光学LID生物传感器1004，询问系统1002由控制光、电子和用于数据产生、收集和分析的其它模块组成，光学LID生物传感器1004可用于检测和监测物质再分布。当沿着(align with)传感器攸逝波的方向发生物质再分布时，产生称为定向物质再分布的信号并可被收集和分析。然而，如一些输出参数如PWHM、共振带宽和形状等所示，光学生物传感器也可能检测到沿着传感器表面或与该表面平行发生的物质再分布。例如，分子如GPCR 1020的移位或分子装配的发生可开始于面向传感器的细胞表面至细胞内区室如内含体或ER。这些运动，如活细胞1008 (只显示一个)中所示的的箭头1006， 一般导致传感器内传感体积(由穿透深度定义)的减少。在一种优选实施方式中，询问系统1002询问光学LID生物传感器1004 (例如，SPR传感器1004，波导光栅传感器1004)，从而可检测和监测活细胞1008中的物质再分布。这可通过以下方式实现发射光束1012至光学LID生物传感器1004，从而当光束1012被传感表面1010反射时，表征物质再分布的共振角或波长响应在反射束1014中占优势，所述光束1012具有本文所述的合适光谱或角度。因此，当在活细胞1008中有可检测的物质再分布时，光学LID生物传感器1004可感知响应的变化，该变化被观察为反射束1014的角度或波长改变。光学响应可记录为时间的函数。以这种方式，如本文所述，可分析导致活细胞1008内发生物质再分布的任何事件的动力学生物传感器输出参数或任何其它参数。
参考图16，该图显示光学LID系统1000用于监测刺激事件，如位于光学LID生物传感器1014上表面上的活细胞1008 (只显示了一个)中G蛋白偶联受体1602 (GPCRsl602)的激动剂诱导的移位。具体说，该图显示了部分由于活细胞1008内的靶标GPCR 1602移位造成的激动剂诱导和时间依赖性的光学响应1601。细胞粘附于基于波导的生物传感器1014的上表面1010。清楚起见，在标记为"C"的部分未显示询问系统1002。
可以看出，静息态的GPCR 1602位于细胞表面1604 (质膜1604)，而GPCR激酶1606 (GRK 1606)和抑制蛋白(arrestin) 1608均匀分布在活细胞1008
90的细胞溶质中(见图"A")。经激动剂激活后，GPCR 1602活化由a、 p和 Y亚单位组成的异源三聚体G蛋白。Ga和GP Y亚单位解离，引起质膜1604 处GRK 1606向受体1602募集。然后，GRK 1606磷酸化GPCR 1602的羧基末端。 另外，13-抑制蛋白1608 (—种相对丰富的细胞内蛋白)，在胞质中迅速移位 (在分钟级别)到质膜1604处的活化的GPCR 1602，结合GRK-磷酸化受体， 将受体与其相应(cognate) G蛋白解偶联。然后抑制蛋白1608结合到脱 敏的GPCR 1602并移位到细胞表面1604处的网格蛋白小窝(clathrin-coated pits)，此处1602在笼形蛋白包裹的小泡(CVV)中内化(见图"B")。最 后，整个1602和1606复合物被递送到内含体1610 (细胞内小泡1610)(见 图"C")。该过程称为移位。关于GPCR移位的更多信息，可参考以下三篇文 章Pierce, K丄等， "Seven-transmembrane receptors. ，， Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002， 3， 639-650，整体纳入本文，至少针对与移位相关的部分。
应理解，这些移位事件导致某个时间点活细胞1008内定向质量分布(例 如，向细胞表面或离开细胞表面)，因此在延长的时间段中产生不同的光学响 应。可导致定向质量分布的另一个可能的生物学事件是由于GPCR活化引起的 细胞形态变化。细胞形态变化包括细胞骨架重构以及细胞贴壁(状态)的变化。 细胞骨架是复杂的蛋白丝网络，延伸经过真核细胞的细胞质，参与执行这些细 胞中的多种活性。除了为这些细胞提供抗张强度之外，细胞骨架还使肌肉能够 收缩、进行细胞运动、并参与细胞内信号传递和运输、细胞分裂和细胞形状变 化。G蛋白偶联受体(GPCR)的活化导致至少两个独立事件，理论上讲这些事 件可对细胞骨架重构产生作用。第一个事件是细胞内信号传递途径的活化，第 二个事件是受体介导的胞吞作用(即移位)，其发生在大多数GPCR的激动剂 活化之后。然后，激动剂/GPCR结合之后发生的细胞内信号传递途径的活化又 导致另外两组相关的事件。第一组过程导致细胞内第二信号传递途径(G蛋白 —效应子一信使)的活化，而第二组的机制通过影响第一组事件调控细胞内 信号传递的程度。这些机制包括磷酸化/脱敏、内化和膜结合受体的下调。假 定两组事件均导致细胞中肌动蛋白丝重构。例如，GPCR活化后，各种形式的G 蛋白(例如Ga和Gh)可与F肌动蛋白丝结合；这些和其它信号传递分子可与 肌动蛋白丝解离。通过受体介导的胞吞而发生的膜结合受体的内化也可导致肌 动蛋白丝的动态变化。
再参考图16，根据本发明，可通过从光学LID系统1000分析光学响应1601
91来鉴定和监测活细胞1008中与GPCR移位相关的不同状态。实际上，从图16
所示的光学响应1601可鉴定三种不同事件。可看到的三种主要事件包括(1)
加入激动剂后，信号1601由于折光率体积指数变化发生非常大的快速减少 (bulk index of refraction changes)(艮卩，该例子中化合物溶^夜相Xf于细 胞培养基的折射系数较低，因此加入化合物导致LID信号降低)；(2)过渡 阶段，响应信号1601变化慢，持续约20分钟该阶段可能与细胞信号传递途 径活化相关，包括但不限于，已活化的受体1602被GRKs 1606磷酸化，抑制 蛋白结合，受体从网格蛋白小窝(chathrin-coated pits)脱敏，和/或其它 细胞响应；和(3)响应信号1601缓慢减少，持续约50分钟，对应于GPCR复 合物1602和1608移位到内含体1602或其它细胞响应如细胞骨架重构。其它 情况下，紧跟起始步骤之后发生的另外的事件可能很明显(例如，图16);它 是一种快速波动的响应信号1601，主要是化合物在细胞培养基中的加入和/或 扩散和/或细胞表面处细胞内组分向活化的GPCR募集造成的。下面参考图17 所示的方法1700描述光学LID系统1002如何进行这种测试的细节。
图18表示用服R进行把靶标鉴定的例子。图18中，不管CHO细胞培养在 含有10%胎牛血清(FBS)(数据未显示)还是0. 1% FBS (至少16小时)的培 养基中(1801)，除了将50 ral EGF溶液加入到150 ml细胞培养基中之后立 即发生的信号快速变化(通常持续少于20秒)之外，EGF刺激未引起显著的 DMR。这种快速变化是由于体积指数变化。相反，当发生刺激事件时，例如加 入EGF， EGF-诱导的A431细胞的响应强烈依赖于培养条件。在0. 1% FBS中饥 饿20小时的A431细胞用EGF处理产生时间依赖性响应(1802)，该响应由三 个连续相组成，提供3种生物传感器输出参数(i)阳性相，信号增加(P-DMR) (点C-D) , (ii)净-零(net-zero)相(点D-E)，和(iii)衰减相，信 号减少(N-DMR)(点E-F-G)，在体积指数变化的最初快速相之后。相反， 与处于静息态的A431细胞相比，增殖中的A431细胞(10%FBS)只产生P-DMR 相(1803)，而用0. 1%FBS只处理4小时的A431细胞产生类似的响应(1804)， 但动力学发生改变，振幅小得多。这些结果表明可基于标记物-诱导的醒R响 应，例如使用细胞信号传递途径(在该具体实例中是EGF)的活化物或抑制物， 来鉴定或评价给定细胞类型中的靶标(例如，EGFR)。
i)细胞信号传递
92可用本文公开的系统和方法监测细胞信号传递。例如，参考图17，该流程 图显示了根据本发明的方法用光学LID生物传感器1004在活细胞1008中实时 监测由激动剂诱导的GPCR活化引起的物质再分布的方法1700的基本步骤。方 法1700包括下述步骤(a)提供光学LID生物传感器1004 (步骤1702);
(b) 将一定数目的活细胞1008置于覆盖光学LID生物传感器1004的介质中， 从而活细胞1008粘附到光学LID生物传感器1004的表面1010 (步骤1704);
(c) 任选至少施加一次缓冲溶液至细胞培养基(步骤1706) ; (d)将含有化 合物(激动剂)的溶液加入细胞培养基(步骤1708);和(e)询问光学LID 生物传感器1004，监测培养在光学LID生物传感器1004上的活细胞1008的时 间依赖性光学响应1601 (步骤1710)。
应理解，如果进行歩骤1706，在加入化合物之前将缓冲溶液(与用于配制 感兴趣化合物的缓冲溶液相同)施加到活细胞1008，则由于活细胞1008对环 境改变发生的响应而引起的任何不利作用可被最小化。这是可能的，因为培养 在光学LID生物传感器1004上的活细胞1008是活的、动态的，这表示它们可 感知周围介质组合物中的变化以及温度的变化并对这些变化做出响应。然而， 因为活细胞1008感知到缓冲液的加入等变化，如果不加入另外的化合物，它 们可能对介质组合物中的那些变化产生抗性。
还应理解，实时方法1700提供了可量化的信息，同样重要的是，它提供 了由于GPCR活化造成的细胞内的物质再分布的动力学。与筛选GPCR的传统方 法不同，该方法1700更易于操作，更灵敏，不依赖于标记，可用于所有GPCRs 1002，而不需要事先知道天然配体或者给定的受体如何偶联于下游信号传递途 径。
还应理解，步骤1704中应优化细胞的数目使得在优化的条件下培养一定 时间后，这些细胞粘附在光学LID传感器1004的表面1010上并达到高覆盖率 (任选大于75%)，以获得高灵敏度。
参考图19，该流程图显示了根据本发明采用光学LID生物传感器1004、 基于活细胞1008中的物质再分布，筛选针对耙标GPCR 1002的激动剂的方法 1900。方法1900包括下述步骤(a)提供光学LID生物传感器1004 (步骤 1902) ; (b)将一定数目的活细胞1008置于覆盖光学LID生物传感器1004 的培养基中，从而活细胞1008粘附到光学LID生物传感器1004的表面1010 (步骤1904) ;(c)向细胞培养基中施加一定浓度含有拮抗剂的溶液一段时
93间，直到光学LID生物传感器1004变得稳定(步骤1906)，所述拮抗剂的亲 和力已知；(d)将含有化合物(激动剂)的溶液加入细胞培养基(步骤1908)， 其中该化合物浓度足够高到可与结合于受体的拮抗剂竞争并使拮抗剂脱离受 体；和(e)询问光学LID生物传感器1004，监测培养在光学LID生物传感器 1004上的活细胞1008的时间依赖性光学响应1601 (步骤1910)。
应理解，该方法1900中，通过预先施加针对活细胞1008中一种受体的拮 抗剂可有效筛选化合物针对该特定受体的激动性。而且还应理解，该方法1900 与先前的方法1800类似，只有一个区别就是方法1900需要事先知道化合物对 活细胞中其相应受体的功能性。例如，需要知道该拮抗剂是否抑制GPCR 1020 活化，或该拮抗剂是否活化GPCR 1020从而导致移位。
参考图20，该流程图显示了根据本发明采用光学LID生物传感器1004、 基于活细胞1008中的物质再分布，筛选针对靶标GPCR 1020的拮抗剂的方法 2000。方法2000包括下述步骤(a)提供光学LID生物传感器1004 (步骤 2002) ; (b)将一定数目的活细胞1008置于覆盖光学LID生物传感器1004 的培养基中，从而活细胞1008粘附到光学LID生物传感器1004的表面1010 (步骤2004) ; (c)向细胞培养基中施加一定浓度含有激动剂的溶液一段较 短时间，从而不会发生移位(歩骤2006)，所述激动剂的亲和力已知；(d) 所述较短时间后，将一定浓度含有化合物的溶液加入细胞培养基(歩骤2008); 和(e)询问光学LID生物传感器1004，监测培养在光学LID生物传感器1004 上的活细胞1008的时间依赖性光学响应1601。应理解，和方法1900类似，该 方法2000需要预先知道活细胞1008中的靶GPCR 1020 (的一些信息)，还需 要预先选择针对该特定GPCR 1020的拮抗剂或拮抗剂预先处理活细胞1008。
应理解，步骤2006和歩骤2008可组合为一个步骤；即，可将细胞中耙标 GPCR的已知激动剂与化合物一起加入。还应理解，与方法1700类似，可先加 入待测试化合物，然后加入已知激动剂。
方法1700、 1900和2000中的每一个还可用自参照(self-referencing) 光学LID生物传感器1004进一步强化。众所周知，光学LID生物传感器1004 的性能一般受传感器的设计和特性、光学、以及环境变动(包括环境气温和气 压)的影响。采用自参照光学LID生物传感器1004的一个主要优点是上表面 1010既有参照区又有样品区，样品区可用于检测活细胞1008中的物质再分布， 同时可用参照区(未粘附活细胞1008)参照出干扰性(spurious)变化，这些干扰性变化对活细胞1008中物质再分布的检测有不利影响。
一种实施方式中，可根据图21所示方法2100制备自参照光学LID生物传 感器1004。可通过以下步骤制备自参照光学LID生物传感器1004: (a)提供 光学LID生物传感器1004 (歩骤2102) ; (b)用软印模(如橡胶印模)物 理隔离光学LID生物传感器1004的表面1010的一个区域(参照区)(步骤2104);
(c) 将一定数目的活细胞置于覆盖光学LID生物传感器1004未隔离区(样品 区)的培养基中(步骤2106);和(d)活细胞1008粘附到光学LID生物传 感器1004未隔离区之后移除软印模(步骤2108)。这时，可如方法1800、 1900 和2000所述进行基于活细胞的试验。应理解，可用不同的方法来制备用于细 胞研究的自参照LID传感器。例如，可用物理屏障将传感器分成两部分，介质 中的细胞只施加并覆盖其中的一个部分。细胞贴壁后，移除物理屏障。
现在参照本文公开方法的另一个特征，众所周知，多路细胞试验已变得日 益重要，不仅是因为通量日益增加，还因为从单个试验获得的大量的和确定的 信息。因此，希望本发明方法可以多路模式进行，在某一个时间进行多个试验。
一种实施方式中，采用图22所示的方法2200，可加强本发明方法以在同 一时间进行多个基于活细胞的试验。根据方法2200，可监测多种类型的活性 1008中由于激动剂诱导的GPCR活化引起的物质再分布，歩骤如下(a)提供 光学LID生物传感器1004 (歩骤2202) ; (b)用印模隔离光学LID生物传 感器1004上表面1010的一部分，印模阻止活细胞1008粘附到光学LID生物 传感器1004的所述部分上(步骤2204) ; (c)将第一种类型的活细胞1008 置于覆盖光学LID生物传感器1004未隔离部分的培养基中，从而活细胞1008 能够粘附于光学LID生物传感器1004的表面1010的未隔离部分(步骤2206);
(d) 从光学LID生物传感器1004上表面1010移除印模(步骤2208) ; (e) 将第二种类型的活细胞1008置于覆盖光学LID生物传感器1004的培养基中， 从而第二种类型的活细胞1008能够粘附于光学LID生物传感器1004的上表面 IOIO上刚刚解除隔离的部分(步骤2210) ; (f)向位于光学LID生物传感器 1004的上表面1010上的细胞培养基中施加含有化合物的溶液(步骤2212); 和(g)询问光学LID生物传感器1004以监测时间依赖性光学响应1601，其代 表了光学LID生物传感器1004上的两种类型活细胞1008内的物质再分布(步 骤2214)。
应理解，这两种类型的细胞可与例如以下细胞相关中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和含有过度表达靶受体的工程化CH0细胞。该方法不仅可进行多路细胞试 验，而且因为两种细胞除靶受体表达水平之外其余都相同，所以通过比较同一 化合物施加于两种不同细胞时产生的光学响应，该方法还可提供关于化合物对 靶受体作用的确切结果。
另一种实施方式中，采用图23所示的方法2300，可加强本发明方法以在 同一时间进行多个基于活细胞的试验。根据方法2300，可监测多种类型的活性 1008中由于激动剂诱导的GPCR活化引起的物质再分布，步骤如下(a)提供 含有光学LID生物传感器1004阵列的小室(微量滴定板)(步骤2302) ; (b) 将第一种类型的活细胞1008置于覆盖一个或多个光学LID生物传感器1004的 细胞培养基中，从而第一种类型的活细胞1008能够粘附于一个或多个光学LID 生物传感器1004的表面1010 (步骤2304) ; (c) 将第二种类型的活细胞 1008置于覆盖一个或多个未覆盖的光学LID生物传感器的培养基中，从而第二 种类型的活细胞1008能够粘附于所述一个或多个未覆盖的光学LID生物传感 器1004的表面1010 (步骤2306) ; (d)向位于光学LID生物传感器1004 的上表面1010上的细胞培养基中施加含有化合物的溶液(步骤2310);和(e) 询问覆盖的光学LID生物传感器1010以监测时间依赖性光学响应1601，其代 表了各覆盖的光学LID生物传感器1004上的活细胞1008内的物质再分布(步 骤2312)。
应理解，可将含有不同靶受体基因的不同DNA载体以及转染试剂阵列置于 LID传感器上；放置一种类型的细胞，然后覆盖这些载体和转染试剂使细胞吸 收这些基因。因此，只有各位点上覆盖的细胞被转染并因此形成转染的细胞簇 (US6544790 B1 "Reverse transfection method"("反向转染方法"))。 类似地，可将一系列功能性受体蛋白与蛋白递送试剂复合，然后用于类似的转 染细胞簇 (US2004/0023391A1 "Methods and devices for protein delivery"("蛋白质递送的方法和装置")).利用当前技术，这两种形式 的转染细胞簇均可用于化合物筛选。
另一种实施方式中，采用图24所示的方法2400，可进一步加强本发明方 法以在同一时间在一种类型的细胞中进行多个靶标筛选。根据方法2400，可筛 选一种类型的活细胞1008中针对多个GPCR1020的激动剂，步骤如下 (a) 提供光学LID生物传感器1004 (步骤2402) ;(b)将活细胞1008置于覆盖 光学LID生物传感器1004的细胞培养基中，从而活细胞1008能够粘附于光学
96LID生物传感器1004的表面1010 (步骤2404) ; (c)施加(多种)拮抗剂 的混合(cocktail)溶液(步骤2406) ; (d)向位于光学LID生物传感器1004 的上表面1010上的细胞培养基中施加含有化合物的溶液(步骤2408);和(e) 询问光学LID生物传感器1004以监测时间依赖性光学响应1601，其代表了活 细胞1008内的物质再分布(步骤24)。
应理解，通过改进方法2400，类似的方法可用于在相同的细胞系中筛选针 对多个受体的拮抗剂。不采用步骤2406中拮抗剂的混合溶液，而可采用感兴 趣化合物的溶液；同时，激动剂的混合溶液用于代替步骤2408中的化合物溶 液。
(1)运输动力学研究的重要性
与细胞信号传递途径、相关的细胞活性和其它细胞变化有关的动力学不仅 对于理解细胞生物学和生理很重要，而且对于细胞试验的开发和药物发现也很 重要。例如，EGFR信号传递网络包括的反应从几乎是瞬时的反应(配体结合后 的受体磷酸化)到持续很多分钟的反应(小泡的形成或溶酶体分裂)或某些细 胞系的形态变化。EGFR的运输在很多步骤被调控，包括胞吞、早期内含体分拣 和溶酶体靶向。内化之后，EGFR被转回质膜或被运输到晚期或多泡内含体。晚 期内含体中的受体再被分拣到溶酶体进行降解或循环回细胞表面。受体的占据 (结合)状态表明它们能够参与分拣过程的各歩骤。虽然EGFR信号级联的主 要分层结构和其活化顺序已经公知，但对于控制这么多种细胞响应(如细胞生 长、存活或分化)的复杂动力学网络和关键信号传递事件的了解很少。可监测 对配体介导的EGFR活化的细胞响应的实时动力学的技术将大大有利于了解信 号级联和网络的动力学。
(2) G-蛋白偶联受体途径
GPCR属于细胞表面受体家族，是设计新药物化合物最常针对的耙点之一。 因为GPCR可将外源信号(即刺激物例如新药的存在)转导为细胞内响应，这 使它们极有价值作为药物靶点和用于新药测试。
GPCR参与多种细胞信号传递途径。配体结合启动了一系列细胞内和细胞信 号传递事件，包括受体构象变化，受体寡聚化，G蛋白活化(GDP-GTP在G。亚 单位上互换，G。和Gh解离，G蛋白与受体分离，产生G「和Gp、—信号传递复
97合物)，和导致产生第二信使(C,移动，产生肌醇三磷酸，和/或细胞内cAMP
水平的调节)并最终导致具体基因表达变化的下游信号传递活化。配体介导的
GPCR活化还导致GPCR从细胞表面脱敏、很多细胞内蛋白的运输，以及靶细胞 的表型、形态和物理特性的变化。这些变化可以是静态的、长久的或动态的(例 如，循环或摆动)。不同的信号传递事件显示出显著不同的动力学，从毫秒(例 如GPCR构象变化)至几十秒(例如Ca"流)至甚至几十分钟(例如基因表达或 形态变化)。现有的GPCR试验包括配体-受体结合试验、第二信使(Ca2+、 IP3 的cAMP)试验、蛋白相互作用试验、移位试验和报告基因试验。因为GPCR活 化最终导致蛋白运输和/或形态变化，所以需要可研究任意化合物通过GPCR对 细胞表面的作用以及被作用的细胞的后续事件(例如，运输和/或形态变化) 的方法。
(3)受体酪氨酸激酶(RTK)信号传递途径 (a) RTK的多样性
在所有真核生物中， 一大类基因编码的蛋白质的功能是作为跨膜细胞表面 受体。基于它们识别的配体、诱导的生物学反应以及其一级结构，膜受体可分 为不同的家族。 一个很大的细胞表面受体家族具有内在受体酪氨酸激酶(RTKs) 活性，催化ATP的磷酸根转移到靶蛋白酪氨酸的羟基上。RTKs在很多基本细胞 过程的控制中发挥重要作用，这些细胞过程包括细胞周期、细胞迁移、细胞代 谢和存活、以及细胞增殖和分化。
受体酪氨酸激酶(RTKs)属于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的一个超家族。PTKs 是一个很大的、多样性的多基因家族。它们的主要功能包括调控生物体的多细 胞方面。与生长、分化、贴壁、运动和死亡有关的细胞至细胞的信号常常通过 酪氨酸激酶传递。相反，很多丝氨酸/苏氨酸家族，如周期蛋白依赖性激酶和 MAP激酶，在真核生物中是保守的，调控单细胞和多细胞生物体中的过程。人 类中，已证明酪氨酸激酶在很多疾病状态(包括糖尿病和癌症)的发展中发挥 重要作用。历史上，酪氨酸激酶确定了一类致癌基因的原型，参与大多数人类 恶性肿瘤。酪氨酸激酶基因还与很多先天性综合征有关。酪氨酸激酶含有高度 保守的催化结构域，与蛋白丝氨酸/苏氨酸和双特异性激酶中类似，但它还有 独特的亚结构域基序清楚地表征这些成员是酪氨酸激酶。已在海绵动物、刺胞 动物、线虫、环节动物、节肢动物、棘皮动物、脊索动物以及其它动物中鉴定
98到酪氨酸激酶。基于内含子/外显子结构或系统发生序列分析，人类的酪氨酸 激酶可分类为20种受体和IO种非受体类别。
所有受体酪氨酸激酶都含有通常是糖基化的并参与受体二聚化的胞外配 体结合结构域。该配体结合结构域通过一个跨膜螺旋连接于胞质酪氨酸激酶结 构域。胞质结构域含有保守的蛋白酪氨酸激酶(PTK)核心和另外的调控序列， 它们自身磷酸化并被异源蛋白激酶磷酸化。RTK可进一步分类为几个受体亚家 族例如，胰岛素受体(IR)家族、表皮生长因子(EGF)受体家族、PDGF受 体家族。受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(EGF)家族由四个受体组成EGF-R (ErbBl) 、 ErbB2 (Neu) 、 ErbB3和ErbB4。
(b) RTK的二聚化
除RTK的胰岛素受体(IR)家族之外，所有巳知的RTK (例如表皮生长因 子(EGF)受体、PDGF受体)在质膜中都是单体。配体结合诱导了这些受体的 二聚化，导致其细胞质结构域的自身磷酸化。IR家族成员是形成22-异二聚体 的两条多肽链通过二硫键连接的二聚体。胰岛素结合于IR的胞外结构域，诱 导四元的异源四聚体结构重构，导致胞质结构域的自身磷酸化增加。
虽然所有RTK都通过二聚化活化，但不同配体诱导形成不同的活化二聚体 状态。具体的配体限定二聚体对；二聚体对继而限定信号传递途径。生长激素 (GH)和GH受体(GHR)的复合、促红细胞生成素(EPO)和EPO受体(EPOR) 的复合的结构研究表明，这些细胞因子是二价的， 一个配体同时结合于两个受 体分子，形成1:2 (配体受体)复合物。受体二聚化被另外的受体受体相 互作用进一步稳定。只有RTK和细胞因子受体的胞外和细胞质结构域均具有独 特构型的某些形式的受体二聚体导致反式自身磷酸化和PTK刺激。
(c) EGFR
EGR受体，如上所述由四个成员组成，属于受体酪氨酸激酶家族，事实上 在哺乳动物所有器官中都表达。在胚胎和出生后发育以及肿瘤进展中，EGF受 体发挥的作用很复杂。除它们在生长和发育中的作用之外，EGFR受体还参与转 活过程，和其它受体如GPCR有交叉。
(d) EGFR信号传递途径
99EGFR和其相应配体的结合导致产生很多细胞内信号(如图38所示)。配 体结合后，最初的变化是受体二聚化形成同二聚体或与其它家族成员的异二聚 体，受体激酶活性的活化和受体在细胞质结构域的酪氨酸残基上的自身磷酸 化。受体自身磷酸化为很多二级信号蛋白产生了停泊位点，这些二级信号蛋白 带有特定的蛋白相互作用结构域如Src同源区2 (SH2)结构域，其与磷酸化 的酪氨酸残基特异性相互作用。各二聚化的受体复合物通过募集不同的含有 SH2的效应子蛋白而启动不同的信号传递途径。作为这种相互作用的结果，这 些二级信号蛋白自身被活化并引发很多下游信号。例如，活化的EGF-R二聚体 与接头蛋白Grb复合，Grb偶联于鸟嘌呤核苷酸释放因子SOS。 Grb-S0S复合物 可直接结合受体中的磷酸酪氨酸位点，或通过Shc间接结合。这些蛋白相互作 用使SOS非常靠近Ras，从而使Ras活化。这又继而活化ERK和JNK信号传递 途径，它们继而活化转录因子，例如c-fos、 AP-1和Elk-l，这些转录因子促 进基因表达并有助于细胞增殖。促进细胞增殖的一个具体途径包括信号蛋白 Shc、 Grb2、 Sos、 Ras、 Raf、 MEK、 ERK禾口 ERK/MAPK，称为Ras/MAPK途径。
(i) EGra信号传递和物质再分布
EGFR的配体包括EGF、 TGF-ci 、双调蛋白、肝素结合EGF样生长因子、P -动物纤维素和表皮调节蛋白(印iregulin) 。 EGFR可被很多不同配体之中任 何一个的结合而活化，各配体似乎刺激产生多少不同的生物反应。而且，随着 受体微环境例如小泡内pH值的不同，不同的EGFR配体结合受体的能力不同。
结合后，活化的EGFR迅速被胞吞作用内化。受体介导的胞吞作用可使细 胞表面受体特异性去除、从质膜卸除并使它们靶向内含体，在那里它们被分拣 以使之下调或进行再循环。胞吞之后，受体-配体复合物经过几个不同的区室， 这些区室中的小泡内环境不同。受体在细胞区室间移动(称为运输)对复合物 活性具有重要作用。不同细胞内区室对一些EGFR激酶底物的可获得性也不同。 不同的胞吞区室中底物可获得性和依赖配体的活性之间的联合关系暗示，运输 能够"解码"各配体独特的信息。而且，配体-受体相互作用的持续性控制受 体运输。因此，受体胞吞和降解是控制信号大小、反应特异性和反应持久性的 重要机制
配体诱导的EGFR内化是一个可饱和的过程，EGFR表达水平的增加超过某 个阈值将导致受体内化的削弱。
100EGF受体的内化可通过诱导途径或组成型途径。通过诱导途径形成的小泡 称为被膜小窝(coated-pit)介导的早期内含体(EE)小泡。所有EE小泡都 经过分拣阶段，它们可返回细胞表面或合并到晚期内含体(LE)中。当EE小 泡再循环回到质膜(PM)时，所有它的受体都成为PM的一部分，任何未结合 的配体都被释放到胞外介质中。类似地，当EE细胞合并入LE时，其所有内含 物都被转移到LE。再循环回到质膜的速率和合并入晚期内含体的速率取决于 EE小泡的类型。胞吞小泡以很快的速率或延时之后(即，缓慢)被再循环回到 质膜。 一般，被膜小窝EE小泡缓慢再循环回到质膜，很大百分比的被膜小窝 EE小泡合并到LE。相反，组成型EE小泡具有更快的再循环速率，因此它们大 多数返回到质膜。受体在LE中经过第二阶段的分拣，被标记然后降解并送到 溶酶体，或者再循环回到细胞表面。小的囊泡以一定速率从执行分拣的内含体 逃脱。这种囊泡或融合入溶酶体使其内含物被降解，或再循环回到质膜。从机 械学上讲，从晚期内含体再循环的受体可能经过高尔基体。这些胞吞过程的净 结果导致EGFR活化后细胞中的定向物质再分布。
取决于具体细胞系中的细胞情况，配体诱导的EGFR活化可导致不同的信 号传递途径或多个信号传递途径，其中一个信号途径相对于其它信号途径占优 势。而且，各细胞系的EGFR表达水平可能不同。因此，不同细胞系中，细胞 中由配体诱导的EGFR活化而介导的物质再分布可能不同。例如，人表皮样癌 A431细胞已知可内源性过度表达EGFR (~1，700, 000拷贝/细胞)，因此已被 用作EGFR信号传递的理想模型 (D. W. Barnes, "Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum—free cell culture," J. Cell. Biol. 1982， 93， 1 - 4) 。 EGF结合之后，A431中的EGFR 被活化，导致通过不同途径(包括Ras/MAPK途径)导致多种细胞响应。例如， 37。C用EGF刺激休眠的A431细胞导致受体胞吞、可折射的(refractile)形 态变化和细胞从胞外基质脱离 (Z. Lu, G. Jiang， P. Blume-Jensen, and T. Hunter, "Epidermal growth factor—induced tumor cell invasion and metastasis initiated by d印hosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase, ，， Mol. Cell Biol. 2001， 21， 4016 - 4031，禾口 Y. Danjo 禾口 I. K. Gipson， "Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement, ，， J". Cell Sci.1998， 111， 3323 - 3332)。另外，受体胞吞是弱化EGF信号的重要细胞过程， 虽然一些证据暗示EGF受体复合物在内含体区室中继续进行信号传递。胞吞过 程包括多个步骤细胞内组分募集到活化的受体，产生的复合物随后内化到内 含体，内化的受体复合物在几个细胞内区室间移动，最终降解和再循环回到细 胞表面。此外，因为这些配体的大小、细胞表面受体的密度、所用细胞系(如 A431细胞系)的密度和形态以及活化后受体的运输，在RTK途径中有很多信号 传递事件导致定向物质再分布。例如，配体结合到细胞表面EGFR导致细胞表 面的质量增加；随后的自身磷酸化和细胞内组分与活化的EGFR的相互作用导 致短时期内物质再分布的净零变化。活化的受体的运输导致各细胞不同区室内 显著的物质再分布。
物质再分布的另一个可能来源是细胞骨架重构。例如，受体募集到质膜处 的网格蛋白小窝启动EGFR运输过程，网格蛋白小窝是将网格蛋白和接头组装 到质膜细胞溶质表面上的蛋白网格而形成的结构。网格蛋白多聚化成六角形阵 列中为组织接头提供了骨架，接头识别内化受体的细胞质结构域的序列基序。 虽然连接肌动蛋白丝和胞吞机器的具体组分还不清楚，但据信肌动蛋白细胞骨 架有助于网格蛋白小窝的形成。皮层肌动蛋白(Cortactin)是F-肌动蛋白相 关蛋白，位于培养细胞的质膜褶皱处，是大GTPase发动蛋白(dynamin)的直 接结合配对蛋白。皮层肌动蛋白和肌动蛋白、发动蛋白一起，是受体介导的胞 吞机制的重要组分 (Bajzer， Z.，等，"Binding internalization, and intracellular processing of proteins interacting with recycling receptors - a kinetic analysis" ， J. Biol. Chem. 1989， 264:13623 - 13631)。
(ii) EGFR的组成型活性
据认为，受体单体与受体二聚体平衡。很有限的一部分受体二聚体胞外和 胞质结构域的四聚结构构型与反式-自身磷酸化和PTK活性的刺激相容(活性 二聚体)。结合于胞外结构域的配体稳定了活性二聚体的形成并因此稳定了 PTK 刺激。已提出，即使不存在配体结合，也存在活性二聚体，因为即使不存在配 体结合，RTK的自身磷酸化也可被蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂加强或被受体过 度表达而加强。实验显示，每分钟质膜上2%的未结合(无配体)受体和15% 配体结合的受体被内化。而且，在用含相对低浓度生长因子如胎牛血清(FBS)
102(低于0.5重量％)或无FBS的培养基培养获得的休眠A431细胞中，由于其 为组成型，仍然有一定程度的EGFR磷酸化。
图7表示EGF剌激导致强烈的剂量依赖性动态响应(见图7A) ; EGF浓度 增加时，限定响应的三种主要生物传感器参数显著改变。EGF浓度越高，l)P-D服 和N-DMR信号的振幅越大，2) P-DMR和N-DMR事件的动力学越快，禾B 3)导致 P-DMR至N-DMR事件转换的时间(转换时间t )越短。当P-薩R事件的振幅显 示与EGF浓度的并发(complicate)关系时，N-DMR信号的振幅显示对EGF的 强烈和可饱和性剂量依赖，产生EC50为约1.45 nM (见图7b)。随着EGF浓 度增加，发现以秒计算的转换时间t呈指数减少(见图7c):另外，N-D服信 号的衰减可用非线性回归拟合。获得的一相衰减常数K也产生通常的可饱和反 应，Kd为5. 76nM (见图7d)。那些剂量依赖性动力学参数(转换时间和N-D服 相的衰减常数)和以前与耙基因C-fos在HeLa细胞中表达的动力学和EGFR胞 吞的动力学有关的实验数据和计算机预测很好的吻合(Schoeberl， B. ， C. Eichler-Jonsson， E. D. Gilles， and G. Muller. "Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF rec印tors" . Nat. Biotech. 2000， 20:370 - 375)。这 些结果表明，EGF诱导的细胞形态改变和受体胞吞是DMR事件，D服是EGFR活 化依赖性事件。
(e) PDGFR
与EGFR类似，血小板衍生的生长因子(PDGF)已证明可驱动细胞反应， 包括增殖、存活、移动和细胞外基质的沉积以及组织重塑因子。敲除研究证明， 对PDGF的很多细胞响应在小鼠发育过程中是很重要的。有两种配体，PDGFa和 PDGFb，两种受体，PDGF受体a和PDGF受体P (分别是PDGFR a禾卩PDGFR P )。 PDGFb和PDGFRI3对维管系统中支持细胞的发育很重要，而胚胎发生过程中更 广泛地需要PDGFa和PDGFR a ，它们在很多情况下发挥重要作用，包括中枢神 经系统、神经嵴和器官发育。
PDGF信号传递网络由四种配体PDGFA-D和两种受体PDGFR a和PDGFRfi组 成。所有的PDGF都作为分泌型、二硫键连接的同二聚体发挥作用，但只有PDGFA 和B可形成功能性异二聚体。PDGFR也可作为同或异二聚体发挥功能，体外试 验已证明配体对a 13和郎受体的亲和性不同。所有已知的PDGF都具有特征性
103"PDGF结构域"，包括参与分子间和分子内键的八个保守性半胱氨酸。
PDGFR是受体酪氨酸激酶，就象EGFR—样。各受体在胞外配体结合结构 域有五个免疫球蛋白重复，在胞质区有一个分裂酪氨酸激酶结构域。配体结合 之后，PDGFR 二聚化，激活酪氨酸激酶结构域，然后在受体胞质结构域自身磷 酸化几个酪氨酸残基。这为信号蛋白和接头创造了停泊位点，这些信号蛋白和 接头在PDGFR结合后启动信号传递。两种受体可活化很多同样重要的信号传递 途径，包括Ras-MAPK (分裂素活化的蛋白激酶)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) 和磷脂酶C途径。然而，与PDGFRa和PDGFRI3相互作用的蛋白谱有轻微差别， 导致它们在体外的功能性有一些差别。
与EGFR信号传递途径类似，PDGFR的活化也可导致可被光学生物传感器监 测并分析的显著物质再分布。
(f)其它RTK
酪氨酸激酶主要可分为受体酪蛋白激酶(RTK)，例如EGFR、 PDGFR、 FGFR、 IR，禾口非-受体酪蛋白激酶(NRTK)，例如SRC、 ABL、 FAK和Janus激酶。除 EGFR和PDGFR之外，其它受体酪氨酸激酶包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子 I受体 (IFG-1R)、神经生长因子受体(NGFR)、成纤维细胞生长因子受体 (FGFRs)。类似地，这些RTK不仅是细胞表面跨膜受体，而且是具有激酶活 性的酶。受体酪蛋白激酶的结构组织显示多结构域的细胞外配体(用于传递配 体特异性)、单通路(single pass)跨膜螺旋和含有酪氨酸激酶结构域的细 胞溶质部分。激酶结构域在N端和C端都有规则序列。
NRTK细胞溶质蛋白，显示可观的结构可变性。NRTK具有激酶结构域，并 且常具有几个另外的信号传递或蛋白-蛋白相互作用结构域如SH2、SH3和ra结 构域。酪氨酸激酶跨越约300个残基，其N末端部分(lobe)由5条链的P片 层和一个a螺旋组成，C末端是一个大的胞质结构域，主要是a螺旋。ATP 结合到两个末端部分(lobe)之间的裂口中，含有酪氨酸的蛋白质底物序列与 C末端部分(lobe)的残基相互作用。通过配体结合于细胞外结构域，然后受 体二聚化，促进细胞溶质结构域的转磷酸化，从而活化RTK，而NRTK的活化机 制要更为复杂，包括异源蛋白-蛋白相互作用以发生转磷酸。
(4)细胞骨架调节
104细胞骨架是细胞质中含有的独特的细胞"架构"或"骨骼"。细胞骨架是 复杂和动态的蛋白纤丝网络，延伸经过真核细胞的细胞质。细胞骨架参与执行 细胞中的多种活性。它通过为细胞提供抗张强度而维持细胞形状。它还引起一 些运动(利用鞭毛和纤毛等结构)，在细胞内运输(例如，小泡和细胞器的运 动)和细胞分裂中发挥重要作用。通过提供"轨道"使细胞可在上面移动细胞 器、染色体和其它物质，细胞骨架参与细胞内信号传递和运输。
细胞骨架赋予真核细胞形状和组织。细胞骨架的长纤维是亚单位的多聚 体。组成细胞骨架的主要纤维类型是微丝、微管和中间丝。(i)微丝是由一 串蛋白组成的扭曲双链，通常7mn至12cm长。蛋白是肌动蛋白。其功能有助 于肌肉收縮、细胞形状和细胞质中的运动。(ii)中间丝由八个亚单位组成索 状。这些蛋白的结构在不同组织类型中也不同。该组分有助于维持形状、支持 神经细胞延伸和粘附细胞。(iii)微管是由形成螺旋的两部分亚单位的管构 成。它由微管蛋白组成，有助于染色体移动、细胞器移动、纤毛和鞭毛的移动。 例如，在肠内皮细胞中，存在所有这三种类型的纤维。微丝伸入绒毛中，赋予 细胞表面以形状。微管从中心体长出至细胞周缘(pheriphery)。中间丝通过 桥粒连接相邻细胞。
(a)细胞骨架结构
细胞骨架是细胞的"架构"或"骨骼"，象所有其它细胞器一样，包含在 细胞质中。它是一种动态结构，维持细胞形状，引起一些运动(利用鞭毛和纤 毛等结构)，在细胞内运输(例如，小泡和细胞器的运动)和细胞分裂中发挥
重要作用。真核细胞有三种细胞骨架蛋白丝肌动蛋白丝、中间丝和微管
(Janmey， P. A. ( 1998) . The cytoskeleton and cell signaling: component
localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78， 763-781))。
肌动蛋白丝直径约7nm。该蛋白丝由两个肌动蛋白链组成螺旋状。它们主要集
中于质膜下，因为它们保持细胞形状，形成胞质突起(如伪突起和微绒毛)， 参与一些细胞-细胞或细胞-基质的连接以及信号的转导。它们对于胞质分裂
(和肌球蛋白一起)以及肌肉收縮也非常重要。中间丝直径约8-11纳米。它 们是细胞骨架中更稳定(强烈结合)和异源的组分。它们组织细胞内部的三维 结构(例如，它们是核膜或肌节的结构成分)。它们也参与一些细胞-细胞和 细胞-基质的连接。微管是约25nm的中空圆柱状结构，由13根原丝组成，这些原丝是a和e微管蛋白的多聚体。它们的行为非常动态，结合GTP以进行多 聚化。它们由中心粒组织。这些蛋白丝在细胞内运输(与动力蛋白和驱动蛋白 一起，运输细胞器如线粒体或小泡)和有丝分裂纺锤体中发挥重要作用。
(b)生物物质从经透化处理的细胞中有控制地释放
关于生物物质从经透化处理的细胞中有控制地释放的描述可见 Negrutskii， B. S.禾口 Deutscher， M. P. ( 1992 ) "A sequester pool of aminoacyl-tRNA in mammalian cells，， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 3601-3604; Negrutskii， B. S. ， Stapulionis, R.和Deutscher， M. P. (1994) "Supmmolecular organization of the mammalian translation system" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 3601-3604，整体纳入本文作为参考，至少 针对与生物物质从经透化处理的细胞中有控制地释放相关的描述。
活细胞是一个大分子的集合。很多研究已证明，内源性大分子通过直接结 合于细胞骨架成分而在哺乳动物胞质中具有高度组织性。细胞骨架，尤其是肌 动蛋白微丝网络在维持这种组织性方面具有重要作用。
经透化处理的细胞已被用于检测细胞结构。用很多化学品或生物制品处理 细胞可在细胞表面上形成孔，产生透化的细胞。这些化学品或生物制品包括去 污剂如皂苷和菲律宾菌素(filipin)，或毒素如毛地黄皂苷或链球菌溶血素0。 然而，与其它成孔试剂相比，如果仔细滴定，皂苷对内部膜造成的损伤最小， 并且可产生很均匀的透化细胞群(〉97%)。皂苷是一种衍生自植物的糖苷，以 其可使质膜产生允许可溶性蛋白分散的足够的孔隙而知名。虽然皂苷处理的细 胞会损失一部分生物大分子，但产生的透化细胞仍然保持了活细胞的大部分生 物功能。这一点已得到以下事实的支持虽然蛋白质合成是一个很复杂的过程， 但这些透化细胞中的蛋白质合成保持较高水平，说明该系统保持了完整细胞的 很多原有结构完整性。这是因为大部分大分子是作为有组织的细胞结构而被隔 绝的(sequestered)，所以它们不会从这些透化细胞中释放出来。例如，在 透化细胞中，翻译机器的组分，如tRNA、氨酰-tRNA合成酶、和EFl通常是高 度隔绝的。不但蛋白质合成机器被细胞骨架隔绝，细胞的很多其它组分也稳定 地或瞬时地与细胞结构相结合；这些瞬间结合的组分可从透化细胞中部分释放 出来。
然而，微丝被破坏之后，蛋白质合成显著减少，伴随着这些翻译组分从细
106胞中释放。另外，细胞骨架结构破坏之后，很多其它隔绝的生物大分子也从透 化细胞中释放出来。这些从透化细胞中再被释放的物质引起质量损失；因此导 致LID传感器表面上的细胞层的有效折射率变化，这种变化可被LID传感器检 测到。因此，用光学生物传感器获得的变化可用于指示干扰细胞骨架结构的调 节剂。
通常，筛选干扰细胞骨架结构的调节剂的方法主要基于采用体外试验的结 合亲和性检测，包括肌动蛋白结合蛋白试验、微管稳定性/去稳定性试验和肌 动蛋白/微管多聚化试验。其它方法基于高分辨率荧光显像技术，直接观察细 胞内骨架结构，或者在化合物处理后检测细胞运动性，或检测细胞骨架相互作 用标记物蛋白如Cdc42或Rho的活化。
本文公开了无标记检测方法，采用光学生物传感器筛选干扰细胞骨架结构 的调节剂。
公开了光学生物传感器领域的一些方法，在某些实施方式中，公开了采 用光学标记独立性检测(LID)生物传感器(例如基于波导光栅的生物传感器) 实时监测化合物诱导的细胞内组分释放的系统和方法，所述细胞内组分在透化 细胞和功能性细胞中被细胞骨架隔绝。公开了一种方法，采用化学品或生物制 品产生可允许可溶性蛋白质扩散通过的透化细胞。公开了使用光学LID生物传 感器筛选细胞骨架组分的调节剂的系统和方法。
与所有研究细胞骨架结构的现有试验技术不同，本文公开的方法提供无标 记的实时方法来筛选干扰细胞骨架结构的调节剂。此外，与所有研究细胞骨架 结构的现有的基于细胞的试验不同，本发明方法利用保持了活细胞的大多数生 物功能、但比活细胞简单得多的透化细胞。与一般针对单个耙标筛选调节剂的 基于荧光显像的试验不同，本发明方法提供多路能力，即可筛选细胞中干扰多 个靶标的调节剂。与完全内反射荧光显像技术结合，本发明方法提供高信息含 量的筛选，包括动力学、亲和性、涉及的靶标以及毒性。
图25表示基于实时检测化合物诱导的细胞内组分释放的方法的实施例， 所述细胞内组分在透化和功能性细胞中被细胞骨架隔绝。该方法包括使用成孔 剂(如皂苷)产生允许可溶性蛋白质扩散通过的透化细胞。已知用很多成孔剂 处理细胞可产生透化细胞。因为细胞内大分子通过直接结合于细胞骨架成分而 在哺乳动物细胞质中具有高度组织性，所以虽然皂苷处理的细胞损失了一部分 生物大分子，但透化细胞通过细胞骨架超-集合的结构隔绝细胞内机器而仍然
107保留了活细胞的大多数生物功能。然而，微丝被破坏之后，蛋白质合成显著减 少，伴随着这些翻译组分从细胞中释放。另外，细胞骨架结构破坏之后，很多 其它隔绝的生物大分子也从透化细胞中释放出来。这些从透化细胞中再被释放 的物质引起质量损失；因此导致LID生物传感器表面上的细胞层的有效折射率 变化，这种变化可被LID生物传感器检测到。因此，用光学生物传感器获得的 变化可用于指示干扰细胞骨架结构的调节剂。 一种实施方式中，可用图25所 示的方法2500筛选扰细胞骨架结构的调节剂。根据方法2500，可监测由于成 孔剂如皂苷在活细胞1008中诱导的细胞表面膜成孔而造成的物质再分布，步 骤如下(a)提供光学LID生物传感器1004 (步骤2502) ; (b)将细胞培 养基中的活细胞1008置于所述生物传感器1004上(歩骤2504) ; (c)任选 施加缓冲溶液(步骤2506) ; (d)将含有化合物的溶液加入覆盖的光学LID 生物传感器1004上表面1010上的细胞培养基中(步骤2508);施加含有成孔 剂的溶液(歩骤2510);和(e)询问覆盖的光学LID生物传感器1010,监测 时间依赖性光学响应，其表明了透化细胞1008中的物质再分布(步骤2512)。 成孔剂是接触细胞时可导致细胞表面膜形成孔隙的化学或生物化合物或组合 物。
通常，本文所述用光学生物传感器进行的与细胞功能或活性相关的检测或 试验可实时进行。虽然很多光学输出信号可用于细胞监测和检测，与刺激诱导 的定向物质再分布动力学相关的输出参数是实时监测细胞信号传递及其结果 的两个参数。
细胞信号传递途径，包括但不限于Ras/MAPK途径、cAMP途径、GPCR信 号传递途径、RhoA途径、Akt途径、整联蛋白(intregin)途径、GPCR弱化途 径、G蛋白途径、Ca途径、磷脂酶C途径、细胞转化途径、细胞迁移途径、 细胞粘附途径等，可与用光学生物传感器检测到的D服信号相关。例如，MAPK 激酶途径的活化已鉴定为在细胞扩展或移动过程中利用整联蛋白调控基因表 达从而导致细胞形态变化的一种机制。上皮细胞响应于细胞外基质(ECM)， 引起整联蛋白介导的FAK磷酸化，继而磷酸化周围的蛋白(桩蛋白(paxillin)、 Fyn/shc、和src)，导致信号放大。FAK还结合PI-3激酶，并在MAP激酶途 径的上游。当MAP激酶或PI-3激酶被抑制，阻断了肌动蛋白的重新组织。Src 磷酸化pl90RhoGAP，使其GAP功能失活(使RhoGTP保持更长久的活性)，促 进进一步信号放大。活化的RhoGTP结合下游激酶如与Rho结合的巻曲的含巻曲蛋白激酶 (pl60ROCK)和p140透明(diaphanous) (pl40Dia)，从而 增加肌动蛋白多聚化和收縮。肌动蛋白的重新组织有助于整联蛋白成簇，产生 更多ECM结合，增加FAK活化和其它信号传递事件。因为细胞信号传递途径及 其在细胞中产生的结果强烈依赖于细胞背景，因此应理解对于给定的细胞类 型，通过特定和预定的靶标活化给定的信号途径可能不导致任何DMR (即，刺 激可能只导致净零DMR相)，或一些情况下，引起的DMR响应和使用不同细胞 系时获得的响应不同。而且，通过不同靶标(例如，GPCR和RTK)引起的刺激 介导的特定信号传递途径的活化可导致同一种细胞类型相同或不同的DMR响 应。换句话说，由通过特定靶标引起的刺激介导的DMR代表了多种细胞信号网 络相互作用的整合的和代表性的结果。而且，剌激诱导的细胞响应可能还依赖 于细胞条件(例如，增殖vs休眠状态，或分化vs未分化，细胞周期状态一 一G1 vs其它状态，等)。 一些情况下，粘附于传感器表面的细胞可能需要预 先处理以达到希望的状态。例如，为了研究某些靶标对某具体信号传递途径造 成的最终导致细胞生长和增殖和/或分化的刺激诱导性活化，优选细胞处于休 眠状态。为了达到休眠状态，需要用只有很少或没有任何生长因子或刺激细胞 生长和增殖的类似因子的培养基预处理处于增殖状态的细胞。因为细胞的功能 和动态，预处理时间对达到希望的状态也很重要。
本文公开了具体用于研究细胞途径的活化及其结果的方法，该方法需要预 处理细胞使其达到休眠状态而非增殖状态。RTK可作为例子。 一种实施方式中， 公开了实时监测细胞中的配体结合以及相继的信号传递事件的方法，包括
(a)提供基于光学的无标记生物传感器；(b)将具有受体酪蛋白激酶的细胞 置于传感器表面；细胞悬浮在含有生物传感器表面的细胞贴壁和生长所需某浓 度血清的培养基中；(c)任选在37'C不含或含有低浓度血清的培养基中培养 贴壁细胞使其饥饿；(d)将具有一层所述细胞的生物传感器置于检测系统中， 监测响应；(e) 任选在某时间中向细胞培养基中至少施加一次缓冲溶液；
(f)任选向培养基中施加含有RTK配体的溶液；和(g)监测所述贴壁细胞 层的时间依赖性响应。优选对具有RTK的细胞进行饥饿处理以使细胞对配体的 响应最大化，因为在血清中可找到很多生长因子。这些生长因子包括PDGF (血 小板衍生的生长因子)、EGF、胰岛素、TGF-a 、胰岛素样生长因子I (IGF-I)、 和神经生长因子(NGF)。不含或含有低浓度( 0. 5。/。)血清或牛血清白蛋白(BSA) 的培养基可用于使细胞饥饿。饥饿时间通常包括过夜饥饿。应理解，本文公开
109的这些方法不限于RTK信号传递途径；可用于很多其它类型的靶标，如促有丝 分裂的GPCR及其配体。
另一种实施方式中，公开的方法用于检测和确定细胞中RTK的表达水平和 细胞表面表达水平，该方法包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，各孔具
有嵌在底部的基于光学的无标记生物传感器；(b)提供多种类型的细胞；(C) 将悬浮在培养基中的一种类型的细胞置于至少一个孔中；(d)在合适的培养 基中培养细胞使其贴壁和生长直到达到一定水平的铺满度；(e)将具有生物
传感器的微量滴定板(各生物传感器覆盖有一层细胞)置于检测系统中，监测
响应；(f)向培养基中施加含有RTK配体的溶液；(g)监测和比较不同细胞
类型的细胞层的时间依赖性响应。不同细胞类型可能需要不同培养基。对于同
一类型的细胞，可用不同的培养基研究培养基对感兴趣的RTK在细胞表面表达 水平的影响。
另一种实施方式中，公开的方法利用光学生物传感器确定配体对RTK的效 力，该方法包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，各孔具有嵌在底部的基 于光学的无标记生物传感器；(b)在培养基中提供一定数目的、具有相对高 水平RTK表达的细胞，使细胞以所需覆盖率粘附于各生物传感器；(c)更换 培养基使粘附的细胞饥饿一段时间；(d)将具有生物传感器的微量滴定板(各 生物传感器覆盖有一层细胞)置于检测系统中，监测响应；(f)向覆盖各生 物传感器的培养基中施加含有不同浓度配体的溶液；(g)监测和比较细胞的 剂量-和时间-依赖性响应。剂量依赖性结合和DMR信号及其相应的动力学可 用于确定配体对感兴趣RTK的效力。应理解，这些方法也可用于确定抑制剂对 下游靶标的效力，所述下游信号在由于RTK或其它信号分子的活化以及后续细 胞变化而产生的总D服信号中有重要作用。例如，休眠A431细胞的EGF诱导 的D服信号可被以下信号细调或受其影响下游信号例如MEK1/2、 或肌动蛋 白丝多聚化、或发动蛋白或受体激酶活性，或上游信号分子如某些GPCR激动 剂包括氯化氨甲酰胆碱。也可利用靶标调节剂独特的DMR特征或其对获得的总 DMR信号的作用来检测调节剂的效力。
还公开了影响RTK信号传递的调节剂的筛选方法。该方法包括(a)提 供基于光学的无标记生物传感器；(b) 将具有感兴趣RTK的一定数目的细胞 置于培养基中覆盖所述生物传感器从而细胞粘附于生物传感器表面；(c)用 所述生物传感器监测细胞响应；(d)向细胞培养基中施加一定浓度含有化合物的溶液；(e)施加含有RTK配体的溶液并连续监测生物传感器上培养的细 胞的时间依赖性响应。
(5)检测胆固醇运输
细胞膜上胆固醇正确的细胞内分布对哺乳动物细胞的很多生物功能非常 重要，其中包括信号传递和膜运输。胆固醇在膜运输中的突出作用正变得日益 明显。例如，位于质膜上的胆固醇耗竭抑制网格蛋白介导的胞吞，但小泡再循 环似乎不受影响。既然直接检测胆固醇不可行，已开发了几种间接方法来研究 胆固醇的细胞内分布和脂类信号传递。利用非浸透(impermeant)淬灭剂进行 荧光甾醇的发射淬灭已用于确定胆固醇在质膜中的跨膜双层(transbilyar) 分布。然而，这种方法并不理想，部分是因为荧光胆固醇类似物相比胆固醇在 性质上可能有量上的差别。而且，虽然胆固醇在水中溶解度很差，但它能够以 可察觉的速率自发地从膜上解吸附。大多数时候它会回到同一个质膜，但它也 可结合到存在的任何其它疏水结合位点。
可将3H-醋酸盐掺入活细胞中并在不同时间检测分离的膜中3H胆固醇的 量来确定新合成胆固醇的运输和分布。放射性标记的胆固醇和胆固醇酯可被递 送到脂蛋白。可用直接化学方法如气相色谱-质谱或间接方法如基于胆固醇氧 化酶的试验来检测总胆固醇。为了应用检测胆固醇运输和分布的这些方法，必 须纯化感兴趣的各种细胞器。获得高度纯化的膜部分一般非常困难；耗时的纯 化过程可能增加胆固醇转移的风险。当细胞器可被容易地分离时，例如对于ER 和质膜，这些方法非常有用，当涉及内含体或高尔基体膜等细胞器时，这些方 法可能很难翻译。
菲律宾菌素染色已广泛用于检测完整细胞里多种膜细胞器中的胆固醇，因 为这种荧光去污剂选择性结合胆固醇但不结合胆固醇酯。菲律宾菌素是一种较 弱的荧光基团，可用冷电荷耦合(cooled charge-co叩led)器件照相机来检 测。然而，菲律宾菌素染色只能提供胆固醇分布的定性信息，因为荧光强度不 一定与胆固醇含量成线性相关。另一个限制是胆固醇与菲律宾菌素孵育的过程 中可能发生再分布。因此，从采用菲律宾菌素的试验中不可能定量胆固醇的细 胞内分布。
已发展了一些专门技术如胆固醇氧化酶试验来定量质膜中的胆固醇。如果 该酶进入细胞内区室(例如由于活细胞胞吞或膜破裂)或试验中胆固醇移动到
111质膜中，则该试验会过高估计质膜上胆固醇的量。虽然已开发了很多方法检测 细胞中的胆固醇分布，但所有这些方法(结果)的解释都有各种程度的不确定 性。因此需要比较几种不同方法的结果以获得对细胞内胆固醇分布的可信分 析。
胆固醇不仅可从细胞中的一个位置或区室运输到另一个位置或区室。它还 可被称为反向胆固醇运输的过程分泌到细胞外。反向胆固醇运输的第一歩是游 离胆固醇从周围细胞的质膜中流出到细胞外的接纳体(acceptor)。胆固醇的 这种运动受细胞的因子和细胞外因子的控制。很多研究巳聚焦于细胞胆固醇的 细胞外接纳体，具体地说是聚焦于这些接受体的修饰如何能够正向加强胆固醇 流出。 一般相信反向胆固醇运输由高密度脂蛋白(HDL)介导。对于含有磷脂 的接纳体如HDL，限速步骤是胆固醇分子从质膜解吸附。
胆固醇从周围细胞中移出至少通过两种途径。胆固醇接纳体(它们已经含 有磷脂)，如HDL颗粒或PL-即oA-l盘片，可通过膜胆固醇供体和接纳体颗粒 之间的浓度梯度通过扩散使胆固醇移动。因此膜孔扩散模型是一种双向物质运 输模型，不需要接纳体颗粒结合或穿透细胞质膜。清道夫受体B l型(SR-B1) 的表达水平与胆固醇流出到HDL或磷脂颗粒的速率相关。SR-Bl刺激胆固醇流 出的能力似乎不依赖于受体-配体结合，可能反应了对膜胆固醇结构域的组织 的影响，这种影响有助于胆固醇向接纳体颗粒的膜孔扩散。
或者，含有较少脂类的胆固醇接纳体如apoA-1与质膜直接作用，同时抽 取胆固醇和磷脂。胆固醇流出到不含脂类的apoA-l的过程很大程度依赖于ATP 结合表达盒转运蛋白Al (ABCA1)的表达。虽然ABCA1在apoA-1介导的胆固醇 流出中的重要性已非常清楚，但对其在胆固醇输出中的确切功能仍然存有争 议，最近的研究暗示其作为apoA-1受体、细胞内胆固醇转运蛋白或参与诱导 膜脂类分布的变化，这种变化有助于apoA-l在细胞表面停泊。
本文公开的方法可用于检测胆固醇运输，或用于(例如)筛选影响胆固醇 运输(例如流出或摄取)的分子。图26显示了筛选干涉胆固醇流出的调节剂 的方法的实施例。该方法基于实时检测化合物对胆固醇流出的影响。质膜上或 细胞内库中胆固醇含量的耗竭导致细胞表面微绒毛的消失，造成贴壁细胞呈扁 平状。细胞扁平状产生正的DMR相，信号增加。基于这种生物学作用，我们利 用从细胞表面抽取胆固醇的试剂(例如甲基-e-环糊精(mPCD)或高密度脂 蛋白(HDLs))、或结合或隔离细胞表面上的胆固醇的试剂(例如相对低浓度
112的皂苷)作为标记物。光学生物传感器获得的变化可用于指示干涉胆固醇流出 的调节剂。图27提供了胆固醇途径的示意图。
图28的结果表明，用meCD处理A431和HeLa细胞均产生可用LID生物 传感器获得的类似的时间依赖性响应。这两种细胞类型的差别是由于与细胞表 面结合的胆固醇含量不同。用EGF预处理A431显著抑制mf3 CD诱导的响应。 这时因为EGF结合于细胞表面的EGFR导致该受体的大量胞吞；受体胞吞引起 细胞表面胆固醇含量的降低。类似地，用H7 (—种蛋白激酶A、 C和G的抑制 剂)预处理A431也抑制mf3CD诱导的响应。这是因为蛋白激酶是细胞表面上 胆固醇含量的重要调控者。
(6)分析活性自由基信号传递和细胞氧化还原状态
分子氧(双氧；02)对于所有需氧生物体的存活非常重要。需氧能量代谢
依赖于氧化磷酸化，这是一个线粒体电子传递(通过多组分NADH脱氢酶复合 物)的氧化还原能量被转换为ATP的高能磷酸键的过程。02作为细胞色素《氧 化酶的最终电子接纳体，细胞色素-C氧化酶是线粒体酶学复合物中的最后一个 酶组分，催化02的四电子还原，成为H20。可在这些(或其他)电子传递反应 中形成02的部分还原和高度反应性的代谢物。这些代谢物包括超氧阴离子 ((V )和过氧化氢(H202)，分别通过02的一电子和二电子还原而形成。在过 渡金属离子的存在下，可形成更具反应性的羟基自由基(0H* )。因为它们相 对于分子02具有较高的反应性，因此02的这些部分还原代谢物通常称为"活性 氧自由基"(ROS)。
ROS对细胞功能具有双重作用。ROS起初被认为是代谢的毒性副产物，可 能引起对脂类、蛋白质和DNA的损伤。为了保护细胞不受ROS的潜在损伤作用， 细胞有几种抗氧化酶，如过氧化物岐化酶(将02*还原为H2CU 、过氧化氢酶 和谷胱甘肽过氧化物酶(将H202还原为H20)。因此，氧应力可广泛定义为氧化 剂的产生和细胞抗氧化以防止氧化伤害的能力。氧应力参与很多人类疾病，包 括动脉粥样硬化、肺纤维化、癌症、神经退行性疾病和衰老。
虽然一般认为ROS是呼吸的毒性副产物，但最近的证据暗示，ROS的产生 可能是细胞信号和调控的重要参与者。在哺乳动物细胞中，最近已证明很多细 胞外刺激诱导ROS细胞内浓度的瞬时增加，特异性抑制ROS的产生将导致刺激 物依赖性信号传递的完全阻断。ROS产生的下游效应是蛋白质或多或少可逆性的氧化。硫醇，由于它们能够被可逆性氧化，被认为是氧化胁迫的关键靶标。 氧还敏感性蛋白，包括蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)作为活性位点赖氨酸，是很 多氧化剂(包括仏02)特异性氧化的靶标，这种修饰可被细胞内的还原剂逆转。 R0S对PTP的抑制有助于蛋白酪氨酸磷酸化介导的受体酪氨酸激酶(RTK)信号 的传播(通常与增殖性刺激物有关)。
R0S在细胞功能调控中作为必需的生物分子这一作用与其作为代谢有毒副 产物这一作用的明显矛盾可能至少部分与产生的ROS浓度的不同有关。当细胞 中产生的R0S超过其抗氧化能力时，可能发生对细胞分子如脂类、蛋白质和DNA 的损伤。
R0S的高度反应性和相对不稳定性使它们在生物系统中极难被检出或测 定。因此，针对R0S和自由基产生的很多评估(试验)都是通过间接检测R0S 与细胞组分如脂类、蛋白质或DNA相互作用产生的各种终产物进行的。鉴定特 定ROS的大多数方法是基于与各种"探测"分子(例如产生荧光的探针、化学 发光探针或显色探针)的作用，所述探测分子被氧化性修饰以产生发光或荧光 信号。这些方法可能很复杂，因为在同一细胞中有可能具有多种形式的活性氧。 此外，氧化氮自由基可使探针的光学性质产生与其他氧分子造成的同样的变 化。定量分析也很困难，因为1)谷胱甘肽的细胞内浓度高，可形成硫醇或 亚磺酰自由基、或捕获或还原氧自由基；2)金属的浓度可变，这可催化或抑 制自由基反应；和3)存在其他自由基淬灭剂如精胺。
公开了实时监测化合物对^02诱导活细胞内动态物质再分布(DMR)的作 用的方法。为了研究ROS信号，利用了各种细胞靶标的很多己知的和特异性的 调节剂预处理细胞一定的时间(通常是一小时)。然后可根据调节剂对^02诱 导的D服信号的作用绘制出ROS信号传递网络。为筛选调节细胞氧化还原状态 的化合物，用化合物预处理细胞较长的时间(通常从过夜至数天)。可通过}1202 诱导的函R信号来检测化合物对细胞氧化还原状态的作用。
与检测ROS信号传递和氧化还原状态的所有现有试验技术不同，本发明提 供无标记和实时的方法来筛选干涉ROS信号传递和其网络相互作用的调节剂。 本发明还延伸到应用基于光学生物传感器的细胞传感。
细胞中ROS的产生来自酶学和非酶学来源。任何电子传递蛋白或酶学系统 都可形成作为电子传递反应"副产物"的R0S。酶学来源包括
(i)线粒体中的细胞代谢。线粒体中ROS的产生占还原条件下总02消耗
114的约1-2%。因为线粒体中S0D浓度高，O"在线粒体中的浓度保持在很低的稳 态水平，不可能逃出细胞质。最近几年，线粒体ROS介导细胞信号的能力，特 别是关于凋亡调控，受到了很大重视。已表明线粒体可能作为"02传感器"介 导低氧诱导的基因转录。
(ii) 内质网(ER)中脂类和蛋白质的生物合成。ER是脂类和蛋白质生物 合成主要涉及的另一种膜结合的细胞内细胞器。滑面内质网(缺少结合的核糖 体)含有酶，包括催化一系列反应使脂溶性药物和其他有害的代谢产物解毒的 细胞色素P-450。细胞色素P-450可氧化不饱和脂肪酸和外源性化学物质，还 原分子02产生02 和/或H202。
(iii) 来自核膜的R0S。核膜含有细胞色素氧化酶和电子运输系统，与 ER类似，但是它们的功能未知。有一种假设是电子从这些酶系统中泄漏，产生 可体内损害细胞DNA的R0S。
(iv) 过氧化物酶体中H.A的产生。过氧化物酶体是总细胞&02产生的重 要来源。它们含有很多产生&02的酶，包括葡糖酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、 尿酸氧化酶、L一醇酸氧化酶和脂酰辅酶A氧化酶。过氧化物酶体的过氧化氢 酶利用这些氧化酶产生的^02在"过氧化"反应中氧化很多其他底物。这些类 型的氧化反应在肝脏和肾脏细胞中尤其重要，在这些细胞中，过氧化物酶体使 进入循环的很多毒性分子(包括乙醇)解毒。过氧化物酶体中进行的氧化反应 的另一个主要功能是氧化脂肪酸，在哺乳动物细胞中这种氧化发生在线粒体和 过氧化物酶体中。这些细胞内细胞器中产生的仏02只有一小部分似乎逃过了过 氧化物酶体的过氧化氢酶。
(v) 来自可溶性酶的ROS。在催化循环中，可溶性酶，例如，黄嘌呤氧化 酶、醛氧化酶、双氢乳清酸酯脱氢酶、黄素蛋白脱氢酶和色氨酸双加氧酶可 产生R0S。
(vi) 来自小分子的R0S。小分子，例如多巴胺、肾上腺素、黄素和氢醌 的自身氧化可以是细胞内ROS产生的重要来源。大多数情况下，这些自身氧化 反应的直接产物是02* 。
(vii) 来自质膜相关酶的R0S。质膜相关的氧化酶(例如吞噬细胞的 (phagocytic) NADra氧化酶)已表明是大多数生长因子一和/或细胞因子一刺
激产生的氧化剂的来源，虽然精确的酶来源还没有完全鉴定到。
(viii) 来自信号传递的R0S。已报道，结合不同种类受体的很多细胞因子和生长因子可在细胞中产生R0S。
(ix)来自环境的R0S。外源性R0S也可被引入活细胞中。例如，外源H必 能够通过质膜扩散到细胞中。
R0S在从受体到核的不同水平上调节许多信号途径。虽然较不清楚，在过 去十年已鉴定了许多细胞靶标，使其范围扩大。受体激酶和磷酸酶可能是氧化 应激的靶标。生长因子受体最常被配体诱导的二聚化或寡聚化活化，这些作用 使其胞质激酶结构域自磷酸化。已经良好演示了响应紫外光，依赖于配体的受 体依赖性成簇和活化，该作用可能是由ROS介导的。已显示外源H202 (通常以 毫摩尔范围)诱导酪氨酸磷酸化和PDGF-、 PDGF-和EGF受体的活化。EGF受体 的溶血磷脂酸诱导的反式激活可能是由形成ROS中间物介导的。由于大部分生 长因子和细胞因子似乎在质膜上或其附近产生R0S，磷脂代谢物可能是氧化还 原信号传递的重要靶标。例如，二酰基甘油的氧化形式在PKC活化中比其非氧 化形式更有效。另外，内皮细胞和成纤维细胞中，PKC活化和蛋白质酪氨酸磷 酸化似乎需要仏02诱导的PLD活化。属于Src家族(Src激酶)和Janus激酶 (JAK)家族的非RTK也是至少外源加入的氧化剂的靶标。
ROS信号传递也能触发许多细胞类型，包括平滑肌细胞中胞内Ca"的改变。 另外，ROS信号传递能够参与MAPK途径。外源氧化剂可激活ERK MAPK途径。 该作用的机制未明，精确的分子靶标也是未知的。 一些研究提示，R0S介导的 ERK活化可能是生长因子受体、Src激酶和/或p21Ras水平的上游事件。该作 用的另一种可能机制可能是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)和/或蛋白质磷酸酶A 的氧化剂诱导的失活。
还有许多其它胞内靶标也被鉴定为氧化响应分子。这些靶标包括NF-KB( — 种转录因子，调节许多与免疫和炎症反应有关的基因)、活化蛋白-1 (AP-1)
(一种转录复合物，是由Fos-Jun或Jun-Jun蛋白二聚化形成的)、和其它转 录因子，其中相似氧化还原机制调节DNA结合，例如Sp-1、c-Myb、p53和egr-1。
ROS信号传递主要涉及两种一般作用机制1)胞内氧化还原态的改变，和 2)蛋白质氧化修饰。
在一个实施例中，本发明提供了一种使用光学生物传感器筛选能干扰R0S 信号传递的化合物的方法。该方法涉及用过氧化氢作为外源R0S来介导培养细 胞层底部部分的物质再分布。该方法包括下列步骤提供非光学标记依赖性检 测(LID)生物传感器，它能测定多个光学输出参数；在生物传感器表面培养
116细胞；在细胞中加入调节物溶液；在细胞中加入外源反应性氧物质溶液；监测 所述光学输出参数。所述调节物加到所述细胞中，并且孵育一段较短时间(例 如30min、 60min、 1小时、3小时、6小时、24小时、2日、3日、5日等)。 所述反应性氧物质是过氧化氢。
6.除了无标记细胞实验
a)与标记技术联合，使用无标记生物传感器的两部分实验
还可联合常规标记技术(例如荧光)使用公开的无标记生物传感器区室基 于细胞的实验来提供对生物样本的多参数信息。
非标记依赖性检测包括包括一套不需要标记任何分析物就可测定生物分 子事件的技术。两种最常用的技术基于质谱(MS)和使用表面质子共振(SPR) 或如本文所述的光栅耦合波导测定折射率(Rl)改变。本文公开的是含有一种
装置的系统，该装置与光学生物传感器结合，该传感器含有具有电介质涂层的 光栅，以同时测量折射率和荧光的改变(共焦或渐逝场)。
虽然基于RI的非标记依赖性检测(RILID)方法提供了相对于标记技术更 显著的优点，其限制是不能直接将事件与特定的物质关联。例如，与荧光不同， 所需蛋白质和某些不良蛋白质的结合在性质上提供了同样"类型"的信号(指 标改变)。无标记检测法本身因此是不具有特异性的。为了克服这种不确定性， 将RILID法与MS结合，能鉴定结合的物质。
RILID测量可实时进行，通常由其能力限制， 一般能检测基质表面约200nm 内或更小距离内的事件，横向分辨率为约lOum。荧光能使得多种物质被标记 (使用不同荧光染料或颗粒)，并可以在可检测约200mn内的渐逝模式使用(使 用全内反射荧光或光栅耦合波导)，或以可检测约10wm内的共焦模式使用， 具有卓越的横向分辨率(在远场内降至约300nm或在近场内小于100nm)。公 开了用RILID作为另一种生物检测"通道"，使用两种技术的组合-无标记生 物传感器和标记，两者的时空分辨率相同，但其中一种对物质具有特异性(标 记，即荧光)，另一种无物质特异性(无标记生物传感器，RILID)。这种组 合本身够强，因为它能够分解复杂的生物检测事件，例如当研究细胞内生物途 径时遇到的那些事件。例如，配体与受体(例如GPCR)的结合可诱导胞内级联， 从而可能导致折射率曲线随时间复杂改变。可通过荧光使用不同报道系统或标 记在细胞、细胞器(例如使用细胞器特异性染料来探测ER、 Golgi、或核)、蛋白质(例如GFP-p-捕获蛋白的移位)、或DNA水平(基因表达，使用荧光原 位杂交，FISH)来检测这些级联中的一个或多个。将LID信号与多色荧光时空 关联可提供有关途径的重要线索。另外，某些荧光报道物和/或标记通常互相 是不兼容的。公开的方法能分析这种关联，并能改进实验，从而不再需要一种 或多种荧光报道物，因为能通过RILID.309获得信息。公开了使用基于平面型 波导的生物传感器的多模式检测系统。该系统不仅监测折射率的改变(由生物 物质在结合和随后活化和细胞应答后的净变引起的折射光的波长或角度改变 指示)，还可以监测荧光(或化学发光、生物发光、磷光或电致发光等)的改 变。还提供了检测系统，它提供用于药物开发和基础研究中的超高含量分析。
目前的生物分析技术通常仅提供一种参数。结果，多个不同实验输出的结 果必须重复整理，以指导有关药物开发(或诊断)的决定。该过程既费时又容 易误导。多参数检测设法用分析技术的组合获得有关几个方面的信息，从而提 供一途径(或多个途径)中多个步骤的线索，以及可能的药物化合物对它们的 调节。多参数检测与多路方式不同，多路方式意味着用一种技术(或组合，例 如放射和荧光标记的组合)同时检测多种生物物质的结合或活化以监测途径中 的同一歩骤。多参数检测联合多路分析(例如反向转染分析)可能同时对多个 样本上提供多种类型的信息。光栅耦合波导在用RILID和荧光多参数检测平台 上有特别的优点。
III.组合物
公开了要用来制备公开的组合物，以及在本文所述方法中使用的组合物的 成分。本文公开了这些和其它物质，应理解当公开这些物质的组合、子集、相 互作用、组等，而没有明确公开特别引用各种成分及其集合组合时，本文特别 考虑了各物质并对其进行了描述。例如，如果公开并讨论了一种特定受体，可 针对许多分子(包括所讨论的受体)对其进行许多修改，特别考虑的是受体可 能的每种和全部组合和排列，除非相反说明。因此，如果公开了分子A、 B和C 组，也公开了分子D、 E禾PIF组，而且公开了组合分子的例子A-D，那么即使没 有单独陈述，分别且综合考虑每种分子，意味着视为公开了组合A-E、 A-F、B-D、 B-E、 B-F、 C-D、 C-E和C-F。该概念应用于本申请的所有方面，包括但不限于， 制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在许多额外的步骤， 应理解每一个这些额外歩骤都可和公开方法的任何特定实施方式或实施方式的组合一起实施。
1.用公开的组合物/组合化学筛选鉴定的组合物 (a)组合化学
可用公开的组合物作为任何组合技术的耙标，以鉴定与公开的化合物以理 想方式作用的分子或大分子。本文公开的核酸、肽、和相关分子可用作组合方 法的靶标。还公开了组合物可通过组合技术或筛选技术鉴定，其中本文公开的 组合物或其部分被用作组合或筛选方案的靶标。
应理解当联合组合技术或筛选方法使用公开的组合物时，能鉴定出具有特 定所需性质(例如抑制或刺激或靶分子功能)的分子(例如大分子)。当用于 公开的组合物(例如公开的细胞)时，也公开了鉴定和分离出的分子。因此， 本文也视用涉及公开的组合物(例如公开的细胞)的组合或筛选方法产生的产 品也被公开了。
人们理解，如本文所述的鉴定分子的方法可用高通量方法进行。例如，可 用荧光共振能量转移(FRET)快速鉴定相互作用，从而鉴定推定的抑制剂。该 技术的原理是当两个分子空间上靠近，即以超出背景的水平相互作用时，产 生信号或信号可熄灭。然后，可进行各种实验，包括例如，加入推定的抑制剂。 如果抑制剂与两种信号分子之间的相互作用竞争，可迅速(in space)使信号 分子相互分离，从而导致信号减弱或增强，视所使用的信号类型而定。可将减 弱或增强的信号与推定抑制剂的存在与否关联。可使用任何信号传递手段。例 如，公开了鉴定任何两种公开的分子之间的相互作用的抑制剂的方法，包括将 第一种分子和第二种分子在推定的抑制剂存在下相互接触，其中第一种分子或 第二种分子含有荧光供体，其中第一或第二种分子(通常不含供体的分子)含 有荧光受体；在推定抑制剂存在下或在推定抑制剂不存在的情况下测定荧光共 振能量转移(FRET)，其中推定抑制剂存在下，FRET与不存在推定抑制剂的情 况下相比减弱，表明推定的抑制剂抑制两种分子之间的结合。这类方法也可用 细胞系统进行。
具有给定功能的催化性或配体结合性的寡核苷酸分子可分离自随机寡核 苷酸的复杂混合物，它被称为"体外遗传学"(Szostak， TIBS 19:89， 1992)。 合成携带随机和给定序列的分子集合，对复杂混合物(例如lOOpglOO寡核苷 酸RNA的约1015条不同序列)进行筛选和富集过程。通过重复循环的亲和层析
119和PCR扩增与柱上的配体相结合的分子，Ellington和Szostak (1990)估计 l(TRNA分子之一以与小分子染料结合的方式折叠。也分离了具有这种配体结合 行为的DNA分子(Ellington和Szostak， 1992; Bock等，1992) 。 X寸于小有 机分子、蛋白质、抗体和其它本领域技术人员已知的大分子来说，存在类似目 标的技术。筛选具有所需活性的分子组，不论基于小有机文库、寡核苷酸、或 抗体，被广泛称为组合化学。组合技术特别适用于鉴定分子之间的结合相互作 用和分离具有特定结合活性的分子，当大分子是核酸时，这种分子常被称为适 体。
有许多分离具有原始活性或具有改变的活性蛋白质的方法。例如，已用噬 菌体展示文库分离了许多与特定靶标相互作用的肽(见例如美国专利 6, 031,071; 5,824,520; 5， 596， 079;和5， 565， 332，在此引入至少它们与噬菌 体展示相关的物质和与组合化学有关的方法以供参考)。
分离具有给定功能的蛋白质的优选方法如Roberts和Szostak所述 (Roberts R. W.和Szostak J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (23) 12997-302 (1997))。该组合化学方法结合蛋白质的功能力和核酸的遗传力。 产生RNA分子，其中将嘌呤霉素与RNA分子的3'末端共价结合。该修饰RNA分 子的体外翻译得到由要翻译的RNA编码的正确的蛋白质。另外，由于嘌呤霉素 (一种不能延伸的肽酰基受体)的结合，延伸的肽链与和RNA结合的嘌呤霉素 结合。因此，蛋白质分子与编码它的遗传物质结合。此刻，可进行正常体外选 择程序来分离功能性肽。 一旦肽功能的选择程序完成，进行常规核酸操纵程序， 来扩增编码所选功能性肽的核酸。遗传物质扩增后，转录新RNA， 3'末端带有 嘌呤霉素，翻译新RNA，进行另一轮功能性选择循环。如此，可以重复方式， 就和核酸选择技术一样进行蛋白质选择。翻译出的蛋白质由与嘌呤霉素结合的 RNA序列控制。该序列可以是任何经最佳翻译(即没有终止密码子等)工程改 造的随机序列，或可以是已知RNA分子的简并序列，以寻求已知蛋白的改进或 改变的功能。核酸扩增和体外翻译的条件是本领域技术人员熟知的，优选如 Roberts和Szostak所述(Roberts R.W.禾口 Szostak J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94 (23) 12997-302 (1997))进行。
另一种优选的设计分离肽的组合方法的优选方法如Cohen等(Cohen B. A.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (24) :14272-7 (1998))所述。该方 法利用和改变了双杂交技术。酵母双杂交系统用于检测和分析蛋白蛋白相互作用。双杂交系统最初在酵母酿酒酵母(5"acc力arc^Fcescerew、/ae)中公开， 是一种鉴定新调控分子，特别是对于感兴趣蛋白的强大分子遗传技术(Fields and Song, A^a&re 340:245-6 (1989) ) 。 Cohen等修改了这种技术，从而能 鉴定出合成或工程改造的新肽序列之间的相互作用，这些肽与选定的分子结 合。这类技术的益处是在胞内环境中进行筛选。该方法利用肽分子文库，这些 分子与酸性活化域结合。用本领域技术人员熟知的方法，联合各种组合文库， 人们能够分离和表征与所需靶标结合或相互作用的小分子或大分子。可用竞争 性结合研究(本领域技术人员熟知的)比较这些化合物的相对结合亲和力，鉴 定最佳化合物。
制备组合文库和筛选组合文库以分离与所需耙标结合的分子的技术是本 领域技术人员熟知的。代表性的技术和方法可见(但不限于)美国专利
5， 084，824，5，288，514，5，449，754，5，506，337:,5，539,083，5，545， 568，
5， 556'762，5,565，324,5'565,332,5，573,905:,5，618，825，5,619， 680，
5， 627，210，5,646，285,5，663,046，5，670,326,,5，677，195，5，683, 899，
5,688，696，5,688，997,5，698，685,5，712,146',5，721，099，5,723， 598，
5， 741，713，5，792，431，5，807，683，5，807，754,,5，821'130，5，831， 014，
5, 834，195，5,834,318，5，834，588，5，840,500，,5,847,150，5，856， 107，
5， 856，496，5，859，190，5，864，010，5，874，443,,5，877，214，5，880' 972，
5， 886，126,5,886，127,5，891，737,5，916，899，,5,919,955,5，925， 527，
5， 939，268，5，942，387，5，945，070,5，948，696:,5，958，702，5，958， 792，
5,962，337，5，965，719，5，972，719,5，976,894:,5，980,704，5，985， 356，
5, 999,086，6，001，579，6,004,617'6，008，321:,6，017,768，6，025， 371,
6， 030，917,6, 040， 193,6， 045, 671，6， 045, 755，6, 060， 596，和6, 061， 636。可用许多不同合成技术，从广泛的分子阵列制备组合文库。例如，稠合的
2,4-嘧啶二酮(美国专利6,025,371) 二氢苯并吡喃(美国专利6,017,768 和5,821,130)，酰胺醇(美国专利5， 976， 894),羟基-氨基酸酰胺(美国 专利5,972,719) 糖类(美国专利5, 965， 719) , 1， 4-苯并二吖庚因-2， 5-二 酮(美国专利5,962,337)，环化物(美国专利5， 958， 792) , 二芳基氨基酸 酰胺(美国专利5,948,696)，噻吩(美国专利5， 942， 387)，三环四氢喹啉(美 国专利5,925,527)，苯并呋喃(美国专利5,919,955)，异喹啉(美国专 利5,916,899)，乙内酰脲和硫代乙内酰脲(美国专利5，859，190)， B引哚(美
121国专利5， 856， 496)，咪唑-吡啶-B引哚和咪唑-吡啶-苯并噻吩(美国专利 5,856,107) 取代的2-亚甲基-2， 3-二氢噻唑(美国专利5， 847， 150)，喹 啉(美国专利5,840， 500) , PNA (美国专利5， 831， 014),含标签(美国 专利5,721,099),聚酮化合物(美国专利5,712， 146)， 吗啉代亚基(美 国专利5, 698， 685和5, 506， 337),磺酰胺(美国专利5, 618， 825)，和苯并 二吖庚因(美国专利5，288，514)。
如本文所用的，组合方法和文库包括常规筛选方法和文库，以及重复过程 中使用的方法和文库。
b)计算机辅助药物设计
可用公开的化合物作为任何分子建模技术的靶标，来鉴定公开的组合物的 结构，或鉴定可能或实际分子，例如小分子，它们与公开的组合物以理想方式 相互作用。本文公开的核酸、肽、和相关分子可用作任何分子建模程序或方法 的靶标。
应理解，当在建模技术中应用公开的组合物时，可鉴定具有特定所需性质 (例如已知或刺激或靶向分子功能)的分子(例如大分子)。当用于公开的组 合物(例如公开的细胞)时，还公开了鉴定和分离出的分子。因此，本文也视 为公开了与公开的组合物(例如公开的细胞)有关的用分子建模法产生的产品。
因此， 一种分离与所选分子结合的分子的方法是通过合理设计。这是通过 结构信息和计算机建模实现的。计算机建模技术使得所选分子的三维原子结构 可视化，而合理设计与分子将相互作用的新化合物。三维构建通常依赖于来自 所选分子的X光晶体分析或醒R显影得到的数据。分子动力学需要力场数据。 计算机图形系统能预测新化合物会如何与靶分子连接，并能够实验性操纵化合 物和靶分子的结构，来优化结合特异性。当在其中之一或两种中产生微小改变， 预测分子-化合物相互作用会怎样，需要分子机制软件和计算增强计算机，通 常与分子设计程序和用户之间的方便用户使用的菜单控制界面结合。
分子建模系统的例子是CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham， MA。 CHARMm进行能量最小化和分子动力学操作。QUANTA进行构建、 图形建模和分子结构分析。QUANTA能实现分子之间行为的互动构建、修饰、可 视化和分析。
许多文章回顾了与特定蛋白质互相作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen等，1988爿"a尸力ar鹏cei/z^'ca Fe朋ica 97， 159-166; Ripka， 7Ve(r 5"cie72Z^st 54—57 (June 16， 1988) ; McKinaly禾口 Rossmann, 1989 ^w w. Wer. 尸力ar船co丄一7W"'o义29, 111-122; Perry和Davies， QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R, Liss, Inc. 1989) ; Lewis禾口 Dean， 1989尸roc. Z。W. 236, 125-140
和141-162;以及有关核酸组分的模式酶，Askew,等，1989 / J瓜C力e瓜5bc. 111， 1082-1090。其它筛选和图形描述化合物的计算机程序可购自下列公司， 例如BioDesign, Inc., Pasadena, CA. ， Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada,禾口 Hypercube， Inc. ， Cambridge, 0nt,ario。虽然这些主要是设计用于 对特定蛋白质有特异性的药物的，它们也可适应设计与已鉴定出的DNA或RNA 的特定区域相互作用的分子。
虽然以上描述了设计和产生可改变结合的化合物，人们还可筛选已知化合 物(包括天然产物或合成化合物)、生物活性物质(包括蛋白质)的文库，以 获得改变底物结合或酶活性的化合物。
2.试剂盒
本文公开了试剂盒，它们涉及可用于实施本文公开的方法的试剂。试剂盒 可包含任何本文所述的试剂或试剂组合，或可理解在实施所公开的方法时需要 或有益的任何试剂。例如，试剂盒可包括在方法的一些实施方式中所述的进行 扩增反应的引物，以及如所需使用引物必需的缓冲液和酶。
IV.制备组合物的方法
除非另外说明，本文所述的组合物和进行所述方法所需的组合物可用任何 本领域技术人员已知的用于特定试剂或化合物的方法制备。
1.核酸合成
例如，用作引物的核酸(如寡核苷酸)可用标准化学合成方法制备，或可 用酶法或任何其它己知方法制备。这些方法包括从标准酶消化，然后核苷酸片 段分离(见例如，Sambrook #■， i/c^/ec"Jsr CJo/ J'"f爿Za/ orator—第 二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.， 1989) 第5、 6章)到纯合成方法，例如通过使用Milligen或Beckman System
1231Plus DNA合成仪(例如Milligen-Biosearch， Burlington, MA的8700型自 动化合成仪或或ABI Model 380B)氰基乙基亚磷酰胺法。用于制备寡核苷酸的 合成、法如Ikuta等，v4tm. y er. A 'oc/ e瓜53:323-356 (1984)所述(磷酸三 酯和亚磷酸三酯法)和Narang等，ife^w^ f/^輝o丄，65:610-620 ( 1980)
(磷酸三酯法)。可用已知方法，如Nielsen等，Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994) 所述的那些制备蛋白质核酸分子。
2.肽合成
制备所述蛋白质(例如SEQ IDN0:23)的方法之一是通过蛋白质化学技术 连接两条或多条肽或多肽。例如，可用目前可得的实验仪器，使用Fmoc (9-芴甲氧羰基)或Boc (叔丁氧羰基)化学来化学合成肽或多肽(Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA)。本领域技术人员可轻易理解，对应 于所述蛋白质的肽或多肽可以用标准化学反应合成。例如，可合成肽或多肽， 但不将其从合成树脂上切下，而肽或多肽的另一部分可合成，随后从树脂上切 下，从而暴露出在其它片段上功能性封闭的端基。通过肽縮合反应，这两个片 段可以通过羧基和氨基末端的肽键共价结合，形成抗体或其片段(Grant GA
(1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W. H. Freeman and Co. ， N. Y.
(1992) ; Bodansky M.禾口 Trost B.编(1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (在此至少引入有关肽合成的部分以供参考))。 另外，肽或多肽可在体内如所述单独合成。 一旦被分离后，这些独立的肽或多 肽各自通过类似的肽縮合反应连接形成肽或其片段。
例如，克隆或合成肽区段的酶连接能使短肽片段连接产生大肽片段、多肽 或完整的肽结构域(Abrahmsen L等，Biochemistry, 30:4151 (1991))。 此外，合成肽的天然化学连接可用于从较短的肽片段合成性构建大肽或多肽。 该方法包括两歩化学反应(Dawson等，Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994))。第一步是未保护的 合成性肽-硫酯和另一种含有氨基末端Cys残基的未保护的肽区段的化学选择 反应，得到硫酯连接的中间物作为最初共价产物。不改变反应条件，该中间物 经过自发快速的分子间反应，在连接位点形成天然肽键(Baggiolini M.等
(1992 ) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I等，J. Biol. Chem.， 269:16075 (1994) ; Clark-Lewis I等，Biochemistry, 30:3128 (1991);
124Rajarath薩K等，Biochemistry 33:6623-30 (1994))。
此外，未保护的肽区段化学连接，其中肽区段之间形成的键是化学连接的 结果，它是非天然(非肽)键(Schnolzer， M等，Science, 256:221 (1992))。 该技术用于合成蛋白质结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的较纯的 蛋白质 (deLisle Milton RC 等，Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992))。
3.制备组合物的方法权利要求
公开了制备组合物的方法和制备形成组合物的中间物的方法。有许多方法 可用于制备这些组合物，例如合成性化学方法和标准分子生物学方法。应理解， 制备这些和其它公开的组合物的方法已被具体公开。公开了用任何公开的核酸 转化细胞产生的细胞。公开了用任何非天然存在的公开的核酸转化细胞产生的 细胞。
公开了任何由任一公开的核酸表达产生的肽。公开了任何通过表达任何公 开的核酸产生的公开的肽。公开了任何通过表达任一非天然存在的公开的核酸 产生的公开的肽。
公开了通过用任何本文所述核酸分子转染动物内细胞获得的动物。公开了 通过用任何本文所述的核酸分子转染动物内的细胞获得的动物，其中所述动物 是哺乳动物。还公开了通过用任何本文所述的核酸分子转染动物内的细胞获得 的动物，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠、家兔、乳牛、绵羊、猪和灵长类。
还公开了通过将本文公开的任何细胞加入动物而产生的动物。
V. 使用组合物的方法
1.使用组合物作为研究工具的方法
如本文所述，可用所述组合物作为微阵列试剂或作为检测或分析现存微阵 列的试剂。可在任何己知方法中用公开的组合物分离或鉴定单核苷酸多形性。 组合物还可用于任何与芯片/微阵列相关的已知筛选分析方法。组合物还可以 任何使用组合物的计算机可读实施方式的已知途径使用，例如，研究相关性或 进行与所述组合物有关的分子建模分析。
VI. —些实施方式的说明公开了一种测试细胞上的剌激事件的作用的方法，包括提供无标记生物传 感器，在生物传感器上培养细胞，对培养的细胞提供刺激事件，收集来自生物 传感器的生物传感器输出数据。
还公开了一种筛选影响细胞存活或增殖的化合物的方法，该方法基于生物 传感器表面细胞的不均一性。
一种筛选影响对细胞的刺激事件作用的调节剂的方法，包括提供无标记生 物传感器，在生物传感器上培养细胞，与含有化合物的溶液孵育一段特定和预 定的时间，对培养的细胞提供刺激事件，收集来自生物传感器的生物传感器输 出数据。
还提供了包括提供检测系统的分析细胞的方法，提供多个生物传感器，将 细胞置于培养基中，在生物传感器上培养细胞至至少70%铺满度，加入化合物 溶液，测定生物传感器中出现耦合的入射角或波长，其中测量发生在10分钟 以内。
还公开了监测化合物毒性的方法，包括(a)提供基于光学的无标记生 物传感器；(b)将细胞置于培养基中，其中细胞附着于生物传感器表面；(c) 在细胞培养基中加入含有化合物的溶液；(d)监测生物传感器上培养的细胞 的反应。
还公开了监测化合物对细胞的作用的方法，包括(a)孵育细胞和化合物， 其中细胞结合于无标记生物传感器，(b)鉴定化合物对细胞的作用，其中该 鉴定步骤包括观察和分析无标记生物传感器的输出。
还公开了一种监测化合物对细胞的作用的方法，包括(a)孵育细胞和化 合物，其中细胞结合于无标记生物传感器，(b)鉴定化合物对细胞的作用， 其中该鉴定步骤包括观察和分析无标记生物传感器的输出，其中将输出与特征 输出比较。
还提供了一种实时监测化合物吸收和毒性的方法，包括步骤(a)提供 基于光学的生物传感器；(b)将一定数量的细胞置于培养基中，以覆盖生物 传感器，从而使细胞结合在生物传感器表面上；(c)在细胞培养基上加上含 有化合物的溶液；(e)监测在生物传感器上培养的细胞的时间依赖性响应。
还公开了一种鉴定细胞状态的方法，包括步骤(a)在生物传感器表面 培养细胞，形成细胞-生物传感器组合物，(b)分析细胞-生物传感器组合物， 其中分析步骤包括鉴定细胞培养表面的不均一性。还公开了用生物传感器在细胞上高通量筛选化合物毒性的方法，包括步骤(a)提供生物传感器；(b)将细胞置于每个孔中，覆盖生物传感器，从而使细胞附着于生物传感器表面，并达到高铺满度；(C)在每个孔的细胞培养基中加入化合物溶液；(d)在某一时间收集光学波导光模式谱，(e)将各化合物的P冊M和对照孔(其中细胞没有接触任何化合物)比较，用单数据点评估化合物毒性。
还公开了一种评估化合物毒性的方法，包括(a)提供基于光学的无标记生物传感器，它与具有孔的微量滴定板结合；(b)将细胞和细胞培养基置于每孔内，其中细胞覆盖生物传感器，从而使细胞附着于生物传感器表面；(c)将化合物溶液加到每孔的细胞培养基中；(d)在指定的时间，收集各孔全部传感器面积上TM。模式共振角带的图像。
还公开了使用光学生物传感器，高通量筛选化合物对细胞增殖的作用的方法，包括(a)提供生物传感器；(b)使细胞与生物传感器接触，形成细胞-生物传感器组合物，从而在一段时间的细胞生长后，细胞铺满度达到45%-55%，(c)孵育化合物和细胞-生物传感器组合物，形成化合物-细胞-生物传感器复合物，(d)收集生物传感器的输出，(d)从输出获得PWHM， (e)将各化合物-细胞-生物传感器复合物的PW丽和对照比较，对照中细胞-生物传感器组合物不接触化合物，其中PWHM的下降表明化合物对细胞有影响。
还公开了一种实时监测细胞内配体结合和随后信号传递事件的方法，包括(a)提供基于光学的无标记生物传感器；(b)将具有受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞置于传感器表面；细胞悬浮在含有一定浓度(细胞在生物传感器表面附着和生长必需的)血清的培养基中；(c)可任选的在不含血清或其它生长因子、或不含任何血清或其它生长因子的培养液中孵育细胞过夜，以达到细胞的休眠状态；(d)将具有一层细胞的生物传感器置于检测系统中，监测应答；
(e)监测在加入含有刺激物的溶液，或隔开一段特定的时间依次加入两种溶液(第一种含有化合物，第二种含有配体或标记物)之前和之后，()粘附细胞层的时间依赖反应。
还公开了一种测量或测定细胞中受体酪氨酸激酶(RTK)的表达水平和细胞-表面表达水平的方法，包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，每个孔含有嵌入底部的基于光学的无标记生物传感器；(b)提供多种细胞；(C)将一类细胞悬浮在至少一个孔的培养基中；(d)在合适的培养基中培育细胞，使其附着和生长，直到达到一定程度的铺满度；(e)将具有生物传感器，每个生物传感器被一层细胞覆盖的微量滴定板置于检测系统中，监测反应；(f)在培养基中加入含有RTK配体的溶液；(g)监测和比较不同类型细胞层的时间依赖反应。
还公开了一种检测配体与RTK (结合)能力的方法，包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，每个孔含有嵌入底部的基于光学的无标记生物传感器；(b)在培养基中提供一定数目具有较高RTK表达水平的细胞，使细胞以所需铺满度度附着在各生物传感器上；(C)交换培养基，以使粘附细胞饥饿一段时间；
(d)将具有生物传感器，每个生物传感器被一层细胞覆盖的微量滴定板置于检测系统中，监测反应；(f)在覆盖每个生物传感器的培养基中加入含有不同浓度配体的溶液；(g)监测和比较细胞的剂量和时间依赖反应。
还公开了筛选影响受体酪氨酸激酶(RTK)信号传递的调节剂的方法，包括(a)提供基于光学的无标记生物传感器；(b)将一定数量的具有感兴趣的RTK的细胞置于培养基中，以覆盖生物传感器，使得细胞附着在生物传感器表面上；(C)用生物传感器监测细胞反应；(d)在细胞培养基中加入含一定浓度的化合物的溶液；(e)加入含有RTK配体的溶液，连续监测在生物传感器上培养的细胞的时间依赖反应。
还公开了一种分析细胞中细胞骨架排列的方法，包括提供光学标记非依赖检测(LID)生物传感器，监测附着于光学LID生物传感器表面的细胞的生物物质释放。
还公开了一种分析细胞骨架重排的方法，包括提供光学LID生物传感器；
将活细胞置于细胞培养基中，以覆盖光学LID生物传感器，从而使活细胞附着于光学LID生物传感器表面；在位于光学LID生物传感器表面的细胞培养基中加入含有成孔试剂的溶液；和询问光学LID生物传感器，以获得指示细胞的生物物质丧失的时间依赖性光学反应。
还公开了一种分析细胞骨架结构的方法，包括提供光学LID生物传感器；
将活细胞置于细胞培养基中，以覆盖光学LID生物传感器，从而使活细胞附着于光学LID生物传感器表面；在位于光学LID生物传感器表面的细胞培养基中加入含有化合物的溶液；在位于光学LID生物传感器表面的细胞培养基中加入含有成孔试剂的溶液；和询问光学LID生物传感器，以获得指示细胞的生物物质丧失的时间依赖性光学反应，从而使人能筛选能干涉细胞内细胞骨架结构的
128调节剂。
还公开了分析细胞骨架结构的方法，包括提供光学LID生物传感器；将活细胞置于细胞培养基中，以覆盖光学LID生物传感器，从而使活细胞附着于光学LID生物传感器表面；在位于光学LID生物传感器表面的细胞培养基中加
入含有成孔试剂的溶液；在位于光学LID生物传感器表面的细胞培养基中加入含有化合物的溶液；和询问光学LID生物传感器，以获得指示细胞的生物物质丧失的时间依赖性光学反应，从而使人能筛选能干涉细胞内细胞骨架结构的调节剂。
公开了测试刺激事件对细胞的作用的方法，包括提供无标记生物传感器，在生物传感器上孵育细胞，对孵育的细胞提供刺激事件，收集来自生物传感器的生物传感器输出。
还公开了鉴定细胞状态的方法，该方法包括在无标记生物传感器表面培养细胞，形成细胞-生物传感器组合物，分析细胞-生物传感器组合物，其中该分析包括鉴定培养细胞的表面的不均一性。
还公开了方法，其中孵育细胞涉及培养细胞，其中刺激作用是通过生物传感器输出鉴定的。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞培养到20-99%铺满度，其中细胞培养到30-80%铺满度，其中细胞培养到40-65%铺满度，其中细胞培养到70-99%铺满度，其中细胞培养到80-95%铺满度。
还公开了可包括一些方法的方法，其中细胞是粘附细胞，其中细胞与生物传感器接触，其中细胞附着于生物传感器。
还公开了方法，其中刺激事件包括在细胞培养物中加入化合物，其中化合物调节细胞的细胞信号途径，其中调节激活细胞信号途径，其中调节抑制细胞信号途径，其中化合物调节细胞上的细胞表面受体，其中化合物是受体的激动剂，和其中化合物是受体的拮抗剂。
还公开了方法，可包括其中细胞表面受体是离子通道、受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、整联蛋白受体、化+^+交换蛋白受体、或免疫受体，其中细胞表面受体是G蛋白偶联受体(GPCR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGF)、或血管内皮生长因子受体(VEGFR)，其中化合物调节细胞内的细胞骨架成分，其中化合物使细胞骨架结构去稳定，其中化合物稳定细胞骨架结构，其中化合物调节胞内
129酶、胞内激酶、胞内细胞器、胞内蛋白质、或胞外基质，其中化合物在化合物溶液中加入。
还公开了还能包括测定是否化合物对细胞有毒的方法。
还公开了方法，可包括一些方法，其中测试多种化合物，以筛选对细胞有毒的化合物，其中通过生物传感器输出监测化合物的毒性水平。
还公开了方法，可包括其中通过生物传感器输出监测细胞，以检测化合物的作用。
还公开了方法，可包括一些方法，其中通过生物传感器输出监测化合物吸收。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器可穿透细胞至100nm深，其中生物传感器可穿透细胞至100nm、 200nm、 300或500nm深，其中生物传感器可接受来自胞内不同穿透深度的数据，其中穿透深度达500nm。
还公开了方法，可包括一些方法，其中用生物传感器输出鉴定细胞状态。
还公开了方法，还包括测定是否刺激事件影响细胞存活或增殖。
还公开了方法，可包括一些方法，其中测试多种化合物来筛选对细胞有毒的化合物，其中监测化合物对细胞的作用，其中化合物是抗癌化合物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中收集来自生物传感器的生物传感器输出包括收集生物传感器输出参数。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数是与生物传感器输出动力学有关的参数。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数包括分析生物传感器输出的总体动力学，其中分析总体动力学包括分析在完成相变时从一个相变为另一个相的速度，其中分析总体动力学包括分析完成生物传感器输出的时间长度，其中分析总体动力学包括分析生物传感器输出的整个时期的时间长度，其中分析总体动力学包括分析P-DMR阶段的总持续时间，其中分析总体动力学包括分析N-DMR阶段的总持续时间，其中分析总体动力学包括分析获得P-DMR的总振幅的速率，其中分析总体动力学包括分析获得N-薩R的总振幅的速率，其中分析总体动力学包括分析从N-DMR到P-DMR的速率，其中分析总体动力学包括分析从P-D服阶段到N-DMR阶段、净零到N-DMR阶段、净零到P-DMR阶段、P-DMR到净零相、N-DMR到净零、或P-DMR到净零的过渡时间t。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数包括分析生物传感器输出相，其中分析相包括分析相变，其中分析相包括分析正向物质再分 布(P-DMR)信号，其中分析相包括分析反向物质再分布(N-画R)信号，其中 分析相包括分析净零向物质再分布(净零DMR)，其中分析相包括分析正向物 质再分布(P-DMR)信号的形状，其中分析相包括分析正向物质再分布(P-DMR) 信号的振幅，其中分析相包括分析反向物质再分布(P-DMR)信号的形状，其 中分析相包括分析反向物质再分布(P-腿R)信号的振幅。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数包括生物传感 器输出的全面动力学，其中分析全面动力学包括分析生物传感器输出产生的整 条曲线的形状。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数是与共振峰有
关的参数。
还公开了方法，可包括一些方法: 耦合生物传感器时，光强vs入射角。
还公开了方法，可包括一些方法, 耦合生物传感器时的光强vs光波长。
还公开了方法，可包括一些方法，
其中生物传感器输出参数包括分析在光 其中生物传感器输出参数包括分析在光 其中生物传感器输出参数包括分析峰位 其中分析峰位置包括分析在最大强度位 其中分析峰位置包括分析在最大强度位 其中生物传感器输出参数包括分析共振 其中生物传感器输出参数包括分析最大
还公开了方法，可包括一些方法 置之前的半最大峰强度位置。
还公开了方法，可包括一些方法 置之后的半最大峰强度位置。
还公开了方法，可包括一些方法 峰上一点的强度。
还公开了方法，可包括一些方法 强度的强度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析共振峰强度包括分析在共振峰 上，峰值强度之前发生的半最大峰强度的强度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析共振峰强度包括分析在共振峰 上，峰值强度之后发生的半最大峰强度的强度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中该方法还包括收集第二生物传感器 输出参数。
131还公开了方法，可包括一些方法，其中第二生物传感器输出参数包括分析 峰位置。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数包括分析峰形。 还公开了方法，可包括一些方法，其中分析峰形包括测定共振峰下面积。 还公开了方法，可包括一些方法，其中共振峰下面积仅包括在共振峰上存
在的半最大强度点之间连线以上的面积。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析峰形包括分析半最大强度点的
共振峰宽度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出参数是与共振带图 像有关的参数。
还公开了方法，可包括一些方法，其中共振带图像是通过用穿过生物传感 器的光点对生物传感器进行光照，并对穿过生物传感器的入射耦合光强分布作 图。
还公开了方法，可包括一些方法，其中入射耦合光强度分布由CCD照相机 显像。
还公开了方法，可包括一些方法，其中有关共振带图像的参数是带形、带 位置、带强度或光强分布。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析了半最大峰宽(PWHM)联合最 大强度位置。
还公开了方法，还进一步包括将培养的细胞与化合物一起孵育。 还公开了方法，可进一步包括确定是否化合物影响刺激事件对细胞的作用。
还公开了方法，可进一歩包括测定化合物对刺激事件对细胞作用的影响。 还公开了方法，可包括一些方法，其中筛选一种或多种额外化合物来测定
是否化合物影响剌激事件对细胞的作用。
还公开了方法，可包括一些方法，其中收集生物传感器输出短于IO分钟，
其中生物传感器输出的收集短于5分钟、l分钟、30秒、10秒、5秒或1秒。 还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出的收集时间基本与
刺激作用的生物扩散限制时间相同。
还公开了方法，可包括一些方法，其中包括提供检测系统。 还公开了方法，可包括一些方法，其中提供多个无标记生物传感器，其中在每两个或多个生物传感器上培养细胞，其中对两个或多个生物传感器提供刺 激事件，其中从两个或多个生物传感器收集生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中监测细胞穿透深度的多样性。 还公开了方法，可包括一些方法，其中每个生物传感器具有一种穿透深度。 还公开了方法，可包括一些方法，其中同时收集来自两个或多个生物传感 器的生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中同时培养细胞。
还公开了方法，可包括一些方法，其中对两个或多个生物传感器同时提供 刺激事件。
还公开了方法，可包括一些方法，其中在多个生物传感器上孵育多种不同 的细胞。
还公开了方法，可包括一些方法，其中多种细胞包括至少两个不同的细胞，
因为至少细胞之一经遗传工程改造。
还公开了方法，可包括一些方法，其中多种细胞类型中的各细胞类型由多
个生物传感器中的不同生物传感器检测。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞培养到至少70%铺满度。 还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞包括多个细胞。 还公开了方法，还包括在细胞中加入缓冲液，其中缓冲液与细胞类型和刺
激事件类型兼容。
还公开了方法，可包括一些方法，其中收集生物传感器输出包括使生物传 感器与可变入射角的光接触，在光入射耦合时测量入射角。
还公开了方法，可包括一些方法，其中收集生物传感器输出包括使生物传 感器与可变波长的光接触，在光入射耦合时测量波长。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞是增殖期、休眠期、分化期、 或在特定的细胞周期状态。
还公开了方法，可包括一些方法，其中通过在生长培养基中培养细胞，使 细胞为增殖期。
还公开了方法，可包括一些方法，其中通过在饥饿培养基中培养细胞，使 细胞为休眠期。
还公开了方法，还包括分析生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中监测以l秒、3秒、5秒、10秒、
13320秒、30秒、l分钟、或5分钟的采样速率连续进行。
还公开了方法，还包括鉴定刺激事件对细胞的作用。 还公开了方法，可包括一些方法，其中鉴定作用包括将生物传感器输出与 特征输出比较。
还公开了方法，可包括一些方法，其中特征输出包括至少以下相之一的动
态物质再分布正-DMR、反-DMR和净零-D服阶段。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞是从一细胞系产生的。 还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞系是遗传工程改造的变体细胞系。
还公开了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在细胞培养物中加入 一种化合物，其中作用是化合物对细胞吸收、分布、代谢或毒性的作用。
还公开了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在细胞培养物中加入 一种化合物，其中测定化合物的作用包括功能性评估化合物对细胞的作用，和 鉴定化合物对细胞吸收、分布、代谢或毒性的作用。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出与细胞物质再分布 的改变有关。
还公开了方法，可包括一些方法，其中可观察作为生物传感器反射光束的 角度或光谱变化的生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中收集生物传感器输出包括监测培养 细胞的时间依赖性响应。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞达到至少80%铺满度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器嵌入微量滴定板。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞在生物传感器上生长至少1小 时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、l周或2周。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器能分辨在与存活细胞接 触的生物传感器表面的一定区域、与被刺激事件影响的细胞接触的生物传感器 表面的一定区域、和不接触细胞的生物传感器表面的一定区域。
还公开了方法，可包括一些方法，其中被影响的细胞释放出一部分胞内成 分或是死细胞。
还公开了方法，还包括将细胞-生物传感器与化合物一起孵育。 还公开了方法，可包括一些方法，其中化合物是化学物质、生物化学物质、
134生物分子、药物或聚合物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析是在与化合物一起孵育后进行的。
还公开了方法，可包括一些方法，其中分析是在少于或等于60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、或l秒中发生的。
还公开了方法，可包括一些方法，其中不均一性是通过从生物传感器收集生物传感器输出测定的，其中生物传感器输出包括具有最大强度的导向模式共振峰，和比较半最大强度的峰宽(P冊M)。
还公开了方法，可包括一些方法，其中导向模式是横向磁场模式。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器是单数形式或多路(multiplexed)形式。
还公开了方法，可包括一些方法，其中当生物传感器是复数形式，其中生物传感器嵌于微量滴定板的一个或多个孔中。
还公开了方法，可包括一些方法，其中在微量滴定板的一个孔中有一个生物传感器。
还公开了方法，可包括一些方法，其中在微量滴定板的一个孔中有多个生物传感器，其中生物传感器用或不用屏障物理分隔。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器用屏障物理分隔，其中在孔中确定区室的屏障比确定微量滴定板孔的屏障要低。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器是光学波导生物传感器。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器是光学波导光栅生物传感器。
还公开了方法，可包括一些方法，其中在两个或多个孔的每一个中培养细胞，其中对两个或多个孔提供剌激事件，其中刺激事件包括在两个或多个孔中加入化合物，其中从两个或多个孔中收集生物传感器输出，其中将两个或多个孔的PWHM与对照孔比较，其中对对照孔不提供刺激事件。
还公开了方法，可包括一些方法，其中以每孔高于1、 2、 3、 4、 5、 10、15、 30、 45、或60秒的速率收集生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中以每分钟多于60、 30、 15、 10、 7、5、 4、 3、 2或l孔的速率收集生物传感器输出。
还公开了方法，可包括一些方法，其中以每孔高于1、 2、 3、 4、 5、 10、
13515、 30、 45、或60秒的速率比较孔的PWHM。
还公开了方法，可包括一些方法，其中以每分钟多于60、 30、 15、 10、 7、
5、 4、 3、 2或1孔的速率比较孔的PW腿。
还公开了方法，可包括一些方法，其中可用单数据点评估化合物毒性。还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出是时间依赖性PW丽
改变'
还公开了方法,还公开了方法，
可包括一些方法，其中生物传感器是光学生物传感器。可包括一些方法，其中生物传感器是基于光学的生物传感
还公开了方法,还公开了方法,还公开了方法，还公开了方法，还公开了方法，还公开了方法，
可包括一些方法，其中生物传感器是无标记生物传感器。可包括一些方法，其中生物传感器结合于培养细胞的系统。可包括一些方法，其中系统是平板。可包括一些方法，其中平板是多孔平板。可包括一些方法，其中平板是微量滴定板。可包括一些方法，其中在两个或多个孔的每个中培养细胞，其中微量滴定板由孔组成，其中生物传感器输出是在指定时刻每孔总传感器区域的TMO模式共振角带的图像。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞达到70%铺满度。还公开了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在两个或多个孔中加入化合物，其中将加入化合物的孔的TMO模式共振角带的宽度与未加化合物的TMO模式共振角带宽度比较，比较TMO模式共振角带的宽度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器是基于波导的生物传感
还公开了方法，可包括一些方法，其中基于波导的生物传感器是基于Nb205
的光学生物传感器。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞是粘附细胞。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞生长到30%、 40%、 50%或90%
铺满度。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出是光学波导光模式谱(OWLS)，导向模式的共振峰、或导向模式的共振带图像。
还公开了方法，可包括一些方法，其中PWHM的下降表示化合物对细胞有
136影响
还公开了方法, 还公开了方法, 还公开了方法, 还公开了方法, 还公开了方法，
还公开了方法， 还公开了方法，
可包括一些方法，其中PWHM变宽表示化合物对细胞有毒。 可包括一些方法，其中PWHM分裂表示化合物对细胞有毒。 可包括一些方法，其中共振带变宽表示化合物对细胞有毒。 可包括一些方法，其中细胞达到至少70%铺满度。 可包括一些方法，其中PWHM的下降表示化合物对细胞有
可包括一些方法, 可包括一些方法，
其中生物传感器与微量滴定板结合。 其中生物传感器嵌入微量滴定板各孔底
部,
还公开了方法,
物传感器。
还公开了方法, 还公开了方法, 还公开了方法，
减少的分析。
还公开了方法，
到30-70%铺满度。 还公开了方法, 还公开了方法， 还公开了方法, 还公开了方法，
可包括一些方法，其中生物传感器是基于光学的无标记生
可包括一些方法, 可包括一些方法,
可包括一些方法，
其中细胞-生物传感器被化合物覆盖。
其中化合物在溶液中。
其中起始细胞数能实现增殖增加或增殖
可包括一些方法，其中细胞数在不存在化合物的情况下达
可包括一些方法， 可包括一些方法， 可包括一些方法， 可包括一些方法，
其中细胞数达到40-60%铺满度。 其中细胞数达到45-55%铺满度。 其中细胞数达到50%铺满度。 其中在生物传感器上培养的细胞器在和 化合物孵育之前含有至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10， 000、 11,000、 12,000、 13,000、 14,000、 15,000、 16,000、 17,000、 18,000、 19,000、 20,000、 21,000、 22,000、 23,000、 24,000、 25,000、 30,000、 35,000、 40,000、 45,000、 50,000、 55,000、 60,000、 65,000、或70,000个 细胞。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出在单个时间点收集。 还公开了方法，可包括一些方法，其中收集的生物传感器输出是一种谱。 还公开了方法，可包括一些方法，其中收集的生物传感器输出是各生物传 感器全部面积的TM0模式共振角带图像。还公开了方法，可包括一些方法，其中收集的生物传感器输出是各生物传
感器全部面积的TM0模式共振角带图像。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出包括总角度漂移，
其中总角度漂移的下降表明化合物是细胞增殖的抑制剂。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出包括总角度漂移，
其中总角度漂移的上升表明化合物是细胞增殖的抑制剂。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出包括入射耦合光的
强度，其中入射耦合光的强度对入射光角度作图。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞在生物传感器上培养至少1小
时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、l周或2周。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出包括耦合模式。 还公开了方法，可包括一些方法，其中耦合模式是横向磁场模式(TM0)。 还公开了方法，可包括一些方法，其中TMO模式对最初细胞接种数作图。 还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞含有受体酪氨酸激酶(RTK)，
其中细胞悬浮在含血清的培养基中，血清浓度使得细胞在生物传感器表面附着
并生长，其中细胞附着在生物传感器表面。还公开了方法，还包括通过将细胞在37"C饥饿培养基中培养，饥饿粘附细
胞，其中饥饿培养基是含有低浓度血清的培养基。
还公开了方法，还包括在培养基中至少加入一次缓冲液。
还公开了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括将RTK配体加入到培
养基中。
还公开了方法，可包括一些方法，其中培养基缺乏PDGF (血小板衍生生长 因子)、EGF、胰岛素、TGF-oc、胰岛素样生长因子I (IGF-I)、和神经生长因 子(NGF)。
还公开了方法，可包括一些方法，其中饥饿培养基具有浓度低于约0.1% 的血清或胎牛血清(FBS)。
还公开了方法，可包括一些方法，其中时间依赖性响应发生至少1， 2， 3, 4， 5, 6， 7, 8， 9, 10, 11， 12， 13， 14， 15， 16, 17， 18， 19， 20, 21' 22， 23， 24, 36，或48小时。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器嵌入具有多个孔的微量 滴定板底部，其中在两个或多个孔的各孔中培养不同类型的细胞，其中对两个或多个孔提供刺激事件，其中刺激事件是在两个或多个孔中加入RTK配体，其中从两个或多个孔中收集生物传感器输出，其中生物传感器输出是不同类型细胞的时间依赖性响应。
还公开了方法，可包括一些方法，其中不同类型的细胞需要不同培养条件。
还公开了方法，可包括一些方法，其中在不同类型的细胞中测量或测定RTK的表达水平或细胞表面表达水平。
还公开了方法，还包括将培养的细胞与一种化合物一起孵育，测定化合物是否调节RTK信号传递。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞具有相对高表达水平的RTK，其中生物传感器嵌入具有多个孔的微量滴定板底部，其中在两个或多个孔的各孔中培养细胞，其中对两个或多个孔提供刺激事件，其中刺激事件是在两个或多个孔中加入RTK配体，其中在两个或多个孔中加入不同浓度的RTK配体，其中从两个或多个孔中收集生物传感器输出，其中生物传感器输出是不同类型细胞的剂量和时间依赖性响应。
还公开了方法，可包括一些方法，其中比较了细胞的剂量和时间依赖性响应。
还公开了方法，可包括一些方法，其中测定了配体的能力。
还公开了方法，还包括分析生物传感器输出，以获得来自细胞的生物物质释放，从而分析细胞中细胞骨架的状态。
还公开了方法，可包括一些方法，其中细胞的生物物质释放依赖于细胞的成孔试剂诱导的通透性。
还公开了方法，还包括在细胞培养物中加入成孔试剂。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器输出是时间依赖性光学反应。 .
还公开了方法，可包括一些方法，其中所述成孔试剂是化学试剂或生物化合物，可导致细胞表面膜中形成孔。
还公开了方法，可包括一些方法，其中成孔试剂是皂苷、毛地黄皂苷、菲律宾菌素或链球菌溶血素0。
还公开了方法，还包括在细胞培养物中加入成孔试剂后在细胞培养物中加入化合物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中筛选一种或多种化合物，以确定是
139否化合物能干涉细胞内的细胞骨架结构。
还公开了方法，还包括在细胞培养物中加入成孔试剂前在细胞培养物中加入化合物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中筛选一种或多种化合物，以确定是
否化合物能干涉细胞内的细胞骨架结构。
还公开了方法，还包括步骤用能检测标记的装置检测标记。还公开了方法，可包括一些方法，其中标记是荧光标记、放射性标记、或
磷光标记。
还公开了方法，可包括一些方法，其中检测标记的步骤与监测生物传感器的步骤同时发生。
还公开了方法，可包括一些方法，其中生物传感器具有两个区，第一个沉积有不含物质的混合物，第二个沉积有含物质的混合物，从而当细胞在传感器上孵育时，覆盖第二个区域的细胞被物质转染。
还公开了方法，可包括一些方法，其中物质是靶基因、靶蛋白、靶蛋白和
标记蛋白的融合蛋白、针对靶标的脂Ai、针对耙标的抗体、反义寡核苷酸及其衍生物、反基因寡核苷酸及其衍生物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中标记蛋白是His-标记、GFP蛋白或其衍生物。
还公开了方法，可包括一些方法，其中物质与试剂复合，从而使当细胞附着在传感器存在物质的区域时，细胞能摄取该物质。
还公开了方法，可包括一些方法，其中通过将含有物质的混合物选择性沉积在沿光栅结构的传感器表面一半形成区域。
还公开了测定活细胞状态的方法，包括观察细胞内含物的动态物质再分布，其中观察步骤在共振波导光栅生物传感器上发生。
还公开了测试化合物对细胞的作用的方法，包括在生物传感器上培养细胞，首先洗涤细胞，饥饿细胞，'将化合物与细胞孵育，并用生物传感器记录信号。
还公开了方法605，还包括在饥饿步骤后用缓冲液漂洗步骤，或其中细胞生长至高于90%铺满度，或其中洗涤细胞两次，或其中饥饿细胞包括将其仅在DMEM中培养，或其中饥饿细胞进行l， 2， 3， 4, 5， 6, 7, 8， 9， 10， 11， 12，13， 14， 15， 16， 17, 18' 19， 20' 21， 22, 23, 24， 25' 30， 35, 40小时，
140或其中饥饿细胞进行过夜，或其中漂洗缓冲液包含lx常规Hank' s平衡盐缓冲液，20mM HEPES缓冲液，在2. 5mM丙磺舒的存在下，pH7. 0，或其中信号是钙信号，或其中在6分钟内每隔6秒记录钙信号，或其中生物传感器包括HTS7000BioAssay读数仪，或其中方法在室温下进行，或其中生物传感器是Corning Epic 角度讯问系统，或其中生物传感器以横向磁场模式使用，或其中生物传感器以p-极化TM。模式使用，或其中化合物用漂洗缓冲液稀释，或其中漂洗缓冲液含有lx常规Hank's平衡盐缓冲液，20mM HEPES缓冲液，pH7. 0，或其中饥饿细胞发生在不含FBS的缓冲液中，或其中化合物是在溶液中，该溶液含有低于0. 05%的DMS0，或其中饥饿步骤在37'C下发生，或其中饥饿步骤还在空气/5呢c02下发生，或其中在化合物溶液和细胞孵育之前，细胞用不含化合物的化合物溶液预处理，直到达到稳态，或其中生物传感器识别共振带中央位置的像素密度改变，或其中生物传感器测量共振带的角度漂移，或还包括将生物传感器数据对时间作图的步骤，或其中增加的信号(P-DMR)意味着传感体积(sensing volume)内生物分子量的增加，减弱的信号(N-DMR)意味着传感体积内生物分子量的下降，或该方法识别细胞和化合物的特征，或其中特征包括P-D服阶段，然后是N-DMR阶段，其中P-DMR阶段的发生速率比N-D服阶段的衰变速率要高，或其中特征包括P-DMR阶段，直到P-DMR阶段达到评估平台，或其中特征包括两个连续的p-DMR事件，其中升高水平的第一个P-DMR阶段的发生速率比对第二个升高水平的P-DMR阶段的速率要高，或其中特征不包括高于噪声水平的任何dmr信号，或还包括将生物传感器的信号对化合物浓度作图
的步骤。
可将细胞培育到20-99%铺满度，30-80%铺满度，40-65%铺满度，70-99%铺满度，和80-95%铺满度。细胞可以是粘附细胞。粘附细胞是可附着在生物传感器表面的细胞。刺激事件可包括在细胞培养物中加入化合物。化合物可调节细胞的细胞信号途径。调节可活化细胞信号途径。调节可抑制细胞信号途径。化合物可调节细胞上的细胞表面受体。化合物调节可以是受体的激动剂。化合物调节可以是受体的拮抗剂。细胞表面受体可以是G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道、受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、整联蛋白受体、Na+Ai+交换蛋白受体、和免疫受体。受体酪氨酸激酶可以是表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGF)、胰岛素受体、血管内皮生长因子受体(VEGFR)。化合物可以调节细胞内的细胞骨架成分。调节物使细胞骨架结构去稳定。 调节物稳定细胞骨架结构。化合物可以调节胞内酶、胞内激酶、胞内细胞器、 或胞内蛋白。化合物可调节胞外基质。
收集来自生物传感器的生物传感器输出数据步骤包括收集生物传感器输 出数据参数。生物传感器输出数据参数是与刺激事件的动力学有关的参数。生 物传感器输出参数可以包括分析生物传感器输出数据的总体动力学。分析总体 动力学可包括分析相变完成的速率。分析总体动力学可包括分析完成数据输出 所需的时间。分析总体动力学可包括分析数据输出总相所需的时间长度。分析
总体动力学可包括分析p-DMR阶段的总持续时间。分析总体动力学可包括分析 N-DMR阶段的总持续时间。分析总体动力学可包括分析获得P-DMR全幅值的速 率。分析总体动力学可包括分析获得N-DMR全幅值的总时间长度。分析总体动 力学可包括分析获得P-D服全幅值的总时间长度。分析总体动力学可包括分析 从P到N-DMR阶段的过渡时间t 。
生物传感器输出参数可包括分析生物传感器输出数据的相。分析相可包括 分析相变。分析相可包括分析正向物质再分布(P-DMR)信号。分析相可包括 分析反向物质再分布(N-薩R)信号。分析相可包括分析净零向物质再分布(净 零DMR)。分析相可包括分析正向物质再分布(P-DMR)信号的形状。分析相可 包括分析正向物质再分布(P-DMR)信号的振幅。分析相可包括分析反向物质 再分布(N-匿R)信号的形状。分析相可包括分析反向物质再分布(N-DMR)信 号的振幅。
生物传感器输出参数可包括生物传感器输出数据的全面动力学。分析全面 动力学可包括分析生物传感器输出产生的整条曲线的形状。生物传感器输出参 数是与共振峰有关的参数。生物传感器输出参数可包括分析在光耦合生物传感 器时，光强对入射角。生物传感器输出参数可包括分析在光耦合生物传感器时 的光强对光波长。生物传感器输出参数可包括分析峰位置。分析峰位置可包括 分析在峰值强度位置之前的半最大峰强度位置。分析峰位置可包括分析在峰值 强度位置之后的半最大峰强度位置。
生物传感器输出参数可包括分析共振峰上一点的强度。分析共振峰强度可 包括分析峰强度的强度。分析共振峰强度可包括分析在共振峰上，峰值强度之 前发生的半最大峰强度的强度。分析共振峰强度可包括分析在共振峰上，峰值 强度之后发生的半最大峰强度的强度。该方法还可包括收集第二生物传感器输出参数。第二生物传感器输出参数可包括分析峰位置。生物传感器输出参数可包括分析峰形。分析峰形可包括测定共振峰下面积。共振峰下面积可仅包括在共振峰上存在的半最大强度点之间连线以上的面积。分析峰形可包括分析半最大强度点的共振峰宽度。生物传感器输出参数可以是与共振带图像有关的参数。可通过用穿过生物传感器的光点对生物传感器进行光照，并用接收系统对穿过生物传感器的入射耦合光强分布作图收集共振带图像。接收系统可以是CCD照相机。有关共振带图像的参数可以是带形、带位置、带强度或光强分布。
可分析半最大峰宽(PWHM)联合最大强度位置。可同时分析生物传感器。从各孔的生物传感器收集数据点的时间可小于1小时、30分钟、5分钟、l分钟、30秒、10秒、5秒、2秒、l秒，而且是生物扩散限制的。可通过在生长培养基中培养细胞，使细胞为增殖期，或可通过在饥饿培养基中培养细胞，使细胞为休眠期，或是分化状态，或特定的细胞周期状态。饥饿培养基是任何降低细胞培养物细胞增殖能力的培养基。
方法还可包括在细胞培养基中至少一次加入缓冲液的步骤，其中所用的缓冲液可基于根据细胞类型和耙标-化合物相互作用的性质的最佳分析。可以连续方式，以1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分钟、或5分钟、30分钟的采样速率进行监测。特征输出可包括动态物质再分布反应，包括三个相中的至少一个正-DMR、反-画R、和净零-D服阶段。可从细胞系产生细胞，或是遗传工程改造的变体细胞系。可分析化合物在细胞上的吸收、分布、代谢和毒性来测定化合物的作用。作用可包括化合物在细胞上的功能评估，并鉴定对细胞的吸收、分布、代谢、排出和毒性的作用。
生物传感器输出与细胞物质再分布的改变有关。可观察作为生物传感器反射光束的角度或光谱变化的生物传感器输出。该方法还包括在细胞培养基中至少一次加入缓冲液。化合物可以是抗癌化合物，或可能的抗癌化合物。在生物传感器上可有至少10xl()S个细胞。细胞可达到至少80%铺满度。生物传感器可嵌入微量滴定板。细胞可在生物传感器上生长至少1小时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、l周或2周。生物传感器能分辨与存活细胞接触的生物传感器表面的一定区域。被影响的细胞可释放出一部分胞内成分或是死细胞。
该方法还包括将细胞-生物传感器与化合物一起孵育。化合物是化学物质、
143生物化学物质、生物分子、药物或聚合物。该方法还包括在与化合物一起孵育 后进行分析。可在少于或等于60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、 3秒、2秒、或1秒中内进行分析。不均一性可通过从生物传感器收集输出测 定(其中该输出产生具有最大强度的导向模式共振峰)，和比较半最大强度的 峰宽(PWHM)来测定。导向模式是横向磁场模式。
生物传感器可以是单数形式或复数形式。当生物传感器是复数形式，生物 传感器可嵌于微量滴定板的一些孔中。在微量滴定板的一个孔中可有一个生物 传感器。在微量滴定板的一个孔中可有多个生物传感器，其中生物传感器可用 或不用屏障物理分隔。当生物传感器用屏障物理分隔时，确定区室的屏障可比 确定微量滴定板孔的屏障要低。生物传感器可以是光学波导生物传感器。生物 传感器是光学波导光栅生物传感器。
该方法还可进一步包括收集时间依赖性PWHM改变。光学波导光模式谱可 以是导向横向磁场模式的共振峰。生物传感器可以是光学生物传感器。生物传 感器可以是基于光学的生物传感器。生物传感器可以是无标记生物传感器。生 物传感器可与培养细胞的系统结合。系统可以是平板。平板可以是具有多孔的 平板。平板可以是微量滴定板。细胞可达到70%铺满度。
方法还可包括步骤获得TMO模式共振角带的宽度，将加入化合物的孔的 TMO模式共振角带的宽度与未加化合物的TMO模式共振角带宽度比较，比较TMO 模式共振角带的宽度。生物传感器可以是基于波导的生物传感器。基于波导的 生物传感器可以是基于NbA的光学生物传感器。细胞可以是粘附细胞。细胞可 生长到30%、 50%或90%铺满度。生物传感器输出可以是光学波导光模式谱 (OWLS)、或导向模式的共振峰、或导向模式的共振带图像。PWHM的变化可表 示化合物对细胞有毒。PWHM变宽可表示化合物对细胞有毒。PWHM分裂可表示 化合物对细胞有毒。共振带变宽可表示化合物对细胞有毒。细胞可达到至少70% 铺满度。生物传感器可与微量滴定板结合。生物传感器可嵌入微量滴定板各孔 底部。生物传感器可以是基于光学的无标记生物传感器。细胞-生物传感器可 被化合物覆盖。化合物可在溶液中。起始细胞数能实现增殖增加或增殖减少的 分析。细胞数在不存在化合物的情况下可达到30-70%铺满度。细胞数可达到 40-60%铺满度。细胞数可达到45-55°/。铺满度。细胞数可达到50%铺满度。在生 物传感器上培养的细胞器在和化合物孵育之前可含有至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10，000、 11，000、 12,000、 13,000、
14414， 000、 15, 000、 16， 000、 17， 000、 18, 000、 19， 000、 20， 000、 21， 000、 22, 000、 23,000、 24,000、 25,000、 30,000、 35,000、 40,000、 45,000、 50,000、 55,000、 60,000、 65,000、或70，000个细胞。
输出可在单个时间点收集。收集的生物传感器输出可以是一种谱。收集的 生物传感器输出可以是各生物传感器全部面积的TMO模式共振角带图像。收集 的生物传感器输出可以是各生物传感器全部面积的TMO模式共振角带图像。该 方法还包括获得提供总角度漂移的输出，其中总角度漂移的下降表明化合物是 细胞增殖的抑制剂。该方法还包括获得提供总角度漂移的输出，其中总角度漂 移的上升表明化合物是细胞增殖的抑制剂。收集的输出可获得入射耦合光的强 度，其中入射耦合光的强度对入射光角度作图。细胞在生物传感器上培养至少 1小时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、或过夜。
输出可以是耦合模式。耦合模式可以是横向磁场模式(TMO) 。 TMO模式还 可对最初细胞接种数作图。该方法还包括37。C在含有低浓度血清的培养基中饥 饿粘附的细胞一定时间。该方法还包括在细胞培养基中加入至少一次缓冲溶液 一定的时间。该方法还可包括在培养基中加入含有RTK配体的溶液。细胞培养 基可缺乏PDGF (血小板衍生生长因子)、EGF、胰岛素、TGF-a、胰岛素样生长 因子I (IGF-1)、和神经生长因子(NGF)。饥饿培养基可具有浓度低于约0. 1% 的血清或牛血清白蛋白(BSA)。时间依赖性响应可发生至少1, 2, 3, 4, 5, 6, 7， 8, 9， 10， 11， 12, 13， 14, 15, 16, 17， 18， 19, 20， 21， 22， 23， 24， 36，或48小时。不同类型的细胞可需要不同培养条件。监测的细胞生物物质 释放可依赖于细胞的成孔试剂诱导的通透性。成孔试剂是化学试剂或生物物 质，可导致细胞表面膜中形成孔。成孔试剂可以是皂苷、毛地黄皂苷、菲律宾 菌素或链球菌溶血素0。
VII.实施例
列出下列实施例是为了给本领域一般技术人员提供有关于本文所要求的 化合物、组合物、制品、装置和/或方法是如何制备和评估的完整公开和描述， 纯粹是示范性的，不意味着限制公开内容。已常识确保数据(例如量、温度等) 的准确性，但仍可能存在一些错误和误差。除非另外说明，份是重量份，温度 是'c，或在环境温度下，压力是或接近大气压。
1451.实施例l基于生物传感器的细胞毒性筛选
常根据化合物的细胞毒性和抗增殖作用来表征化合物，以表征可能的抗癌 药。此类的一种表型是当细胞接触细胞毒性剂(包括二甲基亚砜(DMS0))时， 质膜完整性受损。使用基于波导的生物传感器技术，可检测监测DMSO对中国 仓鼠卵巢(CH0)和A431细胞的作用是否可行。约10X105个细胞置于Corning Epic LID微板的各孔中。这些细胞在血清培养基中培养过夜，以确保细胞附着 在基材表面，并达到至少80%铺满度。检测了细胞对不同浓度DMSO (1%、 2%、 5%、 10%、 15%、 18%、和20%)的反应。高浓度的(约》25°/。) DMSO导致体积指 数改变，超过了所用传感器的最大动态范围，信号丧失。对每种细胞系进行至 少两组实验。
a) 材料和方法
所有细胞系购自美国典型培养物保藏中心。DMSO获自SigraaChemical Co. (St. Louis, M0)。动物细胞的活/死细胞存活试剂盒获自Molecular Probes (Eugene, Oregon)。
在补充有10。/。胎牛血清、100ng/ml青霉素和100pg/ml链霉素的Dulbecco' s 改良Eagle's培养基(DMEM)中培养A431和CHO-Kl细胞。对于细胞培养，将 约10xl(f个细胞(A431或CHO-Kl)悬浮在200jil培养基中，置于96孔Corning Epic生物传感器微量滴定板的各孔中，37°C，空气/5%(]02培养过夜。分析前， 细胞用对应培养基洗涤一次。分析中，IO(HU培养基中的细胞中加入两个含有 20mM HEPES， pH7. 4的25|^1 HBSS缓冲液，各分离至少15分钟，然后加入50(il 丽SO溶液。在所有这些步骤中，用平行角讯问系统监测细胞反应的实时动力学。
分析后，立刻用供应商推荐的方案对相应得到的细胞进行活/死染色。染 色后，用荧光显微镜检(Zeiss Axioplan荧光显微镜)观察处理和未处理细胞 的形态和荧光分布。
b) 结果
结果显示，附着在生物传感器上的细胞产生类似的反应曲线。如图29所 示，CHO细胞层的画SO诱导的剂量响应和时间依赖性响应曲线表明，DMSO浓 度小于20%时，反应基本无特征，除了在引入DMSO溶液后反应逐渐下降。注意 到有最初和迅速的增加时期，这是由于引入所有浓度的DMSO后体积指数改变。
146然而，当DMS0浓度达到20%,观察到4个事件(A)由于DMS0溶液加入之后 立即发生的由于体积指数的变化而产生的大的响应信号；(B)可能由于两种 液体在孔中的混合而产生的小的减弱的信号；(C)可能由于DMSO在某些浓度 下渗入并替代细胞内的生物液体而导致的缓慢而稳定的增强的信号；和(D) 由于高浓度DMSO的毒性引起的细胞蛋白质或其它生物分子的丧失并因此导致 的细胞表面膜丧失完整性而产生的长时间的减弱的信号。已知折射率值是对 于该研究中使用的水相缓冲液系统，1.3328; DMSO， 1.437;和蛋白质约1.5。 另外，在细胞中有约70% (重量)的生物液，它主要有水组成，具有1.3328的 折射指数。另外30%含有蛋白质、DNA、 RNA、脂类分子。还已知当DMSO浓度低 于10%时，细胞膜在实验持续过程中不受DMSO显著影响；然而当服SO浓度在 10%-20%之间时，受损细胞膜百分数增加。在较高浓度，几乎所有细胞膜都受 损 (Beske， 0., 等， "A novel encoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiple cell types" ， J. Biomol. Screening. 2004， 9, 173-185))。
类似的剂量响应曲线在作用于A431细胞的画S0中也观察到(图30) 。 CH0 细胞和A431细胞系之间的事件B的不同行为可能是由于两种类型的细胞在基 材上的粘附和形态不同。CH0细胞倾向于比A431细胞铺开少，导致A431粘附 在基材上的层更薄，意味着当组成事件D的受影响细胞的物质丧失在两种细胞 系中相似时，生物液交换事件(事件C)比生物再分布事件要较不明显。
2.实施例2用光学传感器HT筛选化合物毒性 a)高通量筛选化合物毒性的方法
技术领域：
本发明的一个方面提供了适合用无标记光学传感器高通量筛选化合物毒 性和凋亡的方法。该方法使人能够在几秒钟内检测整个平板的化合物毒性。
该方法的原理基于一个事实，即给定化合物的毒性能导致细胞渗漏，甚至 死亡。这因而导致培养细胞的传感器表面的不均一性。在毒性研究过程中，生
物传感器感应三种区域具有活细胞的区域，具有死亡或正在死亡细胞的区域 (其中死细胞倾向丧失其胞内成分，导致折射率改变)，和无细胞区域。不均
一性的形成可导致给定导向模式的共振峰的PWHM改变，或共振带图像的宽度
和分布的改变，这都依赖于细胞密度。在特定情况(在膜表面培养的细胞具有 朝向，或具有某类优选结构，或某些区域的细胞对毒性化合物敏感)下，化合物毒性可导致产生精细结构，例如肩部(shoulders)(导致共振峰和带变宽)， 甚至分裂共振峰。
考虑细胞在波导传感器平板上预培养并达到高度铺满度(>75%)，传感器 大部分感应折射指数约为1. 37的活细胞以及折射指数约为1. 33的覆盖的培养 基。TMO峰的PWHM较低。在加入毒性化合物后，细胞开始受到影响。受影响的 细胞同时产生物理和生理改变(即形态学、形状和胞内成分重排)。最终受影 响细胞死亡。在化合物处理一段时间后，有混合群的细胞活细胞、受影响细 胞和死亡细胞。因此，随着化合物处理后时间增加，TMO峰的PWHM开始从其较 低水平上升，在某一时刻达到其最大值，并开始再次衰减到其原始的较低水平， 而且总体响应(即角度或波长漂移)也下降。达到其最大值的动力学视细胞系 和化合物作用于细胞的机制而定。该过程是细胞粘附和铺开过程的逆向过程。
在一个实施例中，本发明提供了一种使用光学生物传感器高通量筛选对细 胞的化合物毒性的方法，包括(a)提供在每孔底部嵌入有基于光学的无标 记生物传感器的微量滴定板；(b)将细胞置于每孔中，以覆盖生物传感器， 从而使细胞附着在生物传感器表面，并达到高度铺满度；(c)在每孔的细胞 培养基中加入化合物溶液；(e)在某一时刻收集光学波导光模式谱。将各化 合物的PWHM与对照孔比较，该孔中细胞不接触任何化合物溶液，可用单数据 点评估化合物的毒性。如必需，还可记录时间依赖性PWHM改变以研究动力学。
在另一个实施例中，本发明提供了另一种评估化合物毒性的方法，包括 (a)提供在每孔底部嵌入有基于光学的无标记生物传感器的微量滴定板；(b) 将细胞置于每孔中，以覆盖生物传感器，从而使细胞附着在生物传感器表面， 并达到所需的铺满度；(c)在每孔的细胞培养基中加入化合物溶液；(e)在 某一时刻收集各孔的整个传感器区域的TMO模式共振角带图像。将用化合物溶 液处理的传感器的共振带宽度与对照孔的比较，对照孔中细胞不接触任何化合 物溶液；可评估化合物毒性。
根据细胞毒性和抗增殖效果描述化合物常用于描述可能的抗癌药。 一种表 型是当细胞接触细胞毒性剂(包括二甲亚砜(DMS0))时，质膜完整性受损。 使用基于波导的生物传感器技术，用高通量方法检测了在中国仓鼠卵巢(CH0) 和A431细胞上监测DMS0的效果的可行性。
图31A显示培养于Nb205基光学波导生物传感器上具有不同铺满度度(30 %、 50%和90%)的CHO细胞层的入射耦合光的强度，它是入射角的函数。耦合模式是横向磁场(TMO)模式。图31B显示了计算TMO模式的半最大峰宽 (PWHM)，并对CHO细胞铺满度度作图。随着细胞铺满度度增加，PWHM增加， 在约50%铺满度时达到最大值，然后开始下降到起始值。值得注意的是，在所 有铺满度水平上，细胞的入射耦合峰具有小肩峰，但对于没有细胞附着的传感 器来说并没有。这可能是由于CHO细胞倾向于附着于具有优选朝向的光栅传感 器表面(见图35A)。
图32显示在波导光栅传感器上培养的具有两种不同铺满度度，5% (左) 和75% (右)的CHO细胞层的TMO模式共振峰。在加入DMSO后(最终浓度为 18%)，在不同时刻记录共振峰谱。对于小于约25%的细胞密度，P冊M值不随 时间改变。然而，当传感器上细胞铺满度度高(>70%)时，PWHM起初上升，随 后下降。不仅共振峰变宽，在DMSO处理后约25分钟时出现肩部等细微结构， 甚至共振峰分裂。有趣的是，响应DMSO处理的共振峰变宽和峰形改变是动态 过程，提示DMSO诱导的细胞响应与某些细胞信号途径，例如凋亡一致。
图33显示了不同铺满度度的CH0细胞层覆盖的整个传感器的TM0模式共 振带图像。在用缓冲液(2栏)、18% DMS0 (l栏)处理25分钟后取得图像。 图像提示(i)用缓冲液处理的细胞不导致整个传感器的共振带有任何改变， 不论细胞的铺满度度如何；(ii)用18% DMS0处理的细胞产生铺满度度依赖 性的共振带变宽。当细胞铺满度度高于70%， DMSO-诱导的共振带变宽。这些结 果提示，可用共振带变宽作为化合物毒性的特征；细胞密度或铺满度度对于使 得这类评估有效是重要的。与共振峰谱相似，响应DMSO处理的共振带图像变 宽或形状改变是动态过程，提示DMSO-诱导的细胞响应可能与某些细胞信号途 径，例如凋亡有关。更重要的是，微量滴定板中的所有96个传感器的共振带 图像可在3秒内收集，提示基于共振带图像或谱的本发明方法提供了细胞毒性 评估和化合物毒性筛选的超高通量技术。
图34显示了以相同铺满度度(约95%)的CH0细胞层覆盖整个传感器的 TM。模式共振带图像。在用缓冲液(栏2的6个孔)和不同浓度的DMSO (l栏中 的6个孔，3栏中的6个孔，如图34所示)处理25分钟后获得图像。结果显 示，DMSO的毒性作用依赖于浓度；仅较高浓度导致显著的细胞毒性，如带形改 变所示。特别有趣的发现是当所用的DMSO浓度为约15%时，出现第二条共振带， 可能是由于CHO细胞培养物在传感器上的优选朝向。CHO细胞似乎在培养条件 下与光栅结构的排列一致(见图35)。发现这些结果与常规活/死细胞染色法一致，并用该方法验证(数据未显示)。
3. 实施例3高通量增殖分析
图36A显示当三种不同接种数的细胞用于在常规培养条件下培养36小时， 在波导光栅传感器表面培养的CHO细胞作为入射角函数的入射耦合光强度。耦 合模式是横向磁场(TM。)模式。图36B显示计算TM。模式的半最大峰宽(PWHM) 并对CH0最初接种数量作图。随着细胞的最初接种数增加，PW丽增加，在 20000-30000最初接种细胞处达到最大值(对应铺满度度约为50%)，并开始 下降到起始值。值得注意的是，在所有铺满度水平，细胞的入射耦合峰有明显 肩峰，但对于没有细胞附着的传感器没有。这也可能是由于CHO倾向于以优选 朝向附着在光栅传感器表面(见图35)。有趣的是，这里所示的结果与在固定 时间段后，用不同接种数的细胞以达到不同细胞密度获得的一致(见图31)， 提示该方法是可再现的。
图37显示在波导光栅传感器上培养36小时(不同的孔含有不同起始接种 数的细胞)后，CHO细胞覆盖的整个传感器的TM。模式共振带图像。观察整个传 感器的TM。模式共振带图像的形状和位置依赖于最初接种的细胞数，提示传感 器对细胞密度敏感；CHO细胞的增殖速率依赖于最初接种的细胞数，如在用 Molecular Probes的活/死细胞试剂盒染色后，用荧光显微镜进行细胞密度分 析验证的。对最初接种数为10000、 20000、 30000、 40000和50000个细胞， 对应的铺满度度分别是5%、 30°/。、 55%、 75%、 95%。
4. 实施例4用生物传感器进行细胞信号途径研究 a)材料和方法
所有细胞系购自美国典型培养物保藏中心。所有化学物质购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)， 或Tocris Chemical Co. (St. Louis, MO)。
在补充有10。/。胎牛血清、10(Hig/ml青霉素和100pg/ml链霉素的Dulbecco' s 改良Eagle's培养基(DMEM)中培养A431和CH0-K1细胞。对于细胞培养，将 一定数量的细胞(2xl05-lxl()6个细胞，A431或CHO-Kl)悬浮在200|il培养基 中，置于96孔Corning Epic生物传感器微量滴定板的各孔中，37°C,空气/5% C02培养一段时间，直到细胞密度达到约90%或以上(除非另外说明)。得到的 细胞被称为"增殖性"细胞。通过将所需铺满度度的增殖性细胞在不含或很少
150(约0. 1%胎牛血清(FBS))的培养基中培养至少16小时获得"休眠性"细胞。 直接将增殖性或休眠性细胞用于分析，或用对应的培养基洗涤一次再用于 分析(两者都不导致细胞响应中的明显差异)。在分析过程中，将100pl培养 基中的细胞中加入两个含有20mM HEPES， pH7. 4的25|il HBSS缓冲液中，各分 离至少15分钟，然后加入50ial含有刺激物的溶液。在所有步骤中，使用平行 角度讯问系统监测细胞反应实时动态。为了化合物作用研究，使用改变的方案， 即用50nl培养基开始，然后进行如下依次处理25plHBSS缓冲液两次(每次 分离至少15分钟)、50pl化合物溶液、和最后50)il含剌激物的溶液。
所用的传感器是96孔Corning Epic生物传感器微量滴定板(如图1和图 2a所示)，并直接用于细胞培养物。所用的检测系统是06-24-2003提交的美 国专利申请号10/602， 304(于12-30-2004出版，公开号为US-2004-0263841)、 12-21-2004提交的美国专利申请号11/019， 439、和N. Fontaine等于2005年 3月31日提交的美国专利申请 "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS"中的那些，在此完整引入以供参考，至少是生物传 感器及其用途的部分。
b)结果
(1)实时监测配体结合和随后的RTK信号传递事件
图6A显示休眠或饥饿A431细胞层在加入8nM EGF之前和之后的时间依赖 性响应(用光学生物传感器监测)。A431细胞系是癌细胞系，内源过度表达 EGFR。将含有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco's改良Eagle， s培养基(DMEM) 中的A431细胞加到微量滴定板的各孔中，在各孔底部具有波导生物传感器。 细胞37'C培养过夜，用仅含0. 1%血清的培养基交换血清培养基，继续培养细 胞另18小时。在室温下(约20°C)进行整个时间过程。加入EGF (A)后，EGF 处理休眠A431细胞(通过在O. 1%胎牛血清(FBS)中培养18小时获得)，产 生由三个不同的依次相组成的时间依赖性响应(i)信号增加的正相(P-DMR) (图6A的点C到D) ， (ii)净零相(点D到E),和(iii)具有下降信号 的衰变相(N-DMR)(点E至ljF至ljG)。注意到信号有迅速的响应改变，持续小 于20秒(图6A的点B到C)，它在孔中加入50ml EGF时发生。该迅速改变主 要是由于体积指数(bulk index)改变，临时覆盖了任何D服信号。测得的P-DMR 信号主要是由于胞内成分向活化的EGFR募集，以及由于在EGFR活化后质膜内
151陷造成细胞扁平，而细胞脱离和受体内化是N-DMR事件的两个主要原因。然而 P-DMR事件可能还与和细胞功能无关的事件有关，包括细胞培养基和化合物溶 液之间的溶液扩散和温度差异。
上述步骤在响应曲线中的动力学与文献中所报道的EGF-诱导的EGFR信号 传导的配体结合、磷酸化和运输事件(B. Schoeberl， C. Eichler-Jonsson， E. D. Gilles， G. Muller， "Computational Modeling of the Dynamics of the MAP Kinase Cascade Activated by Surface and Internalized EGF Rec印tors， " A'otec力.20， 370 (2002)) —致。生物学和生物化学
研究已显示在37°C， EGF-结合受体可在5-20分钟内内化入位于靠近细胞膜内 面的早期内含体。然后，这些EGFR与其它成分复合，被运输到晚期内含体(20-60 分钟)和溶酶体(〉60分钟)降解，两者都与细胞膜的内面相对较远(即在运 输过程中，这些受体朝离开传感器表面的方向移动)。受体和配体通过不同区 室存在连续流动；多个步骤显示它们的完全动态分布。由于迅速内化，EGF结 合的受体仅在细胞表面停留相对较短的时间(约3分钟)。
(2)测定EGFR表达水平和细胞表面表达的方法
内源过度表达表皮生长因子受体(EGFR，约1， 700， 000拷贝/细胞)的A431 细胞是EGFR信号传导的广泛研究的模型(A. Glading, P. Chang, D. A. Lauffenburger,禾口 A. Wells, "Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway, ，，J. Biol. Chem. 2000， 275:2390 - 2398)。用EGF在室温或37。C刺激休眠A431细胞最终导致受体内 吞，折射形态学改变和细胞从胞外基质上脱离(Z. Lu， G. Jiang, P. Blume-Jensen， 禾口 T. Hunter, "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase, ，， Mol. Cell Biol. 2001， 21， 4016 - 4031)。因此，EGF刺激导致A431细胞中显著的物质再分布，如用阵列 讯问系统实时测量的(见图6A、图18)。结果显示了 A431细胞的EGF-诱导的 DMR响应强烈依赖于培养条件。在0. 1°/。FBS中培养20小时的A431细胞的EGF 处理产生了由三个不同的依次相组成的时间依赖性响应(i)信号增加的正
相(P-DMR)(图6A的点C到D) ， (ii)净零相(点D到E)，和(iii)具
152有下降信号的衰变相(N-DMR)(点E到F)。然而，与休眠A431细胞相比， 用0. 1%FBS处理仅4小时的A431细胞产生类似响应，但动力学改变，幅度小 得多。相反的，增殖性A431细胞(用10%FBS培养)仅产生响应EGF刺激的P-DMR 事件。此外，休眠或增殖性中国仓鼠卵巢(CH0)细胞都未观察到显著响应， 与CHO细胞不内源性表达EGFR的事实一致(E. Livneh， R. Prywes， 0. Kashle, N. Reiss， I. Sasson， Y. Mory, A. Ullrich, and J. Schlessinger， "Reconstitution of human epidermal growth factor receptors and its deletion mutants in cultured hamster cells, ，， , "/o丄 C6e瓜 1986， 261, 12490 - 12497)。这些结果提示EGF-诱导的腿R信号依赖于EGFR。
图39总结了这三种类型细胞的P-DMR和N-DMR。结果显示，当CH0细胞与 EGF孵育时，没有清楚的P-DMR或B-DMR信号，与CH0细胞不表达EGFR的事实 一致。相反，对于休眠A431细胞，用EGF刺激诱导的P-D服和N-DMR信号分 别是3.08和2.34。然而，未饥饿(即增殖性)A431细胞产生小得多的P-D服 信号，没有明显N-DMR。这些结果确认了血清生长培养基影响EGFR细胞表面表 达水平这一事实；由于血清含有EGF和许多其它生长因子，较高血清培养基得 到较低细胞表面EGFR表达。
(3)测定配体对RTK的能力的方法
如图7所示，用不同浓度的EGF刺激都导致类似的响应(图7A);然而， 三种限定响应的主要参数显示明显倾向于所用的EGF浓度。EGF浓度越高，(i) P-DMR和N-DMR信号的幅度越大，(i i) P-DMR和N-DMR事件越快，禾卩(i ii ) 从P-DMR到N-D服事件的过渡时间t越短。P-DMR事件涉及细胞功能相关和其 它影响。可能的影响包括但不限于由于处理引起的细胞扁平、细胞膜内陷、胞 内成分募集和细胞骨架重建，和EGF结合(程度较小)。非细胞功能相关事件 (包括细胞培养基和化合物溶液的溶液扩散和温度差异)也可能影响分析。因 此，我们观察到总P-D服幅度与EGF浓度的复杂关系。当P-DMR事件的幅度显 示与EGF浓度有复杂关系时，N-D服信号的幅度清楚的对EGF浓度饱和，得到 约1. 45nM的EC5。(图7B)。发现过渡时间t (秒)跟随EGF的递增浓度C指 数下降(图7C):
t (C) =946*e—° 144t+1130
另外，N-DMR信号的衰变可与非线性回归拟合。获得的一相衰变常数K也是可饱和的，得到Kd5. 76nM (图7D)。结果表明(i) EGF诱导的DMR信号依赖 于EGFR活化；(ii)可用光学生物传感器基于配体诱导的物质再分布信号测 定配体能力。
(4)筛选在不同阶段影响RTK信号传导的调节物的方法
图40显示用不同化合物预处理对饥饿的A431细胞层8nM EGF诱导的信号 传导的时间依赖性响应的影响。图41总结了不同情况下结合和DMR信号的净 变化。结果显示，细胞可通透的发动蛋白抑制肽(DIP) (Burke, P.,等，
"Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking" ， Mol. Biol. Cell. 2001, 12:1897 - 1910)完全封闭N-D服信号，但以慢得多的动力学使P-丽R信号轻 微增加。DIP是一种GTPase发动蛋白的细胞可通透抑制剂，竞争性抑制发动蛋 白与突触特异性蛋白质(amphiphysin)的结合，防止胞内吞(Burke， P.,等，
"Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking" ， Mol. Biol. Cell. 2001, 12: 1897 - 1910)。这些观察结果提示，N-醒R信号涉及受体移位及其相关细胞形 态学改变，因为EGF-诱导的EGFR内化主要是通过发动蛋白依赖性途径发生的， 并涉及细胞骨架重排，而发动蛋白与活化EGFR的偶联影响EGF结合亲和力。 DIP存在下，总P-DMR信号比不存在DIP时高50%，提示在P-DMR期间(图6A 的C到D)，有一些活化的EGFR已被内化。已知EGF结合的受体由于迅速内化， 37'C下仅在细胞表面停留较短时间(约3分钟)。此外，估计在运输过程中， 形成的各48. 7%包被的(coated)和96. 2%的光滑小窝(smooth pit)的EE循 环回到细胞表面，即通过披有网格蛋白的小窝使受体内化足够引起大部分内 吞。因此，通过包被的小窝EE小泡进行受体内化是受体在细胞内聚集的主要 机制，当配体存在于系统中时，情况尤其如此。
用渥曼青霉素预处理饥饿的A431细胞对P-DMR和N-DMR信号及其动力学 没有任何明显影响。渥曼青霉素是磷酯酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的一种强 选择性细胞可通透的不可逆抑制剂，其ICs。是2-4nM(Powis，等，"Wortmannin， a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase"，
(1994) Cancer Res. 54 2419)。这提示PLC-y^径的封闭不影响细胞响应 EGF刺激的两种事件。
154用生长激素(GH) 、 PD98059和PP1预处理饥饿的A431细胞(也见图43) 不显著降低结合和DMR信号，但也导致P-DMR和N-DMR事件的动力学下降。 PD98059是特异性的有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)，通过与 MEK的无活性形式结合起作用，因此防止它被cRAF或MEK激酶磷酸化(IC5。=2-7 yM) (Alessi, 等,'(PD 98059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo"， November 17， 1995， J. Biol. Chem. ， Vol. 270, No. 46， pg. 27489—27494)。 用PD98059封闭MAPKK可能减少信号大小以及有EGFR和EGF结合的细胞响应 的持续时间。PP1是Src家族酪氨酸激酶的强抑制剂，抑制p561ck和p59fynT (IC5。分别为5和6nM)，也中度抑制p38、 CSK、 PDGF受体、RET衍生的癌蛋 白、c_Kit禾口 Bcr-Abl (Liu等，Structural basis for selective inhibition of Src family kinases by PP1" ， ( 1999) Chem. Biol. 6， 671)。表皮 生长因子(EGF)与其受体结合，导致网格蛋白重链在酪氨酸1477处(位于控 制网格蛋白装配的结构域中)快速磷酸化。EGF介导网格蛋白磷酸化，随后网 格蛋白重分布到细胞周质，是EGF受体(EGFR)信号传导下游活化SRC激酶的 产物。在缺乏SRC激酶的细胞、或用特异性SRC家族激酶抑制剂处理过的细胞 中，网格蛋白磷酸化和再分布的EGF刺激没有发生，EGF胞内吞延迟。这都和 目前的观察一致。
生长激素(GH)是四螺旋束蛋白，它和许多类激素和细胞因子具有结构相 似性，包括促乳素和各种白介素以及集落刺激因子(Huang， Y.，等，"Growth hormone—induced phosphorylation of epidermal growth factor (EGF) rec印tor in 3T3-F442A cells", J. Biol. Chem. 278， 18902-18913) 。 GH 通过与GH受体(GHR)(—种细胞因子受体超家族的细胞表面糖蛋白成员)相 互作用，发挥其复杂的体细胞和代谢调节作用。近来的研究提示，在GHR和EGFR 家族成员之间有交集，信号传递受体似乎全异类型的例子(分别是细胞因子受 体和酪氨酸激酶受体家族)。GH导致表皮生长因子受体(EGFR; ErbB-1)及其 家族成员ErbB-2磷酸化。显示GH-诱导的EGFR酪氨酸磷酸化需要JAK2，但不 是EGFR的激酶活性。GH导致基底水平和EGF-诱导的ErbB-2酪氨酸激酶活化 和酪氨酸磷酸化的减少，提示GH导致ErbB2的ERK途径依赖性磷酸化，从而 使其对响应EGF的活化去敏化。荧光显微镜研究表明，EGFR-氰基荧光蛋白嵌 合体的EGF-诱导的胞内再分布由于GH共处理显著减少。这也与目前的观察结果一致 (Huang, Y.， 等,"Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor ( EGF)receptor in 3T3—F442A cells" , J". Biol.Chem. 278， 18902-18913)。
(5) AG1478对休眠A431细胞中EGF-诱导的响应的剂量依赖性抑制
图42显示了 AG1478诱导的对休眠A431细胞中EGF-诱导的响应的剂量依 赖型抑制。为了确认这些DMR事件依赖于受体磷酸化，使用强的特异性EGFR 激酶抑制剂一一酪氨酸磷酸化抑制剂AG147S。 A431在不含任何FBS的培养基 中预先饥饿20小时，与在0. 1%FBS培养基中饥饿相同时间的细胞相比，P-DMR 事件的动力学显著加快，过渡时间更短(图42A)。用不同浓度的AG1479预处 理A431细胞1小时，导致对EGF-诱导的响应的剂量依赖型抑制，用N-DMR信 号的幅度对AG1478作图，得到ICs。为约194nM的典型抑制曲线(图42a和b)。 然而，用0. 5%二甲亚砜预处理A431对EGF诱导的响应影响很小(数据未显示)。 这些数据表明，EGFR激酶磷酸化是EGF-诱导的DMR改变所需的；用光学生物 传感器获得的D服信号可用于测定在所测定的簡R事件起到重要作用的调节剂 的能力。
(6) Ras/MAPK途径调节剂对休眠A431细胞中32nM EGF-诱导的响应的影
响
EGF调节细胞增殖和分化，用(至少部分)有丝分裂原活化的蛋白激酶作 为下游信号。另外，ERK活化似乎代表EGFR活化下游的全局负信号，这对于去 粘附是重要的。因此，检测了靶向Ras-MAPK途径的抑制剂，包括MEK抑制剂 U0126、 p38 MAPK抑制剂SB203580和SB20219和JNK抑制剂SP600125的作用 (见图44) 。 U0126显著抑制P-DMR和N-DMR信号的幅度，延迟时间为t 。这 提示MEK1/2抑制妨碍了导致N-DMR信号的细胞脱离和运动，与先前研究一致。 然而，当MEKl/2抑制时，活化EGFR的胞内吞还会发生。由于胞内吞与细胞脱 离和运动相比，远离传感器表面，胞内吞应对整体响应的影响小得多。因此， 用MEKl/2抑制剂预处理的休眠A431的EGF诱导的响应与受体胞内吞一致。这 还得到响应动力学的支持，它与计算机建模的结果一致。相反，SB203580和 SB20219都仅导致部分弱化，而SP600125几乎对EGF-诱导的反应没有影响。 这些结果表明，在休眠A431中，DMR响应的EGF刺激涉及Raf-MEK途径，并通
1过MEK发展。
(7) 蛋白激酶抑制剂对休眠A431细胞用32nM EGF诱导的响应的影响
由于EGFR信号传导涉及各种其它的蛋白质激酶，检测了蛋白质激酶抑制 剂对EGF-诱导的响应的影响。用luM渥曼青霉素(强选择性PI3K抑制剂)、 llxM KT5720 (强选择性蛋白激酶A抑制剂)、10wM KT5823 (蛋白激酶G的 选择性抑制剂)、和IOpM KN62 (CaM激酶II的选择性抑制剂)预处理A431 对响应几乎没有影响。相反，用GF109203x (蛋白激酶C的选择性抑制剂)显 示部分弱化响应(图45)。这些结果表明，是蛋白激酶C，而不是PI3K、蛋白 激酶A和CaM II改变了 EGF剌激DMR改变的能力。
(8) 细胞骨架调节剂对休眠A431细胞用32nM EGF诱导的响应的影响
由于在响应EGF刺激的细胞中靶标的运输和形态改变需要细胞骨架结构的 重建，检测了细胞骨架调节剂对EGF诱导的DMR响应的作用(见图46)。用肌 动蛋白丝破坏剂(松胞菌素B或红海海绵素A)，预处理A431，完全消除了 N-DMR 信号，并导致动力学显著缓慢的延长的P-DMR阶段。两种毒素以不同机制扰乱 组装和分解松胞菌素B捕获肌动蛋白丝，并最终导致肌动蛋白丝分解，而红 海海绵素A隔绝肌动蛋白单体，导致肌动蛋白丝分解。然而，稳定性聚合F-肌动蛋白剂鬼笔环肽或微管破坏剂长春新碱和噻氨酯哒唑(数据未显示)对于 EGF-诱导的响应几乎没有影响。这些结果确认，导致N-DMR信号的细胞运动并 不是由于先前存在的肌动蛋白的重组织，而是由于肌动蛋白聚合，不依赖于微 管装配。相反，由于胞内蛋白的运输需要肌动蛋白丝，P-DMR信号至少部分是 由于胞内成分募集到活化受体上引起的。额外证据来自细胞膜可通透性发动蛋 白抑制肽(DIPC)的作用。用50"M DIPC预处理A431导致用松胞菌素B和红 海海绵素A预处理的细胞相似的响应，但动力学较快。
(9) 磷酸二酯酶抑制剂对休眠A431细胞用32nM EGF诱导的响应的影响
环AMP (cAMP)作为胞内第二信使的一个例子，调节无数细胞功能，例如 代谢、收縮性、运动性、和几乎全部细胞类型中的转录。先前研究显示，cAMP 途径与依赖于细胞背景的生长因子刺激的MAP激酶活性有交集并弱化该活性。 由于磷酸二酯酶(PDE)调节细胞内的cAMP水平，用PDE抑制剂cilostamride、米利酮、Ro 20-1724、 R (-)-咯利普兰和扎达维林(各10uM)研究PDE在 EGF-诱导的响应中的作用。这些抑制剂都对响应没有明显的作用(见图47), 提示cAMP与总DMR响应无关。先前的研究显示，蛋白激酶A可拮抗Raf-l活 性，因此通过调节PDE活性而调节Ras-MAPK。然而，在休眠细胞中，Raf-l显 示组成型磷酸化，对PKA抑制剂不敏感，和我们的观察结果一致，即PKA抑制 剂KT5720 (图45)和PDE4抑制剂Ro 20-1724和R (-)-咯利普兰对EGF-诱 导的DMR信号几乎没有影响。
(10) 室温下(22'C) ， A431细胞中EGF诱导的EGFR内化，细胞形态学 改变，和定向物质再分布
在室温下，用EGF刺激A431细胞触发通过受体二聚化和随后的自磷酸化 的EGFR活化，最终导致受体内吞(见图48A-C)，折射形态改变(见图48D)， 和定向物质再分布(见图2A、图18等)。通过用酸剥离法选择性除去表面结 合的四甲基rhodimine标记的EGF (TMR-EGF),检测了 EGFR内化的程度，并 发现依赖于细胞培养条件。在休眠细胞中比增殖细胞中发现高得多的细胞表面 和内化受体。固定后用得克萨斯红-鬼笔环肽染色观察休眠细胞EGF-诱导的形 态改变。先前研究显示，37。C的A431显示EGF处理后时间依赖性折射形态改 变，并从胞外基质上脱落。与这些研究一致，肌动蛋白重建在EGF处理后约15 分钟开始改变，该改变在刺激延长时变得更剧烈，如细胞边缘的纤丝肌动蛋白 的边缘所示。
(11) 示范性作图显示EGF-诱导DMR信号的一种可能机制-受体内吞
肌动蛋白细胞骨骼在胞内吞中的可能作用。图49的模型描述了皮质肌动 蛋白细胞骨架是如何参与内吞过程的不同步骤的，这些步骤涉及内吞界面和细 胞骨架组织的分子的可能功能。受体被其同源配体(例如EGF)活化后，在受 体内吞中有三个主要步骤(1)胞内机械的空间组织。细胞骨架结构可组织 或抑制内吞机械的侧向运动。质膜的变形和内陷可由细胞骨架支持。2)可能 需要溶解质膜下的皮质肌动蛋白屏障。肌动蛋白聚合可提供在胞内小泡形成时 驱动膜分裂的力。和(3)肌动蛋白聚合可促进新形成的胞内小泡通过形成彗 星状的尾部移动入胞质。5.实施例5筛选细胞骨架调节剂的方法
成孔试剂包括去污剂(例如皂甙和菲律宾菌素)、或毒素(例如毛地黄皂 苷或链球菌溶血素0)。熟知用这些试剂处理细胞可导致在细胞表面膜中形成 孔；得到的通透的细胞可释放一定量的胞内物质，主要是可溶性蛋白质。然而， 有许多生物物质仍然留在这些通透的细胞中，因为它们被细胞骨架结构直接结 合或联合而阻止了。事实上，这些通透的细胞仍然具有活细胞的许多生物功能， 例如蛋白质合成。用能破坏细胞骨架结构的化合物处理细胞能导致这些通透的 细胞释放显著更多的生物物质。
细胞骨架是蛋白质纤丝的复杂和动态网络，伸展在整个真核细胞的细胞质 内。细胞骨架与执行多种细胞内的活动有关。它通过对细胞提供张力强度维持 细胞形状。它还能使一些细胞运动(使用例如鞭毛和纤毛等结构)，并在胞内 运输(例如小泡和细胞器运动)和细胞分裂中起到重要作用。通过提供细胞能 移动细胞器、染色体和其它物质的"轨道"，细胞骨架参与胞内信号传导和运 输。
图50提供了附着在LID传感器表面的CHO细胞响应皂甙，作为时间函数 的剂量依赖型应答。在不同浓度下加入皂甙，明显响应不同。在低浓度下，几 乎没有响应。当皂甙浓度高于约20ug/ml时，信号降低，然后响应增加。最 初增加的信号很可能是由于细胞在传感器表面展平，导致传感器的感应体积内 的质量增加；而下降的信号很可能反映了细胞丧失生物物质；另一种可能性是 由于细胞成分的重排和/或形态改变，导致传感器感应体积内质量净下降。在 测试的最高浓度，没有最初增加的信号；相反，仅有具有比其它较低浓度要强 得多的响应的下降信号。
用较高浓度皂苷处理的细胞的通透性可用Texas红-鬼笔环肽染色不同浓 度的皂苷处理后的CHO细胞，用荧光图像验证(数据未显示)。Texas红-X鬼 笔环肽是一种F-肌动蛋白的高亲和探针，是用偶联的蘑菇毒素制备的。用Texas 红-鬼笔环肽染色需要细胞是可通透的，通常是在甲醛固定后进行的。这是由 于荧光鬼笔环肽偶联物不能渗透入大部分活细胞，虽然未标记的鬼笔环肽能穿 透细胞膜。用高浓度皂苷处理后的细胞内的强荧光表明孔形成，以及细胞是通 透的。基于该研究，选择67ng/ml浓度的皂苷用于化合物筛选。
图51显示了在用不同化合物预处理后，CHO细胞的皂苷诱导和时间依赖性 响应。结果显示这些化合物可主要分成四类(i)导致生物物质丧失的化合
159物(例如松胞菌素B)，如N-DMR信号增加的动力学和幅度验证的；(ii)对
皂苷诱导的响应没有作用的化合物(例如发动蛋白抑制肽、布雷菲德菌素A)';
(iii)在皂苷处理的细胞中延迟生物物质丧失，但在较长时间后有相似总改 变的化合物(例如鬼笔环肽)；和(iv)阻止生物物质由于皂苷引起的丧失的 化合物(例如长春新碱)。这些观察结果与这些化合物的己知性质一致。松胞 菌素B捕获肌动蛋白丝，防止装配，并由于肌动蛋白丝的动态性质，最终导致 肌动蛋白丝分解。相反，鬼笔环肽与F-肌动蛋白结合，促进肌动蛋白聚合。长 春新碱通过与微管蛋白结合抑制微管装配，并诱导螺旋聚集物的自我结合。发 动蛋白抑制肽(DIPC)和布雷菲德菌素A不和肌动蛋白或其它纤丝结合。这些 结果也提示肌动蛋白丝，而不是其它纤丝提供了大部分生物大分子螯合位点。
皂苷处理后，用得克萨斯红-鬼笔环肽染色揭示，松胞菌素B预处理的细 胞和用其它化合物预处理的细胞相比，有相似的染色模式(数据未显示)。这 可能是由于可得的荧光解析度有限。然而，鬼笔环肽预处理的细胞的染色显著 更低。这是由于未标记的鬼笔环肽阻碍标记的鬼笔环肽对F-肌动蛋白的染色。
6.实施例6:用无标记光学生物传感器进行G蛋白偶联受体(GPCR)细胞
试验的系统和方法
图52-60以多幅图表显示了用来证明光学LID系统可用于监测活细胞内物 质再分布(例如CPCR移位)的数项不同实验的结果。如本文所述，可在一光 学LID生物传感器表面上对这些移位进行定位。图52-60中的数据是用一光学 波导光栅传感系统和LID微板(恥205板)(Corning Incorporated制造)获得 的。图52显示据光学LID系统1000监测，中国仓鼠卵巢细胞108 (CH01008) 中数种激动剂诱导的应答。已知，CH0细胞1008内源性表达3-肾上腺素能受 体、(x2-肾上腺素能受体、P2Y-受体以及e-抑制蛋白抑制蛋白和GRK。还已知， CH0细胞1008内毒蕈碱受体内源性表达水平很低。本实验中，在微板的每孔中 加入约5X1(^个CH0细胞1008，该微板上具有光学LID生物传感器阵列1004。 然后，CHO细胞1008在150(il血清培养基中培养24小时以确保CH0细胞1008 粘附到基片表面1010上。该图显示CHO细胞对4种不同被检化合物的光学反 应，所述4种被检化合物是(1) ATP (100pM) ， P2Y受体激动剂；(2)可 乐定(Clonidine) (10pM)，a2-肾上腺素能受体激动剂；(3)肾上腺素(100pM)， P-肾上腺素能受体激动剂；和(4)氧化震颤素(oxotremorine)(10|iM)，
160毒蕈碱受体激动剂。由于毒蕈碱受体在CH0细胞1008内的内源性表达水平很 低，氧化震颤素M (毒蕈碱受体激动剂)被作为对照。各激动剂直接加入含 有不同的含有血清培养基的孔中。然后用光学LID系统采集光学反应信息。
结果，根据加入ATP、可乐定和肾上腺素这三种激动剂后的光学反应显示， 这些贴壁CH0细胞表现出相似的动力学特征和转变。图53中，该过程后期的 动力学分析显示三种激动剂(ATP、可乐定和肾上腺素)都导致一个类似、 缓慢的过程。图54中显示了由这些激动剂引起的图16所示第3期(Stage 3) 的转变。这些类似的转变可能反应了这样一个事实作为GPCR移位的关键组 分的抑制蛋白移位可能是CHO细胞者的限制性因素，因为网格蛋白包涂的 小窝的大小与抑制蛋白的相似。图55所示是波导生物传感器上CH0活细胞 单层的配体-和时间-依赖性反应的实验结果。所用激动剂包括(1)可乐定； (2) 氧化震颤素M; (3) NECA;还用了太兰泽平(telenz印ine)， 一种 Ml受体拮抗剂。
图56所示是波导生物传感器104上，稳定地过表达大鼠毒蕈碱受体亚型1 (Ml)的CHO活细胞单层108的配体-和时间-依赖性反应的实验结果。所用激 动剂包括(1)可乐定；(2)氧化震颤素M; (3) NECA;还用了太兰泽 平(telenz印ine)， 一种M1受体拮抗剂。图57显示波导生物传感器104上， 没有(CHO)或过表达大鼠毒蕈碱受体亚型1的CHO活细胞(Ml CHO)内配体 诱导的总变化。图52和54-56所示的结果表明(1) CHO细胞和M1-CHO细 胞内都有a2-肾上腺素能受体表达；并且，它们的激动剂(可乐定)诱导了物 质再分布信号；(2) Ml受体表达在CHO细胞内很低或几乎没有，但在M1-CH0 细胞内很高，因为其激动剂(氧化震颤素M)在M1-CH0细胞内导致明显更大 的反应，而其拮抗剂(太兰泽平)则没有。
图58中的实验结果显示，发动蛋白磷酸化抑制剂(发动蛋白抑制肽，DIP) 预孵育对于氧化震颤素M诱导的波导生物传感器上不表达或稳定过表达大鼠毒 蕈碱受体亚型1 (Ml CHO)的CHO活细胞单层的时间依赖性响应的影响。结果 显示，DIP预孵育在两种细胞系中都几乎完全消除了氧化震颤素M诱导的物质 再分布，提示氧化震颤素M诱导的物质再分布是发动蛋白依赖性的。大多数 激动剂诱导的GPCR移位都具有这样的发动蛋白依赖性。
图59中的实验结果显示，发动蛋白磷酸化抑制剂(发动蛋白抑制肽，DIP) 预孵育对于可乐定诱导的波导生物传感器上不表达或稳定过表达大鼠毒蕈碱受体亚型l (Ml CH0)的CHO活细胞单层的时间依赖性响应的影响。结果显示， DIP预孵育在两种细胞系中都几乎完全消除了可乐定诱导的物质再分布，提示 可乐定诱导的物质再分布也是发动蛋白依赖性的。
图60中的实验结果显示，发动蛋白磷酸化抑制剂(发动蛋白抑制肽，DIP) 预孵育对于NECA诱导的波导生物传感器104上不表达或稳定过表达大鼠毒蕈 碱受体亚型1 (Ml CHO)的CHO活细胞单层108的时间依赖性响应的影响。结 果显示，DIP预孵育对NECA诱导的响应几乎没有影响，NECA在两种细胞系中 通过非发动蛋白依赖性途径诱导物质再分布信号。图61显示静息A431细胞贴 层中GPCR激动剂诱导的定向物质再分布。与EGF (8nM)的诱导结果相比，三 种GPCR激动剂缓激肽(lOOnM)、卡巴唑(lOmM)和可乐定(ImM)在静息 A431细胞中诱导时间依赖性响应。(F)以10mMAG1478预处理A431细胞对于 GPCR激动剂-和EGF-诱导的响应的影响。
图62图示了 EGF-诱导的EGFR激活和GPCR激动剂诱导的EGFR的转活化。 己知，EGFR是多种信号传递系统中一个重要的下游元素，所述信号传递系统包 括促有丝分裂G蛋白偶联受体(GPCR)、细胞因子受体、整合素和膜去极化剂 和应力诱导剂所用的那些。此前的研究已证明，A431内源性表达缓激肽B2 (Bradykinin B2)受体、毒蕈碱受体和a2-肾上腺素能受体。用GPCR激动剂、 缓激肽、可乐定和卡巴可(carbachol)刺激静息态的A431产生了两条不同的 DMR曲线。卡巴可刺激和可乐定刺激所致反应与低浓度(2-8nM) EGF所致反应 的特征几乎相同。不出所料，用lO(iM AG1478预处理A431完全消除了 N-DMR 阶段(phase)，并且显著降低P-函R阶段的动力学特征。相反，缓激肽刺激 导致一个极快的P-DMR阶段(100秒之内)和短得多的过渡时间t 。，用AG1478 预处理A431只能部分削弱反应。与此前他人的研究结果一致的是，(i) GPCR 激动剂刺激能够通过不同的机制与Ras-MAPK串话(crosstalk)，但这取决于 特定的细胞环境，(2) GPCR激动剂诱导的EGFR转激活可利用产生的Ras/MAPK 激活特征信号来检测。由于GPCR激动剂引发的EGFR转激活所引起的DMR信号 堪与EGF刺激引起的相比，这种转激活可作为一种信号传递放大机制，由此可 以在其天然环境中研究GPCR信号传递和筛选内源性靶GPCR的激动剂和拮抗 剂。不同GPCR激动剂所致D服反应的不同动力学特征表明，不同的GPCR可能 通过不同的机制转激活Ras/MAPK通路，这可能依赖于受体所偶联的G蛋白和 细胞环境。图62显示表皮生长因子受体(EGFR)信号传递途径。EGFR家族成员具有 胞质酪氨酸激酶结构域、单个跨膜结构域和一个参与配体结合和受体二聚化的 胞外域。配体与EGFR的结合导致受体与其它家族成员形成均二聚体或异二聚 体。每个二元受体复合物将通过聚集不同的含Src同源(SH2)效应蛋白引发 不同的信号传递途径。二聚化的结果是自磷酸化启动一系列下游细胞信号传递 途径。被激活的EGF-R 二聚体与鸟苷酸释放因子S0S偶联的衔接蛋白Grb结合。 Grb-SOS复合物能够直接结合或通过She间接结合受体的磷酸酪氨酸位点。这 些蛋白质间的相互作用将SOS带至Ras附近，使得Ras被激活。接着，ERK和 JNK信号传递途径因此被激活，继而激活诸如c-fos、 AP-1和Elk-1等促进基 因表达和细胞增殖的转录因子。EGF二表皮生长因子，EGFR二表皮生长因子受 体，Shc = src同源结构域共有序列，grb2二生长因子受体结合蛋白2， S0S二哺 乳动物"无七之子"(son of sevenless) ， Raf = Ras激活因子，MEK = MAP 激酶激酶，MAPK二促分裂原活化蛋白激酶，Pl3K二磷脂酰肌醇-3，激酶，PIP2 =磷脂酰肌醇3,4-二磷酸酯，PIP3^磷脂酰肌醇3，4,5-三磷酸酯，PLCy^磷 酯酶-Y， DAG二二酰基甘油，IP3二肌醇3，4，5-三磷酸酯，PKC二蛋白激酶C。图 61显示GPCR诱导的EGFR转激活。Src家族激酶被GPCR激发的受体酪氨酸激 酶转激活作用所激活。最易理解的GPCR与受体酪氨酸激酶之间串话的机制包 括继膜相关AD細家族MMP被激活后，GPCR激发蛋白质水解而释放诸如HB-EGF 等配体。被转激活的EGF受体(EGFR1/2)聚集She和Grb2/mSos复合物，令 它们成为GRCR诱导的Ras活化复合物的组装平台。EGF受体的转激活可解释许 多系统中GPCR引发的cRaf-1、 MEK1/2、 ERK1/2 MAP激酶级联活化。Src家族 激酶应EGF受体活化而被激活，在此种形式GPCR信号传递的下游起着重要作 用。此外，有证据表明，Src参与不甚了解的GPCR激发的画P活化，尤其是 GPY亚基依赖途径。
7.实施例7:多模式检测方法
光栅耦合器生物传感器是攸逝波传感器，是基于通过衍射光栅将光与波导 共振耦合(参考本文关于不同生物传感器的论述)。例如，作为生物传感器的 光栅耦合器传感器通常由导向多层组合和衍射光栅构成。通常， 一四层波导生 物传感器的组成包括高折射率(/7》材料(例如折射率约2. 36的他205)薄膜， 薄膜厚度为dF，该薄膜之下是折射率(仏)低于薄膜但高于覆盖介质的基底(例
163如1737玻璃，Corning编号，折射率约1. 50)，覆盖介质是折射率约为1.35 (&)的生物溶液。优选透明基底，以便使入射光可从基底一侧进入。 一层生 物物质粘附层，固定化在波导膜上，折射率约1.4 (仏)，厚度为dA。固定化 的生物物质包括但不限于抗体、抗原、受体、肽、噬菌体、"单链"DNA (RNA) -片断、基因、基因片断、靶、蛋白质、结合蛋白、酶、抑制剂、核酸、核苷 酸、寡核苷酸、变应原、病原、糖、代谢物、激素、活性成分、低分子量分子、 脂质、信号、细胞和细菌。
平面波导中的导波或导向模式是TE (横向电场或s-极化波)和TMm (横 向磁场或p-极化波)，其中，m=0、 1、 2……，表示模式编号。激光从不同角 度照射波导，光只在特定角度与波导耦合，这些角度决定于导向模式的有效折 射率。被耦合的激光平行于波导膜平面的表面传播，在与界面相邻的液体中产 生电磁场。只有在满足两项条件时，给定模式类型才以导波的形式传播(a) 波导膜的折射率必须比其周围的基底和覆盖介质的折射率高至少1%; (2)波 导膜的厚度大于一既定值，即阈值厚度dc。
波导光栅生物传感器由至少一个波导光栅结构单元或至少一个传感器位 置构成。生物传感器可与一微板相连，板上各孔内含有至少一个波导光栅结构。
在此揭示的方法中，样品中的分析物或被标记或未被标记。当分析物被标 记时，可以各种方式标记，例如使分析物带上能够因光(具有宽和/或窄的激 发光谱)激发或化学/电化学激活而发荧光、化学发光、生物发光、发磷光或 电光的部分。当分析物本身未被标记，用被标记的结合伴侣作为参比配体，所 述结合伴侣能够以适当的亲和力结合固定化探针分子的特异性结合位点。参比 配体用来测定分析物对探针分子的相对活性或亲和力。
非标记依赖性检测分析物和/或参比配体与光栅区域内固定化探针分子结 合的方法是基于折射率改变造成的反射光波长或角度变化(参考US4815843或 US5479260)。标记依赖性检测参比配体与探针分子结合或分析物和参比配体 与探针分子竞争性结合的方法是基于颜色的变化(例如荧光、化学发光、生物 发光、发磷光或电光等)。
可采用两种不同的示例性方法实现标记依赖性检测。方法之一中，用波导 光栅基片在波导膜内传播光，同时产生透过固定化探针分子所在侧的攸逝波。 透过的攸逝波以不同效率激发被标记的分析物或被标记的参比配体，所述效率 取决于被标记分子与波导膜表面之间的距离。被标记分子距离所述表面越近，激发效率越高。特别是，攸逝场激发提高了整个平面波导表面上表面-结合荧 光团的激发机率/效率(Budach, W. : Abel, A. P. ; Bruno, A. E. ; Neuschafer， D.;"平面波导-用于多点寡核苷酸杂交荧光试验的高效传感平台"，Anal. Chem. 1999， 71 (16) : 3347-3345;和P丄；Lee, J. E. ; Wood, L. L. ; Saavedra, S. S.，"波导线性二向色性和荧光各向异性引起的Langmuir-Blodgett膜内 的二极分布"，J. Phys. Chem. ， 1996， 100:775-784)。这与基于聚焦显微 镜的发光检测原理相反，后者中，光源聚焦于具有一定体量的元件，由此产生 局部强电场(即落射荧光)。这样，波导光栅结构成为两种检测中的核心部件 基于传感器表面特定分子吸附所致攸逝场传播介质中折射率变化的非标记依 赖性检测和基于颜色变化(强度、强度分布、内部反射荧光总强度等)的标记 依赖性检测，它们具有超高灵敏度，因为攸逝波随着靶标或靶标复合物(不论 标记与否)距离的增加指数性衰减。
这种方法，在以基于荧光的检测为目的时，要求将传感器特别设计为在将 光与波导耦合的同时激发荧光团。具有独特结构(例如光栅结构、周期、深度、 波导膜的性能和厚度、传感器构造等)的给定传感器往往使特定波长的激光以 近乎垂直角耦合进入传感器。这种垂直耦合对于细胞传感来说尤其适宜，因为 细胞被介质所覆盖，而大多数涉及液体处理的设备都希望液体改变的角度是垂 直的。然而，有待激发的荧光分子通常需要具有特定波长范围的特定光源。例 如，Cy3要求激发光在530-560nm波长范围。为了用同一光源检测DMR信号和
荧光，需将传感器调整为能够将同一光源与波导耦合。这样，传播光的攸逝波 就能够被用来激发穿透深度或传感体积以内的荧光分子。
第二种方法采用单独的激发光源来专门激发已结合的被标记分析物或参
比配体，用一单独的发射检测装置来采集发射光。该方法对于波导传感器设计 的要求相对宽松，适用于多种不同的传感器设计。
8.实施例8:内源性GPCR在A431细胞内的特征分析
细胞组分的动态再分布，即动态物质再分布(DMR)，常见于许多细胞过 程中，例如刺激引起的通过G蛋白偶联受体(GPCR)进行的信号传递。DMR可 用共振波导光栅(RWG)生物传感器来放大，所得DMR信号提供了一种新的已 整合的信息以用于感测实际生理环境中的活细胞。用RWG生物传感器和一组 GPCR激动剂激活内源GPCR，通过研究由此介导的静息A431细胞的D服信号确定了各类GPCR (基于受体偶联的G蛋白Gq， Gs和Gi)的独特DMR特征。DMR 信号取决于激动剂的剂量和内源受体的表达水平。就一小组GPCR激动剂观测 到这种由一种DMR信号到另一种的剂量依赖性转变。结合其制作GPCR信号传 递网络相互作用和调节图谱的能力，无标记和非侵入性生物传感器能够进行实 时动力学测定，因而可用于GPCR药物开发和脱孤化。
G蛋白偶联受体(GPCR)是一超家族膜蛋白，其成员蛋白具有相同的结构 基元，该基元具有七个跨膜结构域， 一个胞外N末端和一个胞内C末端。GPCR 被认为与诸如心血管病、呼吸、胃肠道、神经、精神和代谢紊乱等大多数疾病 的发展和演化有关。GPCR代表着人类基因组中最大的可药靶(druggable target)家族，且已被证明是小分子药物开发最具有前景的领域，因为GPCR 占目前药物靶的约50% ， 2000年的相关销售额超过六百亿美元。鉴于目前GPCR 类药物只针对已知的约200种CPCR中的近25%，而且还有约140种新近鉴定 的孤立受体，因此，GPCR作为一类靶分子为药物开发提供了广泛的机会。
包括光、离子、神经递质和激素在内的多种外源刺激通过GPCR调节细胞 的生理学和病理生理学过程。激动剂介导的GPCR活化引发与它们所偶联的G 蛋白及其它调节蛋白的动态相互作用，由此控制胞内反应级联。根据偶联的G 蛋白亚型，可将GPCR分成三族G,， Gs和G,。通过GPCR介导的由配体诱导的 细胞事件通常由受体构象和寡聚状态的改变开始，接着是G蛋白活化(Ga亚基 上的GDP-GTP转换，Ga和G^解离，G蛋白从受体上解偶联，Ga-和Gp厂信号传递 复合物的生成)以及导致第二信使生成的下游信号传递途径活化(Ga2+激活， 肌醇三磷酸的生成和/或胞内cAMP水平调节)。然后，GPCR信号传递引起特定 基因的表达，并通过内吞作用使细胞表面上的GPCR失敏；其中许多涉及到大 量胞内蛋白质的动态转运。最终，靶细胞的表型、形态和物理特征被改变。这 些信号传递和调节机制通常行使着及时而准确的控制，由此控制着各种细胞反 应。结果，所有GPCR信号传递在这一点上几乎都是相同的，即在信号传递 周期中，细胞成分发生了有序且受到调节的动态再分布。监测细胞成分的动态 再分布就能够看清楚GPCR信号传递过程，并且是进行GPCR筛选的高效手段。
a)材料与方法 (1)材料
月泉昔胺类(Adenosine amine cogener， ADAC)， 大麻素(anadamide)ATP，白介素-8 (IL-8)，干扰素-r可诱导蛋白-10 (IP-10)，油酰-L-a-溶 血磷脂酸(LPA) ， NECA，诺考达唑(Nocodazole)，凝血酶，胰蛋白酶和UK14304 购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, M0) 。 A-77636， BRL54443，可乐定， 肾上腺素，HTMT马来酸氢酯(HTMT dimaleate) ， Isoprenternol，氧化震颤 素M，羟甲唑啉(Oxymetazol ine )禾口 SKF38392购自Molecular Probes (Eugene, OR)。血管紧张素II， Apelin 1-17， Apelin 1-13，铃蟾月太(Bombesin)，缓 激肽(bradykinin) ， DAMG0,强啡肽A，内皮素-1，甘丙肽(Galanin) ， GLIGKV-酰胺，GLIGLR-酰胺，胰高血糖素，oc-黑色素细胞刺激因子(oc-MSH)，莫替林， 神经激肽A，神经介肽N，神经肽Y，神经降压素，孤菲肽(nocic印tin)， SFFLR-酰胺，物质P,尾加压素II和YFLLNRP-酰胺得自Bachem(King of Prussia, PA)。 Corning Epic 96孔和384孔生物传感器微板得自Corning Inc (Corning, NY)，使用前用高强度UV消毒(UVO-清洗机，Jelight Company Inc. ， Laguna Hills, CA) 6分钟。
将人表皮癌A431细胞(美国典型培养物保藏中心)培养在含10%胎牛血 清(FBS) 、 4. 5g/L葡萄糖、2mM谷胺酰胺和抗生素的Dulbecco改进Eagle' s 培养基(DMEM)中。将第3至第5代的细胞(约3-7.5Xl(/细胞)在200^1含 10%FBS的DMEM培养基中形成的悬液加入96孔微板的各孔中。类似地，将50jil 生长培养基中 1一2X1(T个细胞加到384孔微板中。37°C、空气/5%0)2条件 下培养，直至覆盖率达约95% (约2-4天)。
(2) Fluo-3 Ca2+激活试验
将第3至第5代A431细胞在Costar 96孔微板上培养至覆盖率约95% ， 洗涤两次，纯用DMEM饿养过夜，用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1XHBSS (1倍常规Hank平衡盐溶液，20mM HEPES缓冲液，pH7. 0)洗涤，在含有4|iM Fluo-3的同一缓冲液中室温下标记l小时。然后，用缓冲液洗涤细胞两次，将 细胞维持在含有2. 5mM丙磺舒的100(il 1XHBSS中。向细胞平板添加100(^1 GPCR 激动剂溶液，从而开始检测，用HTS7000 BioAssay Reader (PerkinElmer Life Science, Boston, MA)记录6分钟的钙信号，每隔6秒记录一次。试验在室 温下进行，以便直接与光学传感数据进行比较。
(3) 动态物质再分布(DMR)光学生物传感器试验
167各项研究均采用配备有横向磁场或p-极化TM。模式的Corning Epic 角 度讯问系统。增加了数步操作来尽可能减少非期望结果。首先，为了尽可能消 除加入化合物溶液时的整体折射率改变，用不含丙磺舒的1XHBSS缓冲液稀释 化合物，但饿养细胞时占用DMEM缓冲液。第二，当在室温下将含有细胞的传 感器培养板放入系统时，为了促进细胞响应并迅速达到稳定状态，先用不含FBS 的DMEM缓冲液将细胞饿养一段时间(通常20土2小时)，并且，不洗涤细胞， 直接将静息态细胞用于试验。第三，尽可能将各化合物溶液中DMS0的浓度降 低到低于0. 05%，但在指定试验中可使用较高浓度DMSO。
在动力学特征测定中，37°C、空气/5%0)2条件下纯用DMEM饿养培养的细 胞(覆盖率约95%) 20小时。然后，将含有细胞的传感器微板放入光学系统， 记录室温下加入溶液之前和之后的细胞响应。在化合物研究中，各孔中的细胞 先用50^1的化合物溶液或1XHBSS预处理直至其达到稳定的状态(即没有明 显的物质再分布，通常在l小时之内)，然后才添加50|al的GPCR激动剂。全 部研究在室温下进行，微板上始终加盖，仅在添加溶液时短时(数秒)打开， 这是为了尽可能减少温度波动和蒸发冷却。本文所述响应单位指据CCD相机 成像，各传感器共振带中心位以像素计的变化；据采用甘油和二甲亚砜的浓度 依赖性响应曲线的一实验标定方法，1个单位等于飞.82X10—4折射率变化。应 理解，根据操作参数和试验的需要，也可以确定其它单位。
b)结果与讨论 (1) A431细胞的内源性GPCR和它们的信号传递
用A431细胞作为模型系统研究配体诱导的三种主要GPCR (Gq、 Gs和Gi 偶联受体)在实际生理条件下的光学特征。该方法主要以A431中已知的内源 受体为基础，并结合了用许多其它不同类型GPCR的己知激动剂小文库进行的 随机筛选。某特定GPCR很可能能够通过一种以上受体偶联的G蛋白进行信号 转换，甚至通过其它非G蛋白信号传递途径转换。
A431细胞中的己知内源性GPCR包括缓激肽B2受体，|32肾上腺素能受体， 腺苷受体A:、 A幼和A2B，组胺受体比，蛋白酶活化受体PA&和PAR2，嘌呤能受 体P2Y,、 P2Y4、 P2Y6、和P2Y ， LPA受体LPA!、 LPA2和LPA3，和铃蟾肽受体BRS,。 其他人的RT-PCR研究显示，A431内源性表达至少四个P2Y受体家族成员P2Y, (较低)、P2Y4、 P2Y6、和P2Yn，但也有研究提出也有P2Y2内源性表达。这些受体中，B2受体、P2Y受体、PAR受体、LPM和LPA3、以及BRS!是主 要的G「偶联受体，A2A、 &8和&则是Gs-偶联受体。对于A431中Hi受体的信号 传递途径知之甚少。有趣的是，关于A431中内源性Gi-偶联受体的文献报道很 少。 一个例子是Ai受体。虽然已知LPAi主要通过Gi途径传递信号，但没有关于 A431中LPA,信号传递机制的文献报道。
(2) A431中内源性GPCR活化的光学特征
用一组激动剂分别刺激静息A431细胞。记录并分析剂量依赖性动力学响 应。在典型的动力学测定中，实时监测每个传感器的激动剂诱导的共振光角位 移，并作为时间的函数制图。信号(P-腿R)增强表示传感体积( 120mn)内 生物分子量增加；相反，信号(P-腿R)减弱表示传感体积( 120腦)内生物 分子量减少。传感体积，即穿透深度，是波导膜内耦合光的固有特性，它产生 延伸进入细胞层和介质的攸逝波。
图63显示了 GPCR激动剂诱导的4种A431细胞光学响应。如图63a所示， 第一种光学特征展示两个主要阶段 一个信号迅速增强(图63a，点A至B) 的P-DMR阶段和此后一个信号缓慢衰减(图63a，点B至C)的N-DMR阶段。 产生这种光学特征的激动剂包括B2受体激动剂缓激肽，P2Y受体激动剂ATP和 PAR激动剂凝血酶、胰蛋白酶、GLIGLR-酰胺、GLIGKV-酰胺和SFFLR-酰胺。用 Fluo-3进行的传统Ca2+激活试验显示，根据细胞内Fluo-3荧光强度的改变， 所有这些激动剂都剂量依赖性地提高胞内Ca"水平。结合关于缓激肽介导的 A431响应的细胞机制的详细分析，这些结果提示这种光学特征是Gq-偶联受 体活化的结果，该活化导致Ca2+的迅速激活以及下游信号传递事件。
第二种光学特征展示一个主要阶段(图63b) : P-DMR阶段，其中，信号
缓慢增强至一高位平台(63b:点B至点C)。许多时候会有一个初期阶段，期 间，信号缓慢减弱并小幅振荡，这在加入激动剂溶液之后(63b:点A至点B) 就出现。完成初期阶段的时间通常比加入化合物溶液所诱导的长得多( 数 秒)。当加入化合物溶液时，化合物溶液与DMEM介质(如果存在)之间折射 率不匹配导致产生一个与整体折射率(bulk index)改变相关的快速阶段。产 生这种光学特征的激动剂包括^激动剂肾上腺素和Isoprenternol以及A^和 A2B激动剂NECA。传统Ca2+激活试验显示，所有这些激动剂都不引起胞内Ca"水 平的明显改变(数据未显示)。另一方面，毛喉素和NKH447这两种腺苷酸环化酶活化剂都产生与p2和A2激动剂所诱导的相似的光学特征(图64)。已知这 两种化合物都能激活腺苷酸环化酶，提高胞内cAMP (Gs-偶联受体信号传递中 的第二信使)的水平。用10j^M毛喉素或NKH447预处理静息细胞完全消除了肾 上腺素介导的DMR响应(图65)，这表明，这两种化合物引起的细胞响应与所 述激动剂共享相同的下游信号传递途径。这些结果提示这种光学特征是Gs-偶联受体活化的结果，该活化引起胞内cAMP累积及下游信号传递事件。
第三种光学特征展示两次连续的P-D服事件(图63c): —个升至高水平 的快速P-DMR阶段(图63c: A点到B点)，和后一个信号升至另一个高位平 台的P-D服阶段(图63c: B点到C点)。在靶向已知内源性GPCR的这些激动 剂中，只有LPA受体激动剂LPA当其剂量低于约500nM时产生这种光学特征。 其它也引发这种响应的激动剂包括MC受体oc-MSH。可将这种光学特征认为是Gi-偶联受体活化的结果，因为，不出所料，它与Gs-偶联受体的光学特征相似。 Gi和Gs信号传递都会调节胞内cAMP水平，但调节方向相反。
第四种光学特征没有任何明显的画R信号(图63d)，这与单用HBSS诱导 的相似。按照典型方法，每种激动剂在lnM至10,的五个剂量接受监测，并 且，至少进行两次独立实验确保结果正确。这一类别的激动剂包括A-77636， SCH23390和SKF38392(DRD1)，大麻素(CNR1和CNR2)，血管紧张素II(AGTRl)， Apelin 1-17和Apelin 1-13(AGTRLl) ， BRL54443 (HTR1E/F)，可乐定和UK14304 (ADRA2A、 B和C) ， DAMGO和强啡肽A (0P固1禾卩0PRK1)，内皮素-1 (EDNRA 和EDNRB)，甘丙肽(GALR1和GALR2)，胰高血糖素(GCGR)，白介素-8 (CXCR1)， IP-IO (CXCR3)，莫替林(motilin) (MOTR) ， P物质(TACR1)，神经激肽 A (TACR2)，神经介肽N和神经降压素(NTSE1)，神经肽Y (NPY1、 2、 4、 5、 6R)，孤菲肽(0PRL1)，羟甲唑啉(ADRA1A)和尾加压素II (GRP14)。括号 内是这些肽所靶向的受体。这些激动剂没有产生明显的DMR信号表明，它们的 相应受体在A431细胞中无表达或低表达。IL-8剌激几乎无DMR信号(数据未 显示)提示内源性CXCR1在A431细胞内的表达水平比较低。另一种可能性 是，A431细胞的IL-8组成性分泌水平很低。
铃蟾肽受体亚型l (BRSi)也曾被报道在A431细胞中内源性表达。Fluo-3 试验显示，铃蟾肽引起20±5% (n=5，数据未显示)的最大胞内Ca"水平提高， 这表明铃蟾肽引发Gq信号传递。不出所料，用铃蟾肽刺激静息A431引起剂量 依赖性Gq型光学特征(数据未显示)，但振幅比缓激肽、ATP或任一种PAR激
170多。据测定，表观ICs。约为lnM。铃蟾肽诱导的小幅DMR信 号提示服S1在A431细胞内表达水平较低。
(3)测定激动剂激活A431中内源性GPCR的效力
接着，测定了产生明显DMR信号的激动剂的效力。由于有时候A431中表 达一个以上亚族受体，并且，某个激动剂能够以不同的效力激活多个亚族受体， 所以，先用激动剂溶液的5倍浓度系列来测定细胞响应。大多数情况下，再用 一个激动剂溶液两倍浓度系列来准确测定激动剂的EC5。值。将DMR信号的振幅 绘制成与激动剂浓度相关的图，并用Prism分析，计算ECs。。
图66汇总了靶向内源性Gq-偶联受体的各激动剂的剂量依赖性响应。由于 对与激动剂浓度相关的P-D服和N-DMR信号振幅分析获得的ECs。几乎相同，只 绘制了 P-DMR信号并就得出的激动剂效力进行了讨论。所有饱和曲线与单结合 位点非线性回归拟合良好，得到一个表观ECs。。据测定，ATP、缓激肽和凝血酶 的表观EC5。分别为2. 2±0. 6pM (n=3) ， 10. 0±1. 2nM (n=3)和9. 6±2. 0单位/ml (n=3)。作为比较，还用Ca2+通量试验测定了这些激动剂的ECs。值(数据未显 示)，发现与光学生物传感器试验所得的一致。已知胞外ATP是离子型P2X和 G蛋白偶联P2Y受体的强激动剂。因为RWG生物传感器对于细胞生物大分子而 非离子的再分布最敏感，并且，ATP-介导的光学特征与缓激肽和PAR激动剂所 诱导的相似，所以推断内源性P2Y主要导致ATP介导的鹿R信号。另一方面， 132而非Bi受体在A431中内源性表达，并且，B2受体导致缓激肽的大多数生理活 性和病理生理活性。凝血酶是PAR,的激动剂，SLIGLR-酰胺和SLIGKV-酰胺是 PAR厂特异性激动剂。然而，SFFLR-酰胺和胰蛋白酶似乎既可激活PARi又可激活 PAR2。
图67汇总了激活内源性G「偶联受体的激动剂的剂量依赖性响应。此处， 将缓慢增强的P-画R信号的振幅作为激动剂函数的浓度作图。NECA和肾上腺素 的表观ECs。分别为2L5土1.2nM (n=3)和6. 0土1.4nM (n=3) 。 NECA是A2A、 A2B 和Ai受体的激动剂，与它们的亲和力分别为20、 330和14nM。已有报道在数 个细胞系(包括A431)中，A和A2腺苷受体共存并对腺苷环化酶具有相反的作 用。在A431中，腺苷激发两阶段性响应低剂量(<~10|iM)通过八1受体抑制 集落形成，高剂量(至IOOjiM)通过A2受体逐渐逆转这种抑制。这样，这种双 重效应为实现对信号传递途径的互逆控制和微调提供了可能。由于NECA对A,
m和A2A的亲和力相近，NECA诱导的光学特征显示Gs-信号传递占优。用腺苷胺类 (ADAC)进一步区分效应，ADAC是一种腺苷受体选择性激动剂，对A,、 A2A和 A3的亲和力分别为0.85、 210和285nM。我们特别关注的是高剂量ADAC。结果 显示，在高剂量(〉50nM) ， ADAC剂量依赖性地激发典型的Gs-型光学特征，表 观有效ECs。为3.7±1. lpM (n=3)。另一方面，由于A431内源性表达大量卩2受 体( 40， 000拷贝/细胞)，观测到的肾上腺素诱导的DMR信号专一指向P2活化。 肾上腺素结合(32的ECs。为5-20nM。
图68显示a-MSH诱导的剂量依赖性响应。此处，绘制两个P-D服活动与激 动剂浓度相关的图。据测定，oc-MSH的表观ECs。为9. 0土1.6nM (n=3)，与文献 记载的一致。
我们系统地研究了大量不同GPCR的激动剂刺激静息A431细胞产生的光学 特征。激动剂的选择一定程度上是以已知的A431内源性GPCR为基础的。结果 显示，所选激动剂介导的光学特征可归入三大类(见图63a、 b和c)，此外， 还有与仅用载体(即冊SS)处理所得相似的第四种光学特征(图63d)。三种 不同的特征被用于清楚地区分导致这些光学特征产生的细胞信号传递机制。首 先，用传统的第二信使试验(Fluo-3试验)将激动剂根据其引起Ca2+激活的能 力进行分类。第二，用两种腺苷酸环化酶(AC)活化剂(毛喉素和NKH447)刺 激静息态的A431细胞。研究GPCR激动剂介导的光学特征与腺苷酸环化酶活化 剂介导的光学特征之间的相似度，据此相似度指认Gs-介导的信号传递。第三， 对一组己知调节剂对于特定激动剂所诱导光学特征的作用进行全面鉴定，从而 揭示其细胞机制和信号传递网络相互作用。根据这些研究，确定了以下三类 GPCR信号传递的三大类光学特征Gq-、 Gs-和Gi-信号传递。由于关于A431细 胞内源性G广偶联受体的信息很少，虽然HTMT诱导的剂量依赖性响应提供了有 力的支持，但Gr型光学特征有待进一步确认。
除IL-8之外，所有靶向A431内已知GPCR的激动剂都产生了明显的D服 响应。用RWG生物传感器测定的它们的效力与Fluo-3试验(如果可以进行或 有此文献记录)的结果一致，这提示MRCAT可用于准确测定激动剂的效力。
(4)激动剂介导的细胞响应的特征转变
CPCR信号传递是复杂的，取决于细胞状态和环境、激动剂的选择性和受体 的表达水平和类型。根据细胞状态和环境，某特定GPCR的激活可能通过一种以上G蛋白引发细胞响应。例如，用缓激肽诱导的内源性缓激肽B2受体活化在 A431细胞内通过G,-和Gs-两种途径介导细胞信号传递；这两种信号传递途径交 互调节。本发明发现，通过B2受体介导的信号传递既依赖于A431细胞的状态， 又依赖于缓激肽的剂量。在增殖状态下，低剂量(〈100nM)缓激肽优先引发Gs-介导的信号传递，高剂量(〉100nM)则优先引发Gq-信号传递。另一方面，用 于刺激静息A431细胞(用0. 1%FBS处理约20小时)时，0. 5nM至约100nM的 缓激肽既介导Gs-途径又介导Gq-途径。相反，完全静息的A431细胞(用不含 任何FBS或其它生长因子的DMEM培养基处理约20小时)对各种剂量的缓激肽 都有响应，且都以G,-信号传递为主(数据未显示)。
可确定，包括LPA和HTMT在内的某些激动剂引发的D服信号具有较为复 杂的剂量依赖性。图69显示LPA诱导的剂量依赖性响应。在低剂量LPA，完全 静息的A431细胞对LPA刺激的响应为典型的G「型光学特征，并在高剂量LPA 逐渐转变为Gq-型光学特征。 一种可能是，LPA在低剂量优先激活产生Gr型光 学特征的LPAi受体。随着LPA浓度升高，内源性LPA2和LPA3受体被激活，于是 发生Gq-介导的信号传递。
图70显示HTMT诱导的剂量依赖性光学特征。HTMT是HjB &受体的激动 剂。在低剂量(〈 40nM) ， HTMT剂量依赖性地产生典型的Gi-型光学特征(图 70b)。随着HTMT浓度升高至80nM， D服相关光学特征减弱并变得几乎稳定(即 没有明显的DMR) 。 HTMT浓度进一步升高使特征转变成了典型的Gs-型光学特 征(图70b)。将作为HTMT浓度的函数的P-D腿信号振幅作图，该图清楚地显 示了这一转变(图73c)。由于Gs-信号传递导致胞内cAMP累积，而Gr信号测 定引起相反的效果，可以想见，HTMT可能通过不同的受体以不同的效力激活 G,-和Gi-两种信号传递。至少，就RWG生物传感器监测到的动态物质再分布而 言，Gs-和Gi-信号传递之间的微妙平衡决定了最终的细胞响应。
9.实施例9:探测不同靶之间的交叉通话
不同的耙之间常会发生交叉通话，这在亚族成员靶之间更为常见。例如，
EGFR可由某些GPCR激动剂转激活。而且， 一个靶(例如GPCR)的活化剂可以 激活另一密切相关的靶。
蛋白酶激活受体(PAR)包含一新的G蛋白偶联受体(GPCR)家族，该基 组迄今为止包括PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4。 PAR采用一种独特的蛋白水解机制来活化，而非通过可逆的配体结合来激活。凝血酶和胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶以位点特异性方式剪切受体的胞外N末端外结构域(exodomain)。在人类中，PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4的活化剪切位点分别是残基41-42 (R丄SFLLRN)，36-37 (R丄SLIGKV) ， 38-39 (K丄TFRGAP)和47—48 (R化YPGQV)。剪切暴露出一个新的N末端，然后由该末端作为限制(tethered)配体序列。该限制配体结构域与受体分子内结合并激活受体，由此引发信号传递。激活PAR的蛋白酶包括凝血因子(例如凝血酶，凝血因子VIIa和Xa)，炎性细胞的蛋白酶(肥大细胞胰蛋白酶(Tryptase)，中性粒细胞组织蛋白酶G)和表皮组织的酶(胰蛋白酶)。四种PAR中，三种(PAR1、 PAR3和PAR4)主由由凝血酶激活，PAR2则由胰蛋白酶样蛋白酶(例如肥大细胞胰蛋白酶和凝血因子Xa)激活。对应于限制配体序列前5个或前6个氨基酸的合成肽(PAR活化的肽或PAR-AP)可直接激活除PAR3之外的PAR。由于这些合成肽的受体激动剂功能不涉及蛋白水解，PAR-AP可用于研究PAR的生理学和病理生理学功能。
PAR存在于大量正常和患病组织和细胞中，包括皮肤、血小板、内皮细胞、胃肠道、脑和肺。大多数细胞表达多种PAR。例如， 一个例子是A431细胞，该细胞内源性表达PAR1和PAR2。然而，对于A431细胞内的PAR信号传递途径却知之甚少，虽然表皮癌细胞表达可能是潜在PAR活化剂的包括人呼吸道(airway)胰蛋白酶样蛋白酶在内的多种丝氨酸蛋白酶。
a)材料与方法(1)试剂
凝血酶、胰蛋白酶、红海海绵素A、松胞菌素B、鬼笔环肽(phalloidin)、诺考达唑(nocodazole)、甲基-(3-环糊精(m卩CD) 、 oc-环糊精(aCD) 、 N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)和表皮生长因子(EGF)购自Sigma ChemicalCo. (St. Louis, MO) 。 KN-62和GF 109203x得自Tocris Chemical Co. (St.Louis， MO) 。 Fluo-3和得克萨斯红(Texas red)-鬼笔环肽(TR-鬼笔环肽)得自Molecular Probes (Eugene, OR) 。 SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺、GLIGLR-酰胺、缓激肽和YFLLNRP-酰胺得自Bachem (King of Prussia, PA) 。 Corning Epic 96孔生物传感器微板得自Corning Inc (Corning, NY)，使用前用高强度UV消毒(UVO-清洗机，Jelight Company Inc., Laguna Hills, CA) 6分钟。(2) 细胞培养物
将人表皮癌细胞A431细胞(美国典型培养物保藏中心)培养在含有10%胎牛血清(FBS) 、 4.5g/L葡萄糖、2mM谷胺酰胺和抗生素的DMEM培养基中。将第3至第5代的细胞(约3-7. 5X1(^细胞)在200^1含10%FBS的DMEM培养基中形成的悬液加入96孔微板的各孔中，37'C、空气/5%(]02条件下培养，直至覆盖率达约95% (约2-4天)。
(3) Fluo-3 Ca2+激活试验
将第3至第5代A431细胞在Costar 96孔微板上培养至覆盖率约95%，洗涤两次，纯用DMEM饿养过夜，用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1XHBSS(1倍常规Hank平衡盐溶液，20mM HEPES缓冲液，pH7. 0)洗涤，在含有叫MFluo-3的同一缓冲液中室温下标记1小时。然后，用缓冲液洗涤细胞两次，将细胞维持在含有2. 5mM丙磺舒的lOOpl 1XHBSS中。通过向细胞培养板添加50^1 PAR激动剂从而开始了试验，用HTS7000 BioAssay Reader (PerkinElmerLife Science, Boston, MA)记录6分钟的转信号，每隔6秒记录一次。试验在室温下进行，以便直接与光学传感数据进行比较。
(4) 动态物质再分布(DMR)光学生物传感器试验
各项研究均采用配备有横向磁场或p-极化TM。模式的Corning Epic 角度讯问系统。培养后，纯用DMEM饿养细胞(覆盖率约95%) 20小时，洗涤两次后维持于lOOpl DMEM中。然后，将含有细胞的传感器微板放入光学系统，记录加入溶液之前和之后的细胞响应。在化合物研究中，细胞先用50^1的化合物溶液或1XHBSS预处理各孔中的细胞直至其达到稳定期(即没有明显的物质再分布，通常在l小时之内)，然后才添加50^1的PAR激动剂。用1XHBSS配置化合物溶液或PAR激动剂溶液以使细胞培养基与化合物溶液的折射率相互匹配，从而尽可能减小加入溶液致整体折射率变化造成的非期望效应，当这种效应发生时可能会暂时遮蔽所有DMR信号。全部研究在室温下进行，微板上始终加盖，仅在添加溶液时短时(数秒)打开，这是为了尽可能减少温度波动和蒸发冷却。本文所述效应单位指据CCD相机成像，各传感器共振带中心位置以像素计的改变；据采用甘油和二甲亚砜的浓度依赖性效应曲线的一实验标定方法，1个单位等于 5. 82X10—4的折射率改变。(5)荧光成像
将细胞接种在Corning Epic 96孔微板上，用无血清DMEM培养基饿养一夜，用胰蛋白酶或凝血酶处理一定时间以示踪，用4%仲甲醛定影，在含0.2%Triton的磷酸盐缓冲液(PBS)中透化，用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭。然后，用0.5^M得克萨斯红标记的鬼笔环肽室温下培养细胞1小时，洗涤。最终洗涤并计数后，用Zeiss Axioplan荧光显微镜的40倍目镜观察细胞。
b)结果
(1) PAR激动剂在A431细胞中介导胞内C,升高根据Fluo-3荧光强度增加，静息A431细胞内，凝血酶、胰蛋白酶、PAR1-AP(SFFLR-酰胺)和PAR2-AP (GLIGKV-酰胺和GLIGLR-酰胺)都浓度依赖性地诱导胞内〔&2+ 〔[Ca21,)迅速的瞬时性升高。根据非线性回归和Scatchar分析，全部PAR激动剂介导的饱和曲线非常符合单结合位点。据测定，凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGLR-酰胺和SLIGKV-酰胺的ECs。分别为6±1单位/ml (相当于60土10nM) ， 5.0±0. 4(iM， 45. 7±5. 8nM， 2. 5±0. 3jaM和3. 8±0. 4pM。凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺诱导的最大[Ca"]i升幅分别48. 2±3. 5%， 74. 3±3. 9%， 100±6. 3%， 52±6. 3%和64±3. 7% (图71)。胰蛋白酶引起的最大[Ca2+]i升幅约为凝血酶的两倍。另一方面，胰蛋白酶引起的最大[Ca"]i升幅也比两种PAR2-AP引起的高得多。而且，用SFFLR-酰胺(20!iM)与SLIGKV-酰胺(20(xM)的混合物刺激A431所诱导的[Ca2+]i升幅为102±5. 4%，与单用200nM胰蛋白酶的效果相似。有意思的是，浓度高达160pM的PARI特异性部分激动剂YFLLRNP也没有诱导任何明显的[Ca21升高，但用80,YFLLRNP预处理细胞抑制200nM胰蛋白酶介导的[Ca2+] i升高(48. 3±4. 5%， n=5)。发现YFLLRNP在适当浓度(<Tl00^M)选择性地通过PARI激活G加3信号传递级联，造成血小板形状改变，但不刺激人血小板中的Gq或Gs信号传递途径。以上结果提示，胰蛋白酶能激活除PAR2之外的PAR。凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺诱导最大响应所需的浓度分别为40单位/ml，20jiM， 400nM， 20nM禾卩20jiM。
176(2) PAR激动剂介导A431细胞中肌动蛋白丝的重构
已知，PAR活化在诸如LNCaP等数种细胞系中可能是通过Rho家族蛋白的活化而引起细胞骨架结构重构。由于本发明光学传感系统的独特设计采用一光带(200X3000)im的维度，注意这是目前本发明角度讯问中的配置；用来照射的光通常在约5(^m至5mm范围内)照射各生物传感器(这意味着，DMR相关光学特征是该照明区域内的所有细胞的平均值)，研究了PAR激动剂对高覆盖率(〉90%)细胞的细胞骨架结构的影响。据得克萨斯红-X-鬼笔环肽染色图案(数据未显示)显示，用凝血酶或胰蛋白酶刺激覆盖率约95%的静息A431细胞诱导了肌动蛋白丝的重构。静息A431细胞显示典型的染色图案一肌动蛋白丝表现为被最大程度拉长并均匀分布于整个细胞质。用100nM胰蛋白酶或40单位/ml凝血酶处理细胞在约10分钟后引发显著的细胞骨架重构，并在约30分钟后变得明显。凝血酶或胰蛋白酶刺激后30分钟，肌动蛋白丝变得主要集中在细胞边缘。以上结果表明凝血酶和胰蛋白酶都在A431细胞内介导肌动蛋白丝重构。
(3) PAR激动剂在A431细胞中介导显著的动态物质再分布
本发明证明5种受检PAR激动剂都产生Gq-型光学特征，都会在一定的激动剂浓度达到饱和。基于非线性回归和Scatchard分析，与Ca"激活结果相似，用光学生物传感器试验获得的PAR激动剂介导DMR信号的饱和曲线也非常符合单位点结合模式。值得注意的是，对于胰蛋白酶，关注的是其在低剂量
C〈2000nM)诱导的函R信号，因为其在高浓度(〉2000nM)引起明显的细胞从生物传感器表面脱附(数据未显示)。
由于细胞活性的许多重要方面，包括转运、信号传递和形态改变，都以细胞骨架结构重排为前提，所以对细胞骨架调整在PAR激动剂诱导的光学特征响应中的作用进行研究(图72)。红海海绵素A预处理A431细胞彻底抑制凝血酶或胰蛋白酶介导的DMR信号，但松胞菌素B抑制效应的效力弱得多。已知，这两种试剂采用不同的机制引起肌动蛋白解体松胞菌素B给肌动蛋白丝加帽
(cap)，红海海绵素A则封锁隔离肌动蛋白单体。这一区别可能使毒素各具不同的能力来调节受体信号传递，通过或者影响内吞作用或者影响信号传递元件的组装。相反，稳定性聚合F-肌动蛋白试剂鬼笔环肽和微管干扰剂诺考达唑对凝血酶和胰蛋白酶介导的响应都没有显著作用。引起调节细胞骨架重构的Rho活化的PAR胞内信号传递似乎涉及两条主要的信号传递途径引起磷酸肌醇水解和转依赖性Rho活化的Gq-偶联途径，和通过G12/13-偶联pll5Rho-GEF的非钙依赖性Rho直接活化。因此，对靶向Ca2+信号传递的调节剂的作用进行了研究。所用调节剂是强PKC抑制剂GF109203x和强Ca27钙调蛋白依赖性蛋白激酶II (CaMKII)抑制剂KN-62 (图73)。GF109203x对于凝血酶和胰蛋白酶介导的DMR都没有明显影响。但是，KN-62预处理对凝血酶和胰蛋白酶介导的DMR信号有不同的影响。KN-62轻度抑制凝血酶介导的丽R信号，但几乎彻底消除了胰蛋白酶介导的DMR信号。为了调查KN-62直接抑制胰蛋白酶活性的可能性，采用了BAEE水解试验。结果显示，KN-62
对胰蛋白酶的活性没有任何明显的影响(数据未显示)。
724.还研究了 PARI特异性部分激动剂YFFLRNRP的作用，此前显示该激动剂激活612/13，引起细胞形态改变但不激活人血小板中"-介导的Ca2+信号传递。YFFLRNRP只在高剂量刺激产生明显的DMR信号(数据未显示)。YFFLRNRP剂量依赖性地抑制凝血酶、SFFLR-酰胺和胰蛋白酶介导的D服信号(图74)。在最高试验浓度，YFFL脂RP几乎彻底阻断了凝血酶介导的画R信号，但只部分减弱SFFLR-酰胺和胰蛋白酶介导的DMR信号。相反，YFFLRNRP对PAR2-AP GLIGKV介导的DMR信号几乎没有影响。总之，以上结果提示，细胞骨架重构主要是由通过PAR2活化的Gf介导Ca"信号传递引起的，而不是通过PARI活化的非Ca2+依赖性机制。
(4)受体失敏和PAR激动剂的交叉失敏
由于A431至少内源性表达PAR1和PAR2，而且，凝血酶和胰蛋白酶都能高效激活一种以上受体，所以对多种PAR激动剂组合的后续刺激引起的受体失敏和交叉失敏进行了研究，用Fluo-3检测的[Ca2+L升高程度或用光学生物传感器测定的D服信号来评价。Ca"激活试验的间隔为6分钟，D服光学实验为1小时左右。
图75汇总了依次受到多种PAR激动剂组合刺激的A431中[Ca2+]i的主要结果。 一旦A431受到胰蛋白酶的刺激，此后使用其它PAR激动剂(40单位/ml凝血酶，20|xM SFFLR-酰胺，20pM GLIGKV-酰胺，20pM GLIGLR-酰胺或200nM胰蛋白酶)都几乎不诱导[Ca2+]i升高(图75a-c，数据未显示)。相反，受检的PAR激动剂都不影响缓激肽在后刺激介导[Ca2+]i升高，缓激肽是A431内源性表达的B2受体激动剂(图79d)，这提示胰蛋白酶在先刺激抑制PAR激动剂 响应不是因为膜蛋白的非特异性消化。另一方面，40单位/ml凝血酶在先刺激 彻底阻抑40单位/ml凝血酶介导的[Ca2+]i升高，但只轻度抑制胰蛋白酶诱导 [Ca"i升高，但是，SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺的在先刺激显著 削弱但不完全消除胰蛋白酶诱导的[Ca2+]i升高(图79e-g;数据未显示)。而 且，先用凝血酶刺激后，PAR2-APSFFLR-酰胺诱导的[Ca2+]i升高(48.5±3.8%) 与没有在先刺激时的(52.0±6.3%)相近。相反，先用凝血酶刺激只部分阻抑 SFFLR-酰胺诱导的[Ca2+],升高(32±4.3%)，这与此前其它研究人员的以下观 察结果一致SFFLR-酰胺能够激活PARI和PAR2 (Blackhart， B. D. ; Emilsson， K. ; Nguyen, D. ; Teng， G. W. ; Martelli， A.丄；Nysted, S. ; Sundelin， J.; Scarborough, R. M. J. Biol. Chem. ， 1996, 271, 16466-16471)。因此， 胰蛋白酶可导致对PARI-AP和PAR2-AP的响应性失敏，但凝血酶不会使对 PAR2-AP的响应性失敏。
图76汇总了 RWG生物传感器实时观测所得依次受到多种PAR激动剂组合 刺激的A431的DMR响应主要结果。胰蛋白酶在先刺激完全消除胰蛋白酶(数 据未显示)或凝血酶诱导的DMR信号(图76a)，显著抑制三种PAR-AP (SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺)介导的DMR信号(图76b-c，数据未显示)。 相反，胰蛋白酶预处理对缓激肽介导的DMR几乎没有影响(图76d)。另一方 面，先用凝血酶、SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺刺激显著抑制但不 完全消除胰蛋白酶诱导的D服信号(图76e-g，数据未显示)。而且，先用凝 血酶剌激后，两种PAR2-AP (SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺)诱导的DMR信号与 没有在先剌激时的相似(数据未显示)。总之，以上结果显示，凝血酶主要激 活PARI ，胰蛋白酶激活PARI和PAR2两者。
(5)凝血酶和胰蛋白酶介导的[Ca2+]i升高和DMR信号对细胞内胆固醇水 平敏感
由于细胞胆固醇水平对包括GPCR信号传递在内的许多细胞功能具有重要 意义，所以对m(3CD引起的胆固醇降低对凝血酶和胰蛋白酶介导的胞内Ca"升高 和DMR信号的影响进行了研究。用m(3CD预处理静息A431细胞剂量依赖性地抑 制胰蛋白酶或凝血酶介导的[Ca2+L升高(数据未显示)。两者的剂量依赖性抑 制曲线都与单相衰减非线性回归拟合良好；与以下事实一致mpCD引起胆固醇分子透过细胞膜迅速外排。另一方面，非活性环糊精立体异构体ocCD高达8mM 也不影响胰蛋白酶和凝血酶介导的响应(数据未显示)。
类似的，用mpCD预处理A431也剂量依赖性地改变了凝血酶或胰蛋白酶诱 导的光学特征(图77)。与Ca2+激活试验测得的相似，mpCD剂量依赖性地抑制 凝血酶介导的DMR，但与之不同的是，mpCD对胰蛋白酶介导的DMR的抑制表现 出复杂的特征随着mpCD剂量升高，信号的减弱逐渐衰减。这一区别提示 胰蛋白酶介导的DMR比凝血酶所介导的具有更为复杂的细胞机制。相反，非活 性环糊精立体异构体ocCD高达8mM时对两种激动剂诱导的DMR信号的影响仍然 微乎其微。然而，高剂量的aCD (〉10mM)引起大量细胞从生物传感器表面脱附 (数据未显示)。还研究了用m(3CD降低胆固醇后PAR的功能回复。该实验以 经mpCD处理的细胞在去除含m(3CD的培养基后细胞表面胆固醇的及时恢复为基 础。为此，用5mM mpCD处理静息A431细胞15分钟以确保去除所有细胞表面 胆固醇，然后纯用DMEM培养基洗涤经处理的细胞三次。然后，用100|il培养 基维持细胞，并放入光学系统。培养15分钟使细胞达到适度稳定的状态后， 在特定时间向各孔加入IO(HU凝血酶溶液(80单位/ral)。记录整个试验期间 的光学响应。如图78所示，结果显示，凝血酶诱导的DMR信号依赖于细胞表 面胆固醇去除后的时间。凝血酶诱导的DMR信号逐渐恢复直至原先的水平(不 去除胆固醇所得的水平)。凝血酶诱导的光学特征的这种时间依赖性恢复强烈 暗示胆固醇辅助微结构域的形成是动态的和可逆的，细胞膜上胆固醇的浓度 在PAR信号传递调节中具有重要作用。
(6) EGFR与PAR之间的交叉通话
由于某些GPCR转激活EGFR，所以研究了 EGF对PAR信号传递的影响。EGF 在先剌激对胰蛋白酶(图79a)或凝血酶(数据未显示)介导[Ca"]i升高的影 响微乎其微。然而，在EGF充分激活EGFR的100nM， EGF完全阻抑胰蛋白酶(图 79b)或凝血酶(图79c)介导的丽R反应中的N-DMR，但仅减弱P-DMR。以上 结果显示，EGFR和PAR之间可能存在交叉通话，至少就调节肌动蛋白丝重构而 言是这样。
总之，为了搞清楚A431细胞中PAR信号传递的机制，用5种PAR激动剂 (凝血酶、PARI-AP FLLLR-酰胺、胰蛋白酶、PAR2-AP GLIGLR-酰胺和GLIGKV-酰胺)和1种PARI特异性部分激动剂YFLLRNP刺激A431细胞。检测包括[Ca2+]i
180水平和动态物质再分布在内的细胞响应。有三项证据支持这样的结论凝血酶 主要激活PAR1，胰蛋白酶激活PAR1和PAR2两者。第一，两种被检PAR激动剂 引起的[Ca2+]i升高和DMR都具有剂量依赖性和饱和性，这提示A431细胞内存在 PAR1和PAR2信号传递。与其它PAR激动剂所介导的相比，胰蛋白酶介导更强 的[Ca"i升高和DMR信号，这提示胰蛋白酶可能激活非PAR2受体。SFFLR-酰胺和GLIGKV-酰胺混合物介导的[Ca2+]i升高与单用胰蛋白酶所介导的相似， 进一步强化了这一可能性胰蛋白酶在A431细胞中既激活PARI又激活PAR2。
第二项证据来自这样的观测结果先用胰蛋白酶刺激机会完全阻抑除缓激肽(B2
受体激动剂)之外任一PAR激动剂介导的[Ca2+]i升高，由此提示和PAR2 —样， PARI也被胰蛋白酶剪切和激活。另一方面，先用凝血酶处理仅轻度抑制[Ca2+]i 升高，但显著抑制胰蛋白酶介导的DMR信号。有意思的是，延长胰蛋白酶在先 处理时间( 1小时)完全抑制凝血酶介导的A431细胞的D服响应，这提示 在胰蛋白酶持续刺激1小时后，没有完整的凝血酶活化受体恢复。然而，与 [Ca2+L测定不同，延长胰蛋白酶在先刺激只部分抑制全部三种PAR-AP介导的 D服信号，这暗示可能有部分PAR2受体被恢复。己知SFFLR-酰胺能够活化 PAR1和PAR2两者。还已知，受体蛋白水解和磷酸化通过受体内化作用和抑制 胞内信号转导调节PAR的活性。根据细胞环境，细胞表面功能性受体的恢复可 能需要数十分钟至数小时。第三项证据来自YFFLRNP的效果。先用YFFLRNP进 行的刺激剂量依赖性地抑制凝血酶、SFFLR-酰胺或胰蛋白酶介导的D服信号， 但不抑制PAR2-AP SLIGKV-酰胺介导的信号。在最高剂量(729pM) ， YFFLRNP 完全阻抑凝血酶介导的DMR信号，但只部分抑制SFFLR-酰胺或胰蛋白酶介导的 信号。总之，以上结果显示，在A431细胞中，胰蛋白酶不仅激活PAR2还激活 PAR1。据报道，PAR1、 PAR3和PAR4是凝血酶受体，而胰蛋白酶除PAR2之外还 能够激活PAR1和PAR4。德克萨斯州红-X-鬼笔环肽染色的肌动蛋白丝和RWG生物传感器显示 的动态物质再分布支持PARI和PAR2活化在A431细胞细胞骨架重构中的作用。 PARl活化已被证明在包括血小板和LNCaP在内的多种类型细胞中引起细胞骨架 重构。用凝血酶或胰蛋白酶剌激A431细胞引起显著的肌动蛋白丝重排由拉 长肌动蛋白丝无规分布变为集中在细胞边缘附近。而且，被检PAR激动剂都诱 导生物传感器表面上贴附细胞底部明显的物质再分布。肌动蛋白干扰剂红海海 绵素A和松胞菌素B能够选择性削弱凝血酶或胰蛋白酶所介导的DMR信号，但
181肌动蛋白聚合促进剂鬼笔环肽或微管调节剂诺考达唑则不能，这提示了在A431 细胞中肌动蛋白丝重排在DMR响应中的作用，也由此提示了 PAR信号传递在细 胞骨架重构中的作用。人血小板受凝血酶作用会发生多种分布和形态改变，在 其中，PARI已被证明能够通过pll5Rho-GEF活化RhoA， pll5Rho-GEF是一种 GTP转换因子(GEF)，它结合PARl-偶联的G蛋白，G12/13。在A431细胞中，YFFLRNP
(一种PARI特异性部分激动剂，据报道，其特异性活化&2/13但不活化Gq)被 发现能够诱导与其它PAR激动剂相似的DMR信号(数据未显示)。而且，YFFLRNP 预处理A431细胞剂量依赖性地减弱凝血酶和SFFLR-酰胺介导的DMR信号，但 对PAR2-AP GLIGKV-酰胺的信号没有影响。以上结果提示，A431中PARI的活 化可能还通过G,2,'3引发细胞骨架重构。另一方面，胰蛋白酶介导的细胞骨架重 构可能是由G⑧3依赖性和G,依赖性两种途径引起的，因为胰蛋白酶介导的DMR 信号对CaMKII抑制剂KN-62和PARI特异性部分激动剂YFFLRNP都敏感。 一种 可能性是，胰蛋白酶依赖于通过PAR2活化的GJ言号传递途径而不是通过PARI 活化的G^3信号传递途径诱导细胞骨架重构。
细胞表面的胆固醇倾向于与包括鞘脂类和饱和磷酯在内的其它脂类一起 形成微结构域，选择性地将众多信号传递蛋白区室化。用mpCD而不是其非活 性立体异构体0^0处理细胞削弱了？八1 信号，包括凝血酶和胰蛋白酶诱导的。32+ 激活和动态物质再分布。EGF在先刺激的效果提示胆固醇损耗转激活EGFR至 少引起凝血酶或胰蛋白酶介导的N-DRM事件的减弱。此外，胆固醇损耗能够减 弱Ca2+激活暗示质膜中的胆固醇通过Gq-信号传递途径调节PARI和PAR2信号 传递两者。已知，胆固醇抽提导致PAR信号传递中两种重要分子Ptdlns4，5-P2 和GJ勺区室化缺失。胆固醇损耗引起的Ca2+激活抑制可能是Ptdlns和G,离域
(delocalization)的直接结果。如前所述，PAR介导的DMR信号可能还涉及 与Gq途径无关的其他途径。然而，去除胆固醇能够完全阻抑胰蛋白酶和凝血酶 介导的画R提示胆固醇损耗可能还削弱其它信号传递途径，例如G^3途径。 以上发现与其它研究人员此前的以下观测结果一致A4. 1细胞的膜边缘波动
(membrane raffling)需要胆固醇。有意思的是，功能恢复实验显示，胆固 醇装配的微结构域是动态和可逆的。
胰蛋白酶、凝血酶或PAR-AP介导的&2+信号传递和动态物质再分布提示 在A431细胞中，凝血酶介导PARI信号传递，胰蛋白酶激活PARI和PAR2两者。 PARI和PAR2两者的激活引起细胞骨架结构重构，但可能是通过不同的机制。G,和Ca2+-依赖性机制被认为是PAR2-介导的细胞骨架重排的机制，而包括G12/13 在内的其它信号传递途径则可能引起PARl-介导的重排。而且，在A431中，细 胞表面的胆固醇在调节PAR信号传递方面具有重要作用。以上发现提示PAR 信号传递可能对肿瘤浸润和转移具有重要意义。本发明强烈增强了 RWG生物传 感器在揭示细胞信号传递及其网络交互作用方面的巨大潜力。
实施例10:活性氧类信号传递和细胞氧化还原状态的研究
R0S在不同水平调节大量从受体到细胞核的信号传递途径。在过去十年中， 已经鉴定到了细胞靶，并在不断增加，虽然对它们尚知之甚少。受体激酶和磷 酸酶可能是氧化应激的目标(靶)。生长因子受体，最常见的，是被配体诱导 的二聚化或寡聚化所诱导，所述二聚化或寡聚化引起其胞质激酶结构域的自磷 酸化。还已很好证明了紫外线引起受体的非配体依赖性簇化和活化，而这一效 果似乎是由ROS介导的。有数据显示，外源性HA (通常以mM计)诱导PDGF-受体和EGF受体的酪氨酸磷酸化和活化。溶血磷脂酸诱导的EGF受体转激活似 乎是由ROS的即时形成介导的。因为大多数生长因子和细胞因子似乎在质膜或 其附近产生R0S，磷脂代谢物是氧化还原信号传递潜在的重要靶标。例如，氧 化态的二酰基甘油激活PKC比其非氧化态更有效。此外，PKC活化和蛋白质酪 氨酸磷酸化似乎是内皮细胞和成纤维细胞内1￥)2-诱导的PLD活化所必需的。属 于Src家族(Src激酶)和Janus激酶(JAK)家族的非RTKs也是靶标，至少 是外源性加入的氧化剂的靶标。
此项研究中，所有光学响应都是用波长讯问系统监测的。RWG生物传感器 的构成包括用于生化试验的三个主要部件EpicTM传感器微板，RWG检测器，和 液体操作系统。传感器微板的构成包括装在一给定SBS格式(例如96孔或384 孔)塑料孔板上的玻璃底板，这样的微板能够进行高通量的筛选。在一 96孔 EpicTM传感器微板中，每孔有一个约3X3mm2的RWG传感器。RWG传感器的构成 包括一层介电材料薄膜，该薄膜位于呈现光栅的玻璃基片上。
波长讯问检测器系统位于集成光纤的正中。用通过光纤和准直透镜以公称 垂直入射角透过微板底部而产生的一宽带光源照射光栅表面的一个小区域。将 用于记录反射光的检测光纤与照射光纤捆绑在一起。 一系列8个照射/探测头 线形排开，这样，可以一次采集同一微板上同一列内8个孔的反射波谱。通过 空间-控制的移动，整个微板移动通过各照射/探测头，使得每个传感器被多次
183经过，各一列依次通过。由此采集到一系列反射光谱，并用其进行分析。由于 该检测系统测定细胞响应刺激而诱导的反射光波长改变，该方法被称为波长讯 问系统。
图80显示用角度讯问系统监测所得，lmM 11202引起的静息A431细胞的多 项光学输出参数。11202刺激引发传感器传感体积内显著的物质再分布(图84A)。 DMR信号由两个主要事件组成 一个包括以下三个阶段的初峰物质信号增强
(P-DMR),过渡阶段和衰减物质信号(N-DMR);和长时间的增强物质信号， 直至达到一平台水平。另一方面，H202刺激还稍微增强TM。模式共振峰的P冊M， 这表明细胞层底部物质再分布的不均匀性增加。与P冊M —致的是，刺激后， 峰强度随时间略微降低，积分面积则基本保持不变。
图81显示不同剂量HA引起的A431细胞的动态物质再分布信号，用波长 讯问系统监测波长改变所得。如图81a和b所示，HA刺激的光学特征非常依 赖于其剂量。当HA的浓度约为8mM或以下，细胞对HA的响应是一典型的两 事件曲线 一个初峰和一个长时间的增强物质信号。然而，当&02的浓度约为 16mM或以上时，细胞对&02的响应具有独特特征初期的增强物质信号，然后 是相对稳定的过渡阶段，最后是衰减物质信号。后期的衰减物质信号与活/死 细胞染色结果非常符合(数据未显示)，这表明经高剂量^02处理的细胞发 生了细胞凋亡一一个造成细胞物质流失的过程。
图82显示src激酶调节剂对lmM &02介导的细胞响应的作用。结果显示， 两种特异性src激酶抑制剂，PP1和PP2，显著抑制HA介导的细胞响应，但是 作为阴性对照的PP3不影响响应。由此提示，Src激酶参与HA介导的DMR信 号；以及，光学生物传感器可用来筛选影响ROS信号传递的调节剂。
图83显示静息A431细胞不同氧化还原状态对HA介导的D服信号的影响。
用不同的初始接种细胞数量和不同的培养时间形成不同的氧化还原状态。如下 制备低氧化还原活性细胞每孔75，000个细胞，普通条件下培养3天，然后 用0%胎牛血清(FBS)饿养一夜，如下制备高氧化还原活性细胞每孔10，000 个细胞，普通条件下培养10天，然后用0% FBS)饿养一夜。根据光学显微镜 镜检，细胞密度相近( 95%)。如图83所示，两种不同氧化还原状态的细胞 对4mM &02具有不同的响应。在低氧化还原活性状态细胞中，&02引发典型的 DMR信号，最终增加细胞底部的物质。然而，在高氧化还原活性状态细胞中， 相同浓度的^02介导凋亡(即，最终，细胞物质流失)细胞的特征性DMR信号。以上结果显示，光学生物传感器可用于区分培养的细胞的氧化还原状态，并可 用于筛选细胞氧化还原状态的调节剂。
实施例ll:细胞检测中多项光学输出参数的分析
实时、平行记录数种已知细胞响应和过程(包括贴壁、铺展、脱附和通过 EGFR或缓激肽B2受体的细胞信号传递)的多项光学输出参数。这些光学数据 包括入射角变化和描述共振峰的三个参数强度、PWHM和面积。由于TM。模式 的高灵敏度和信息含量，只用它进行全部信息采集和分析。
a) TM。峰的形状
如图31所示，CHO细胞TM。峰的形状和位置取决于细胞覆盖率。随着细胞 覆盖率的提高，共振峰向高入射角方向移动。PWHM值，描述峰的形状状的参数 之一，也表现为细胞覆盖率依赖性(图31b)。当细胞覆盖率约为50%时，PWHM 达到最大值；PWHM最大值比高于75%的高密度时(有或没有细胞单层)的PWHM 值高约35%。值得注意的是，以上数据是在细胞在生长培养基培养约2天后、 充分铺展后测得的。
贴壁CH0细胞的TM。峰还对DMS0 (高剂量时具有毒性)敏感。如图32a所 示，用18% DMS0处理增殖细胞(用10% FBS诱导)时，TM。峰的形状和位置表 现出动态改变。用DMS0处理后，在监测期间(约3小时)，峰的强度和面积 都增加。然而，峰的位置(即入射角)表现出动态特征入射角起初向物质增 加的方向移动(例如25分钟)，然后向物质减少方向移动(例如40和120min)。 类似的，峰的形状起初变宽且显示出复杂的细微结构(例如25分钟)，最后 收窄(例如40和120分钟)。已将出现复杂的峰结构表示为传感器表面或其 附近出现大规模的物质无规不均匀性，由此表明，在DMS0处理后的特定时期 内，生物传感器探测到了表面不均匀性的升高。DMS0处理后25分钟的CHO细 胞活/死亡染色结果显示存在混合细胞群活细胞、死细胞和受影响细胞(图 32b)，表明CHO细胞似乎对應SO处理有不同的响应。以上结果显示，TM。峰的 形状可用于研究传感体积内不均匀的横向物质再分布。
(b)细胞贴壁和铺展
185用光学成像技术，用SPR和RWG之类光学生物传感器很好地研究了细胞在 表面上的贴壁和铺展。细胞开始与表面相互作用是通过最初的接触和附着，此 时，细胞通常仍然是悬浮状态时的圆形。然后，附着细胞发生形态改变，即已 知的铺展一细胞扩大其与表面的接触面积的过程。附着和铺展都有赖于表面的 性质和细胞悬浮于其中的培养基的性质。由于细胞贴壁和铺展都引起传感体积 内明显的纵向和横向物质再分布，我们首先鉴定没有和有长春新碱条件下，5% FBS中，A431细胞的贴壁和铺展。长春新碱是一种植物碱(plant alkaoid)， 通过结合微管蛋白抑制微管组装。
我们研究了室温下(25°C)，没有和有长春新碱条件下，5。/。FBS中，A431 细胞的贴壁和铺展。结果显示，没有长春新碱时，入射角改变表现出三个主要 阶段(数据未显示)。加入细胞溶液后，信号立即、迅速增强，这可能是三个 事件造成的细胞溶液的加入引起整体折射率改变，血清蛋白质在传感器表面 的固定化，以及细胞沉淀后与表面接触。此后，出现一个长时间的增强信号， 反映缓慢的细胞铺展过程。最后达到一饱和水平。该饱和水平(16. 8±0. 6单位， n二3)比类似密度充分铺展细胞的水平(22.6±1.0单位，n=3)低得多。另一方 面，归一后的PW服也是动态的，具有独特的特征(数据未显示)。加入细胞 溶液后，PWHM值开始升高。约20分钟后，PWHM开始回落，在2小时内回落至 其原点水平，然后是缓慢的持续增长，直至达到一平台水平。P冊M的终点值比 起点值高约25%，表明细胞尚未完全铺展，即使是在环境条件下用生物传感器 进行了 20小时的检测之后。光学显微镜成像证实了这一点(数据未显示)。 以上数据提示(i)室温下，A431 cells似乎不能达到最佳程度的贴壁；(ii) 细胞通过多个步骤与表面相互作用，每一步都具有其独特的特征；和(iii) 铺展步骤明切增加传感体积内的物质，表明细胞与表面的接触增加。
100nM长春新碱显著改变光学特征。长春新碱不仅抑制初始响应和总响应， 而且降低细胞铺展的动力学特征(数据未显示)。有长春新碱时，入射角的总 变化比没有长春新碱时小约20%。有意思的是，长春新碱还改变P冊M值的动态 特征(数据未显示)。与没有长春新碱时不同，PWHM—开始先降低，并在低值 维持约3小时，然后升高，直至到达一平台，这表明长春新碱主要影响细胞 贴壁和铺展过程中的初期步骤。以上结果显示，生物传感器不仅能够揭示细胞 与表面的相互作用，而且能够区分改变细胞贴壁和铺展过程的能力不同的化合 物。
186(c ) EGFR信号传递
如前所述，通过分析多种已知调节剂对EGF所介导DMR信号的调节己获得 了丰富的信息。结果显示，在静息A431细胞中，EGF介导的DMR需要EGFR酪 氨酸激酶活性、肌动蛋白聚合和发动蛋白(dynatnin)活性，并且主要通过MEK 进行。通过平行多项参数测定，鉴定了EGF介导的EGFR信号传递的光学特征。 如图84a所示，特别有意义的是高剂量EGF诱导的体现为角度变化的细胞响应。 用超过的32 nM的高剂量EGF刺激时，静息A431细胞出现一个新的DMR信号 阶段。最初的快速P-DMR (增强信号)之后是短暂的过渡阶段和长时间的衰减 N-DMR (信号减弱)，除此之外，在细胞最终达到平台值(与16nM或32nM诱 导的水平相似)之前，还有一个部分回复RP-腿R阶段(增强信号)。 一种可 能性是，在高剂量EGF刺激后，细胞经历了一段脱附过程，然后是一段部分再 附着过程。
因为EGF介导某些细胞靶标(例如PI3K，EGF-诱导的细胞迁移的重要因素) 的不对称横向再分布，平行监测了描述共振峰的多项参数。然而，不同剂量的 EGF刺激后，三项参数似乎都保持不变(图85b;仅显示P冊M)，这表明EGF 刺激不增加细胞底部横向物质再分布的不均匀性。这与肌动蛋白丝的TR-鬼笔 环肽染色结果不一致(图85c和d)。这些图像显示，在横向上，EGF介导肌 动蛋白丝明显重排。无法测到EGF引发的横向物质再分布不均匀性表明，不对 称再分布可能主要在探测容积之外发生。
b)缓激肽B2受体信号传递
缓激肽B2受体是一种G蛋白-偶联受体，并引起缓激肽(BK)的大多数生 理学和病理生理学作用。缓激肽(BK)似乎是包括促有丝分裂和抗促有丝分 裂效应等多种生理学和病理生理学响应介体。A431细胞内源性表达缓激肽B2 受体，但不表达B,受体。在此鉴定了 BK刺激产生的静息A431细胞光学特征， 结果显示，BK刺激引起A431细胞的动态物质再分布；其动力学特征、振幅和 持续时间取决于细胞培养条件、BK剂量和细胞环境。如图86所示，对静息A431 细胞的BK刺激产生PWHM的快速升高，然后缓慢回落至原点水平，而峰强度则 产生与PWHM和角度变化的相反的动态响应。而且，这两项参数的变化也是BK 剂量依赖性的，而且，其动态特征和动力学特征与此前报导的DMR信号相似。以上结果提示与EGF-介导的细胞响应相比，BK刺激引起细胞成分更显著的
不对称再分布，这继而增加了细胞底部横向物质再分布的不均匀性。
总之，RWG生物传感器为探测活细胞提供了丰富的信息。理论分析揭示
测得的光学特征是综合响应，可作为显示结果，用于研究天然环境中的细胞而
不需要标记。已经对数种细胞响应和过程，包括贴壁、铺展、脱附、通过EGFR和缓激肽B2受体的细胞信号传递进行了全面研究。通过对多项光学输出参数的平行动力学测定鉴定了细胞底部纵向和横向上刺激诱导的动态物质再分布的独特特征。已发现，细胞贴壁和铺展涉及多个步骤；长春新碱能够通过干扰初期步骤来调节细胞贴壁和铺展。出乎意料的是，EGF不引发明显的不对称横向物质再分布，至少在细胞底部是这样。这提示，EGF诱导的细胞成分不对称再分布(细胞迁移的重要过程)发生在细胞上部而非底部。然而，增加生物传感器的穿透深度(例如反向波导构型)应能允许检测这样的横向再分布。但是，多参数监控必将增加多个维度，从而能够区分刺激诱导的细胞事件。
有意思的是，缓激肽在A431细胞中诱导的B2受体活化引发了纵向和横向两个方向的物质再分布。
Example 12:用终点测定高通量筛选作用于内源性GPCR的化合物
此处所述为适用于高通量筛选调节或影响细胞中、细胞增殖中或细胞死亡中一种或多种信号传递途径的化合物的方法。这些高通量方法是基于这样的理
解如本文中所述，可用多种不同的参数来分析生物传感器的输出数据。而且，如本文所述，特定细胞、细胞内的特定受体或特定细胞事件例如死亡或增殖或信号传递途径调节可具有特定的特征。如本文所述，该特征可由一个或多个生物传感器输出参数构成。重要的是，对于高通量方法来说，在方法过程中有一个时间点，在该时间点采集的生物传感器输出参数将可反映出细胞的状态，艮口，某信号传递途径被激活或关闭，细胞已死亡或正在增殖。该个点可以是有可用于构成特征的一组生物传感器输出数据特征的时刻。
配体诱导的D服信号通常延续较长时间(数十分钟)。因此，动力学测定
似乎不适合高通量(HT)筛选类应用。然而，基于某特定配体诱导的DMR信号的总体动态学特征和很好表征的动力学特征，可以容易地开发出用于HTS应用的终点测定方法。基于两种GPCRs (A431细胞内的缓激肽B2受体和CH0细胞内
188蛋白酶活化受体亚型1 (PARI))的光学特征，用两种终点测定开发了高通量 筛选方法。
图86显示试验期间作为化合物的函数的两个时间点之间的波长改变。这
两个时间点是临加入化合物前(基线点)和加入化合物后5分钟(测定点)。
两点间的差别反映缓激肽(缓激肽B2受体激动剂)介导的P-DMR过程的总振幅。 B2受体在A431细胞内内源性表达。在缓激肽剌激前，该细胞已转入静息态。本 实施例采用384孔Coring Epic生物传感器平板。每孔含有A431细胞，覆盖 率约为90%。半数孔用100nM的缓激肽处理，另半数孔只用HBSS缓冲液处理。 结果显示，经100nM缓激肽处理细胞的波长总变化为约800pm，经HBSS缓冲 液处理细胞响应的振幅小得多(约-10pm)。该试验窗口非常大( 810pra)， 而该试验的波动性却很小(经缓激肽处理细胞的CV约为 6%)。
图87显示试验期间作为化合物函数的两个时间点之间的波长改变。这两 个时间点是临加入化合物前(基线点)和加入化合物后5分钟(测定点)。 两点间的差别反映缓激肽(缓激肽B2受体激动剂)介导的P-DMR过程的总振幅。 两点间的差别反映凝血酶(PARI受体激动剂)介导的P-DMR过程的总振幅。 此处使用另一细胞系一CHO细胞。PARI受体在CHO细胞中内源性表达。在凝血 酶刺激前，通过在DMEM培养基中培养细胞4小时使部分细胞转入静息态。本 实施例采用384孔Coring Epic生物传感器平板。每孔含有CHO细胞，覆盖率 约为90%。半数孔用40单位/ml的凝血酶处理，另半数孔只用HBSS缓冲液处 理。由于激动剂在A431细胞中诱导的B2活化和在CH0诱导的PARI活化都引发 Gq信号传递，该试验结果的重要性在于Gq-型光学特征至少在这两种细胞系 中是普遍存在的。用相同的终点测定就能够筛选作用于不同细胞内不同内源性 靶标的CPCR调节剂。
图88显示试验期间作为化合物函数的两个时间点之间的波长改变。这两 个时间点是临加入化合物前(基线点)和加入化合物后5分钟(测定点)。 用不同剂量的凝血酶处理CH0细胞。结果显示，用终点测定法，细胞剂量依赖 性地对凝血酶刺激做出响应，产生的表观EG。为12.5单位/ml。该试验结果提 示终点测定不仅能够高通量地筛选GPCR调节剂，而且能够确定实际生理学 条件下，GPCR激动剂对内源性GPCR的激动活性和效力。与对单个细胞响应或 特定标记靶标进行试验的传统方法不同，基于生物传感器的细胞试验适用于大 规模、基于多个靶标地选择强效配体。 一旦鉴定到一个独特的D服特征并确定
189了其通过特定状态细胞内的一类特定靶标与一特定的信号传递相关联，就可对 化合物文库进行筛选。可根据它们的光学特征对化合物进行分类。这样的筛选 可用于化合物分类。
或者，因为产生给定类型光学特征的化合物可能是同一类内源性受体例如 Gq偶联受体的激动剂。可对此类化合物在先刺激对受体特异性激动剂诱导的 DMR信号的作用进行研究，并用来指示靶标特异性。这样的筛选可用于基于靶 标的筛选。
鉴定正确的主要结构(lead structure)是药物开发中的关键步骤。 一旦 选定了主要结构，就可用本文所述光学生物传感器来系统地研究其对活细胞的 作用。例如，可用信号传递途径中一组靶标的多种已知调节剂来研究所述主要 结构所诱导丽R信号的调节特征，从而使该主要结构与特定的靶标或信号传递 途径相关联。 一旦确立了所述关联，就可用生物传感器对主要结构进行优化。 因为通过某个靶标的细胞信号传递是复杂的，还可进一步将主要结构优化成只 选择性调节某受体的某一种特定聚合状态，或某一特定途径或某种细胞状态途径。
190
权利要求
1. 一种测定刺激事件对细胞产生的影响的方法，包括提供无标记生物传感器，在所述生物传感器上孵育细胞，对所培养的细胞实施刺激事件，采集生物传感器的生物传感器输出。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述孵育细胞包括培养细胞。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，根据生物传感器的输出确定刺激的影响。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将细胞培养至20-99%覆盖率。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将细胞培养至30_80%覆盖率。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将细胞培养至40-65%覆盖率。
7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将细胞培养至70-99%覆盖率。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将细胞培养至80-95%覆盖率。
9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞是贴壁细胞。
10. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞与所述生物传感器相接触。
11. 如权利要求IO所述的方法，其特征在于，所述细胞连接于所述生物传感器。
12. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述刺激事件包括向细胞培养物中加入化合物。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物调节细胞的细胞信号传递途径。
14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述调节激活细胞信号传递途径。
15. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述调节抑制细胞信号传递途径。
16. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物调节细胞表面受体。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述化合物是所述受体的激动剂。
18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述化合物是所述受体的拮抗剂。
19. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述细胞表面受体的G蛋白偶联受体、离子通道、受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、整合蛋白受体、^+/8+交换剂受体或免疫受体。
20. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述细胞表面受体是Gq-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGF)或血管内皮生长因子受体(VEGFR)。
21. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物调节细胞内的细胞骨架组分。
22. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述化合物导致细胞骨架结构去稳定化。
23. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述化合物稳定细胞骨架结构。
24. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物调节胞内酶、胞内激酶、胞内细胞器、胞内蛋白质或胞外基质。
25. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物以化合物溶液形式加入。
26. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定所述化合物是否具有细胞毒性。
27. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，测试多种化合物，以筛选出具有细胞毒性的化合物。
28. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述化合物的毒性水平通过生物传感器输出来监测。
29. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，根据生物传感器输出监测化合物对细胞的产生的影响。
30. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，根据生物传感器输出监测化合物的吸收。
31. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物传感器可穿透细胞至100咖的深度。
32. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物传感器可穿透细胞至100nm、 200nm、 300nm或500nm的深度。
33. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物传感器可接收来自细胞内不同穿透深度的数据。
34. 如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述穿透深度至多500nm。
35. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，用生物传感器输出确定细胞状态。
36. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定刺激事件是否影响细胞生存能力或增殖。
37. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，测试多种化合物，以筛选具有细胞毒性的化合物。
38. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，监测化合物对细胞产生的影响。
39. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化合物是抗癌化合物。
40. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述采集生物传感器输出包括采集生物传感器输出参数。
41. 如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数是生物传感器输出信号动力学特征相关参数。
42. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括对生物传感器输出整体动力学特征的分析。
43. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析阶段转变完成时由一阶段变为另一阶段的速度。
44. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析完成生物传感器信号输出所需的时间。
45. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析生物传感器输出一个完整阶段的信号所需的时间。
46. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析P-DMR阶段的总持续时间。
47. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括N-DMR阶段的总持续时间。
48. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析达到P-服R阶段总振幅的速度。
49. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析达到N-DMR阶段总振幅的速度。
50. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析由N-DMR阶段到P-DMR阶段的速度。
51. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述对整体动力学特征的分析包括分析由P-DMR阶段到N-DMR阶段、由净零阶段到P-DMR阶段、由净零阶段到N-DMR阶段、由P-DMR阶段到净零阶段或由N-DMR阶段到净零阶段所需的过渡时间t 。
52. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述生物传感器的输出参数包括对生物传感器输出数据中阶段的分析。
53. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析阶段转变。
54. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析正向物质再分布(P-DMR)信号。
55. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析逆向物质再分布(N-DMR)信号。
56. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析净零物质再分布(净零-歷R)信号。
57. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析正向物质再分布(P-DMR)信号的形状。
58. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析正向物质再分布(P -DMR)信号的振幅。
59. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析逆向物质再分布(N-DMR)信号的形状。
60. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述对阶段的分析包括分析逆向物质再分布(N-DMR)信号的振幅。
61. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述生物传感器的输出参数包括生物传感器输出中的总体动态学特征。
62. 如权利要求61所述的方法，其中，分析总体动态学特征包括分析生物传感器输出产生的完整曲线的形状。
63. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数是与共振峰相关的参数。
64. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括分析光强度与入射角，所述入射角为光与生物传感器耦合的入射角。
65. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括分析光强度与光的波长，所述波长为光与生物传感器耦合的波长。
66. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括分析峰的位置。
67. 如权利要求66所述的方法，其特征在于，分析峰的位置包括分析在最大强度所在位置之前的半最大峰值强度的位置。
68. 如权利要求66所述的方法，其特征在于，分析峰的位置包括分析在最大强度所在位置之后的半最大峰值强度的位置。
69. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括分析共振峰上某点的强度。
70. 如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述分析共振峰强度包括分析最大强度的强度。
71. 如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述分析共振峰强度包括分析达到峰值强度之前共振峰上半最大峰值强度的强度。
72. 如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述分析共振峰强度包括分析达到峰值强度之后共振峰上半最大峰值强度的强度。
73. 如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采集第二生物传感器输出参数。
74. 如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述第二生物传感器输出参数包括分析峰的位置。
75. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数包括分析峰的形状。
76. 如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述分析峰的形状包括测定共振峰下的面积。
77. 如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述共振峰下的面积只包括共振峰上两个半最大强度点连线之上的面积。
78. 如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述分析峰的形状包括分析半最大强度点处共振峰的宽度。
79. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出参数 是与共振带图像相关的参数。
80. 如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述共振带图像是通过用 点光源照射并透过生物传感器并对穿透生物传感器的入射耦合光强度分布进 行成像获得的。
81. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，用CCD相机进行所述入射 耦合光强度分布成像。
82. 如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述与共振带图像相关的 参数是带的形状、带的位置、带的强度或光强分布。
83. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述分析半最大值处的峰宽 和最大强度所在的位置。
84. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用化合物培 育培养的细胞。
85. 如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述方法还包括确定所述 化合物是否影响刺激事件对细胞产生的影响。
86. 如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述方法还包括确定化合 物对于刺激事件对细胞产生的效应的影响。
87. 如权利要求85所述的方法，其特征在于，对一种或多种其它化合物 进行筛选，确定化合物对于刺激事件对细胞产生的效应的影响。
88. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，采集少于10分钟、5分钟、 l分钟、30秒、10秒、5秒或1秒的生物传感器输出。
89. 如权利要求88所述的方法，其特征在于，采集生物传感器输出的时 间基本上等于刺激效应的生物扩散时间极限值。
90. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供检测系统。
91. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，提供多个无标记生物传感器， 在两个或多个生物传感器上培养细胞，在所述两个或多个生物传感器上施加剌 激事件，采集所述两个或多个生物传感器的生物传感器输出。
92. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，对多种细胞穿透深度进行
93. 如权利要求92所述的方法，其特征在于，每个生物传感器具有一个穿透深度。
94. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，同时采集两个或多个生物传感器的生物传感器输出。
95. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，同时进行细胞培养。
96. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，同时对两个或多个生物传 感器施加剌激事件。
97. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，在多个生物传感器上培养 多种类型的细胞。
98. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述多种细胞包括区别在 于其中之一经过遗传改造的至少两种细胞。
99. 如权利要求98所述的方法，其特征在于，多种细胞类型中的各种细 胞类型用多种生物传感器中的不同生物传感器检测。
100. 如权利要求l所述的方法盖率。
101. 如权利要求l所述的方法
102. 如权利要求l所述的方法 加入缓冲液，所述缓冲液与细胞类型和刺激事件类型相容。
103. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述采集生物传感器输出 包括以不同入射角的光照射生物传感器，测定入射光耦合时的入射角。
104. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述采集生物传感器输出 包括用不同波长的光照射生物传感器，测定入射光耦合时的波长。
105. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞处于增殖状态、 静息状态、已分化状态、特定的氧化还原/氧化状态或特定的细胞周期状态。
106. 如权利要求105所述的方法，其特征在于，通过用生长培养基培养 细胞使细胞处于增殖状态。
107. 如权利要求105所述的方法，其特征在于，通过用饥饿培养基培养 细胞使细胞处于静息状态。
108. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分析生物 传感器输出。
109. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，进行连续监测，取样速度 为1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、l分钟或5分钟。，其特征在于，将细胞培养至至少70%覆，其特征在于，所述细胞包括很多细胞。 ，其特征在于，所述方法还包括在细胞中
110. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定刺激 事件对细胞产生的影响。
111. 如权利要求iio所述的方法，其特征在于，所述鉴定影响包括将生 物传感器输出与特征输出比较。
112. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述特征输出包括动态 物质再分布响应，所述动态物质再分布响应包括至少一个以下阶段正-DMR、 负-DMR和净零-DMR。
113. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞来自细胞系。
114. 如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述细胞系是经遗传改 造的突变细胞系。
115. 如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述刺激事件包括向细 胞培养物中添加化合物，所述影响是在以下方面的影响化合物对细胞吸收、 分布、代谢或毒性影响。
116. 如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述刺激事件包括向细 胞培养物中添加化合物，所述确定化合物的影响包括对于化合物对细胞产生的 影响的功能性评价和鉴定化合物对于细胞吸收、分布、代谢或毒性的影响。
117. 如权利要求l所述的方法，将生物传感器输出与细胞内物质再分布 相关联。
118. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物传感器的输出是 可观察的生物传感器的反射光的角度或光谱变化。
119. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述采集生物传感器输出 包括监测所培养细胞的时间依赖性响应。
120. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞达到至少80%覆 盖率。
121. 如权利要求119所述的方法，其特征在于，所述生物传感器埋在微 板内。
122. 如权利要求119所述的方法，其特征在于，所述细胞在所述生物传 感器上生长至少1小时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、l周 或2周。
123. —种鉴定细胞状态的方法，该方法包括在无标记生物传感器表面上 培养细胞，由此形成细胞-生物传感器组合，检测该细胞-生物传感器组合，其中所述检测包括鉴定培养细胞所在表面的不均匀性。
124. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述生物传感器能够区 分生物传感器表面与活细胞接触的区域、与受到刺激事件影响的细胞接触的区 域和不接触任何细胞的区域。
125. 如权利要求124所述的方法，其特征在于，所述受影响的细胞泄漏 了部分胞内组分或者是死细胞。
126. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用化合 物孵育所述细胞-生物传感器组合。
127. 如权利要求126所述的方法，其特征在于，所述化合物是化学物质、 生物化学物质、生物分子、药物或聚合物。
128. 如权利要求126所述的方法，其特征在于，所述检测在用化合物孵 育后进行。
129. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述检测时间短于或等 于60、 45、 30、 15、 10、 5、 3、 2或1秒。
130. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，如下所述测定不均匀性 采集生物传感器输出，其中所述生物传感器输出包括具有最大强度的导向共振 峰，并比较半最大强度(P冊M)处的峰宽。
131. 如权利要求130所述的方法，其特征在于，所述导向模式是横向磁 场模式。
132. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述生物传感器成单个 或复合样式。
133. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，当所述生物传感器成复 合样式，它埋在微板的一个或多个孔内。
134. 如权利要求133所述的方法，其特征在于，在微板的一个孔内有一 个生物传感器。
135. 如权利要求133所述的方法，其特征在于，在微板的一个孔内有多 个生物传感器，这些传感器物理上通过隔断物分开或者相互之间没有隔断物。
136. 如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述生物传感器被隔断 物理地间隔开来，其中界定孔内区室的隔断物低于界定微板上各孔的隔断物。
137. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述生物传感器是光学 波导生物传感器。
138. 如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述生物传感器是光学 波导光栅生物传感器。
139. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在两个或多个孔中培养细 胞，其中，对这两个或多个孔施加刺激事件，所述刺激事件包括向这两个或多 个孔中添加化合物，采集这两个或多个孔的生物传感器输出，将这两个或多个 孔的PWHM与对照孔的比较，其中不对对照孔施加刺激事件。
140. 如权利要求139所述的方法，其特征在于，以高于每孔l、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 30、 45或60秒的速度采集生物传感器输出。
141. 如权利要求139所述的方法，其特征在于，生物传感器输出的速度 高于每分钟60、 30、 15、 10、 7、 5、 4、 3、 2或1孑L。
142. 如权利要求139所述的方法，其特征在于，比较各孔PWHM的速度高 于每孔l、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 30、 45或60秒。
143. 如权利要求139所述的方法，其特征在于，比较各孔PWHM的速度高 于每分钟60、 30、 15、 10、 7、 5、 4、 3、 2或1孑L。
144. 如权利要求139所述的方法，其特征在于，用单数据点评价化合物的毒性。
145. 如权利要求139所述的方法， 时间依赖性PWHM变化。
146. 如权利要求139所述的方法， 生物传感器。
147. 如权利要求139所述的方法， 光学的生物传感器。
148. 如权利要求139所述的方法， 记生物传感器。
149. 如权利要求139所述的方法， 细胞培养系统上。
150. 如权利要求149所述的方法，
151. 如权利要求150所述的方法，
152. 如权利要求151所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出是其特征在于，所述生物传感器是光学其特征在于，所述生物传感器是基于其特征在于，所述生物传感器是无标其特征在于，所述生物传感器安装在其特征在于, 其特征在于， 其特征在于,所素系统是平板。所述平板是多孔板,所述匹配是微板。
153.如权利要求l所述的方法，其特征在于，在两个或多个孔内培养细 胞，其中微板有多个孔，生物传感器输出是各孔在指定时间的全传感器区域TM。模式共振角度带图像。
154. 如权利要求153所述的方法，其特征在于，细胞达到70%覆盖率。
155. 如权利要求153所述的方法，其特征在于，剌激包括向所述两个或 多个孔中添加化合物，其中将加化合物孔的TM。模式共振角度带宽度与不加化 合物的孔的TM。模式共振角度带宽度比较。
156. 如权利要求153所述的方法，其特征在于，所述生物传感器是基于 波导的生物传感器。
157. 如权利要求156所述的方法，其特征在于，所述基于波导的生物传 感器是基于吣205的光学生物传感器。
158. 如权利要求153所述的方法，其特征在于，所述细胞是贴壁细胞。
159. 如权利要求153所述的方法，其特征在于，所述细胞生长至30%、 50%或90%覆盖率。
160. 如权利要求153所述的方法，生物传感器输出是光学波导光模式光 光谱(OWLS)，导向模式的共振峰或导向模式的共振带图像。
161. 如权利要求140所述的方法，其特征在于，最大强度共振峰位置的 降低表明化合物具有细胞毒性。
162. 如权利要求140所述的方法，其特征在于，PWHM变宽表示化合物具 有细胞毒性。
163. 如权利要求140所述的方法，其特征在于，PWHM分裂表示化合物具 有细胞毒性。
164. 如权利要求140所述的方法，其特征在于，共振带变宽表示化合物 具有细胞毒性。
165. 如权利要求164所述的方法，其特征在于，细胞覆盖率达到至少70%。
166. 如权利要求140所述的方法，其特征在于，PWHM改变表示化合物对 细胞具有影响。
167. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，生物传感器装在微板上。
168. 如权利要求167所述的方法，其特征在于，生物传感器埋在微板上 各孔的底部。
169. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，所述生物传感器是基于 光学的无标记生物传感器。
170. 如权利要求166所述的方法， 生物传感器上。
171. 如权利要求170所述的方法，
172. 如权利要求166所述的方法, 行增殖增强分析或增殖减弱分析。
173. 如权利要求172所述的方法, 量达到30-70%覆盖率。
174. 如权利要求172所述的方法， 盖率。
175. 如权利要求172所述的方法， 盖率。
176. 如权利要求172所述的方法，其特征在于，用化合物覆盖所述细胞-其特征在于， 其特征在于,所述化合物配在溶液中。 起始细胞的数量足以进其特征在于，在无化合物时，细胞数其特征在于，细胞数量达到40-60%覆其特征在于，细胞数量达到44-55%覆其特征在于，细胞数量达到50%覆盖
177. 如权利要求171所述的方法，其特征在于，在用化合物孵育之前， 培养在生物传感器上的细胞数量为至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10000、 11000、 12000、 13000、 14000、 15000、 16000、 17000、 18000、 19000、 20000、 21000、 22000、 23000、 24000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000或70000个细胞。
178. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，在单个时间点采集生物 传感器输出。
179. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，采集的生物传感器输出 是光谱。
180. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，采集的生物传感器输出 是各生物传感器全区域TM。模式共振角度带的图像。
181. 如权利要求179所述的方法，其特征在于，采集的生物传感器输出 是各生物传感器全区域TM。模式共振角度带的图像。
182. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，生物传感器输出包括总 角度变化，其中总角度变化减小表示化合物是细胞增殖抑制剂。
183. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，生物传感器输出包括总 角度变化，其中总角度变化增大表示化合物是细胞增殖抑制剂。
184. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，生物传感器输出包括入射耦合光强度，将入射耦合光强度绘制成光入射角的函数的图。
185. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，细胞在生物传感器上培 养至少1小时、5小时、IO小时、16小时、24小时、36小时、l周或2周。
186. 如权利要求166所述的方法，其特征在于，生物传感器输出包括耦 合模式。
187. 如权利要求186所述的方法，其特征在于，所述耦合模式是横向磁 场模式(TM。)。
188. 如权利要求187所述的方法，其特征在于，将所述TM。模式绘制成最 初接种细胞数量的函数的图。
189. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞具有受体酪氨酸 激酶(RTK)，其中所述细胞悬浮在含有血清的培养基中，血清在培养基中的 浓度允许细胞在生物传感器表面上附着和生长，其中所述细胞贴壁在生物传感 器表面。
190. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在37。C 用饥饿培养基饿养贴壁细胞，其中所述饥饿培养基是含有低浓度血清的培养 基。
191. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在培养 基中至少加一次缓冲液。
192. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述刺激事件包括向培 养基中添加RTK的配体。
193. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述培养基不含PDGF(血 小板衍生生长因子)、EGF、胰岛素、TGF-a、胰岛素样生长因子I (IGF-1)和 神经生长因子(NGF)。
194. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述饥饿培养基中的血 清或胎牛血清(FBS)的浓度低于约O. 1%。
195. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述时间依赖性响应持 续至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 36或48小时。
196. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述生物传感器埋在多 孔微板底部，在两个或多个孔中培养不同类型的细胞，对这两个或多个孔施加 剌激事件，所述刺激事件包括向这两个或多个孔中添加RTK的配体，采集这两个或多个孔的生物传感器输出，所述生物传感器输出是不同类型细胞的时间依 赖性响应。
197. 如权利要求196所述的方法，其特征在于，所述不同类型的细胞需 要不同的培养条件。
198. 如权利要求196所述的方法，其特征在于，测定或确定所述不同类 型细胞的RTK的表达水平或细胞表面表达水平。
199. 如权利要求196所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用化合 物孵育细胞，和确定该化合物是否调节RTK信号传递。
200. 如权利要求189所述的方法，其特征在于，所述细胞具有较高的RTK 表达水平，诉输生物传感器埋在多孔微板底部，在两个或多个孔中培养细胞， 对这两个或多个孔施加刺激事件，所述刺激事件包括向这两个或多个孔中添加 RTK的配体，其中向这两个或多个孔中添加不同浓度的RTK配体，采集这两个 或多个孔的生物传感器输出，所述生物传感器输出是不同孔中细胞的剂量依赖 性响应和时间依赖性响应。
201. 如权利要求200所述的方法，其特征在于，比较所述细胞的剂量依 赖性响应和时间依赖性响应。
202. 如权利要求200所述的方法，其特征在于，测定配体强度。
203. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分析细胞 的生物物质释放的生物传感器输出，据此分析细胞中细胞骨架的状态。
204. 如权利要求203所述的方法，其特征在于，所述细胞的生物物质释 放依赖于成孔试剂诱导的细胞透性。
205，如权利要求203所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向细胞 培养物中添加成孔试剂。
206. 如权利要求205所述的方法，其特征在于，所述生物传感器输出是 时间依赖性的光学响应。
207. 如权利要求205所述的方法，其特征在于，所述成孔剂是能够在细 胞表面膜中形成孔的化学或生物化合物。
208. 如权利要求207所述的方法，其特征在于，所述成孔剂是皂苷、毛 地黄皂苷、菲律宾菌素或链球菌溶血素O。
209. 如权利要求205所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在向细 胞培养物中添加成孔试剂之后向细胞培养物中添加化合物。
210. 如权利要求209所述的方法，其特征在于，对一种或多种其它化合 物进行筛选，确定化合物是否能够干扰细胞内的细胞骨架结构。
211. 如权利要求205所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在向细 胞培养物中添加成孔试剂之前向细胞培养物中添加化合物。
212. 如权利要求211所述的方法，其特征在于，对一种或多种其它化合 物进行筛选，确定化合物是否能够干扰细胞内的细胞骨架结构。
213. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用能够检 测标记的仪器检测标记的步骤。
214. 如权利要求213所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光标记、 放射性标记或磷光标记。
215. 如权利要求213所述的方法，其特征在于，所述检测标记的步骤与 监测生物传感器的步骤同时进行。
216. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物传感器有两个区 域，第一个区域没有含物质混合物沉积，第二个区域有含物质混合物沉积，在 将细胞孵育于所述传感器上时，第二区域上的细胞被所述物质转染。
217. 如权利要求216所述的方法，其特征在于，所述物质是靶基因、靶 蛋白、靶蛋白与标签蛋白的融合蛋白、靶的RNAi，靶的抗体、反义寡核苷酸及 其衍生物、反基因寡核苷酸及其衍生物。
218. 如权利要求217所述的方法，其特征在于，所述标签蛋白是His-tag、 GFP蛋白或衍生物。
219. 如权利要求218所述的方法，其特征在于，所述物质与一种试剂复 合从而使得细胞在与传感器的物质提呈区域上贴壁时能够摄取该物质。
220. 如权利要求216所述的方法，其特征在于，所述区域是按照光栅结 构在半个传感器表面选择性沉积含物质混合物形成的。
221. —种确定活细胞状态的方法，该方法包括观测细胞成分的动态物质 再分布，所述观测步骤在共振波导光栅生物传感器中进行。
222. —种测定化合物对细胞产生的影响的方法，所述方法包括在生物 传感器上培养细胞，首次洗涤细胞，饿养细胞，将化合物与细胞共孵育和用生 物传感器记录信号。
223. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在饿养 步骤后用缓冲液洗涤的步骤。
224. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，细胞生长至覆盖率超过 90%。
225. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，洗涤细胞两次。
226. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养细胞包括仅在DMEM 中培养细胞。
227. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养时间为l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、
228. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养进行一夜。
229. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，洗涤缓冲液含1X常规 Hank平衡盐溶液、20mM HEPES缓冲液，pH7. 0，并含有2. 5mM丙磺舒。
230. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述信号是钙信号。
231. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，记录6分钟的钙信号， 以6秒为间隔。
232. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述生物传感器具有 HTS7000 BioAssay Reader。
233. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行。
234. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述生物传感器是Corning⑧ EpicTM角度讯问系统。
235. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，在横向磁场模式中使用 所述生物传感器。
236. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，在p-极化TM。模式中使用 所述生物传感器。
237. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，用洗涤缓冲液稀释化合物。
238. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液含有l X常规Hank平衡盐溶液、20mM HEPES缓冲液，pH7. 0。
239. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养细胞在不含胎牛血 清的培养基中进行。
240. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，化合物溶液中二甲亚砜 的含量低于O. 05%、 0.1%、 0.5%、 1%、 2%或5%。
241. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养在37C进行。
242. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，饿养在空气/5%0)2中进行。
243. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，在用化合物溶液孵育细 胞之前，用不含化合物的溶液预处理细胞，直至达到稳定期。
244. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，生物传感器鉴定共振带 心中位置的像素密度变化。
245. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，生物传感器测定共振带 的角度变化。
246. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将生物 传感器数据绘制成与时间相关的图。
247. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，信号增强(P-躍R)表示 传感体积内生物分子的量增加，信号减弱(N-DMR)表示传感体积内生物分子 的量减少。
248. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，该方法鉴定细胞和化合 物的特征。
249. 如权利要求248所述的方法，其特征在于，所述特征包括P-画R阶 段和其后的N-DMR阶段，P-DMR阶段出现的速度高于N-DMR阶段的衰减速度。
250. 如权利要求248所述的方法，其特征在于，所述特征包括一个直至 到达一高位平台的P-DMR阶段。
251. 如权利要求248所述的方法，其特征在于，所述特征包括两个连续 的P-DMR事件，其中第一个P-DMR阶段升至一高水平的的速度高于第二个P-DMR 阶段升至第二个高水平的的速度。
252. 如权利要求248所述的方法，其特征在于，所述特征没有任何高于 干扰信号水平的DMR信号。
253. 如权利要求222所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将生物 传感器的信号绘制成与化合物浓度或化合物种类相关的图。
254. 如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述氧化还原/氧化状态 是通过用化合物处理一定时间形成的。
255. 如权利要求254所述的方法，其特征在于，细胞用化合物处理l小 时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时或64小时。
256. 如权利要求105所述的方法，其特征在于，如下监测所述氧化还原/氧化状态向细胞添加外源氧化剂，监测氧化剂诱导的光学输出。
257. 如权利要求256所述的方法，其特征在于，所述氧化剂选自H202、Mn04 _、 Cr03、 Cr2072—、 0s04。
258. 如权利要求254所述的方法，其特征在于，所述化合物来自随机化 合物文库或是天然生物物质。
全文摘要
公开了使用无标记光学生物传感器进行细胞检测的组合物和方法。在某些实施方式中，所述检测可用高通量方法进行，且可以是多路的。
文档编号A61B5/05GK101500481SQ200680019857
公开日2009年8月5日 申请日期2006年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者A·M·菲里, J·拉希瑞, N·H·方丹, 晔 方, 阮宝祺 申请人:康宁股份有限公司