专利名称：改善细胞对杂质粒子渗透性的方法
技术领域：
本发明涉及改善细胞对杂质离子渗透性的组合物和方法，所述杂质离子包括本发明的探针。
技术背景
细胞是活的生物体的基本单位。几乎所有细胞的 一个 共有的特征是他们都^皮细胞质膜所环绕(或约束)。细胞膜包裹 细胞内含物并调节物质运动进出细胞。只有能够扩散穿过细胞膜 或萍皮运输穿过细胞膜的分子肯以移动进出细月包。有些可以穿过脂 质中心，有些必须乂人空中穿过。还有一些其它的分子，必须以一 种能量依赖的形式与载体相附着才能穿过细胞膜。同样，细力包核 和其它细胞器官也具有膜结构来调节分子流动进入或流出细月包 器官。
固定是一种化学过程，能够在一种位置"放置"细胞 分子，从而可以研究细胞或组织。大多数用作固定剂的试剂(例 如，醇和醛，其中醇例如乙醇，醛例如多聚曱醛)是通过与细胞 分子，尤其是蛋白质相交联而起作用的。这些交联过程防止胞内 结构的降解。许多固定剂非常适于通过不同的识别方法来保护不 同的胞内分子和结构物。以任意目的被选择的这些固定剂可以通 过这些目的的特点所决定。
不幸的是，目前的固定方法经常会妨碍随后研究员或 者医生进4亍的细月包内成分4企测。才奐句话说，能够预防细月包降解和 固定的方法同才羊可以妨石寻i午多依赖于大尺寸4企测分子的不同类 型的研究和诊断。据此，人们进行了很多努力来渗透细胞或在固 定后制造渠道。
目前使用的在固定之后渗透细胞膜的方法并不是对 所有样本都是有效的，且十分严格(因此，破坏被研究的结构) 和/或需要昂贵的仪器。例如，Hoffman等(美国专利第6,835,393 号)7>开了聚羧酸聚合物的应用和只用在无固定的才羊品中的用 于破坏细胞膜的pH值。Connelly等人(美国专利第5,597,688和 5,422,277号)公开了带有2,4 - 二硝基苯磺酸，2,4 - 二硝基安 息香酸或2，4- 二硝基苯的组合物在细胞膜固定和渗透方面的应 用，但是这些组合物限制研究员或医生选择固定剂，且因此，限 制必需的实验灵活性。机械性方法，例如超声波降解法、电穿孔 等等通常只对未固定的样品起作用且需要昂贵的仪器。
另外，现有技术中对许多胞内靶分子，例如病原体来 讲可利用的研究和i貪断方法依赖于显微4竟评1"介、细爿包形态学参 数、染色性质和确定的法分子的存在和缺失。但是，这些诊断方 法中有许多并不完全准确或不足够灵敏。
目前最需要的是能够改进样品细月包"莫对杂质4立子;参 透性的组合物和方法，所述杂质4立子例如带标记的4全测分子。另 外，还需要的是能够改进胞内靶分子和病原体的检测的组合物和 方法。发明内容
在一个实施方案中，本实验通过体内杂交能够直接将靶分子或靶分子片断从细胞中检测出来，其中所述细胞来自细胞培养基或来自从病人身上获得的样品。在一种优选i也实施方案中，所述细月包是病原体。该方法由几个步骤组成，这些步骤4尤选^E不必须地按照所列出的顺序进行。将培养基或样本中的样品沉淀到玻璃4反上。将样品在JE皮璃;f反上用加热或者用固定剂固定。所述固定剂可以是，例4口，曱醇、甲醇乙酸、丙酮、甲醛或福尔马林。用IDF溶液处理固定样品(参见上下文)，并对才羊品进4亍染色或用探针检测并观察。作为选择，将样本与IDF溶液相混合、培养，然后涂4未或放置在玻璃^反上，风干并固定。IDF溶液可以由以下试剂的任意混和物组成离液盐(例如，好u^C盐酸胍或氬氯化物)、离子型去污剂(例如十二烷基磺酸钠)和/或非离子型去污剂(例如，IPGEL、脱氧胆酸、胆酸或胆汁盐类)或其他具有相似性质的试剂、曱醇和乙酸。各种试剂在IDF溶液中的浓度依赖于例如被检测的病原体的细胞壁。尽管本发明不受任何理^仑或机制的限制，但是应该相信，IDF溶液能够在病原体的细胞壁和/或膜(细胞膜或核膜)上制造"渠道"。这些渠道允许探针渗透细胞壁和细胞膜并进入病原体原生质和/或细胞核。本发明的探4十可以包括DNA、 RNA、 PNA、肽、糖肽、脂肽或醣脂类，或上述物质的任意混和物。样品中被固定的细胞的耙分子与探针复合物(所述探针复合物包括对靶分子有特异性的结合试剂)相4妄触，所述探针复合物在适于杂交或结合的情况下对靶分子具有特异性(例如，如Shah和Harris在美国专利第6,165,723中描述的那样，该专利通过引证在此全部并入本文)。然后，乂人样品中洗 掉未杂交的或未结合的探针。在一个实施方案中，对被洗涤的样品用适当的复染色剂(例如，伊文思蓝、DAPI、高锰酸钾等等)染色。通过例如显微镜，视觉4全测杂交的活结合的#:针复合物，探针复合物的存在是细胞靶分子存在的一种信号。该方法可以在不同的杂交緩冲液中进行，Shah和Harris在美国专利第 6， 165,723号中公开了本发明的 一些非限制性实施例，该专利通过 引证在此全部并入本文。使用的杂交緩冲液由使用的纟笨针性质决 定。本发明的方法对于检测细胞、细胞要素是有效的，且优选地 对检测样本的病原体也是有效的。例如，这里7>开了非限制性的 特异性探针复合物，所述复合物可有效用于;f全测分歧杆菌类病原 体。
本发明的方法在例如检测来自多种样本的核酸、肽、 醣肽、脂肽和醣脂是有效的。作为例子的样本包括，例如，细胞、 细月包型、组织或重要的病原或病原体，包括，或者书f生自例如血 清、原生质、唾液、尿、脑脊骨逸液、组织和乳液。本发明的《且合 物和方法可以在来自任意生物的任何样本中 <吏用，所述生物包括-<旦不<又限于哺乳动物、爬4亍动物、鱼、鸟、才直物禾口昆虫。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加细;l包壁、细胞膜、细胞器官膜和核力莫渗透性的组合物(IDF溶液)， 所述组合物在一个实施方案中包括GuSCN (石克氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙氧基)乙醇)、 醋酸、曱醇、胆酸钠和脱氧胆酸钠。本发明进一步预计硫氰酸胍 的浓度是大约2.0到3.3M;Tris-HCl的浓度大约是10到100 mM; Tris-HCl的pH值大约是7.0-9.0;乙二胺二乙酸的浓度大约是5 到50 mM; IGEPAL的浓度大约是百分之0.1到2.0;醋酸的;农度 大约是百分之0.1到10.0;曱醇的浓度大约是百分之20到50; 胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到2.5，脱氧胆酸钠的浓度大约 是百分之0.02到2.5。
在其他实施方案中，石克氰酸胍》爰沖滴j皮浓度为大约 2M到6M的盐酸胍所取代。在另一个实施方案中，IGEPAL #皮浓度为0.01% - 2.0%的十二烷基磺酸钠所取代。在依旧另一个实施 方案中，硫氰酸胍与盐酸胍结合使用和/或IGEPAL与十二烷基磺 酸钠结合4吏用。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于给细胞中 靶分子染色的方法，该方法包括a)将细胞与包括GuSCN (硫 氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙 氧基)乙醇)、醋酸、曱醇和脱氧胆酸钠的组合物相4妻触从而产 生一种具有通透性的细胞；b)将步骤a)所得的具有通透性的细 胞与一种能够与所述靶分子特异性结合的结合试剂相接触，和c) 才全测步骤b)所述的结合试剂。
在其他方面，本申请预期上述方法的靶分子选自由， 例如核酸、肽核酸、肽、糖蛋白、脂类、脂蛋白、病毒、朊病毒 和支原体所《且成的《且中。
在其他实施方案中，本发明预期结合试剂选自由核 酸、肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白、抗体或抗体片断和脂类所组成的ia中。
本发明的结合试剂可以另外包括一种检测基团，此枱r 测基团可以选自由例如荧光标记、放射性标记、染料、胶态金属、 生物素/抗生素蛋白、山葵、过氧化物酶等等所组成的组中。在一 种有选的实施方案中，检测是通过一种标记的抗体，该抗体对耙 分子抗原具有亲和性。 一种包括^r测基团的结合试剂在这里^皮定 义为探针复合物。
在一个实施方案中，在试管中用IDF溶液处理临床样 品，随后煮沸从而在溶液中释放核酸。这一技术对于耙分子，例 如分歧杆菌、真菌和酵母是有效的，其中所述酵母需要利用例如机械水解(例如，通过超生作用)或与酶长时间培养的方法来消化细胞壁。重要的革巴分子可以进一步#1以下步骤纯化(1 )才示准 DNA纯化技术或(2 )使用特异性探针进行三明治杂交技术。然 后如果需要的话，在检测之间可以分别通过PCR或RT-PCR才支术 扩增纯化的靶分子DNA和RNA。
在一种更为优选的实施方案中，革巴分子是来自肺结核 分歧杆菌樣支生物的核酸，且结合试剂是 一 种与来自肺结核分Jt支4干 菌微生物的核酸互补的寡聚核苦酸(或PNA探针)。
在另一个方面，该方法还包括背景染色/人而更高的加 亮或显现检测基团。背景染色和染色技术对于本领域普通4支术人 员来讲是已知的。
具体实施方式
本发明基于一种发现，此发现是一种改进的方法，此 方法通过体内杂交的方式能够使探针渗透进细胞(例如一种病原 体)的细胞壁和/或细胞膜，从而4企测来自培养基或个体(例如， 血涂片、活组织检查切片、石蜡包裹的组织和)样本的细胞中輩巴 分子核酸、蛋白质、肽、脂肽、醣肽、脂质体等等的存在。本发原体可以在例如，唾液、全血、中枢脊髓液(CSF)、其他体液或 受感染的组织中发现。更具体的，这里描述了对于传统的固定/ 预处理方法的新型改进，这种改进允许探针(例如，寡居核苷探 4十)渗透进入细月包(例》0，病原菌，比3口，细菌、病毒、真菌、 酵母和原生动物)，这些可以^立于^皮感染的宿主细月包的内侧或外 侧。另外，在与荧光标记的探针进行杂交之后进行一种具有复染 剂(例如，DAPI、伊文斯蓝、高锰酸钾)的过程，从而允许带 有杂交探针的生物体在培养基或临床样品中更加容易观察到。
这里描述的新颖独特的体内杂交预处理过禾呈、4全测技 术和本发明组合物允许在细胞、孩i生物或组织部分中4吏用重组 DNA、 RNA、 PNA、肽、醣蛋白、月旨类和醣脂作为4罙4十，且与细 菌学、寄生虫学、组织学和病理学实—验中常用的显賴U竟才企查方法 相匹配。本发明对样品细胞(或组织)使用了经过预处理的核苷 序列的核酸探针，并通过例如显微镜、电子显微镜、流式细J包计 数或放射成像(例如，X-射线成像、磷成像)的方法检测样品， 从而确定哪些细万包(或组织)含有重要的特异性革巴分子(例3口才亥 酸序列)。因此，在感染的全血涂片或组织切片中，病原-微生物 例力口细菌、病毒、原生动物或真菌可以在净皮感染的细月包之内斥企测 出来。这种方法提供了游泳的诊断和科学信息，因为特异性核酸 的存在或缺失与 一 种或 一 种以上的可观察到的结构和形态学有 关，且在这种情况下，提供了临床诊断和预后。
用于乂人标本中直4妻发现輩巴分子核酸片卓殳的方法有以下 步骤组成，优选的，这些步骤4姿照所列顺序进4于。首先将乂人个体 处获得的样品;故置在载玻片上。用固定剂(例如，曱醇、曱醇-乙酸固定剂或者福尔马林醋酸固定液)将样品固定在载玻片上。 一旦样品被固定，用本发明的组合物和方法渗透样品细胞。估支为 选择，在试管中将样品与IDF溶液混合，培养然后放置在载^:片 上，风干并固定。然后，在适于杂交的条件下用对靶分子有特异 性的探针接触细胞。
在杂交足够时间之后，从样本中洗去所有未杂交的探 针。在一种优选的实施方案中，随后将样品与一种复染色剂(例 如，伊文思蓝、高锰酸钾等等)相接触。无论样品是否被复染色 了，则与样品靶分子杂交探针可以通过例如显微镜检查法进行视觉才企测。在样本中#:针的存在是靶分子片#殳存在的一种表现。与本发明原位杂交试同时或者顺序进行的复染色样品能够清除的确定样品中靶分子的位置，乂人而^是高本发明方法。这种4言息有 助于更清楚的确定基质杂交作用。
本方法适用于从个体获得的任何样品。这包括zf旦不4又 限于，全血、血清、血浆、痰液、尿、母乳、大脑脊髓液和组织。 本方法还适合于纟果测昆虫质粒、昆虫细胞、才直物细月包、真菌和细 菌细胞内的病原体或者其他靶分子。
固定细胞或者组织的目的是将细月包固定并^f呆持细i包或 者组织的形态学，使细胞成分，例如，RNA在原位杂交期间净皮 维持在细胞基质之内，并同时交联和/或沉淀在细胞基质中的蛋白质，因此细胞或者组织对探:针:;參入和随后的杂化作用^f呆持基本上开》文的结构。
在一种优选的实施方案中，本发明的揮:针包括，例如 合成的或者生物学上生产的核酸(DNA、 RNA和等^f介物)；；肽 核酸(PNA;和等《介物)；包含特异性核酸的肽(和等价物)或 者在精确条件下与特异性细胞靶分子杂交的肽序列。在另 一实施 方案中，本发明的探针包括合成的或者生物学上生产的糖肽、脂 肽和朊病毒或者在精确的条件下与细胞内特定的靶分子结合的 朊病毒-样分子(或者其等价物)。
探针复合物的定义是包括一种标记物基团的探针，所 述标记物基团适合于检测过程。如果探针是一种核酸，标记物基 团附属于5'末端、3'末端、内部或者在其任何一种结合物中。优 选的标记物基团是一种识别标记，例如》文射性同位素示踪(例如， p32、 I125、 H3)、生物素标记或者荧光标记。做为选择，所述探针 具有一种标记的聚脱氧核苦酸尾部，该聚脱氧核苷酸尾部^皮用来斗全测探针复合物。该探针复合物可能还由多种不同的核酸序列、 PNA、肽、糖肽、脂肽或者朊病毒或者包括一个或一个以上标记物基团标记的其任何一种结合物组成。如果大于一个一个纟罙4十基 团被标记，则最好用不同的标记物基团来标记每一探针基团。
寡聚核苷酸探针的核苷酸序列核苷酸序列基本上与至 少至少一部分耙分子耙分子核酸互补。靶分子核酸既是一种在固定细胞或者组织之内正常存在的核酸，又是，喉支为选择，在与异探针复合分子优选由DNA或者RNA片段组成，DNA或者RNA 片^a的大小在大约10-50个核苷范围内。
肽探针包括，例如，抗体及已知能够结合少见定的耙分 子或靼分子范围的其他分子。非抗体探针的实施例包4舌，例如， 酶和酶底物和其作用部分。另外，已知的药物或者化学试剂可以 选择性地结合革巴分子蛋白质(例如，抗生素可以结合细菌)。例 如，脂肽具有在细胞中检测脂质体基团的用途，所述细胞包括细 月包中的特异性细月包器或者细月包器部分和内在4匕细菌。例如，#唐肽 妨碍血小^反凝聚并因此可以用来耙向在血小々反起作用过程中必 需的分子，由此帮助凝结异常的研究和诊断。朊病毒或者朊病毒 一部分可以-陂用作，例如，对神经学组织的揮:4十。同才羊，朊病毒 可以是固定样品中的耙分子。
在一种优选的实施方案中，被添加给样品的探针多于 輩巴分子(例如，10:1、 100:1或者1000:1 )。这可以4吏杂交杂交反应有效地进行并促进^:针靶分子的结合。
通常通过在纟羊品上添加一种纟果4f溶液，〗吏纟果针复合物(包括，例如，DNA、 RNA和/或PNA)与固定样品的样品輩巴分 子(例如，核酸)相接触。适合于杂交作用的示范性的条件是能 够提供适当的緩沖液环境的溶液。适用于杂交作用的溶液的一些 实施例是1 ) 一种包括大约10%到50%的曱酰胺、2X.SSC ( pH7.4)和1% NP40的4C沖液；2) —种包4舌大约1.5 M到4 M的 GuSCN緩沖液、5MGuSCN原料緩沖液的緩冲液；其中GuSCN 原料纟爰沖液由5 M GuSCN、 100 mM Tris曙HC1 ( pH 7.8)、 40 mM 乙二胺四乙酸、P/。NP40所组成。通过加入IxTE pH 7.8来3希释 库存缓沖液到指定的GuSCN摩尔浓度，乂人而产生上面^是到的 GuSCN -爰冲液的摩尔浓度。3) —种包括大约2到6 M GuHCl 緩冲液的緩冲液。8 M GuHCl緩冲液由8 M GuHCl、 200 mM Tris 隱HC1、 (pH7.8)、 40mM乙二胺四乙酸、P/oNP40所组成。通过 加入IxTEpH 7.8来稀释库存緩冲液到指定的GuHCl摩尔浓度， 从而产生上面提到的GuHCl緩冲液的摩尔浓度。4)一种包括曱酰 胺(20 - 50% )和GuSCN緩沖液的混合物的緩冲液，(例如，0.5M 到3M)。 5)—种包括GuSCN緩冲液、(例如0.5M到3M)和 GuHCL緩沖液(例如IM到5M)的混合物的纟爰冲液。
具体的组合物和杂交|￡沖液的浓度随揮:针的种类或 使用的探针组合物的不同而变化。组合物和使用的緩冲液的浓度 还依赖探针的于Tm(熔化温度双链DNA分离形成两个互补单链的温度)、揮:针序列、揮:针长度和杂交温度，本领域技术人员 只需进4亍常^见实-验方法就可以确定所述组合物和4吏用的l爰冲液浓度。
本发明不局限于1壬<可一种具体的杂交温度，然而，应 该理解，在杂交緩冲液中利用曱酰胺可以使杂交作用在比标准杂 交过程4氐得多的温度下进4亍。例如，在水相杂交纟爰沖液，例4口氯 化钠中，对靶分子有特异性(对宿主细胞没有特异性)的普通探 针复合物通常需要的温度大约是60 - 65 :摄氏度。在上述杂交液 l)中进行的相同杂交作用在大约42摄氏度下进行，且具有相等 的特异性。
同才羊，GuSCN的4吏用也能够4吏杂交作用在比标准杂交 过程低得多的温度下进行。例如，在普通步骤中，在水相杂交緩 冲液，例如氯化钠中，对靶分子有特异性(对宿主细胞没有特异 性)的普通探针复合物通常需要的温度大约是60 - 65摄氏度。 在GuSCN或者GuHCl杂交緩冲液中进行的相同杂交作用在大约 37摄氏度下进行，且具有相等的特异性。
在杂交作用完成之后，通常通过使用 一系列洗涤緩冲 液洗涤从样品中洗去未杂交的探针。本领域技术人员能够确定适 当的洗涤緩冲液和洗涤时间。在一个实施方案中，洗涤緩冲液包 括0.3M的氯化钠、0.03M的柠檬酸钠、和0.1o/。SDS。另 一种 适当的洗涤緩沖液包括磷酸盐緩沖盐水(PBS)。
在洗清之后，可以对样品进行复染色。在一个实施方 案中，背景的复染色能够提高杂交探针的显色。优选的复染色剂 是，例如，DAPI、伊文思蓝和高4孟酸钾。本领域技术人员已知 一些其他适当的复染色剂。当使用荧光标记的探针来检测对靶分 子有特异性的核酸、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白时，通常会用到染 色步骤。尽管有一定帮助，但是本发明的实施方案不需要进4亍复 染色。
通过使用适合特异性基团的方法来检测探针，其中所 述特异性基团被用于标记探针复合物。检测荧光标记探针的优选 的方法是使用例如，特殊的绿色、红色和蓝色显微镜过滤器(即， 荧光显孩H竟检查法)。通过例如自动射线照相术和磷光剂成^f象4支 术可以检测到杂交的放射性标记探针。生物素标记的探针可以通 过酶催化检测系统检测，这种检测系统是可商业购得的。
通过与4采针复合物进行反应，上面描述的方法可以在 单一临床样品中同时检测到不同的病原体，所述纟采针复合物由i午多不同的核酸序列组成，每个都用不同的标记物基团标记。为了同时冲企测不同的寡聚核苷酸揮:针，它们可以祐:i殳计成所有的揮:4十 复合序列具有非常相似的Tm (熔化温度)值，其中，所述寡聚 核苷酸探针对存在于样品中的不同靶分子的不同核酸具有特异 性。然后用不同的可4企测基团(例如，不同的荧光基团)标i己每 一特异性寡聚核苷酸。用含有许多组分的探针复合物进行杂交。 杂交的样品按照上边的表述进行处理，并通过适合于检测4果针复 合物不同标记的寡聚核苷酸的方法^L察才羊品(例如，如果〗吏用不 同的荧光基团的话，则使用适当的过滤器观察)，从而检测在样 品中存在哪些靶分子。
本领域普通技术人员和医师可以识别与这里描述的原位杂交过程共同 <吏用的新型预处理过程与所有过去已知的监测 方法和这里描述的方法兼容，且并不祐 使用的4企测方法所限制。 原位杂交过程已经被革新，因此需要更少的操作，且因此能够在 很短的时间内进行。本发明的实施方案还包括试剂盒，所述试剂 盒包括本发明的组合物。以试剂盒形式存在的组合物能够允许这 里所描述的过程以多种不同的实施方案实施，这里描述的过禾呈包 括已经与多种检测方法进行简明性和兼容性优化的方法。可以预 料，这里制备的包含特别制备的试剂和探针的试剂盒更适合于在 临床/诊断实验室中应用，在临床/诊断实验室中，检测特异性 核酸存在或者缺少的能力可以用来阳性地或者阴性地识别以具 体耙分子的存在为特征的病理状态。
现有^支术中对于多种细月包病变可用的i貪断方法耳又决于 微观评价、细胞形态学参数、表面抗点蚀特性、和某些靶分子的 存在或者缺失。然而，许多诊断方法并不完全准确或者不充分壽文 感。在原位杂交过程忠使用上面描述的规程和病原体特异性探针，能够比较容易且更加准确的识别样品中的靶分子(包括但不ff曰.工4広乂Jr 、|> j > 7PV/;r、Y十、乂0
本发明提供了一种用于原位杂交过程的简单的预处理 方法，这些方法提高了探针对细胞的渗入性，且因此，与过去所 描述的过程相比改进了杂交和才企测特性。这种改进包^舌通过增加 特异性"信号"的杂交和探测效率来最大化试验的敏感性。尽管本 发明不局限于任何一种具体的机制，人们普遍相信增加的灵4文度 是由于改进的杂交过程，杂交过程是通过改进^笨针对细胞的渗透 作用来实现的，同时最大化靶分子(例如核酸序列)在细胞或者 组织中的保持力且最大化细胞或者组织样品的另 一 种生物化学 和形态特征的保存。实施例
—种上述方法优选的且非限制性使用在于从培养基或 从痰液中才全测结核分枝杆菌。本领域普通技术人员应该了解并理 解，新型的方法同样适合于多种其他系统、细胞、组织培养和组 织，用于与重要的特异性核酸杂交(或者4企测^^细月包、组织或者 病原体其4也的细"包组分)，同时l呆持细力包完整和形态学。实施例
将培养物或者病人的痰液涂在玻璃平板上，并风干。 洗涤被培养的细胞并通过离心作用浓缩。将洗涤的细胞悬浮在带 有BSA的磷酸盐緩冲液中。为了4吏细胞失活，在100纟聂氏度下 煮沸悬浮的细"包15分钟。才羊品制备方法1
用1 ) NALC/NaOH或2 ) NALC/NaOH处理痰液随 后在100 l聂氏度下煮沸经过处理的痰液15分钟，4吏样品失活， 或3)用离液序列高的溶液，例如，盐酸胍或石充^碌u酸盐(简单 的i兌，才目对于疫液2隱3个体积、的5 M GuSCN或8 M的GuHCl才目 混合)处理痰液。在37才聂氏度下培养样品20分钟。离心才羊品4吏 细胞成J求状。用^粦酸盐緩沖溶液洗涤细胞。将洗涤后的细力包悬浮 在带有1。/。 BSA或4) 一种离液序列高的溶液，例如，盐酸胍或 硫代硫酸盐的磷酸盐緩冲溶液中，随后煮沸(如上面步骤3所述)， 此外，在100摄氏度下煮沸悬浮在带有1。/。BSA磷酸緩冲液中的 细月包15分钟，从而杀死分纟支4干菌。随后将所-彈的培养物或痰液 才羊品涂布到^皮璃纟反上，然后风干。
用甲醇或乙酸甲酯或乙醇固定样品。用IDF溶液处理 固定的涂片(如Supra所公开的)10分钟。IO分钟之后，用磷 酸》爰冲液洗涤涂片3次，并风干。才羊品制备方法2(Supra)在试管中混合并在室温(20-25摄氏度)下混合15分 钟。随后将痰液-IDF混合物涂布到玻璃4反上，风干并用曱醇固定。 省去杂交之前对固定涂片进行的IDF处理过程。在杂交之前用磷 酸緩沖液洗涤玻璃板3次。才羊品制备方法3
在20-25摄氏度下(室温条件下)用含有2 %的戊二 醛的磷酸緩沖液处理玻璃^反上甲醇固定的痰液-IDF混合物5分 钟，然后用磷酸緩冲液洗涤三次，并风干。省去杂交之前对固定 涂片进行的IDF处理过程。才羊品制备方法4
将1体积的未处理过的病人痰液与两体积的IDF溶液 (Supra)在试管中混合并在室温(20-25摄氏度)下混合15分 钟。将痰液-IDF混合物煮沸15分钟来释;^文溶液中的核酸并同时 4吏才羊品无传染性。通过标准才支术可以将核酸乂人煮沸的样品中纯化 出来，或者所需要的靶分子核酸可以使用特异性探针和磁珠通过 三明治杂交筛选出来，如Shah等人所述(Shah J. S.， King W， Liu J.， Smith J., Serpe G. and Popoff S.， and. (1997) . Assay improvements. 美国专利第5，629，156号。该专利通过引证在此全部并入本文)。 通过PCR (对于DNA靶分子)或RT-PCR (对于RNA靶分子) 过禾呈可以扩增纯4匕的草巴分子。样品探测
—种寡聚核苷酸揮:4十由一种DNA序列组成，所述 DNA序列能够特异性的与肺结核分歧杆菌的23 S核糖体RNA杂 交，^口 Shah, Nietupski和Liu(美国专矛j第5,521,300号)戶斤述。声斤 述寡聚核苷酸优选的用语4全测细月包中肺结核分歧杆菌的存在。合 适的探针复合物的例子是PI. TB探针5'_罗丹明纟录-AGA — ACA — CGC - CAC — TAT - TCA _ CAC —GCG — CGT — ATG — C - 3 ' [SEQ ID NO: 1] 66.5cP2 -Tb-1 51-2c5'-罗丹明纟录—TTC _ GAG — GTT — AGA — TGC — CC - 3' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧杆菌探针5'陽荧光淬灭基团陽ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC隱3' [SEQ ID NO: 3] 68.7cP4 —分歧杆菌属揮:4十-54.1c 5'-荧光淬灭基团—GCA — TTA — CCC — GCT — GGC画3' [SEQ ID NO: 4]P5 -伯克霍尔德氏菌探针5' — FAM — CTT — GGC — TCT — AAT — ACA — GTC — GG - S' [SEQ BD NO: 5] tm52cPNA探针.
在一个实施方案中，在37摄氏度条件下，该探针复 合物与经过固定/预处理的样品中的核酸相4妄触，其中，所述经过 固定/预处理的才羊品<立于2.5 M GuSCN， 50 mM Tris (pH 7.8), 20 mM乙二胺四乙酸和1%NP40的杂交緩冲液中。在一个可选择的 实施方案中，该揮:针复合物在42才聂氏度下与固定样品中的核酸 相接触，所述固定样品位于50 %甲酰胺，2X SSC (pH 7.4), 20 mM乙二胺四乙酸，1%NP40的杂交緩沖液中。
用于检测分歧杆菌属的交替探针复合物中使用的合 适的寡聚核苷酸序列的例子是P2 -Tb-1 51-2c5'陽罗丹明纟录_ TTC _ GAG — GTT — AGA _ TGC — CC — 3 ' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧杆菌属探针5'-荧光淬灭基团 -ATC GCC CGC ACG CTC ACAGTTAAGCCGTGAGATTTC -3'[SEQIDNO: 3] 68.7cP4 -分歧杆菌属揮:针-54.1c 5'-荧光淬灭基团—GCA — TTA _ CCC — GCT _ GGC - 3' [SEQ ID NO: 4]SEQIDNOs:3和4及其互补序列适用于检测分歧杆菌属。 SEQIDNOs:l和2及其互补序列适用于4企测肺结核分歧杆菌。 SEQIDNO: 5适用于才企测伯克霍尔德氏菌。
由于在细菌细胞中存在大量的rRNA ( 1,000- 10,000 拷贝)，所以在检测分歧杆菌病原体时选择使用核糖体RNA序 列。优选的探针复合物的寡聚核苷酸是一种DNA,该DNA带有 与肺结核分歧杆菌rRNA的互补序列。优选用荧光素在3，和5， 末端对寡聚核苷酸进行标记。应当理解，RNA寡聚核苷酸探针 同才羊也可以^皮z使用。
如上所述，揮:针总量是一种预计的量，该量应该超过 ^=羊品中可能具有的可利用rRNA的估计量(大约100 : 1 ), 乂人而 使杂交反应更为有效且能够促进高速率的探针靶分子退火。在 定量术语中，这需要探针由30个核苷长度的寡聚核苷酸组成， 且使用的浓度范围为1-10 ng/ml，从而在背景上产生可靠的信号。
应当理解，使用GuSCN还能够使杂交过程在比普通 杂交过程低得多的温度下进行。对靶分子有特异性(但对宿主细 胞无特异性)的特异性探针在水相杂交溶液，例如氯化钠中进行 杂交作用，需要大约60-65摄氏度的温度。但是在上述GuSCN 或GuHCl杂交緩沖液中进行的杂交作用在37才聂氏度下就可以确 保专一性。
原4立杂交方法的 一 个 <尤势在于相7+少量的细"包包4舌 一种样品，大量的一致才羊品可以在短时间内^皮处理。这里所描述 的独特的原位杂交方法是十分简单的。本发明的方法还可以用于 很多样品中，包括，但不仅限于石蜡包裹的组织部分、丙酮固定 的样品。
这些试验的结果显示出在被试验的样品中检测到靶 分子(病原体DNA)，在对照样品中没有才企测到輩巴分子。在用本 发明IDF溶液处理过的样品中检测到的輩巴分子通常比较好。在不 进行过度试验的情况下，本领域普通技术人员应当可以认识、理 解并明白本发明的IDF溶液可以在许多需要4罙4十(或其他小物 质)有岁丈进入细月包、病原体(例如，l立于细月包中的病原体)或细 胞器官的情况下使用。
从以上叙述可以明白，本发明^是供了用于增加细胞、 细胞壁、细胞膜、细胞器官和细胞器官膜渗透性的组合物和方法， 用于帮助，例如才企测细月包内成分和/或病原体。
权利要求
1.一种用于增加细胞壁、细胞膜和核膜渗透性的组合物，包括GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、甲醇、氯化钠和脱氧胆酸钠。
2. 根据4又利要求1所述的组合物:约是2.0到3.3 M。
3. 根据权利要求1所述的组合物:大约是10到100 mM。
4. 根据权利要求1所述的组合物:值大约是7.0到9.0。
5. 根据权利要求1所述的组合物, 度大约是5到50 mM。
6. 根据权利要求1所述的组合物， 约是百分之0.1到百分之2.0。
7. 根据权利要求1所述的组合物， 百分之1.0到百分之10。
8. 4艮据权利要求1所述的组合物, 百分之20到百分之50。
9. 才艮据纟又利要求1所述的组合物, 是百分之0.02到百分之2.5。3核膜渗透性的组合物，包括 CL、乙二胺四乙f臾、IGEPAL乙醇)、乙酸、曱醇、氯4b钠 其中所述好L氰酸胍的浓度大其中所述Tris - HCL的浓度 其中所述Tris - HCL的pH 其中所述乙二胺四乙酸的浓 其中所述IGEPAL的浓度大 其中所述乙酸的浓度大约是 其中所述曱醇的浓度大约是 其中所述^^酸钠的浓度大约
10. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱氧胆酸钠的浓度 大约是百分之0.02到百分之2.5。
11. 一种用于对细月包中草巴分子染色的方法，包4舌a) -使细月包与 一种组合物相4妄触乂人而产生一种可渗透细月包，所述组合物包 括GuSCN (碌u氰酸胍)、Tris - HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、曱醇、氯化钠 和脱氧胆酸钠；b)将步骤(a)的可渗透细胞与对结合所述 靶分子有特异性的粘合剂相接触，和；c)一全测步骤(b)所述 的粘合剂。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述靶分子选自由核酸、 肽核酸、肽、糖蛋白、脂质体、脂蛋白、病毒和朊病毒所组 成的《且中。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述粘合剂选自由核酸、 肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白和脂质体所组成的组中。
14. 才艮据4又利要求11所述的方法，其中所述粘合剂还包括一种 才企测基团。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中检测基团选自由荧光标 记物、放射性标记物、染料、胶态金属、生物素/抗生物素蛋 白和山葵过氧化物酶所组成的组中。
16. 才艮据权利要求11所述的方法，其中所述4企测作用是通过一 种对所述粘合剂有亲合性的标记抗体完成的。
17. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述GuSCN的浓度大 纟々是2.0多J 3.3 M。
18. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述Tris-HCL的浓度 大约是10到100 mM。
19. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述Tris - HCL的pH 值大约是7.0到9.0。
20. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述乙二胺四乙酸的 ;农度大约是5到50 mM。
21. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述IGEPAL的浓度大 约是百分之0.1到百分之2.0。
22. 一艮据权利要求11所述的组合物, 是百分之1.0到百分之10。
23. 根据权利要求11所述的组合物， 是百分之20到百分之50。
24. 4艮据4又利要求11所述的组合物， 约是百分之0.02到百分之2.5。其中所述乙酸的浓度大约 其中所述曱醇的浓度大约 其中所述胆酸钠的浓度大
25. 才艮据^又利要求11所述的组合物，其中所述脱氧月旦酸钠的浓 度大约是百分之0.02到百分之2.5。
26. 根据权利要求11所述的方法，其中所述靶分子是一种来自 孩吏生物结核分枝杆菌的核酸。
27. 根据权利要求11所述的方法，其中所述粘合剂是一种与来 自孩t生物结核分枝杆菌的核酸互补的寡聚核苷酸。
28. 根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括背景染 色法。
全文摘要
本发明提供了一种方法，用于允许杂质离子非常有效的渗透细胞的细胞壁、细胞膜、细胞器官膜和/或核膜，并与细胞中的补体靶分子杂交或结合。所述细胞来自培养基或来自病人体内获得的样本。杂质离子可以是探针，所述探针由以下物质单独或两个或两个以上的结合体组成，例如DNA、RNA、肽核酸(PNA)、糖肽、脂肽、醣脂类或朊病毒。所述靶分子是一种细胞、一种细胞成分或者优选地一种病原体或病原体成分。所述病原体可以是例如细菌、真菌、酵母或者病毒。
文档编号A61K31/155GK101272773SQ200680035276
公开日2008年9月24日 申请日期2006年7月27日 优先权日2005年7月28日
发明者J·S·沙阿, 海伦娜·威奥特曼 申请人:Id-菲什技术公司