脂质体组合物的制作方法

专利名称：：脂质体组合物的制作方法脂质体组合物发明领域本发明涉及使用作为递送载体、有二价阳离子骨架的脂质体的治疗组合物和方法。二价阳离子骨架保护治疗剂。所述的脂质体任选地包含脂质体外表面上的亲和部分通过靶组织用于有效结合和内化。脂质体为了空间稳定性和延长循环任选地亦包含亲水聚合物表面衣层。发明背景脂质体用于各种治疗目的，特别地，用于通过脂质体的全身施用载送治疗剂至耙细胞。由于各种原因，可能需要使用脂质体保护治疗剂。为了开拓双膦酸类药物的治疗作用，药物分布必须以使治疗剂可有效地特定地与治疗目标的靼表面相互作用的方式进行改变。因此，需要提供包含治疗剂可被其保护的二价阳离子骨架的治疗性脂质体组合物。发明概述一方面，本发明包括用于哺乳动物个体的基于脂质体的治疗方法，其包括给个体全身施用脂质体，脂质体包含(i)有效的二价阳离子骨架和(ii)治疗剂。二价阳离子骨架提供对治疗剂的保护，否则治疗剂一旦引入体内有可能从传统脂质体制剂中渗漏出来。另一方面，本发明包括用于哺乳动物个体的基于脂质体治疗的方法，其包括给个体全身施用脂质体，脂质体包含(i)二价阳离子骨架、(ii)治疗剂、(iii)用于空间稳定性和延长循环的亲水聚合物衣层、和(iv)任选的亲和部分，其有效地特异性地结合至治疗目标的粑表面。亲水聚合物衣层是由共价连接至脂质体中的表面脂质成分的聚合物链组成。在一个实施方案中，二价阳离子骨架包含二价阳离子，诸如钙离子、锌离子、镁离子。在一个实施方案中，在治疗剂,皮施用至靶区处，亲和部分是有效地特异性与耙区处受体结合的配体，且脂质体包括包封形式的治疗剂。该实施方案的实施例是实体瘤的治疗，在实体肿瘤处亲和部分对特异性地与肺瘤特异性抗原结合是有效的，脂质体具有约10至约500mn之间的平均粒度，并包含包封的药物。在一个实施方案中，二价阳离子骨架包含阳离子脂质。这些脂质包括甾醇、酰基或二酰基链，其中脂质整体上带净正电荷。示例性的脂质包括1，2-二酰基-3-三曱基铵-丙烷(DOTAP)、二曱基二-十八烷基铵(DDAB)、N-[1-(2，3，-二-十四烷基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DMRIE);]\-[1-(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二曱基-N-羟基乙基澳化铵(DORIE);N-[l-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTMA);3卩[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol);发明详述l.脂质体的组成基于脂质体治疗中使用的脂质体有至少一个具有外表面的外双层。应当理解脂质体可包含另外的双层。外双层是分别由内部和外部脂质层的双层组成的，每层由形成泡嚢的脂质组成，诸如磷脂和胆固醇，一般有二酰基疏水脂质尾端和极性头部基团。脂质体主要是由这类形成泡嚢的脂质组成的。脂质体包含有效地保护治疗剂在其,iL^露与其^N互作用前不渗漏的二价阳离子。二价阳离子骨架通过包封药物降低了治疗剂跨过脂质体双层的通透性。二价阳离子骨架帮助包封高度可溶的治疗剂。另外，二价阳离子骨架可促进更有效地递送治疗剂至肿瘤。在一个实施方案中，加至脂质体中的钙离子帮助保留活性药物不在与靶反应之前分散。被施用于靶细胞或区域的治疗剂被包封到脂质体中。本文使用的治疗剂、化合物和药物可互换使用。治疗剂可依化合物的性质包封到脂质体的内部水相室或脂双层中。被包封的治疗剂可以是可被包封到脂质泡嚢中的大量治疗剂中的任何一种，包括可稳定地包裹到泡嚢的水溶性室中的水溶性成分、稳定地分配在泡嚢的脂相中的亲脂性化合物、或可稳定连接的例如通过与泡嚢外表面静电连接的亲脂化合物。示例性的水溶性化合物包括双膦酸类药物。治疗剂的实例是取代的烷基二膦酸，特别是式I的杂芳基烷基二膦酸及其盐R1——CHP03H2—R2P03H2其中Rl是包含如2至4个N-原子或1或2个N-原子以及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基，且其是未取代的或被低级烷基、苯基或被低级垸基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低级烷氧基、羟基、二-低级烷基M、低级烷硫基和/或卤素C-取代、和/或在能够被低级烷基、低级烷氧基和/或囟素取代的N-原子处N-取代，且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或囟素，特别是所述化合物的制备、包含它们的药物组合物、及其用作药物的用途。包含2至4个N-原子或1或2个N-原子及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基的实施例是咪唑基例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基，吡唑基例如吡唑-l-基或吡唑-3-基，噻唑基例如蓉唑-2-基或噻唑-4-基，或不太优选的噁唑基例如喁唑-2-基或鳴唑-4-基，异喷、唑基例如异噁唑-3-基或异巧悉唑-4-基，三唑基例如1H-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-3-基或4H-l，2，4-三唑-4-基或2H-l，2，3-三唑-4-基，四唑基例如四唑-5-基，蓉二唑基例如1，2，5-噻二唑-3-基，和噍二唑基例如1,3，4-喁二唑-2-基。这些基团可包含一个或多个相同或不同的、优选为一个或两个相同或不同的选自开头提及的基团的取代基。如所指出的未取代的或取代的基团Rl，例如是未取代的或被苯基或如指出的被取代的苯基C-取代的咪唑-2-基或咪唑-4-基，或被d-C4烷基例如曱基C-或N-取代，且一般为咪峻-2-基、l-d-d烷基咪唑-2-基诸如l-甲基咪唑-2-基、或2-或5-d-C4烷基咪唑-4-基诸如2-或5-甲基咪唑-4-基、未取代的瘗哇基，例如，噻唑-2-基或未取代的或被C广C4烷基诸如甲基取代的1H-l，2，4-三唑基、例如l-C广C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基诸如l-甲基-lH-l，2,4-三唑-5-基、或咪唑-l-基、吡唑-l-基、1H-l，2，4-三峻-l-基、4H-l，2，4-三唑-4-基或四唑-l-基、未取代的或被苯基或如指出的被取代的苯基或被d-C4烷基诸如甲基C-取代，例如咪唑-l-基、2-，4-或5-C广C4烷基咪唑-l-基诸如2-,4-或5-甲基咪唑-l-基、吡唑-l-基、3-或4-C广C4烷基吡唑-l-基诸如3-或4-曱基吡唑-l-基、1H-l，2，4-四唑-l-基、3-d-Ct烷基-lH-l，2，4-三唑-l-基诸如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三哇-l-基、3画d-C4烷基-4H-1，2，4-三唑画4画基诸如3-甲基-4H-1，2，4-三唑-4-基或lH-l，2，4-四喳-l-基。下文中基团和化合物的术语"低级"将被理解为以下的基本意义，包含最多达7个(含7个)碳原子、优选地达4个(含4个)碳原子。一般术语有例如以下的意义低级烷基是例如d-C4烷基诸如甲基、乙基、丙基或丁基，且亦是异丁基、仲-丁基或叔-丁基，并还可以是Cs-C7烷基诸如戊基、己基或庚基。苯基-低级烷基是例如苯基-d-C4烷基，优选地l-苯基-d-C4烷基诸如节基。低级烷氧基是例如d-C4烷氧基诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。二-低级烷基氨基是例如二-d-C4烷基M诸如二甲基氨基、二乙基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二丙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基或二丁基氨基。低级烷硫基是例如d-C4烷硫基诸如甲硫基、乙硫基、丙硫基或丁硫基，及异丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基。卤素是例如有原子序数达35含35的卣素，诸如氟、氯或溴。式I化合物的盐特别是其与药物可接受碱的盐，诸如由Ia、Ib、IIa和lib族金属例如碱金属盐、优选钠或钾盐、碱土金属盐优选钩或镁盐、铜、铝或锌盐衍生的的非毒性金属盐，及与氨或有机胺或季铵碱诸如无羟基或c-羟基化的脂肪族胺、优选单-、二-、或三-低级烷基胺的铵盐，例如，甲基胺、乙基胺、二甲基胺或二乙基胺、单-、二-、或三(羟基-低级烷基)胺诸如乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、三(羟基甲基)氨基甲烷或2-羟基-叔-丁基胺或N-(羟基-低级烷基)-N，N-二-低级烷基胺或N-(聚羟基-低级烷基)-N-低级烷基胺诸如2-(二曱基M)乙醇或D-葡糖胺或脂肪族季铵氢氧化物，例如四丁基铵氢氧化物。关于这一点，亦应提及式I化合物也可以内盐形式获得，条件是Rl基团有足够的碱性。这些化合物因此亦可通过用强质子酸诸如盐酸、硫酸、磺酸、例如甲磺酸或p-曱苯磺酸、或M磺酸例如N-环己基M磺酸转化成相应的酸加成盐。在一个实施方案中，治疗剂是式I化合物及其盐，特别是内盐和其与碱的药物可接受的盐。其中Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基、1H-l,2，4-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四唑基、，懲唑基、异悉唑基、喷、二唑基、噻唑基或噻二唑基，其是未取代的或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基、苯基或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基、和/或卣素、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷硫基和/或卣素依次取代的苯基C-取代，和/或在能够被未取代的或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的低级烷基或苯基-低级烷基取代的N-原子处N-取代；且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卤素。在一个实施方案中，治疗剂是式I化合物及其盐，特别是内盐和其与碱的药物可接受的盐。其中Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四哇基、喁唑基、异鳴唑基、鳴二峻基、瘗唑基或瘗二唑基，其是未取代的或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基、苯基或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或囟素、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷硫基和/或卣素取代的苯基C-取代，和/或在能够被未取代的或被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的低级烷基或苯基-低级烷基取代的N-原子处N-取代；且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卤素。在一个实施方案中，治疗剂是式I化合物及其盐，特别是内盐及其与碱的药物可接受的盐。其中R1是咪唑基，诸如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪喳-4-基、4H-l，2，4-三唑基诸如4H-l，2，4-三唑画4画基、或噢唑基诸如噢唑-2画基，其是未取代的或被一个或两个选自Crd烷基诸如甲基、d-C4烷氧基诸如曱氧基、苯基、羟基、二-C广C4烷基氨基诸如二甲基氨基或二乙基氨基、d-C4烷硫基诸如甲硫基、和/或原子序数大至35含35的卣素诸如氯C-取代，和/或在能够被C广Q烷基诸如曱基、或苯基-C广C4烷基诸如苄基取代的N-原子处N-取代；且R2优选地是羟基或不太优选地为氢或氨基。在一个实施方案中，治疗剂是式I化合物及其盐，特别是其药物可接受的盐。其中Rl是未取代的或被苯基C-取代咪唑-2-或-4基或被d-Ct烷基诸如甲基C-取代或N-取代的，例如，咪唑-2-基、l-d-C4烷基咪唑-2-基诸如l-甲基咪唑-2-基、或2-或5-CrC4烷基咪唑-4-基诸如2-或5-甲基咪哇-4-基、或未取代的噻唑基，例如未取代的或被d-C4烷基诸如甲基取代的瘗喳-2-基、或是lH-l，2，4-瘗唑基，例如ld-C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基诸如l-甲基-l，2，4-三唑-5-基，且R2是羟基或不太优选地是氢。在一个实施方案中，治疗剂是式I的化合物及其盐，特别是其药物可接受的盐。其中Rl是未取代的或被苯基或d-C4烷基诸如甲基取代的C取代的咪唑-l-基、吡唑-l-基、lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-4-基或四峻-l-基，例如，咪峻-l-基、2-，4-，或5-C广C4烷基咪唑誦l-基诸如2-，4-或5-甲基咪唑-l-基、p比峻-1-基、3-或4-d-C4烷基吡唑-l-基诸如3-或4-曱基吡哇-l-基、lH画l，2，4-四唑-l-基、3画d画C4烷基-lH訓l，2，4-三唑-l-基诸如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-l-基、3-CrC4烷基-4H-l，2，4-三唑-4-基诸如3-甲基-4H-l，2，4-三唑-4-基或1H-四唑-l-基，且R2是羟基或不太优选地是氢。在一个实施方案中，治疗剂是式I化合物及其盐，特别是其药物可接受的盐。其中Rl是未取代的或被d-C4烷基诸如甲基取代的咪唑基,例如，l-曱基咪唑-2-基、咪唑-4-基或2-或5-甲基咪唑-4-基，且R2是羟基或不太优选地是氢。在本发明优选的实施方案中，脂质体包含用于治疗实体肿瘤诸如唑来膦酸的包封的药物。脂质体的外层表面可包含由亲水聚合物链组成的亲水聚合物的表面衣层，其优选地紧密堆积形成有效保护脂质体表面成分的刷状衣层。根据本发明，亲水聚合物链与脂质体脂质化学连接。脂质体外层表面可包含亲和性部分，有效地与靶特异性地结合，例如，基于脂质体治疗目标的生物表面诸如细胞膜、细胞骨架、组织或靼表面或区域。亲和部分通过共价连接与脂质体外表面结合至脂质体中的表面脂质成分和/或亲水聚合物衣。亲和部分是有效特异性结合的配体，且与靶上载的配体结合分子有高亲和性。例如，在一个实施方案中，亲和部分与胂瘤特异性抗原和/或实体肿瘤中过度表达的受体结合是有效的，且在另一个实施方案中，亲和部分与在炎症部位的细胞结合是有效的。在另一个实施方案中，亲和部分是维生素、多肽或多糖或蛋白质效应器。本发明的脂质体是用于施用治疗剂至靶。治疗剂^L包封于脂质体内。本发明的脂质体組合物主要是由形成泡嚢的脂质组成的。这样的形成泡嚢的脂质是如下的一种(a)能在水中自发形成双层泡嚢的，可作范例的是磷脂，或(b)被稳定地加入到脂质双层中，其疏水部分与双层膜的内部、疏水区接触，且其头部定位朝向泡嚢的外部和内部、极性表面。此类型的泡嚢形成脂质优选地是有一般为酰基链的两个烃链，和不管是极性或非极性的头部的脂质。但是，其他包含四个烃基链的磷脂，诸如四肉豆蔻基心磷脂也是适合的。有许多合成的泡囊形成脂质和天然存在的泡囊形成脂质，包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中烃链的一般长度在约14-22个碳原子，且有可变的不饱和度。上文描述的其酰基链有可变的饱和度的脂质和磷脂可商购获得或根据已经公布的方法制备。其他适合的脂质包括糖脂和甾醇诸如胆固醇或胆固醇衍生物。单独或联合用于本发明的优选的二酰基链脂质包括二酰基甘油，诸如，磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磚脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SPM)、心磷脂等。这些脂质优选地用作泡嚢形成脂质，主要的脂质体成分，并用在下文描述的衍生的脂质中。另外，泡嚢形成脂质^f皮选择用于实现特定的流动性或刚性，以控制脂质体在血清中的稳定性，并控制脂质体中包封成分的释放速率。脂质体的刚性，如通过泡嚢形成脂质测定的，如将要描述的亦可在脂质体与靶细胞的融合中起作用。有更刚性的脂质双层，或液晶双层的脂质体，是通过加入相对刚性的脂质，例如有相对高的相转变温度，例如高至60。C的脂质实现的。刚性的、即饱和的脂质对在脂质双层中更大的膜刚性起作用。其他脂质成分，诸如胆固醇也是已知对脂质双层结构中的膜刚性起作用。本发明的脂质体可包含由与脂质体表面脂质连接的聚合物链组成的亲水聚合物衣层。这些亲水聚合物链被加到脂质体，包括约l-20摩尔百分数之间的亲水聚合物-脂质结合物。适合用于聚合物衣层的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基乙基丙烯酸酯、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、聚乙二醇、聚甘油和聚天冬酰胺、透明质酸。在优选的实施方案中，亲水聚合物是聚乙二醇(PEG),优选地是分子量在500-10000道尔顿之间的PEG链，更优选地在2000-10000道尔顿之间，且最优选地在1000-5000道尔顿之间。在另一个优选的实施方案中，亲水聚合物是聚甘油(PG)，优选地是分子量在400-2000道尔顿之间的PG链，更优选地在500-1000道尔顿之间，且最优选地在600-700道尔顿之间。本发明的脂质体组合物可包含亲和性部分。亲和性部分与靶特异性结合一般是有效的，即，生物表面诸如靶细胞表面或膜、细胞表面受体、细胞骨架、斑块区等。如将要描述的，亲和部分通过与脂质体脂质不论与磷脂或是胆固醇直接连接、或通过短聚合物链连接与脂质体表面结合。在一个实施方案中，亲和部分是与在靶区的受体特异性结合有效的配体，更特异性地，用于与在靶细胞上的受体结合的配体。适合此目的的配体的非限制性实例列于表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本发明的一个实施方案中，表l中列举的配体可祐使用将脂质体靶向于特定的靶细胞。例如，与DSPE的头部连接或与由DSPE衍生的短PEG链的尾端连接的叶酸盐配体可被加至脂质体中。"短"PEG链，如本文使用的意思是有选择的长度(分子量)的特定PEG链以便当加至脂质体中时配体可通过亲水聚合物链的表面衣层被遮挡或保护。被加至脂质体中的表面结合的叶酸盐配体与内皮细胞上的叶酸盐受体结合是有效的，用于包封治疗剂施用至靶细胞，例如，用于上皮癌治疗的肺瘤活性剂的施用。亲和部分是有细胞结合活性且有效地与配体竟争受体位点的短肽。配体-受体细胞结合事件的抑制作用导致感染过程的停止。包含包封剂的脂质泡嚢是按照熟知的方法制备的，诸如上文描述的那些，一般地，脂质膜的7jC合作用、反相蒸发、溶剂稀释、清洁剂透析法、冻融和微嚢化。要递送的化合物在亲脂化合物的情况下可被包含在有机基质中，或在水溶性治疗剂的情况下可包含在水合基质中。或者，治疗剂可在施用给个体前装栽到预先形成的泡嚢中。II.脂质体的制备A.可释放聚合物衣层的制备亲水性聚合物链通过连接与脂质体相连，该连接可响应于所选择的刺激而断裂。在一个实施方案中，连接是肽、酯或二硫键。肽-连接的化合物是通过例如将聚烷基醚诸如PEG与脂质胺偶联而制备。封端PEG是用羰基二咪唑偶联剂被激活以形成活化的咪唑化合物。活化的PEG然后与所示的示例性三肽的N-末端胺偶联。所述肽的J^&基团然后可通过传统的碳二亚胺偶联剂，诸如二环己基碳二亚胺(DCC)被用于偶联脂质胺基团。酯连接的化合物可通过例如偶联脂质酸诸如磷脂酸与聚烷基醚的末端醇基团，使用醇通过酸肝偶联剂而制备。或者，包含内酯键和适当端基的短的连接片段，诸如伯胺基团，可通过酰胺或氨基甲酸酯连接用于将聚烷基醚与泡嚢形成性脂质偶联。B.亲和部分的连接如上文所述，本发明的脂质体可包含与PEG-包衣脂质体的表面相连接的亲和部分。亲和部分是依照该部分的性质，通过与脂质体脂质表面成分直接相连或通过短的间隔臂或带与脂质体连接。可有多种方法例如亲和部分，用于将分子与脂质泡嚢表面连接。在一个优选的方法中，亲和部分是通过下文所述的偶联反应与脂质偶联以形成亲和部分-脂质结合物。该结合物被加至脂质溶液中用于脂质体的形成。在另一个方法中，用于亲和部分共价连接的被激活的泡嚢形成性脂质被加入到脂质体中。通常，部分与间隔臂的连接可通过衍生化泡嚢形成性脂质而实现，一般地DSPE，与有反应性末端基团的亲水聚合物诸如PEG用于亲和部分的连接。用于将配体与活化的PEG链连接的方法在本领域中有所描述(Allen等人，1995;Zalipsky，1993;Zalipsky，1994;Zalipsky，1995a;Zalipsky，1995b)。在这些方法中，mPEG的惰性末端甲氧基被换以适合偶联反应的反应性功能团，诸如氨基或肼基。端基功能化的PEG被与脂质连接，一般地DSPE。功能化的PEG-DSPE衍生物被用于脂质体形成并且所需要的配体在脂质体形成之前或之后被连接到PEG链的反应性端。部分的连接亦可通过用有活性末端基团的亲水聚合物诸如PEG衍生化胆固醇用于亲和部分连接而实现。用于配体与活化的PEG链连接的方法在本领域有所描述(Guo，W.，Lee，T.，Sudimack,J.，和Lee,R.J.脂质体通过叶酸-PEG-胆固醇的受体耙向递送，(2000)/.hj^so附e及m.，10:179-195)。C.脂质体制备脂质体可通过各种技术制备，诸如Szoka等人，1980中详细描述的那些。多室泡嚢(MLV)可通过简单的脂质-膜水合技术制备。在该方法中，上文详述的这种类型的脂质体形成脂质混合物溶解于适合的有机溶剂中，在容器中蒸发以形成薄膜，其然后被7K基质覆盖。形成MLV的脂质膜水合物粒度一般在约0.1至10微米之间。本发明的用于制作融合脂质体的脂质成分优选以以下述摩尔比存在约70-95%的泡嚢形成脂质、1-20%的用亲水聚合物链^"生化的脂质、和0.1-5%的连接亲和部分的脂质。一个示例性的制剂包含80-95%摩尔百分数的磷脂酰胆碱、1-20%摩尔百分数的PEG-DTP-DSPE、和0.1-5%摩尔百分数的亲和部分-DSPE。可包含在制剂中的胆固醇摩尔百分数约为161-50%之间。本发明的另一个适合于制备融合脂质体的方法是由Uster等人，1996描述的。在该方法中，有包封的治疗剂的脂质体是从泡嚢形成脂质制备的。预制的脂质体被加至含亲和部分-DSPE结合物和/或PEG-衍生化的脂质结合物的浓缩分散体溶液中，并在有效实现胶束脂质结合物插入到预制的脂质体中的条件下孵育。又一个适合本发明脂质体制备的脂质体制备方法是溶剂注入法。在该方法中，脂质混合物，溶解在溶剂中，优选为乙醇或DMSO，在搅拌下被注入到7jc相基质中以形成脂质体。该溶剂通过适当的技术诸如透析或蒸发被除去，然后脂质体被制成所需的粒度。该方法实现了相对高的包封效率。亲水性治疗剂通过将活性剂包括在7jc相7jc合混合物中被包封到脂质体中。疏水的治疗剂在薄膜形成之前通过将活性剂包含在脂质中或在注入到水相基质中以前溶解在脂质溶剂中被包封在脂质体中。脂质体优选地被制备成具有基本上在所选粒度范围内的均匀的粒度，一般在约10至约500nm，优选地50至约300nm，且更优选地80至约200腿。当需要时，脂质体可通过诸如蒸发或冻干被干燥，并在任何所需的溶剂中重混悬。在脂质体,皮冻干的情况下，非还原糖可在冻干前、或在脂质体配制期间被加入以提供稳定性。一种这样的糖是蔗糖。有二价阳离子骨架的脂质体可通过在脂质体制备期间加入包含二价阳离子的溶剂而制备。有二价阳离子骨架的脂质体在施用于个体之前亦可通过用适当的包含二价阳离子的溶剂重溶冻干脂质体而制备。已发现具有跨膜浓度梯度的本发明脂质体可在一种或多种糖的存在下贮存在其脱水条件下被脱水，接着再7JC合，且该浓度梯度则用于产生跨膜电位，其将荷载二价阳离子进入脂质体，并形成药物-二价阳离子骨架。当使用脱水脂质体时，再7jC合通过简单加入二价阳离子的水溶液实现，例如氯化钩、含二价阳离子的緩冲溶液至脂质体中，并允许其再水合并形成药物-二价阳离子骨架。脂质体可通过溶液轻轻涡旋被重混悬至水溶液中。可在适合于脂质体及其内容物的組合物的室温下或在其他温度下进行再水合。III.治疗方法一方面，本发明包括用于哺乳动物个体的基于脂质体治疗的方法，其包括给个体全身施用包含(i)二价阳离子骨架和(ii)治疗剂的脂质体。二价阳离子骨架提供了治疗剂的保护，否则治疗剂可能在货架上及一旦i^身体从传统脂质体中渗漏。另一方面，本发明包括用于哺乳动物个体的基于脂质体治疗的方法，其包括给个体全身施用包含(i)二价阳离子骨架、(ii)治疗剂、(iii)用于稳定性和延长循环的亲水聚合物衣层、和(iv)任选的有效地特异性结合至治疗目标的耙表面的亲和部分的脂质体。疏水聚合物衣层是由与脂质体中的表面脂质成分共价连接的聚合物链组成的。施用的脂质体被允许全身循环直至实现了脂质体所需的生物分布，借此暴露亲和剂至乾表面。在优选的实施方案中，脂质体被用于实体肿瘤的治疗。脂质体包括包封形式的抗肿瘤药物并通过有效与肿瘤特异性抗原特异性结合的亲和部分被靶向于肿瘤区域。例如，脂质体可通过包含用于增殖性肿瘤内皮细胞上表达的Flk-1，2受体的选择性连接的脂质体中的VEGF配体被靶向于肿瘤血管内皮细胞。在此实施方案中，脂质体制成粒度在约10-200nm之间，优选地50-150nm且最优选地80-120nm。在此粒度范围的脂质体已显示能够通过存在于肿瘤血管的内皮细胞内衬中存在的"间隙，，i^肺瘤(Yuan等人，1995)。在一个实施方案中，从式I化合物中选择治疗剂。式I化合物及其盐具有有价值的药理学性质。特别地，它们对温血动物的钙代谢有显著的调控作用。更特别地，在大鼠中它们起到显著的骨吸收的抑制作用，如在ActaEndrocinol.78，613-24(1975)中描述的试验方法中证实的，通过在皮下施用剂量范围从约0.01至1.0mg/kg后PTH-谦导的血清钾水平的升高的方法，以及在TPTX(曱状腺曱状旁腺切除的)大鼠模型中通过皮下施用剂量约0.0003至l.Omg后维生素D3诱导的高钓血症的方法。由Walker256肺瘤诱导的肿瘤钙血症在口服施用约1.0至100mg/kg的剂量后被同样地抑制。另外，在根据Newbould，Brit.J.Pharmacology21，127(1963)和根据Kaibara等人，J.Exp.Med.159，1388-96(1984)的试验方法中，当以约0.001至l.Omg/kg的剂量皮下施用时，式I的化合物及其盐对有佐剂性关节炎的大鼠中的关节炎病症的发展产生显著的抑制作用。它们因此特别地适合用作治疗与钓代谢损伤相关疾病的药物，例如关节的炎性病症、关节软骨中的退行性过程、骨质疏松症、牙周炎、甲状旁腺机能亢进、及血管和假体植入物中的钓沉积。在观察到难溶性钩盐异常沉积的疾病如关节炎疾病例如强直性脊柱炎、神经炎、滑嚢炎、牙周炎和跟腱炎、纤维发育不良、骨关节病或动脉硬化，以及硬的身体组织的异常分解作用是主要症状的那些疾病，例如遗传性低磷脂酶症、关节软骨的退行性状态、不同种源的骨质疏松症、派杰氏病和骨营养不良性纤维化、及肿瘤诱导的溶骨性病症的治疗中亦实现有利的结果。在脂质体施用后，例如，静脉施用，及在充足的时间消逝后以允许脂质体分布至个体并外渗至肺瘤内，脂质体的亲和部分提供结合和内化至粑细胞中。在一个实施方案中，亲水表面衣层通过pH敏感性连接与脂质体连接，并且是在脂质体渗漏至肿瘤内后，由于肿瘤区域的低氧特性连接被断开。从上文中，可以理解本发明的各种特性和目标是如何达到的。本发明的脂质体提供了靶向脂质体的方法。亲水表面衣层减少了脂质体的吸收，实现长血液循环时间用于脂质体的分布。在分布后，与脂质体连接的亲和部分允许与靶的多价显露和结合。以下实施例阐释了本发明的脂质体的制备、表征、和使用。实施例绝对不是限制本发明的范围。尽管本发明已描述了有关特别的实施方案，对本领域的技术人员显然了解可进行各种变化和改变而不偏离本发明。实施例1770|Limol的磷脂酰胆碱和330pmol的胆固醇溶解于二氯甲烷中。搅拌这些混合物以^^溶剂在真空下约36X:挥发以形成薄的干燥的脂质膜。向该混合物中，加入唑来膦酸(110pmol)的15ml的蔗糖溶液并涡旋。单室脂质体通过使用超声仪制备。药物包嚢的效率是通过在适当的水相溶剂中透析一份脂质体过夜或在200,000xg下离心一份脂质体2小时测定的。之后脂质体部分溶于甲醇中，并通过标准方法使用高效液相色谱(HPLC)，诸如反相HPLC进行分析。实施例2将脂质(二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚甘油、胆固醇)溶于二氯甲烷中。该脂质溶液使用旋转蒸发仪在真空下蒸发。在蒸发后，脂质残渣在干燥器中进一步干燥过夜。唑来膦酸、蔗糖和氯化钠溶解于去离子水中以达到所需的批浓度。然后，干燥的脂质残渣在唑来膦酸、蔗糖/NaCl溶液中被水化以形成多室脂质体(MLV)。通过0.2nm和O.linm的聚碳酸酯滤器挤压降低MLV的粒度。5毫升的最终制剂填装至玻璃小瓶并使用VIRTIS冻干仪冻干。冻干的脂质体唑来膦酸在施用给个体前用钙緩冲液重溶。实施例3阳离子磷脂、DPPC、叶酸-PEG-DSPE、胆固醇溶解于乙醇中。脂质醇混合物然后被^L在唑来膦^/蔗糖溶液中。大批的脂质体唑来膦酸然后通过0.2nM和0.1pM聚碳酸酯滤器挤出。在粒度降低后，然后将产物加热至40'C在真空下蒸发掉有机溶剂然后通过0.22|uM滤器无菌过滤并冻干。由HPLC法测定的药物包封效率为约50%。实施例4将DSPC、PEG-胆固醇、叶酸-PEG-胆固醇溶解于乙醇中。脂质醇混合物然后分散在唑来膦酸/蔗糖溶液中。大批的脂质体唑来膦酸然后通过0.2|nM和O.lpM聚碳酸酯滤器挤出。在粒度降低后，然后将产物加热至40。C在真空下蒸发掉有机溶剂并通过0.22jtM滤器无菌过滤并冻干。权利要求1.给哺乳动物个体施用治疗剂的方法，其包括给所述的个体全身施用包含含有治疗剂的二价阳离子骨架的脂质体组合物。2.权利要求l的方法，其中所述的治疗剂是水溶性的。3.权利要求2的方法，其中所述的治疗剂是式I化合物和其可药用盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中Rl是包含如2至4个N-原子或1或2个N-原子以及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基，且其是未取代的或被低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷硫基和/或卣素C-取代的、和/或在能够被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的N-原子处N-取代，且R2是氢、羟基、氨基、低级烷石危基或离素。4.权利要求3的方法，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。5.权利要求l的方法，其中所述的二价阳离子骨架包含二价阳离子，诸如钓离子、锌阳离子或镁阳离子。6.权利要求l的方法，其中所述的二价阳离子骨架包含阳离子脂质。7.权利要求1的方法，其中所述的脂质体组合物具有约10至约500纳米的平均粒度。8.权利要求1的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲水性聚合物。9.权利要求l的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲和性部分。10.给哺乳动物个体施用治疗剂的方法，其包括给所述的个体全身施用包含含有治疗剂的二价阳离子骨架的脂质体组合物。11.权利要求10的施用治疗剂至靶细胞的方法，其中所述的亲和性部分是有效地特异性与在靶细胞上的细胞表面受体结合的配体，且所述的脂质体还包含包封形式的治疗剂。12.权利要求10的方法，其中所述的亲和性部分有效地特异性地与胂瘤特异性抗原结合。13.权利要求10的方法，其中所述的治疗剂是水溶性的。14.权利要求10的方法，其中所述的治疗剂是式I化合物和其可药用盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Rl是包含如2至4个N-原子或1或2个N-原子以及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基，且其是未取代的或被低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷硫基和/或囟素C-取代、和/或在能够被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的N-原子处N-取代，且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卣素。15.斥又利要求10的方法，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。16.权利要求10的方法,其中所述的二价阳离子骨架包含二价阳离子，诸如钓离子、锌阳离子或镁阳离子。17.权利要求10的方法，其中所述的二价阳离子骨架包含阳离子脂质。18.权利要求10的方法，其中所述的脂质体组合物具有约10至约500纳米的平均粒度。19.权利要求10的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲水性聚合物。20.权利要求10的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲和性部分。21.脂质体组合物，其包含含有治疗剂的二价阳离子骨架。22.权利要求21的组合物，其中所述的治疗剂是水溶性的。23.权利要求21的组合物，其中所述的治疗剂是式I化合物和其可药用盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>其中Rl是包含如2至4个N-原子或1或2个N-原子以及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基，且其是未取代的或被低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或闺素取代的苯基、或被低级烷氧基、羟基、二-低级烷基M、低级烷硫基和/或卣素C-取代、和/或在能够被低级烷基、低级烷氧基和/或卤素取代的N-原子处N-取代，且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卣素。24.权利要求21的组合物，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。25.权利要求21的组合物，其中所述的二价阳离子骨架包含二价阳离子，诸如钙离子、锌阳离子或镁阳离子。26.权利要求21的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲水性聚合物。27.权利要求21的方法，其中所述的脂质体组合物还包含亲和性部分。28.脂质体组合物，其包含(a)治疗剂；(b)二价阳离子骨架；(c)亲水性聚合物衣层；和(d)任选的亲和性部分。29.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的亲和性部分是有效地特异性与在乾表面上的细胞表面受体结合的配体。30.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的亲和性部分有效地特异性地与肺瘤特异性抗原结合。31.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的治疗剂是水溶性的。32.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的治疗剂是式I化合物和其可药用盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Rl是包含如2至4个N-原子或1或2个N-原子以及1个O-或S-原子的杂原子的5-元杂芳基，且其是未取代的或被低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷硫基和/或卤素C-取代、和/或在能够被低级烷基、低级烷氧基和/或卤素取代的N-原子处N-取代，且R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卣素。33.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。34.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的二价阳离子骨架包含二价阳离子，诸如钙离子、锌阳离子或镁阳离子。35.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的二价阳离子骨架包含阳离子脂质。36.权利要求28的脂质体组合物，其中所述的脂质体组合物具有约10至约500纳米的平均粒度。全文摘要公开了哺乳动物个体的基于脂质体的治疗方法。所述的方法使用脂质体和/或具有含有与治疗所靶向的生物表面有效地特异性结合的亲和性部分的外表面的脂质体和亲水性聚合物衣层。亲水性聚合物衣层由与表面脂质成分共价连接的聚合物链组成。在所需的脂质体生物分布实现后，亲和剂结合于靶表面并帮助脂质体的内化。文档编号A61K31/662GK101252912SQ200680031484公开日2008年8月27日申请日期2006年8月31日优先权日2005年9月1日发明者J·奥戈尔卡,J·张,S·库马尔,W·江申请人:诺瓦提斯公司