专利名称：抗癌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以糖-胆甾烷醇化合物为有效成分的药品。
技术背景在胆固醇B环的双键为饱和的胆甾烷醇上结合GlcNAc-Gal-、 GlcNAc-Gal-Glc-、 Fuc-Gal-、 Gal-Glc-或Gal-后得到的糖-胆甾烷醇化合 物具有优异的抗肺瘤活性(参照专利文献l、 2和3)。这样的糖-胆齒烷醇化合物，从抗肿瘤活性来看糖链部分为2个以上 的化合物为主体，但是糖链数多的话，存在合成变得复杂，成本增加的 问题。另一方面，也报道了在糖部分仅具有半乳糖的化合物，但是在活 性方面仍没有满足。并且，糖-胆齒烷醇化合物还通常存在对水为不溶 性的问题。因此，期待着糖链数少且具有充分的抗肿瘤活性，并且溶解性优异 的糖-胆甾烷醇化合物。另一方面，在糖链部分具有N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)的胆甾 烷醇化合物是已知化合物(非专利文献1)，但其生物活性迄今为止没 有任何报道。专利文献1:特开平11-60592号公报 专利文献2:特开2000-191685号公报 专利文献3:国际公开第2005/007172号文本 非专利文献l: Studies on steroids. Part CXXXXV. Synthesis of conjugated cholesterol and cholestanols. (1979)， 27 (8)， 1926-31.发明内容本发明的目的在于提供一种简便地合成，并且具有充分抗肿瘤活性 的糖-胆齒烷醇化合物。糖-胆齒烷醇化合物，对糖链或者胆笛烷醇单独而言完全看不到抗肿 瘤活性，活性表达必须糖-胆甾烷醇化合物的整体结构，但是从结构活 性相关的角度出发，对糖链数或者种类进行类推是极其困难的。然而，本发明人等意外地发现，在糖部分仅具有GlcNAc的以下述式(1)表示 的胆甾烷醇化合物对癌细胞具有强的增殖抑制活性。并且，该胆齒烷醇 化合物的环糊精包合物、脂质体制剂能够弥补该化合物的不溶性的缺 点，并且在发挥上述活性方面是极其有效的。即，本发明涉及以下的发明。 l)一种抗癌剂，以下述式(l):<formula>formula see original document page 5</formula>所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物作为有效成分。2) —种脂质体制剂，含有上述胆甾烷醇化合物。3) —种包合物，是上述胆甾烷醇化合物的环糊精包合物。4) 上述胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物在制造抗癌剂中的应用。5) 癌的预防或治疗方法，其特征在于，给与上述胆甾烷醇化合物 或它的环糊精包合物。本发明的胆笛烷醇化合物由于具有优异的抗肿瘤活性，并且与以往 的糖-胆甾烷醇相比能够简便地合成，因此作为用于癌的预防或者治疗 的医药品是有用的。并且，该化合物的环糊精包合物、脂质体制剂溶解 性优异，且在发挥抗癌活性方面是极其有效的。
具体实施方式
本发明的胆齒烷醇化合物是已知化合物(前述非专利文献1 )，可以 通过例如以下的方法制备。<formula>formula see original document page 6</formula>即，可以通过4个步骤由4-甲氧苯基-3, 4， 6-三-0-乙酰基-2-脱氧 -2-苯二酰亚胺基-p-D-吡喃葡糖普制备本发明的胆甾烷醇化合物(参照 后述的制备例)。另外，本发明的胆甾烷醇化合物的糖链部分优选GlcNAcp-，因此 作为本发明的胆甾烷醇化合物，5-ot-胆甾烷-3 0-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-p-D-吡喃葡糖苷(la)是适合的。本发明的胆甾烷醇化合物可以容易地被环糊精类或者其衍生物包 合而形成复合体。由于考虑到与如下情况相关待包合的客体分子的直 径、或者环糊精与客体分子之间的范德华力、客体分子与来源于环糊精 的羟基之间的氢鍵，因此环糊精不是能够适合所有不溶性化合物的，但 环糊精能够与本发明的胆齒烷醇化合物形成良好的包合复合体。作为本发明的环糊精包合物中的环糊精，除了a-环糊精、P-环糊 精、Y-环糊精等环糊精类之外，还包括例如曱基-P-环糊精、2-羟丙基-P-环糊精、单乙酰基-P-环糊精、2-羟丙基-Y-环糊精等环糊精衍生物。 其中，从提高溶解性的角度出发，2-羟丙基-p-环糊精是适合的。这样的环糊精包合物可以通过如下方式进行配制例如，配制环糊精类或其衍生物的适当水溶液(例如20~40% )，向其中添加本发明的胆甾 烷醇化合物，进行搅拌。这里使用的胆甾烷醇化合物的浓度，只要是胆齒烷醇化合物能够与 环糊精形成包合物的浓度即可，通常是1~50质量％，优选是10 30质 量％左右。如此得到的环糊精包合物，对水为易溶性，因此能够在活体内高效 发挥效果。并且，还具有能够在体外试验体系中进行稳定的评价的优点。此外，本发明的胆甾烷醇化合物通过制成脂质体制剂，可以更有效 地到达作用表达部位。并且，还可以在体外试验体系中进行稳定的评价。这样的脂质体制剂优选是含有本发明的胆甾烷醇化合物、膜成分物 质以及脂肪族或芳香族胺的脂质体。相对于膜成分物质l摩尔，脂质体制剂中的胆甾烷醇化合物的含量 期望是0.3-2.0摩尔，优选0.8-1.5摩尔。作为膜成分物质，可列举磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等天然和合成的磷脂类以及它们的 混合物，除此之外可以优选使用水性卵磷脂等加工后的天然磷脂。更适 合地，可列举磷脂酰胆碱类的1 oc 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC )。脂肪族或者芳香族胺主要是为了使脂质膜表面带正电而添加的物 质。作为这样的胺，可列举硬脂胺、油胺等脂肪族胺；芴乙基胺等芳香 族胺，特别是，可以很好地使用硬脂胺。相对于膜成分物质(磷脂)1摩尔，优选含有该胺0.04-0.15摩尔， 优选0.1~0.15摩尔。根据需要，在该脂质体中除了上述物质以外还可以添加作为膜结构 稳定剂的胆固醇、脂肪酸、二乙酰磷酸酯(diacetyl phosphate)等。作为使膜成分分散的水溶液，优选使用水、生理盐水、各种緩冲液、 糖类的水溶液以及它们的混合物。作为緩冲液，无论是有机类、无机类， 可很好地使用在体液氢离子浓度附近具有緩冲作用的緩冲液，例如可列举砩酸緩冲液。脂质体的配制没有特别限定，可以使用通用的方法，例如可以依照特开昭57-82310号公报、特开昭60-12127号公报、特开昭60-58915 号公报、特开平1-117824号公报、特开平1-167218号公报、特开平 4-29925号公报、特开平9-87168号公报、Methods of Biochemical Analysis (1988) 33, p337或者"脂质体"(南江堂)中所记载的方法等。以下，显示本发明的胆甾烷醇化合物的脂质体化的顺序。首先，在本发明的胆甾烷醇化合物、上述膜成分物质以及脂肪族或 芳香族胺中添加有机溶剂和水进行混合后，用旋转蒸发器等将有机溶剂 完全去除，接着进行水分的去除。膜成分物质、烷基胺以及胆齒烷醇化合物的混合比例可以示例52 : 8:20(摩尔比)，只要是其近旁的混合比例就没有特别问题。胆甾烷醇化 合物的混合比例小时，可以根据需要添加以胆固醇为代表的膜结构稳定 剂，但如果该混合比例高，则未必一定添加膜结构的稳定剂。有机溶剂只要是对水为不溶性的挥发性有机溶剂就没有特别限制， 例如可以使用氯仿、氯曱烷、苯以及己烷等，当考虑到溶解性时，可以 使用适当添加了乙醇或者甲醇等较高极性的有机溶剂配制成的混合有 机溶剂。该混合有机溶剂和水的混合比例只要是形成均一的比例就没有 特别限制。此外，当添加水分进行配制时，作为水分去除法极为普遍地使用冻 干法，对其没有限定，还可以在减压干燥器中进行干燥。去除水分后， 添加上述分散水溶液，用涡流混合器等进行振荡，由此实现脂质体化。在使脂质体的尺寸一致时，通过例如超声波处理、采用多孔膜过滤 器的挤压处理、利用高压喷射乳化装置的处理或者将它们组合，可以使 尺寸均一化。此外，要想获得更小的脂质体颗粒，可以通过例如延长超 声波处理时间来实现。并且，作为脂质体的粒径，优选40nrn ~ 300nm。另 一方面，作为以上述脂质体制剂以外的方法使用本发明的胆甾烷醇 化合物的情况，可以根据各种给与方式列举各种稳定剂。本发明的胆甾烷醇化合物、其环糊精包合物、含有该胆甾烷醇化合 物的脂质体制剂(以下也称为"胆齒烷醇化合物等")如后述实施例所示，显示出远远强于在糖链部分具有GlcNAc-Gal-或Gal-的胆甾烷醇 化合物的细胞增殖抑制效果。因此，含有这些作为有效成分的制剂作为 用于癌的预防或者治疗的药品是有用的。本发明的抗癌剂可以根据治疗部位、治疗目的选择适当给药形式， 在脂质体制剂中，只要不使用损害其形状稳定性的添加剂等，就可以采 用例如口服剂、注射剂、栓剂、软骨剂、贴剂等的任何一种，可以利用 各种本领域技术人员公知惯用的制剂方法进行制造。在配制口服用固体制剂时，可以在向本发明的胆齒烷醇化合物等中 添加赋形剂、根据需要添加粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、 矫臭剂等后，根据常规方法制造片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶嚢 剂等。作为这种添加剂，是本领域通常使用的即可，例如作为赋形剂可 示例乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钓、高冷土、微晶纤维 素、硅酸等；作为粘结剂可示例水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、 淀粉溶液、明胶溶液、羧曱基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲 基纤维素、乙基纤维素、紫胶、磷酸钩、聚乙烯吡咯烷酮等；作为崩解 剂可示例干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷 基硫酸钠、单硬脂酸甘油酯、乳糖等；作为润滑剂可示例精制滑石、硬 脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等；作为矫味剂可示例白糖、橙皮、柠檬酸、 酒石酸等。在配制口服用液体制剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添 加矫味剂、緩冲剂、稳定剂、矫臭剂等，根据常规方法制备内服液剂、 糖浆剂、酏剂等。作为此时的矫味剂，上述列举的即可；作为緩沖剂可 列举柠檬酸钠等；作为稳定剂可列举黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶等。在配制注射剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加pH调 节剂、緩冲剂、稳定剂、等渗剂、局麻剂等，根据常规方法制备皮下、 肌内以及静脉内用注射剂。此时的pH调节剂和緩冲剂可列举杵檬酸钠、 醋酸钠、磷酸钠等。作为稳定剂可列举焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、 硫代乳酸等。作为局麻剂可列举盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。作为 等渗剂可示例氯化钠、葡萄糖等。在制备栓剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加本领域内 公知的制剂用载体，例如聚乙二醇、羊毛脂、可可脂、三脂肪酸甘油酯等，进一步根据需要添加Tween (注册商标)这类的表面活性剂等后， 根据常规方法进行制备。在制备软骨剂时，根据需要向本发明的胆甾烷醇化合物等中配合通 常使用的基剂、稳定剂、湿润剂、保存剂等，根据常规方法进行混合、 制剂化。作为基剂，可列举液体石蜡、白凡士林、白蜂蜡、辛基十二烷 醇、石蜡等。作为保存剂可列举过氧化苯曱酸甲酯、过氧化苯曱酸乙酯、 过氧化苯甲酸丙酯等。在制备贴剂时，根据常规方法向通常的支撑体上涂布前述软骨、乳 脂、凝胶、糊等即可。作为支撑体，由棉、人造纤维、化学纤维制成的 织布、无纺布；软质氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等膜或者发泡体片是适合 的。本发明的胆甾烷醇化合物等的给与量根据患者的症状、体重、年龄、 性别等而不同，不能一概而定，通常作为成人每天胆甾烷醇化合物(1) 的剂量，为约0.01 ~200 mg/Kg，优选为0.1 ~ 50mg/Kg即可，优选将 其1天一次或者分成2~4次左右给药。下面，根据实施例更具体地说明本发明。实施例制备例1 GlcNAc-胆齒烷醇的制备(1 )乙基國3， 4， 6-三画0-乙酰基國2-脱氧-2-苯二酰亚胺基國l画硫代-j3-D画 吡喃葡糖苷(化合物(2))的制备在氩气环境下，将4-甲氧苯基-3, 4， 6-三-0-乙酰基-2-脱氧-2-苯 二酰亚胺基-P-D-吡喃葡糖普(2g， 4.19mmo1)和乙硫醇(0.40mL， 5.45 mmol))的干燥二氯甲烷(30ml)溶液进行冰冷却，滴加三氟化硼乙醚 络合物(3.19mL， 25.14mmol)后，在室温下搅拌过夜。在水冷却下向反应 液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用硫酸钠干燥有机层，减压下蒸馏去除溶 剂，将残渣用乙酸乙酯-己烷进行重结晶，得到1.62g的标题化合物。性状白色粉末iH-NMR (CDC13) 5: 1.22 (3H, t， J=7.3Hz)， 1.86 (3H， s)， 2.04 (3H， s)， 2.11 (3H， s)， 2.61-2.76 (2H， m)， 3.90 (1H， ddd， J=2.4Hz， 4.9Hz， 10.3Hz)， 4.18 (1H， dd， J=2.2Hz， 12.4Hz)， 4.31 (1H， dd， J=2.2Hz， 12.4Hz)， 4.39 (1H， dd， J=10.3Hz， 10.3Hz)， 5.18 (1H， dd， J=9.2Hz， 10.3Hz)， 5.49 (1H， d， J=10.3Hz)， 5.83 (1H， dd， J=9.2Hz， 10.3Hz)， 7.74 (2H， dd， J=2.4Hz， 5.4Hz)， 7.86 (2H， dd， J=2.4Hz， 5.4Hz)。(2) 5國oc -胆甾烷-3 P國基-2 -脱氧-2画苯二酰亚胺基画3， 4， 6画三隨0國 乙酰基-P-D-吡喃葡糖苷(化合物(3》的制备在氩气环境下，向(1)中得到的化合物(2)( 400 mg， 0.834mmol)、 5隱oc -胆甾烷-3 P -醇(389 mg， 1.0 mmol)、活化分子筛4A(1.88 g)的混合 物中加入干燥二氯甲烷(4.6ml)，在室温下搅拌l小时之后，加入三氟 甲磺酸甲酯(0.28 mL， 2.48 mmol嫩拌过夜。向反应液中加入三乙胺(1 mL)搅拌30分钟后，进行硅藻土 (celite)过滤，用二氯甲烷清洗滤出 物。合并滤液和清洗液后蒸馏去除溶剂，将残渣用>^柱色镨法(己烷 乙酸乙酯=3: 1，表示体积比。下同)精制，得到510mg的标题化合物。性状白色粉末工H-NMR (CDC13) S: 0.51-2.10 (55H， m)， 3.48-3.56 (1H， m)， 3.85 (1H， ddd， J=2.4Hz, 4.9Hz， 10.3Hz)， 4.15 (1H， dd， J=2.2Hz, 12.2Hz)， 4.26-4.34 (3H， m)， 5.15 (1H， dd， J=8.9Hz， lO.OHz)， 5.46 (1H， d， J=8.4Hz)， 5.77 (1H， dd， J=8.9Hz， 10.8Hz), 7.74 (2H， dd， J=2.4Hz， 5.4Hz), 7.86 (2H, dd， J=2.4Hz: 5.4Hz)。(3) 5-a-胆甾烷-3|3-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-3，4，6-三-0-乙酰基-p-D-吡喃葡糖苷(化合物(4))的制备向(2)中得到的化合物(3)(510mg， 0.633mmo1)的1-丁醇(5.0mL) 悬浮液中加入乙二胺(5.0mL),在120°C下搅拌过夜。在减压下蒸馏去 除反应液，向残渣中加入吡啶(5mL)、醋酸酐(5mL)、 4-二甲基^J^比啶(催化量)搅拌过夜。在减压下蒸馏去除反应液，将残渣溶解在乙酸乙酯中，用1M盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗后，用硫 酸钠干燥有机层，减压下蒸馏去除溶剂，将残渣用^柱色镨法(己烷 乙酸乙酯=1: 4)精制，得到250mg的标题化合物。性状白色粉末工H-NMR (CDC13) S: 0.55-2.07 (58H， m)， 3.52-3.72 (3H， m)， 4.10 (1H， dd， J=2.2Hz， 11.3Hz)， 4.26 (1H， dd， J=2.2Hz， 12.2Hz)， 4.86 (1H， d， J=8.4Hz)， 5.03 (1H， dd， J=9.7Hz, 9.7Hz)， 5.35-5.43 (2H， m)。(4) 5-ot-胆甾烷-3 P-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-P-D-吡喃葡糖苷 (化合物(la))的制备向(3)中得到的化合物(4) (250mg, 0.348mmol)的甲醇(5.0mL )、 二氯甲烷(5.0mL )混合溶液中加入28%的甲醇钠甲醇溶液(0.07mL， 0.363 mmol)，在室温下搅拌过夜。加入AMBERLYST15,中和^^应液后，过 滤，在减压下蒸馏去除滤液，将残渣悬浮于甲醇中，滤出不溶物，用甲醇 清洗、干燥，得到159mg的标题化合物。性状白色粉末工H國NMR (DMSO-d6+D20) 5: 0.62-1.94 (4犯，m)， 2.99-3.05 (2H， m)， 3.22-3.50 (4H， m)， 3.66 (1H， d， J=11.6Hz)， 4.40 (1H， d， J=7.6Hz)， 7.64 (1H， d， J=8.4Hz)。实施例1脂质体以及环糊精包合物的制备使用20nmol/mL (溶解于氯仿/甲醇=5/1， v/v)的GlcNAc-胆甾烷 醇(化合物(la))以及胆齒烷醇作为起始物质。(1)脂质体制剂的制作以52/8/20 (摩尔比)的比例混合loc二棕榈酰磷脂酰胆碱、硬月旨胺 以及糖-胆齒烷醇，使得成为700 pl，然后，添加有机溶剂(氯仿/甲醇=2/1， v/v) 300 nl以及蒸馏水lmL混合。其后，用旋转蒸发器将有机溶剂完全去除后，进行冻干操作，完全去除水分。将该冻干品溶解于PBS lmL 中，进行超声波处理(15W， 15分钟)，由此将脂质体均化成粒径 40 300nm左右，供给实施例2。(2)环糊精包合物的制备配制羟丙基P环糊精的20%水溶液，添加GlcNAc-胆甾烷醇，通过 搅拌-混合，制作环糊精和GlcNAc-胆甾烷醇包合物。GlcNAc-胆齒烷醇 由于不溶性，通过搅拌增溶，可确认形成良好的包合物。实施例2 GlcNAc-胆甾烷醇的细胞增殖抑制效果在96孔板上播种培养癌细胞林(HT-29(人))，使其为1 x 104个 细Jlfe/100 pl/孔，然后添加实施例1配制的GlcNAc-胆甾烷醇化合物的脂 质体制剂和环糊精包合物，在37"C培育3天。其后，进行MTT测试， 确定细胞数。另外，增殖抑制率根据下式求出。结果示于表l。其结果是，GlcNAc-胆甾烷醇显示强的细胞增殖抑制效果。细胞增殖抑制率(CPI率)(％)处理细胞的OD 未处理细胞的OD J此处，处理细胞的OD在450nm测定，未处理细胞的OD在650nm 测定(根据MTT测试)。[表l]糖链胆甾烷醇的细胞增殖抑制效果糖链1形状CPI50(nM)2GlcNAcGalChol月旨质体10.2GlcNAcChol月旨质体10.4GalChol月旨质体12.7Choi月旨质体354.3GlcNAcGalChol环糊精15.9GlcNAcChol环糊精8.8GalChol环糊精37.4Choi环糊精> 10001) GlcNAcGalChol: GlcNAc |3 1，3Gal j3-胆甾烷醇 GlcNAcChol: GlcNAc卩-胆甾烷醇 GalChol: Gal j3國胆甾烷醇 Choi:胆甾烷醇2) 50% CPI所必需的浓度。
权利要求
1、一种抗癌剂，以下述式(1)所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物作为有效成分。
2、 一种脂质体制剂，含有权利要求l所述的胆甾烷醇化合物。
3、 一种包合物，是权利要求l所述的胆甾烷醇化合物的环糊精包 合物。
4、 根据权利要求3所述的包合物，其中，环糊精是2-羟丙基-p-环糊精o
5、 下述式(1)所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物在制造 抗癌剂中的应用。<formula>formula see original document page 2</formula>
6、癌的预防或治疗方法，其特征在于，给与下述式(l):<formula>formula see original document page 3</formula>所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物。
全文摘要
本发明提供一种简便地合成，并且具有充分的抗肿瘤活性的糖-胆甾烷醇化合物。一种抗癌剂，以右式(1)所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物作为有效成分。
文档编号A61K31/704GK101253192SQ20068003149
公开日2008年8月27日 申请日期2006年9月1日 优先权日2005年9月2日
发明者中川崇, 矢泽伸, 西村东洋 申请人:大塚制药株式会社