专利名称：用于提高功能性血管完整性、细胞存活和在脑中局部缺血或者局部缺血发作后减少程序 ...的制作方法
用于提高功能性血管完整性、细胞存活和 在脑中局部缺血或者局部缺血发作后 减少程序性细胞死亡的组合物和方法发明领域本发明涉及哺乳动物营养和其增强血管完整性和保护免于与脑中局部 缺血或者局部缺血发作有关的细胞损伤的作用。具体地，本发明利用一氧 化氮释放化合物、长链多不饱和脂肪酸和任选地包括抗氧化剂、抗炎剂、生长因子和B族维生素的其他成分的组合，其作为普通膳食的一部分施用， 以提高血管完整性、促进细胞存活和从而减轻脑和/或其他器官中的局部缺 血损伤，例如，脑局部缺血中的损伤。发明背景在本说明书中全文引用多种出版物，包括专利、公布的申请、技术文 章和学术文章。将这些引用的出版物每个都完整引入本文作为参考。由于流向脑的血流的暂时或者永久减少或者停止引起对脑的氧供应减 少，发生低氧局部缺血脑损伤。脑的局部缺血导致中风，与随后脑组织的 程序性细胞死亡和坏死，导致梗塞。类似于心血管局部缺血，脑局部缺血 可以由多种因素引起，如血块、血栓形成、栓塞、动脉粥样硬化斑块的阻 塞，或者脉管系统中的其他阻塞。已经将高胆固醇血症、高血压、糖尿病 和肥胖症等因素鉴定为局部缺血性中风的危险因素。局部缺血性中风是世 界上人类死亡的主要因素，并且也侵袭其他动物，包括陪伴动物。还已知局部缺血损害显著促进脑老化和痴呆。痴呆是影响老年人口的 主要疾病。痴呆的发病率从60到64岁人中约0.3到1%增加到95岁以上 人中的50 % ，每5年发病率加倍(McDowell， I" Aging (Milano) 13: (2001)143-162)。在西方人口中，认为阿尔茨海默氏病(AD)是痴呆的主要形式， 而血管性痴呆(VD)似乎是东方人口中的主要形式(Fratiglioni， L.等人， Drugs Aging (1999) 15: 365-375; Ott， A.，等人，The Rotterdam Study, BMJ (1995) 310: 970-973)。不断增长的证据表明血管性痴呆和阿尔茨海默 氏病通常共存于具有痴呆的群体中。例如，Kalaria (Neurobiol. Aging (2000) 21: 321- 330)报导约90 %的AD患者具有脑血管病理，约30 %的VD 患者具有AD病理。脑血管损害和AD共存于痴呆的老年人中被Snowdon 等人(JAm. Med. Soc. (1997) 277: 813-817)证实。此外，确定AD的病理 学诊断的标志(淀粉状蛋白沉积，和神经原纤维缠结)存在于非痴呆的老年 人中(Snowdon等人，1997，同上)。这些数据表明淀粉状蛋白沉积，和神经 原纤维缠结不足以在AD患者中引起痴呆，强调了脑局部缺血损伤对脑老 化和VD和AD的发生和进展的显著作用(Korczyn, A. J. Neurol. Sci. (2005) 230: 3-6)。因此，预防人类和动物中局部缺血诱导的脑损害和神经元程序 性细胞死亡可以延迟脑老化，减小认知损害的风险，和延迟痴呆的进展。局部缺血可以发生于任一组织中，但是最通常与脑、心脏或肾脏损害 有关。如上文讨论的，脑中的局部缺血可以引起急性损害，如中风，或者 慢性损害，如痴呆和相关的病症。在心脏中，局部缺血发作可以导致心力 衰竭；同样，肾衰竭可以由肾中的局部缺血事件引起。在脑或任何其他组织的局部缺血性中风或发作期间，脉管系统中发生 生物化学反应，其可以导致水肺、出血性转变，和受侵袭的组织的进一步 损害，如神经系统损害。同样，已经鉴定脉管系统的治疗和保护为探索急 性局部缺血性中风以便开发新的疗法的潜在途径。此外，血管保护涉及减 小由于局部缺血发作引起的组织损害。已经确定血管内皮发挥多种调节功能，包括通过保持非粘连的、抗血 栓形成表面而调节血管紧张度、炎症和内稳态(Boak， L.，等人Cur. Vase. Pharmacol. (2004) 2:45-52)。血管内稳态部分是血管平滑肌收缩和松弛的功 能，其受到多种因子的影响，所述因子包括自由基一氧化氮(NO)，其是血 管平滑肌的强烈松弛剂。NO由三种不同的NO合酶(NOS)产生，所述NO合酶为神经元 NOS(nNOS)，其主要位于神经组织中并且产生用于神经传递的NO;可诱 导的NOS(iNOS)，其主要发现于巨噬细胞中并且可以应答促炎介体；和内 皮NOS(eNOS),其由内皮细胞如在血管内皮中发现的内皮细胞产生 (Michel, T"等人J. Clin. Invest. (1997) 100: 2146-2152， Moncada， S"等 人Pharmacol. Rev. (1991) 43:109-142，和Nathan, C. (1992) FASEB J 6: 3051-3064)。 eNOS释放的NO在血管舒张、平滑肌增殖、动脉血压的调节 中具有主要作用，并且通过抑制血小板和白细胞附着和聚集而具有抗凝和 抗炎作用(Gewaltig， M. T"等人Cardiovasc. Res. (2002) 55:250-260， De Graaf， J.C.等人Circulation (1992) 85:2284-2290， Freedman, J.E.，等人 Circ. Res. (1999) 84:1416-1421， Furchgott, R.F.,等人FASEB J (1989) 3:2007-2018， Gaboury, J"等人Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. (1993) 265: H862-H867,和，Kubes, P.，等人Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88: 4651-4655)。在延长的局部缺血期间NO产生的减少与内皮损伤有关 (Laude，L.，等人Braz. J. Med. Biol. Res. (2001) 34:1-7)。NOS酶将L-精氨酸氧化为瓜氨酸，导致形成作为副产物的NO。从而，已经提出补充NO前体如L-精氨酸可以提高血管健康，并且可以促进血管疾病状态的修复。实际上，已经表明饮食精氨酸补充诱导血管舒张的恢 复和提高动物模型和具有高胆固醇血症的人类患者中的冠状动脉循环，以及增强具有冠状动脉病的患者中的总体内皮功能(Boak，L.，等人2004)。此 外，还已经表明L-精氨酸补充提高NO水平和减轻人类患者中02自由基 介导的心肌损伤(Kiziltepe，U.，等人Int. J. Cardiol. (2004) 97:93-100)。最 近的研究已经表明精氨酸补充促进诱导的肠局部缺血-再灌注后大鼠肠中 的内皮修复(Sukhotnik， I"等人，Pediatr. Surg. Int. (2005) 3:191-196)。从 而，施用NO前体如L-精氨酸涉及内皮细胞活化和保护，特别是血管内皮 细胞的活化和保护。已经表明脂肪酸调节内皮细胞活化。发现施用长链多不饱和脂肪酸 (LCPUFA)抑制淋巴细胞对血管内皮细胞的黏附(Khalfoun， B.，等人Transplantation (1996) 62: 1649-1657)。随后的研究确定施用LCPUFA减 小了粘附分子和细胞因子应答刺激的内皮细胞表达，提示LCPUFA具有抗 动脉粥样硬化和抗炎性质(De Caterina， R.,等人Am. J. Clin. Nutr. (2000) 7l(suppl)2l3S_223S)。很多证据表明经常消费LCPUFA,尤其n-: 脂肪酸 保护心血管系统，减小动脉粥样硬化斑块形成，和减小心血管疾病，尤其 心肌梗塞后的死亡危险(Calder， P. C. Clin. Sci (Lond). 2004 107: l画ll)。相 比，对于膳食LCPUFA对脉管系统和脑组织，尤其脑中局部缺血发作的影 响的研究很少。长久以来已经知道氧化性应激和损害涉及老化过程。已经确立氧化性 应激在许多神经变性疾病的病理发生中起作用，所述疾病包括阿尔茨海默 氏病和某些形式的痴呆(例力p ， Smith, M.A.， Dementia & Geriatric CognitiveDisorders(1999)， Vol. lO，S叩p.l)。因此，已经用补充抗氧化剂来 延緩衰老过程和保护免于氧化性应激的变性作用。类似地，B族维生素叶 酸、维生素B6和维生素B12对于脑的健康和正常功能是重要的。这些维 生素的状态在老年人中经常不足，并且这些不足可以导致过高半胱氨酸血 症，其是动脉粥样硬化(Temple ME,等人，Ann Pharmacother 2000; 34: 57-65.; Hankey GJ，等人，Lancet 1999; 354:407-413)和阿尔茨海默氏病 (Clarke R,等人，Arch Neurol 1998 1449-1455)的最近鉴定的危险因素。 这些不足可以通过闭塞性血管病、中风或血栓形成导致脑或其他组织的局 部缺血。发明概述本发明的 一方面描述了组合物，其包含增强例如脑中的血管完整性和/ 或减小动物中程序性细胞死亡有效量的一种或多种长链多不饱和脂肪酸 (LCPUFA)和一种或多种一氧化氮释放化合物(NORC)。所述例如脑的增强 的血管完整性，和/或细胞存活用于在发生局部缺血发作的情况下减少组织 如脑中的局部缺血损伤，并且还可以对此类局部缺血事件的最初发生发挥 保护作用。在一些实施方案中，所述组合物是宠物食品组合物、饮食补充剂，或者^^皮配制用于人类消费的食品。在多种实施方案中，LCPUFA包括花生四 烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的至少一种，并 且NORC包括L-精氨酸或其衍生物的至少一种。所述组合物可以包含额 外的成分。例如，可以包括一种或多种抗氧化剂、B族维生素、细胞生长 因子，或者抗炎剂。在一些实施方案中，配制组合物用于陪伴动物，如狗或猫。在其他实 施方案中，配制所述组合物用于人类消费。本发明的另一方面描述了增强动物中血管完整性和/或减小局部缺血 诱导的脑损伤的方法，其包括对所述动物规则地施用组合物，该组合物包 含一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC，任选补充如上述的额外成 分，它们的量有效增强动物组织中的血管完整性和/或在动物脑中局部缺血 发作的情况下减小局部缺血诱导的脑损伤。在一些实施方案中，该方法应 用于陪伴动物，如狗或猫。在其他实施方案中，所述方法应用于人。在一些实施方案中，对所述动物规则地施用所述组合物导致在动物脑中发生局部缺血的情况下脑损伤的减轻，或者它导致动物中脑老化的延迟。 在另一实施方案中，对动物规则地施用该組合物导致在动物中发生局部缺 血的位置细胞程序性细胞死亡的减少，所述位置可以在任何组织中，包括 脑、心脏和肾。通过参考下面的附图、详细描述和实施例，本发明的其他特点和优点 将变得显而易见。附图简述图l.条形图，显示了对照和试验^:食对受到暂时大脑局部缺血的所有 大鼠中局部缺血损伤体积的影响。在实施例l中描述了对照和试验饮食的组成(*相对于对照p<0.01)。图2.条形图，显示了对照和试验々欠食对暂时大脑局部缺血后显示出损伤的大鼠中局部缺血损伤体积的影响。在实施例l中描述了对照和试验^:9食的组成(*相对于对照p<0.01)。图3.条形图，显示了对照和试验饮食对大鼠中大脑局部缺血诱导的程序性细胞死亡的影响。在实施例i中描述了对照和试验^:食的组成(*相对于对照p<0.001)。图4.曲线图，显示了局部缺血损伤体积(X轴)与如通过受到暂时大脑 局部缺血的大鼠中TUNEL染色(Y轴)定义的凋亡细胞百分数(Y轴)之间的 相关性。在实施例1中描述了对照和试验^:食的组成。阐明性实施方案详述 定义在说明书和权利要求书全文中使用涉及本发明的方法和其他方面的多 种术语。除非指出相反，此类术语以它们在本领域中的普通含义给出。其 他特别定义的术语将以它们在本文提供的定义一致的方式理解。下面的缩写可以用于说明书和实施例中AA，花生四烯酸；ALA， a-亚麻酸；ANOVA,方差分析；DHA， 二十二碳六烯酸；DM,干物质； DPA， 二十二碳五烯酸；EPA， 二十碳五烯酸；LA，亚油酸；LCPUFA， 长链多不饱和脂肪酸；NORC， 一氧化氮释放化合物；L-Arg， L-精氨酸。在该说明书的上下文中，将术语"约，，解释为任选加上或减去20%;更 优选地任选加上或减去10 % ;甚至更优选地任选加上或减去5 % ;最优选 地任选加上或减去2 % 。"有效量"指如本文所述的化合物、材料或組合物的有效实现特定生物 学结果的量。此类结果包括，但不限于，增强血管完整性或者减小局部缺 血性脑损伤。此类有效活性可以例如，通过对动物施用本发明的组合物来 实现。术语"血管完整性，，指动物中血管的总体健康，包括但不限于，健康的 血管紧张度和结构、健康的血管生长、健康的收缩和扩张、减小的通透性、 减小的增生、减小的炎症、减小的细胞和/或血小板粘附、正常血压和血流 的保持，等等。"增强的血管完整性，，指如通过本领域任何合适的方法测量的，动物中血管的总体健康的任何改善。如本文所用的，"长链多不饱和脂肪酸"或者"LCPUFA"指任何一元羧 酸，其具有至少20个碳原子和至少两个双鍵。LCPUFA的非限制性实例 包括(n-6)脂肪酸，如花生四烯酸和(n-3)脂肪酸，如二十碳五烯酸、二十二 碳五烯酸和二十二碳六烯酸。如本文所用的，"一氧化氮释放化合物"或者"NORC"指引起动物中释 放游离一氧化氮的任何化合物。此类化合物的优选实例包括L-精氨酸和 L-精氨酸的类似物或者衍生物，如精氨酸a-酮戊二酸、GEA3175、硝普钠、 三硝酸甘油酯、S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺、硝酸甘油、S-NO-谷胱甘肽、 NO-共轭的非类固醇抗炎药物，如NO-萘普生、NO-阿司匹林、NO-布洛芬、 NO-双氯芬酸、NO-氟比洛芬和NO-酮洛芬、NO-释放化合物-7、 NO-释 放化合物-5、 NO-释放化合物-12、 NO-释放化合物-18、 二醇二氮烯 镥(diazeniumdiolates)和其衍生物、二乙胺NO-亲核复合体(NONOate)，或 者任何有机或无机化合物、生物分子、或其类似物、同系物、缀合物或衍 生物，其在动物中引起释放游离一氧化氮。"局部缺血，，指脉管组织的任何收缩或阻塞引起的对任何身体器官、组织或部分的血液供应的任何减少或停止。"局部缺血发作"指局部缺血的任 何暂时或永久期间。"脉管组织，，指动物身体中任何血管网络，血管包括但不限于动脉、静 脉和毛细血管。"血管内皮细胞"或"血管内皮，，指这样的细胞，其包含薄的扁平细胞层， 所述细胞内衬在血管的内表面，在管腔中的循环血液和血管壁剩余部分之 间形成界面。本发明涉及任何动物，优选哺乳动物，更优选陪伴动物，最优选人。"陪 伴动物，，是任何驯养的动物，并且包括但不限于，猫、狗、兔、豚鼠、白鼬、 仓鼠、小鼠、沙鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、驴、猪等等。如本文所用的，术语"宠物食品，，或者"宠物食品组合物"指预期由动物， 优选由陪伴动物摄入的组合物。"完全和营养平衡的宠物食品"是这样的食品，其含有基于陪伴动物营养领域公认的权威推荐的合适量和比例的所有 已知需要的营养，并且因此能够作为膳食摄入的唯一来源以维持生命或者 促进生产，而不用加入补充营养来源。营养平衡的宠物食品组合物是本领 域/^知和广泛^f吏用的。如本文所用的，"饮食补充剂"是除了动物的正常饮食之外意在被摄入 的产品。如本文使用的，"配制用于人消费的食品，，是意在由人类摄入的任何组 合物。描述本发明人已经观察到在狗中补充精氨酸以剂量依赖性方式增加了多种生长因子和抗炎蛋白质的表达。许多此类因子，包4舌NGF、 nIGF和BDNF 发挥有效的神经元保护作用(Mattson， MP等人Neurobiol. Aging. (2002) 23:695-705，和Kruttgen， A.等人Proc. Natl. Acad Sci USA (1998) 95:9614-9619)。在狗的进一步研究中，使用精氨酸的天然来源，包括绯粉(含 有富含LCPUFA的鱼油)，发明人发现与使用纯L-精氨酸观察到的相等或 比其更好的应答。如本文的实施例中详述的，在卵巢切除的大鼠模型中暂 时大脑局部缺血的功能研究表明含有L-精氨酸、鱼油、抗氧化剂和B族维 生素的组合的膳食显著减轻了脑损伤和程序性细胞死亡，与含有仅仅精氨 酸或鱼油的膳食相比更是如此。因此，本发明的多方面通过提供膳食组合 物和方法利用这些发现来提高动物的血管完整性和减轻动物中局部缺血中 的局部缺血损伤，例如，动物的脑局部缺血情况下的脑损伤。预期膳食组合物在多种局部缺血情况下是有效的，所述情况包括但不 限于，脑老化(中风和轻微中风)和相关的病症、局部缺血心脏事件、被诱 导的局部缺血和再灌注手术(手术前和手术后施用)、糖尿病诱导的外周局 部缺血，以及作为绝经后雌激素治疗的备选方案来减小绝经后妇女中中风 和心血管疾病的风险。在多种实施方案中，本发明的组合物和方法应用多组分方法以提高功能血管完整性、在局部缺血发生后减小程序性细胞死亡和增强细胞存活。这些组分包括(l)增强血管完整性和功能，(2)增强细胞修复，(3)提高抗炎效 果(4)优化细胞代谢，和(5)减小氧化性应激。组合物本发明的一方面描述了包含有效增强动物中血管完整性的一种或多种 长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)和一种或多种一氧化氮释放化合物 (NORC)的组合物。LCPUFA和NORC可以在该组合物中作为一种成分或 添加剂存在。在组合物的优选实施方案中，LCPUFA包含至少一种(n-3) 脂肪酸，如ALA、 EPA、 DPA和DHA,并且NORC包含至少一种L-Arg 和其衍生物。组合物使得该組合物被施用的动物的血浆中富含LCPUFA和 NORC。本发明的组合物可以包括多种额外的组分，其用于提供多组分方法以 提高血管完整性和增强局部缺血中的细胞存活，如上面所述。这些组分包 括抗氧化剂、B族维生素、生长因子和抗炎剂。在一个优选实施方案中，本发明的组合物是宠物食品组合物。这些将 有利地包括预期提供必要的膳食需要，以及处理(例如饼干类)或其他膳食 补充剂的食品。任选地，宠物食品组合物可以是干燥组合物(例如，粗磨食 物)、半潮湿组合物、湿润组合物，或其任一混合物。在另 一优选实施方案中，本发明的组合物是经配制用于人类消费的食补充剂的食品和营养品。在详述的实施方案中，经配制用于人类消费的食 品是完全的和营养上平衡的。在另一优选实施方案中，组合物是饮食补充剂，如肉汤、饮用水、饮 料、液体浓缩剂、酸奶酪、粉剂、粒剂、糊剂、混悬剂、咀嚼剂、morsel、 treat、零食、弹丸剂、丸剂、胶嚢剂、片剂，或者任何其他递送形式。还 可以特别配制饮食补充剂用于具体动物如陪伴动物或者人的消费。在一个 详述实施方案中，饮食补充剂可以包含高浓度的LCPUFA和NORC,使得可以将该补充剂以小量施用于动物，或者备选地，可以在施用于动物前 稀释。饮食补充剂可以需要在施用于动物前与水混合。可以将组合物冷冻。可以将LCPUFA和NORC与组合物的其他组分 预先混合以提供所需的有益量，可以被涂布在宠物食品组合物、饮食补充 剂或者经配制用于人消费的食品上，或者可以在提供给动物前加入组合物， 例如使用粉剂或混合物。本发明的组合物包含有效增强施用该组合物的动物中的血管完整性的 LCPUFA和NORC。对于宠物食品和经配制用于人类消费的食品，作为组 合物百分比的LCPUFA的量基于干重为组合物的约0，1%到约13%的范围 内，尽管可以提供更大的百分比。在多种实施方案中，所述量基于干重为 组合物的约0.1%、 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%、 0.7%、 0，8%、 0.9%、 1.0o/o、 l.l0/o、 1.2°/o、 13°/o、 1.4°/o、 1.50/0、 1.6°/0、 1.70/o、 1.8°/0、 1.9°/o、 2.0%、 2.1%、 2.2%、 2.3%、 2.4%、 2.5%、 2,6%、 2.7%、 2.8%、 2.9%、 3.0%、 3.1%、 3.2%、 3.3%、 3.4%、 3.5%、 3.6%、 3.7%、 3.8%、 3.9%、 4.0%、 4.1%、 4,2%、 4,3%、 4,4%、 4.5%、 4，6%、 4,7%、 4,8%、 4.9%、 5.0%，或以上，如6%、 7%、 8%、 9%、 10%、 11%、 12%、 13%或以上， 并且作为组合物百分比的NORC的量基于干重为组合物的约0.1%到约 12%的范围内，尽管可以提供更大的百分比。在多种实施方案中，所述量基于干重为组合物的约0.1%、0.2%、03%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、 0.9%、1.0%、 1.1%、1.2%、1.3%、 1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、 1.9%、2.0%、 2.1%、2.2%、2.3%、 2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、 2.9%、3.0%、 3.1%、3.2%、3.3%、 3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、 3.9%、4.0%、 4.1%、4.2%、43%、 4.4%、4,5%、4.6%、4.7%、4.8%、 4.9%、5.0%，或以上，例如，6%、 7%、 8%、9%、10%、11%、12%或以上。在特定实施方案中，利用2-2.5% LCPUFA和2-2.5%纯的 L-精氨酸。可以配制々欠食补充剂以含有几倍更高浓度的LCPUFA和 NORC，以适于以片剂、胶嚢剂、浓缩液体或者其他相似的剂型施用于动 物，或者在施用前稀释，如通过用水稀释、喷雾或者喷洒到宠物食品上，和其他相似的施用方式。在备选实施方案中，组合物中LCPUFA和NORC的量为在动物的血 清中建立特定浓度的LCPUFA和NORC所需的量的函数。如本领域技术 人员将理解的，可以通过测定喂饲上述推荐量的LCPUFA和NORC的动 物的血清水平来计算血清中LCPUFA的特定浓度。每种LCPUFA的来源可以是任何合适的合成的或天然来源。LCPUFA 的优选来源包括但不限于，报春花、墨绿色蔬菜，如菠菜、藻类和蓝绿藻， 如螺旋藻，植物种子和油，如亚麻子、油菜、大豆、核桃、西葫芦、红花、 芝麻、小麦胚、向日葵、玉米，和大麻，和鱼，特别是冷水鱼，如鲑鱼、 金枪鱼、鲭、绯、黑鲈、海鲈、鲨鱼、大比目鱼、鯰鱼、沙丁鱼、虾，和 蛤，和它们的提取油，或者可以根据本领域中任何合适的方法从头合成 LCPUFA。每种NORC的来源可以是任何合适的合成或天然来源。精氨酸的优选 来源包括但不限于，动物和植物蛋白。尤其富含精氨酸的植物的非限制性 实例包括豆类，如大豆、羽扇豆，和长豆角，谷类，如小麦和稻，和水果， 如葡萄。种子和坚果如可可和花生也富含精氨酸。尤其富含精氨酸的动物 蛋白的非限制性实例包括家禽和鱼产品。可以根据本领域中任何合适的方 法从头合成或者由商业来源提供NORC。本发明的组合物可以任选包含补充物质，如矿物质、维生素、盐、调 味品、色素和防腐剂。补充性矿物质的非限制性实例包括钙、磷、钾、钠、 铁、氯化物、硼、铜、锌、镁、锰、碘、硒等等。补充维生素的非限制性 实例包括维生素A、各种B族维生素、维生素C、维生素D、维生素E和 维生素K。额外的々欠食补充剂还可以包括例如，烟酸、泛酸、菊粉、叶酸、 生物素、氨基酸，等等。本发明的组合物可以任选包含一种或多种补充物质，其促进或维持血 管健康，或者进一步增强血管完整性或细胞存活。此类物质包括，但不限 于， 一种或多种长春西汀、辅酶Q1()、磷脂酰丝氨酸、乙酰基-L-肉碱、a-石克辛酸、提取物，如越桔(Vaccinium myrtilis),或者抗氧化剂，包括生育酚类、生育三烯酚类、类胡萝卜素类，如a和p胡萝卜素、番茄红素、叶 黄素、变胞藻黄素、玉米黄素和黄酮类化合物，如黄烷醇、黄烷酮、黄酮、 黄烷-3-醇类(儿茶酚)、花青苷，和异黄酮类(异黄酮)，等等，以及抗炎剂和 生长因子(尤其应用于促进细胞存活)，如本领域技术人员将理解。在多种实施方案中，本发明的宠物食品或者饮食补充剂可以包含基于 干物质，按组合物的重量计约15%到约50%粗蛋白。粗蛋白材料可以包含 植物蛋白，如大豆、棉籽和花生，或者动物蛋白，如酪蛋白、白蛋白和肉 蛋白。本文所用的肉蛋白的非限制性实例包括猪肉、羔羊、马、家禽、鱼 和其混合物。组合物可以还包含基于干物质，组合物重量的约5%到约40%脂肪。 组合物可以还包含糖类来源。组合物可以包含基于干物质，组合物重量的 约15%到约6t)o/。糖类。此类糖类的非限制性实例包括谷类或粮食，如稻、 玉米、高粱、紫花苜蓿、大麦、大豆、油菜、燕麦、小麦，和其混合物。 组合物还可以任选包含其他物质，如干燥的乳清和其他乳品副产品。组合物还可以包含至少一种纤维来源。如本领域技术人员将知道的， 可以利用多种可溶或不溶纤维。纤维来源可以是甜菜浆水(来自甜菜)、阿 拉伯树胶、talha胶、蚤草、米糠、长角豆胶、柑桔浆、果胶、低聚果糖以 及短链寡果糖、寡甘露果糖、大豆纤维、羽扇豆纤维、阿拉伯半乳聚糖、 半乳寡聚糖、阿拉伯木聚糖，或者其混合物。备选地，纤维来源可以是可 发酵的纤维。以前已经描述可发酵的纤维为陪伴动物的免疫系统提供益处。 本领域技术人员已知的提供用于增强肠内益生微生物的生长的益生組分的 可发酵纤维或其他组合物也可以被掺入到该组合物中以帮助增强本发明所 提供的对动物免疫系统的益处。此外，也可以向组合物中加入例如益生微二 生物，如乳杆菌或双歧杆菌物种。在详述的实施方案中，组合物可以是完全的或者营养平衡的宠物食品。 在该上下文中，宠物食品可以是湿润食品、干燥食品或者中等水分含量的 食品，如宠物食品配制和生产领域技术人员将认识到的。"湿润食品"描述 这样的宠物食品，其通常以罐头或箔袋出售，并且水分含量通常为约70 0/0到约90%。"干燥食品，，描述这样的宠物食品，其具有与湿润食品相似的组 成，但是含有有限的水分含量，通常为约5%到约15%,并且因此例如作 为小的饼干样粗磨食物提供。可以为成年动物，或者为老年或年幼动物特 别配制组合物和々欠食补充剂，如"狗食，，(puppy chow)、"猫食"(kitten chow) 或者"老年"(senior)制剂。通常，专门的制剂将包含适于不同发育阶段或年 龄动物的能量和营养需要。本发明的某些方面优选与完全和平衡的食品组合使用(例如，如国家研 究委员会(National Research Council), 1985，狗的营养需要(Nutritional Requirements for Dogs), National Academy Press, Washington D. C，或美 国官方饲料4空制切、会(Association of American Feed Control Officials), Official Publication 1996中所述)。即，根据本发明的 一些方面的包含 LCPUFA或DHA的組合物优选与高质量商业食品一起使用。如本文所用 的，"高质量商业食品，，指被生产以产生80%或以上的关键营养物消化率的 饮食，如在上面国家研究委员会对狗的推荐中所给出的。类似的高营养标 准将用于其他动物。技术人员将理解怎样确定将加入给定组合物中的合适量的LCPUFA 和NORC。可以考虑的此类因素包括组合物类型(例如，宠物食品组合物、 饮食补充剂，或经配制用于人类消费的食品)、不同动物对特定类型组合物 的平均消耗，和该组合物的生产条件。优选地，基于动物的能量和营养需 要计算将加入组合物的LCPUFA和NORC的浓度。根据本发明的一些方 面，LCPUFA和NORC可以在组合物的生产和/或加工的任何时候加入。 这包括但不限于，作为宠物食品组合物、饮食补充剂，或者经配制用于人 类消费的食品的制剂的部分，或者作为应用于宠物食品组合物、饮食补充 剂，或者经配制用于人类消费的食品的涂层。可以根据本领域中任何合适的方法制备组合物，所述方法为如Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney， A. Rainbird撰 写的章节，标题为"A Balanced Diet" ， 57到74页(Pergamon Press Oxford)中所述。方法本发明的另一方面描述了增强动物中血管完整性和/或促进细胞存活 的方法，其包括对该动物施用组合物，该组合物包含有效增强动物中血管完整性和/或促进细胞存活的量的一种或多种LCPUFA和一种或多种 NORC。本发明的再一方面描述了减轻动物的脑或其他组织的局部缺血诱 导的损伤的预防方法，其包括对该动物规则地施用组合物，该组合物包含 有效减轻例如对脑的局部缺血诱导的损伤(例如动物中局部缺血发作，动物 脑中局部缺血发作)的量的一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC。在本发明的两个上述方面任一方面的详述实施方案中，组合物是如本 文示例的宠物食品组合物、々大食补充剂，或者经配制用于人类消费的食品。 在进一步详述的实施方案中，LCPUFA是一种或多种(n-3) LCPUFA,包 括但不限于EPA、 DPA和DHA，并且NORC是一种或多种L - Arg和其 衍生物。动物可以包括如上述的任一种驯养的或者陪伴动物，或者可以包 括人。在一些实施方案中，动物是陪伴动物，如狗或猫。在另一实施方案 中，动物是人。可以通过多种备选施用途径的任一种对动物施用组合物。此类途径包 括，但不限于，经口、鼻内、静脉内、肌内、胃内、经幽门、皮下、经肠 途径，等等。优选地，经口施用组合物。如本文使用的，术语"经口施用，， 或"口服施用，，指动物摄入，或者人被指导而食用或者食用 一种或多种本文 所述的发明组合物。当人被指导而食用组合物时，此类指导可以是教导和/或通知人使用该 组合物可以和/或将提供所提及的益处，例如，增强动物中血管完整性或者 动物中的细胞存活，防止或延迟脑老化或者局部缺血发作，减少局部缺血 诱导的损伤，例如，对脑、心脏或其他组织的损伤，在局部缺血发作的情 况下保护免于局部缺血相关的伤害，例如，在再灌注手术、糖尿病诱导的 外周局部缺血等情况下，如上述。此类指导可以是口头指导(例如，通过如 医生、兽医，或者其他健康专业人员的口头指导，或者收音机或电视媒体(例如，广告)，或者书面指导(例如，通过如医生、兽医，或者其他健康专业 人员的书面指导(如处方)，销售专业人员或組织的书面指导(例如，通过销 售手册、小册子，或者其他指导性附件)，书面媒介(如因特网、电子邮件 或者其他计算机相关的媒介)，和/或与组合物相关的包装(例如，存在于容 纳组合物的容器上的标签)。施用可以是基于需要或基于希望，例如， 一月一次、 一周一次、每天 一次，或者高于每天一次。类似地，施用可以为每两天、两周、或两月一 次，每第三天、三周或三月一次，每第四天、四周或四月一次，等等。施 用可以为每天多次。当用作普通饮食需要的补充物时，可以将组合物直接 施用于动物或者与每天的饲料或食物接触或混合。当用作每天饲料或食物 时，施用将是本领域技术人员公知的。施用还可以以规则的基础进行，例如，作为动物的饮食方案的一部分。 饮食方案可以包括引起动物规则地摄入组合物，其包含增强血管完整性或 者在动物中局部缺血发作的情况下减小对脑的局部缺血诱导的损伤有效量的一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC。规则摄入可以是每天一次， 或者每天两次、三次、四次或多次，以每天或每周为基础。类似地，规则 施用可以每两天或两周一次、每三天或三周一次、每四天或四周一次、每 五天或五周一次、或每六天或六周一次，并且在此类饮食方案中，施用可 以是每天多次。规则施用的目标是为动物提供优选的日剂量的LCPUFA和 NORC，如本文示例。才艮据本发明的方法，包含一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC 的组合物的施用，包括作为饮食方案的一部分的施用，可以跨越从摄入直 到动物的整个寿命的时间范围。提供下面的实施例用于更详细地描述本发明。它们意在阐明而不是限 制本发明。实施例117卩-雌二醇或者具有精氨酸、鱼油或组合的饮食补充剂对卵巢切除的大鼠模型中暂时脑局部缺血引起的脑损伤的作用将17P-雌二醇(E2)的长期治疗与含有精氨酸、鱼油形式的LCPUFA或 者其组合的三种试验饮食分别比较它们对卵巢切除的大鼠模型中暂时脑局 部缺血引起的脑损伤的作用。方法动物.将雄性 Charles Rivers Sprague画Dawley 大鼠(250g， Wilmington, MA)在手术前适应动物设施三天，使用12小时光暗周期。在 饮食喂饲开始前2周进行双侧卵巢切除术。开始饮食喂饲后4周，腹膜内 (i.p.)注射氯胺酮(60mg/kg)和曱苯瘗唤(l 0 mg/kg)后在麻醉下进行暂时大脑 中动脉(tMCA)闭塞。^L食和激素施用.将每组14到15只大鼠随机分配到五个治疗组之一。 这些组如下组1对照饮食(白色饮食)组2对照饮食+ SILASTIC⑧雌二醇植入物1周(白色+ E2) 组3饮食I(粉色饮食) 组4饮食II(紫色饮食) 组5饮食III(灰色饮食)对照饮食为标准大鼠饮食，其含有140 g/kg酪蛋白、100g/kg蔗糖、 50g/kg纤维、155g/kg糊精、466 g/kg玉米淀粉、35 g/kg标准盐混合物、 40g/kg大豆油、10 g/kg标准维生素混合物、1.8 g/kg L-胱氨酸和2.5 g/kg 氯化胆碱。所有三种试验饮食(饮食I、 II和III)都补充(l)额外的B族维生 素，包括45mg/kg烟酸、35mg/kg泛酸、24mg/kg吡哆醇、15 mg/kg硫 胺、9 mg/kg核黄素、3 mg/kg叶酸、0.8 mg/kg生物素和0.225 mg/kg维 生素B12和(2)抗氧化剂混合物，其含有500 mg/kg维生素E、 150 mg/kg维 生素C、 100 mg/kg变胞藻黄素和0.4 mg/kg硒。饮食I还包括2 %精氨酸 (20g/kg)。饮食11还包括2%精氨酸和2%绯鱼油(20 g/kg)。饮食III还包 括2%绯鱼油。所有^:食无限制地喂养大鼠四周。每周更换食物一次。并且每周测定体重和食物摄入一次。诱导tMCA闭塞前一周，对组2大鼠以SILASTIC 弹丸剂中4mg/ml的剂量施用E2，所述弹丸剂被皮下植入。用该程序保护 脑免于多种损害和产生生理上相关水平的血清E2(Simpkins等人，1997; Jimg等人，20(B)。这是阳性对照，因为以前已经表明E2的该剂量和处理 时间导致保护免于tMCA闭塞的影响(Simpkins，等人，1997; Yang等人， 2004a，Yang,等人，2004b)。大脑中动脉闭塞和样品制备.通过腹膜内注射氯胺酮(60 mg/kg)和曱 苯噻嗪(10mg/kg)麻醉动物。如以前描述的(Simpkins等人，1997)使用微小 改动进行tMCA闭塞。简言之，通过中线颈切开暴露左颈总动脉、颈外动 脉和颈内动脉。将3.0单丝缝线引入颈内动脉腔中并轻轻地前进直到感觉 到阻力。在20分钟内以最小出血进行手术操作。缝线保持在原位60分钟， 然后退出以允许再灌注。在整个操作中监测直肠温度并用加热垫保持在 36.5到37。C之间。再灌注开始后24小时，处死动物并除去脑。然后将脑 用金属脑才莫子(ASI Instruments Inc.; Warren, MI)冠向切成2mm切片， 并通过氯化2，3，5-三苯基四唑错(TTC)在生理盐水中的2%溶液在37。C温 育，然后用10%福尔马林固定。用TdT介导的dUTP Nick-末端标记(TUNEL) MCA闭塞进行的DNA 片段化分析广泛用于局部缺血性中风模型(Bederson等人，1986)。该神经 元死亡的体内模型在许多神经元和其他细胞中可以快速诱导同步程序性细 胞死亡过程(Li等人，1997)。因此，通过用TUNEL测定法分析DNA片段 化检查暂时局部缺血对程序性细胞死亡的效果。根据改进的生产商使用说 明(Gavrieli等人，1992)进行TUNEL染色。将福尔马林固定的、石蜡包埋 的组织切片用二甲苯脱蜡，通过梯度乙醇处理再水化，并用PBS进行最后 的洗涤。将切片用4%低聚甲醛后固定20分钟。然后洗涤切片并用PBS 中的100ng/ml蛋白酶K处理15分钟，用平衡緩冲液平衡10分钟，然后 用含有TdT酶和FITC标记的dUTP (Promega， Madison， WI)的緩冲液在 湿润室中37。C温育。通过在2xSSC緩冲液中室温下温育15分钟终止反应。 然后将切片用含有DAPI的抗褪色试剂(Molecular Probes, Eugene, OR)封固。将阳性对照切片在室温下浸入DNase I溶液中10分钟，然后用TdT 緩冲液平衡。在荧光显微镜下以合适的激发/发射滤光器对观察切片。在该方案中， 一些动物被排出在研究之外。被定量其损伤体积的动物 数目为每组12到15 只。统计方法.使用Prism软件(Graphpad Inc; San Diego， CA)，用单向方 差分析法(ANOVA)分析结果。通过单向ANOVA，接着通过Tukey的多重 比较检验确定组间的差异显著性。所有值以平均值+ASEM表示。结果中风体积所有四种实验条件(雌二醇和饮食I、 II和III)都减小梗塞 大小(
图1)。雌二醇处理(组2)减小梗塞体积68%，这是雌激素对中风损害 保护的典型值(Simpkins，等人，1997; Fan等人，2003; Yang等人，2004a; Yang等人，2004b)。类似地，饮食II显著减小梗塞体积(67 % )。测试的两 种其他饮食也减小平均梗塞体积，但是数据差别太大而使得值不是统计学 显著的。因为每组都有观察不到损伤的大鼠(在我们的损伤体积计算中值为0), 所有在省去这些值后评估数据，以确定0值对组差异的贡献程度。如图2 中所示，使用该数据修饰，相同的两组显著低于对照饮食组。从而，组间 差异由观察到损伤的动物以及没有观察到损伤的动物数目引起。雌激素处 理和饮食的保护效果主要对皮质发挥作用，皮质是称作半影的脑区域，因 为认为半影是在实验性中风中"可拯救的"。这与称作梗塞核心的基底神经 节相反，基底神经节迄今在实验性中风中还不容易通过任何测试的处理拯 救。程序性细胞死亡.使用TUNEL染色进行程序性细胞死亡的评估以确 定雌二醇处理和三种试验々大食对应答实验性局部缺血的程序性细胞死亡应 答的影响。在完成该研究的所有动物中评估TUNEL染色的三个脑区域。 在大脑皮质的核心、大脑皮质的半影和下皮层的核心中，基于我们使用 TTC染色对受损的脑区域的评估(Wen等人，2004),进行TUNEL的评估。使用DAPI核计数器染色，将TUNEL阳性细胞数目对视野中细胞总数归 一化。计数来自所有三个脑区的切片并将每只动物的平均细胞数用于产生 组平均值。在来自最大程度脑梗塞的切片中随机选择的显微镜视野(320 fui^切片)中进行细胞计数，如通过TTC染色测定。TUNEL染色在对照动 物的所有三个脑区域中都是广泛的。当进行所有五个处理组的比较时，在 每个脑中TUNEL染色与使用TTC染色以定量损伤体积所发现的结果相关 (图3)。即，在E2处理的动物以及喂饲饮食II的动物中都有TUNEL染色 的显著减小。喂饲饮食I和III的动物介于对照和饮食II动物之间。该TTC 染色和TUNEL染色之间的相关性在图4中描绘。激素和饮食对TUNEL 染色的影响的表征表明E2和饮食II对细胞死亡的大部分保护由程序性细 胞死亡的抑制所介导。结论所有三种试验饮食都减小了平均梗死体积以及TUNEL阳性细胞数并 且饮食II将这些参数减小到用已知的神经保护剂雌二醇观察到的水平。本发明不限于本文描迷的和上面示例的实施方案，而是能够在所附权 利要求的范围内改变和修饰。
权利要求
1.组合物，其包含有效增强动物中血管完整性的量的一种或多种长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)和一种或多种一氧化氮释放化合物(NORC)。
2. 权利要求l的组合物，其中所述组合物是宠物食品组合物、饮食补 充剂(其中LCPUFA和NORC各自在0.5到10g/天的范围内)，或者经配制 用于人类消费的食品。
3. 斥又利要求1或2的组合物，其中LCPUFA包括花生四烯酸、二十 碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的至少一种。
4. 前面权利要求任一项的组合物，其中NORC包括L-精氨酸或其衍 生物的至少一种。
5. 权利要求4的组合物，其中LCPUFA为按制剂的重量计至少约 0.1%到约13%的量，精氨酸为按制剂重量计至少约0.1%到约12%的量。
6. 权利要求5的组合物，其中LCPUFA以饮食制剂的约1 %到约3% 的量存在。
7. 权利要求5或6的组合物，其中NORC以饮食制剂的约1%到约3 %的量存在。
8. 前面权利要求任一项的组合物，其还包含约O.lmg到5g量的至少 一种抗氧化剂。
9. 前面权利要求任一项的组合物，其还包含约1到5xRDA量的B族维生素。
10. 前面权利要求任一项的组合物，其还包含用于促进细胞修复的至 少一种生长因子。
11. 前面权利要求任一项的组合物，其还包含至少一种额外的抗炎剂。
12. 前面权利要求任一项的组合物，其中所述动物是陪伴动物。
13. 权利要求12的组合物，其中所述陪伴动物是狗或猫。
14. 权利要求1到11任一项的组合物，其中所述动物是人。
15. 增强动物中血管完整性的方法，其包括对该动物规则地施用组合物，该组合物包含增强动物中血管完整性有效量的一种或多种LCPUFA和 一种或多种NORC。
16. 权利要求15的方法，其中所述组合物是宠物食品组合物、饮食补 充剂，或者经配制用于人类消费的食品。
17. 4又利要求15的方法，其中LCPUFA包括花生四烯酸、亚油酸、a-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的至少一种。
18. 权利要求15的方法，其中NORC包括L-精氨酸或其衍生物的至 少一种。
19. 权利要求18的方法，其中LCPUFA为按制剂的重量计至少约 0.1%到约13。/。的量，L-精氨酸为按制剂重量计至少约0.1。/。到约12%的量。
20. 权利要求15的方法，其还包含选自抗氧化剂、B族维生素、生长 因子和抗炎剂的至少一种额外组分。
21. 权利要求15的方法，其中所述动物是陪伴动物。
22. 权利要求21的方法，其中所述陪伴动物是猫或狗。
23. 权利要求15的方法，其中所述动物是人。
24. 权利要求15的方法，其中所述组合物对动物的规则施用在动物脑 中局部缺血发作的情况下，导致脑损害的减轻。
25. 权利要求15的方法，其中所述组合物对动物的规则施用导致动物 中脑老化的延緩。
26. 权利要求15的方法，其中所述组合物对动物的规则施用导致动物 中发生局部缺血的部位细胞程序性细胞死亡的减少。
27. 权利要求26的方法，其中局部缺血发生在选自脑、心脏和肾的组 织中。
28. 减轻动物中局部缺血诱导的脑损伤的方法，其包括对该动物规则 地施用组合物，该组合物包含在动物的脑中局部缺血发作的情况下减轻局 部缺血i秀导的脑损伤有效量的一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC。
29. 权利要求28的方法，其中所述组合物是宠物食品组合物、饮食补 充剂，或者经配制用于人类消费的食品。
30. 权利要求28的方法，其中LCPUFA包括花生四烯酸、二十碳五 烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的至少一种。
31. 权利要求28的方法，其中NORC包括L-精氨酸或其衍生物的至 少一种。
32. 权利要求31的方法，其中LCPUFA为按制剂的重量计至少约 0.1%到约13。/。的量，L-精氨酸为按制剂重量计至少约0.1%到约12%的量。
33. 权利要求28的方法，其中所述动物是陪伴动物。
34. 权利要求33的方法，其中所述陪伴动物是猫或狗。
35. 权利要求28的方法，其中所述动物是人。
36. —种或多种LCPUFA和一种或多种NORC在生产用于共同施用 以增强血管完整性的一种或多种药物中的用途。
37. 权利要求36的用途，其用于在脑中局部缺血发作的情况下减轻脑 损伤。
38. 权利要求36的用途，其用于延緩动物的脑老化。
39. 权利要求36的用途，其用于在动物中局部缺血部位减少细胞程序 性细月包死亡。
40. 权利要求39的用途，其中局部缺血发生在选自脑、心脏和肾的组 织中。
41. 一种或多种LCPUFA和一种或多种NORC在生产用于共同施用 以减轻动物中局部缺血诱导的脑损伤的一种或多种药物中的用途。
全文摘要
公开了用于增强动物中血管完整性的组合物和方法。利用长链多不饱和脂肪酸和一氧化氮释放化合物的组合物和方法在减轻动物中局部缺血诱导的脑损伤中也是有效的。
文档编号A61P9/10GK101247736SQ200680030641
公开日2008年8月20日 申请日期2006年8月25日 优先权日2005年8月26日
发明者B·拉尔森, 潘元龙 申请人:雀巢技术公司