专利名称：：用于HBV治疗的PEG-IFNa和利巴韦林的制作方法用于HBV治疗的PEG-IFNa和利巴韦林本发明涉及使用对治疗慢性乙型肝炎有效的一定量的PEG-IFN-a缀合物与利巴韦林(Ribavirin)的联合来治疗慢性肝炎病毒感染的领域。干扰素(IFN)是天然存在的蛋白质，具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的活性。已知在人中存在四种不同类型的干扰素(Pestka等人，(1987)Ann.Rev.Biochem.f^，727-777和Emanual&Pestka(1993)J.Biol.Chem.268,12565-12569)。IFNa家族代表由被刺激的外周血白细胞细胞系(Pestka等人，loc.cit.;Havell等人，(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA2，2185-2187;Cavalieri等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sei.USA21，3287-3291)、类淋巴母细胞细胞系和类原粒细胞细胞系(Familletti等人，(1981)Antimicrob.Agents.Chemother.^，5-9)产生的主要类型的干扰素。实现IFNa的抗病毒效果不仅通过直接影响病毒自身，而且通过在防止病毒感染的意义上对它们的靶细胞的作用。干扰素可以影响癌症胂瘤并且影响机体的免疫系统，即例如，活化巨噬细胞和NK细胞并增强细胞膜的多种免疫有效成分的表达。制备干扰素-cDNA及其直接表达(特别是在大肠杆菌中)的细节，已经是许多出版物的主题。因此，例如，重组干扰素的制备是已知的，例如参见Nature^(1982)，503-508，Nature言(1980)，326-320，Nature塑(1981)，20-26，NucleicAcidsRes.丝(1980)，4057-4074，以及欧洲专利号No.32134，43980和211148。在慢性乙型肝炎中，利巴韦林与标准干扰素a的联合诱导CD4+T-细胞持续增殖和Thl细胞因子释放，这增强了持续根除HBV的可能性(MARico,JAQuiroga,DSubira，SCastanon，JMEsteban，MPardo，VCarreno:HepatitisBvirus-specificT-cellproliferationandcytokinesecretioninchronichepatitisBeantibody-positivepatientstreatedwithribavirinandinterferonalpha.份/7fl油gy2001,33:295-300)。在初步研究中，24名HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎患者用标准干扰素(5MU每周三次)和利巴韦林(每天1000-1200mg)联合治疗了12个月[TCotonat，JAQuiroga，JMLopez-Alcorocho，RClouet,MPardo,FManzarbeitia,VCarreno:PilotstudyofcombinationtherapywithribavirinandinterferonalfafortheretreatmentofchronichepatitsBeantibody-positivepatients.好印"Mtosv2000，31:502-506。所有患者均是以前对干扰素单一治疗的无反应者。在这些难以治疗的群体中，12个月后的随访病毒学反应(PCR检测HBVDNA阴性)在50%的患者中实现，21%的患者中ALT正常[TCotonat,JAQuiroga，JMLopez-Alcorocho,RClouet,MPardo，FManzarbeitia,VCarreno:PilotstudyofcombinationtherapywithribavirinandinterferonalfafortheretreatmentofchronichepatitsBeantibody-positivepatients.i7印"to/0^;2000，31:502-506]。因此，该治疗并非总是有效的。因此，PEG-IFN-a缀合物与利巴韦林的联合治疗可以比IFN-a与利巴韦林的联合治疗更有效。已经观察到，在IFN-a的情形中，加入聚乙二醇(PEGylation)增加了循环半衰期和血浆残留时间，降低了免疫原性，减少了清除并增加了体内活性。因此，本发明提供了PEG-IFN-a缀合物与利巴韦林联合用于制备治疗慢性乙型肝炎感染药物中的应用。此外，本发明还提供了在需要治疗慢性乙型肝炎感染的患者中治疗慢性乙型肝炎感染的方法，该方法包括施用对治疗慢性乙型肝炎有效的一定量的PEG-IFN-a缀合物与一定量的利巴韦林的联合。本发明还提供了包括PEG-IFN-a缀合物与利巴韦林的试剂盒，用于治疗慢性乙型肝炎感染。优选的，所述慢性乙型肝炎是HBeAg-阴性或HBeAg-阳性的慢性乙型肝炎。更优选的，所述的慢性乙型肝炎是HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎。患者或者是以前未接受过治疗的患者，或以前用IFN-a和/或利巴韦林或任何其它药物治疗，但随后复发的患者，或对以前的IFN-a和/或利巴韦林或任何其它药物治疗的无反应者。优选的，患者是以前对干扰素单一疗法的无反应者。使用乙型肝炎e抗原(HBeAg)区分由野生型HBV引起的HBeAg-阳性的慢性肝炎，和由天然存在的HBV变体引起的HBeAg-阴性的慢性肝炎，所述变体具有在基因组的前核心或/和基本核心启动子区域的突变。已经认识到，最近十年间，HBeAg-阴性的慢性肝炎在很多国家都在增长，而且代表了很多国家中的主要病例。该类型的乙型肝炎一般与更严重的肝病联系在一起，所述肝病具有极低自然康复率和对抗病毒治疗的低持续应答率。本文使用的术语"PEG-IFN-a缀合物"包括源自任何天然材料(例如，白细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)或来自所述天然材料的材料(例如，细胞系)的IFN-a，或那些用重组DNA纟支术制备的IFN-a。克隆IFN-aA其直接表达(特别是在大肠杆菌中)的细节已经是很多出版物的主题。重组IFN-a的制备是已知的，例如参见Goeddel等人，(1980)Nature巫，316-320和(1981)，Nature290,20-26，以及欧洲专利号No.32134，43980和211148。有许多类型的IFNa，例如IFNaI、IFNa2，并且另外它们的亚型，包括但不限于IFNa2A、IFNa2B、IFNa2C和IFNaII(也称为IFNaII或a-IFN)。术语"IFNa"也包括来自Amgen的共有IFNa(consensusIFNa)，或WO01/25438或WO2004/046356中公开的天然和/或重组的IFNa或IFNa变体的混合物。使用IFNa2A是优选的。欧洲专利号No.43980和211148中已经描述了IFNa2A的制备。IFNa与多聚物如聚亚烷基二醇(取代或非取代的)缀合，例如，与聚乙二醇缀合形成PEG-IFN-a缀合物。可以通过本领域已知的各种连接体实现缀合，特别的，通过例如在欧洲专利申请公开号No.0510356、593868和809996中公开的那些。聚合物(优选的聚乙二醇)的分子量可以在300至70000道尔顿之间，可以缀合一个或多个，优选的1个至3个聚合物到IFN-a上。优选的PEG-IFN-a缀合物具有式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R及R'是甲基，X是NH，n和n'分别或两者都是为420或520。利巴韦林，l-(3-D-呋核亚硝脲(Ribofuranosyl)-lH-l，2，4-三唑-3-氨甲酰，描述在默克索引，化合物No.8199，第11版中。其制备和配制描述在美国专利号No.4.211.771中。实施本发明的联合治疗的PEG-IFN-a的剂量是，不论体重，每周约33至540毫克(mcg),每周给药一次或两次。实施本发明的利巴韦林的剂量是，每天约400至1200毫克，每周至少五天，优选的每周7天。基于患者体重在40至150kg之间的假设，剂量范围因此为每天每千克体重10至30毫克之间。在更具体的实施方案中，利巴韦林的每日剂量为800至1200毫克，更优选的1000至1200毫克。该每日剂量可以以单剂量每天一次性施用，也可以以分剂量每天2次或3次施用。优选的，利巴韦林的日剂量以分剂量每天2次施用。根据本发明，利巴韦林与PEG-IFN-a缀合物联合施用给患者，即，在患者接受利巴韦林剂量的相同或不同时段中，施用PEG-IFN-a缀合物剂量。在本发明的实施方案中，在至少一次剂量的PEG-IFN-a缀合物的同一周内，施用至少一次日剂量的利巴韦林。在更具体的实施方案中，大多数利巴韦林施用与一次或多次PEG-IFN-a施用发生在同一周内。在另一个具体的实施方案中，所有的或几乎所有的利巴韦林施用都与一次或多次PEG-IFN-a施用在同一周内发生。目前，口月良施用PEG-IFN-a缀合物制剂是无效的，因此优选的PEG-IFN-a缀合物施用方法是肠胃外的，优选的通过皮下(sc)或肌内(im)注射。利巴韦林可以胶嚢剂或片剂形式口服施用，结合肠胃外施用PEG-IFN-ct缀合物。当然，两种药物的其它可用施用方式也是可预期的，例如通过鼻腔喷雾、经皮肤的、通过栓剂、通过緩释剂型等。只要递送了合适剂量而不会破坏活性成分，任何施用形式都将有效。通过联合治疗对比单一疗法和/或IFN-a与利巴韦林的联合治疗的受控制的临床实验，可以测定治疗的效果。在联合治疗对于减轻'艮性乙型肝炎，优选的HBeAg-阴性或HBeAg-阳性的慢性乙型肝炎感染，更优选HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎感染的征兆和症状中的功效，以及副作用的频率和严重程度上，与以前的IFN-oc单一疗法和/或IFN-a和利巴韦林的联合治疗相比较。三组患有慢性乙型肝炎感染(优选的HBeAg-阴性或HBeAg-阳性，更优选的HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎)的群体与评估相关。研究患者群体的其中之一或全部三个，其具有下列组合1、以前未治疗的患者。2、以前用IFN-a和/或利巴韦林或其它任何药物治疗过但随后复发的患者。3、对以前的IFN-a和/或利巴韦林或其它任何药物治疗无反应的患者。通过前述的慢性乙型肝炎(优选的HBeAg-阴性或HBeAg-阳性，更优选的HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎)的征兆和症状减轻的程度确定联合治疗的效果。实施例该研究的主要目的是比较具有PEG-IFN-a2A的PEG-IFN-a2A和利巴韦林的联合在治疗HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎中的效果和安全性。等数患者(每治疗组61名患者)接受48周的PEG-IFN-a2A与利巴韦林的联合、或PEG-IFN-a2A。第三患者组(165名患者)接受48周的PEG-IFN-a2A加安慰剂。单治疗组为PEG-IFN-a2A联合组提供安全性和效果的比较。与利巴韦林或安慰剂联合，PEG-IFN-a2A的剂量是180照，每周皮下(sc)施用一次，进4亍48周。利巴韦林的剂量根据体重是每天1000mg或1200mg，以分剂量施用。患者体重<75kg(165lbs)，每天接受1000mg(早上400mg和晚上600mg)，而患者体重275kg的每天接受1200mg(早上600mg和晚上600mg)。主要的效果参数是，在未治疗的随访期结束时組合的持续病毒学[即，AMPLICORPCR(灵敏度2100拷贝/ml)测定的HBV-DNA水平〈104拷贝/ml]和生物化学(血清ALT浓度正常化)反应。患者必须在第68周和72周均有正常的血清丙氨酸M转移酶活性(ALT)，以及在第72周没有可检测的病毒，则所述患者被认为是有反应者。在筛选中、基线时、48周治疗时期的第1、2、4、6和8周以及之后每4周都进行安全性评估。在随后的24周随访期内继续安全性评估。安全性的测量包括不利事件、生命体征、实验室测试和剂量调整表格，以及由于安全性或耐受性原因从治疗提前撤出。在i^A本实验的前6个月内没有治疗HBV、在前30天内没有用任何试验药治疗的，18周岁或以上的男性和女性HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎患者，构成患者群体。患者必须有可计量的HBV-DNA，在随机化前的2个月内有两次异常的ALT水平(允许之间有正常的ALT值)，在12个月内肝活组织检查与HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎一致。排除了患有其它形式肝病、共感染了HCV、丁型肝炎或人免疫缺乏病毒(HIV)、肝细胞癌、已存在严重抑郁或其它精神病、心脏病、肾病、癫痫发作、或严重的视网膜病变等的患者。在实验的治疗部分(48周)之前，有长达4周的篩选期(时间从第一次筛选评估到第一次测试药物施用)。符合所有合格标准的患者被随机分到两个治疗计划中任一个。以随访末期的初步结果作为下列效能分析(附录C)的基础。PEG-IFN单一疗法的估计的反应率是30%，联合治疗的为55%。通过成对比较随访末期反应率来解决主要的研究问题。成对的显著水平被设定为a=0.05(双侧检定)。效能被设定为80%。将中断治疗的计算为随访末期的无反应者。使总数随机化为:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.PEG-IFN-α缀合物与利巴韦林联合用于制备治疗慢性乙型肝炎感染的药物的应用。2.权利要求1的应用，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性或HBeAg-阳性的慢性乙型肝炎感染。3.权利要求1的应用，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎感染。4.根据权利要求1至3的任一项的应用，其中PEG-IFN-a缀合物的量是约每周33至540mcg。5.根据权利要求1至4的任一项的应用，其中利巴韦林的量是每天400至1200mg。6.根据权利要求1至5的任一项的应用，其中PEG-IFN-a缀合物是具有以下式的PEG-IFN-a2A缀合物其中R和R'是甲基，X是NH,并且n和n'分别是或二者都是420或520。7.治疗慢性乙型肝炎感染的方法，其包括施用对慢性乙型肝炎有效的一定量的PEG-IFN-a缀合物与一定量的利巴韦林的联合。8.权利要求7的方法，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性或HBeAg-阳性的慢性乙型肝炎感染。9.权利要求7的方法，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎感染。ROCH2CH2(OCH2CH2)n—e—NHR'OCHsCH^OCH^H^if-O—C—NHO210.根据权利要求7或9的方法，其中所述方法中施用的PEG-IFN-ot缀合物的量是约每周33至540mcg。11.根据权利要求7至10的任一项的方法，其中所述方法中施用的利巴韦林的量是每天400至1200mg。12.权利要求7至11的任一项的方法，其中PEG-IFN-a缀合物是具有以下式的PEG-IFN-a2A缀合物其中R和R'是甲基，X是NH，并且n和n，分别是或二者都是420或520。13.用于治疗慢性乙型肝炎感染的包括PEG-IFN-a缀合物和利巴韦林的试剂盒。14.权利要求13的试剂盒，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性或HBeAg-阳性的慢性乙型肝炎感染。15.权利要求14的试剂盒，其中所述慢性乙型肝炎感染是HBeAg-阴性的慢性乙型肝炎感染16.根据权利要求13至15的任一项的试剂盒，其中PEG-IFN-a缀合物的量是约每周33至540mcg。17.根据权利要求13至16的任一项的试剂盒，其中利巴韦林的量是每天400至1200mg。18.根据权利要求13至17的任一项的试剂盒，其中PEG-IFN-a缀合物是具有以下式的PEG-IFN-a2A缀合物ROCH2CH2(OCH2CH2)n—O-c—MHOO其中R和R'是甲基，X是NH，并且n和n'分别是或二者都是420或520。19.在上文中描述的发明。全文摘要本发明提供了PEG-IFN-α缀合物与利巴韦林联合在治疗慢性乙型肝炎感染中的应用。本发明还提供了在需要治疗慢性乙型肝炎感染的患者中治疗慢性乙型肝炎感染的方法，包括施用对治疗慢性乙型肝炎有效的一定量的PEG-IFN-α缀合物与一定量的利巴韦林的联合。文档编号A61K31/7056GK101242857SQ200680029339公开日2008年8月13日申请日期2006年8月3日优先权日2005年8月15日发明者H·L·A·詹森,M·波佩斯库,N·普拉克申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司