抗肌球蛋白VasiRNA和皮肤色素脱失的制作方法

专利名称：抗肌球蛋白Va siRNA和皮肤色素脱失的制作方法
抗肌球蛋白Va siRNA和皮肤色素脱失本发明涉及包括一条正义RNA链和一条互补反义認A链一起形 成RNA双链的新颖的分离siRNA，其特征在于该正义RNA链包括， 与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F的核苷酸序列中14至30个连 续核苷酸的片段相比，最多有一个不同的核苷酸的序列，本发明也涉 及包括至少一种上述siRNA的组合物，还涉及至少一种上述siRNA作 为化妆品或在皮肤色素脱失中作为治疗剂的用途。皮肤色素沉着是包括许多步骤的复杂过程。黑素细胞位于表皮的 基底层，可以通过内部或外部的刺激激活(例如，暴露于紫外线(UV) 照射)，在称为黑素体的与溶酶体相关的特化细胞器中产生黑色素。成 熟后，核周黑素体沿着微管和肌动蛋白细胞骨架转移至黑素细胞树突 外周(Lambert J等，Cell Mol Biol (Noisy-le-grand): 45: 905-18， 1999; HaraM等，J Invest Dermatol.: 114: 438-43， 2000; Vancoillie G等，J Invest Dermatol.: 114:421-9， 2000)。包括黑色素的黑素体然后从树突 的远端通过至今未知的机理转移至相邻的角化细胞。该复杂过程中步骤的任何改变可以导致皮肤色素沉着失调。特别 地，活化黑素细胞数量的增加，和/或黑色素产生的增加，和/或黑素体 从黑素细胞转移至角化细胞的增加可以导致皮肤的色素沉着过度(或 色素异常症)。这样的色素沉着过度可以由许多因素引起，如药物，日 晒，代谢或营养功能障碍，以及由遗传或自体免疫疾病引起。这对于 患者通常意味着严重的美学和心理后果，这些患者在许多情况中将寻 找合适的治疗。因此，人们已努力研发对色素沉着过度的有效治疗。大部分现有 的化学治疗包括靶向黑色素合成途径的色素脱失剂，特别是通过抑制 黑色素合成必需的酪氨酸酶的活性。这样的色素脱失剂特别包括氢醌 及其衍生物，视黄醇或维甲酸，抗坏血酸及其衍生物，胎盘提取物， 曲酸，阿魏酸，熊果苷，二羟基苯衍生物(WO00/47045),愈疮木酚 衍生物(WO00/47179), 4-(2，3-二羟基苯基)-环己醇(WO00/56279),间苯二酚衍生物(WO00/56702),酚酰胺(WO99/32077)。这些物质 可能具有特定的缺陷。它们可能是不稳定的，需要在高浓度使用，其 作用模式缺少特异性，或是毒性的或刺激性的。还已经研发了物理类型的治疗，如中等深度剥落，磨皮或激光治 疗。然而，这些治疗通常不太有效并引起不利的副作用，如炎症后色 素过少症或色素过多症的风险，黄褐病，或结疤，这些可能具有致癌 的后果(Briganti S等，Pigment Cell Res.: 16: 101-10， 2003; Haider RM， Nootheti PK. J Am Acad Dermatol.: 48: S143-48， 2003; Haider謹， Richards GM. SkinThrapy Lett.: 9: 1-3， 2004)。因此，存在需要来研发新的有效而可靠的色素沉着过度的化妆和/ 或治疗性处理。除化学处理外，抑制基因表达的另一种可能的途径是使用反义核 酸或使用称为RNA干扰的方f去(Dykxhoorn DM等，Nat Rev Mol Cell Biol.: 4: 457-67， 2003; SoutschekJ等，Nature: 432: 173-8， 2004)。RNA干扰(此后称为RNAi)是具有给定正义核酸序列的双链RNA (dsRNA)以一种相对于该核酸序列特异性的方式，使包含所述核酸序 列的所有信使RNA (mRNA)降解的过程。尽管最初在秀丽隐杆线虫 (Cae"or/wM/似e/eg(ms)中证明了RNAi过程，但现在人们清楚RNAi 过程是非常普遍的现象，并且已经实现了通过RNAi抑制人的基因。使用小干扰RNA (或siRNA)可以实现RNAi的过程。这些siRNA 是正义序列中包括与靶mRNA的片段高度同源，优选相同的，少于30 个核苷酸的dsRNA序列。当siRNA穿过原生质膜时，细胞的反应是破 坏siRNA和所有包括相同或高度同源序列的序列。因此，具有与siRNA 序列相同或高度同源片段的mRNA将被破坏，从而该基因的表达将得 到抑制。对于色素沉着过度的治疗，在现有技术中已经提出使用针对酪氨 酸酶或TRP-1蛋白的基因的反义寡核苷酸(WO01/58918),或针对酪 氮酸酶磷酸化过程中涉及的PKC pi蛋白的基因的反义寡核苷酸 (WO2005/073243 )。人们也已提出使用靶向酪氨酸酶基因的siRNA (WO2005膽536)。然而，所有这些基因涉及黑色素合成途径，对于针对不是涉及黑色素合成途径，而是涉及黑素细胞中黑素体的转运和转移到角化细胞 过程中靶基因的siRNA，还没有公开或提示。本发明人已经表明肌球蛋白Va蛋白涉及黑素细胞中黑素体的转运 (Lambert J等，Cell Mol Biol (Noisy—le—grand) : 45: 905—18， 1999; Lambert等，J Invest Dermatol.: Ill: 835~40， 1998)。更特别地，肌球 蛋白Va蛋白具有几个剪接变体，并且包括外显子F的变体是转运黑素 体必需的(WestbroekW等，J Jnvest Dermatol.: 120: 465—75， 2003)。然而，迄今为止，没有尝试过使用siRNA抑制包括外显子F的肌 球蛋白Va蛋白的变体，或将该方法应用至色素沉着过度的化妆或治疗 性处理中。本发明人发现了有可能通过合成靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的 siRNA，并由这些siRN诱导肌球蛋白Va蛋白外显子F特异性的RNAi 过程。它们还显示出在没有导致细胞活力降低的siRNA浓度下，所述 siRNA能有效地抑制包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的变体的表达， 并且该效应是剂量依赖性的。此外，发明人还发现耙向肌球蛋白Va蛋 白外显子F的siRNA的存在能够抑制黑素体从黑素细胞转移至角化细 胞。因此，本发明涉及包括一条正义RNA链和一条互补反义RNA链 一起形成RNA双链的新颖的分离siRNA，其特征在于该正义RNA链 包括，与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30 个，有利地15至29个，16至28个，17至27个，18至25个，18至 23个，或18至21个连续核苷酸的片段相比，最多有一个不同的核苷 酸的序列。在本发明的整个说明书中所用的表述"包括编码肌球蛋白 Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列片段"应理解为与基因序列相对应 的RNA序列的意思，即基因序列中的T被U替代的相应的RNA序列。因此本发明siRNA的正义链包括编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显 子F的核苷酸序列中14至30个连续核苷酸的片段，有利地15至29 个，16至28个，17至27个，18至25个，18至23个，或18至21 个连续核苷酸，或与这样的片段相比较具有一个不同核苷酸的序列。 这是因为RNAi过程是序列特异性的，高序列同源性是有效RNAi所需 的。有利地，RNA的正义链包括与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F的核苷酸序列中14至30个连续核苷酸的片段，有利地15至29 个，16至28个，17至27个或18至25个连续核苷酸相同的序列。已经在不同物种中描述过肌球蛋白Va蛋白，特别是人类，小鼠和 大鼠。在有利的实施方案中，编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F核 苷酸序列是人类的编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F序列，由SEQ ID NO:l来表示。人类肌球蛋白Va蛋白的序列示于图1A中，对应于 外显子F的部分(SEQIDNO:l)是下划线的。所有靶向序列SEQ IDNO:l的14至30个连续核苷酸片段的siRNA 都包括于本发明的范围中，有利地是15至29个，16至28个，17至 27个，18至25个，18至23个或18至21个连续核苷酸。然而，有利 地，所靶向的肌球蛋白Va蛋白外显子F片段，即siRNA的正义链中 包括的序列，不是具有肌球蛋白Va蛋白mRNA中特征性结构的片段 或调节蛋白可以结合的片段。如本发明中所用的术语"特征性结构" 理解为意思是可以在肌球蛋白Va蛋白的mRNA中形成的茎干或环状 或发夹型结构。几个组织提供了可以在互联网上自由获得的不同工具 (参见以下的表1)，并可以用来设计耙向人类肌球蛋白Va蛋白外显子 F的siRNA。表l.siRNA选择工具的互联网网址组织互联网地址Ambionhttp:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA一design.htmlDharmaconhttp:〃www.dharmacon.com/sidesign/Qiagenhttp:〃www1.qiagen.com/Products/GeneSilencing/ CustomSiRna/SiRnaDesigner.aspxEmbosshttp://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sirna.htmlTuschl Laboratoryhttp:〃www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.htmlThe Whiteheadhttp:〃jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/大多数销售定制siRNA的公司保证所合成的siRNA的有效性。此 外，通过不同的测试可以证实所有靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的 siRNA的有效性，特别是实施例1和2详述的那些。本发明人已经合成并测试了几种靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子7F的不同片段的特异性siRNA。在根据本发明的siRNA的有利实施方 案中，人类编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F的核苷酸序列中14 至30个，有利地15至29个，16至28个，17至27个，18至25个， 18至23个或18至21个连续核苷酸序列的片段选自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。三个序列SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的位置详细说明于图1B中。在特别有利的实施方案中，编码 肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F的核苷酸序列中14至30个，有利地 15至29个，16至28个，17至27个，18至25个，18至23个或18 至21个连续核苷酸序列的片段由核苷酸序列SEQ IDNO:3组成。根据本发明的siRNA是小的双链RNA，具有由Watson-Crick键配 对的正义链和反义链，并且其中正义链的序列由肌球蛋白Va蛋白外显 子F的核苷酸序列中14至30个，有利地15至29个，16至28个，17 至27个，18至25个，18至23个或18至21个连续核苷酸片段组成 或包括肌球蛋白Va蛋白外显子F的核苷酸序列中14至30个，有利地 15至29个，16至28个，17至27个，18至25个，18至23个或18 至21个连续核苷酸片段。已知具有由30至50%鸟嘌呤和胞嘧啶构成的序列的siRNA比具有 更高比例的鸟嘌呤和胞嘧啶的序列更有效。因此根据本发明的siRNA 有利地具有由30至50%鸟嘌呤和胞喷啶的序列。应当理解根据本发明的siRNA可以同样包括两个互补单链RNA 分子，或单个单链RNA分子，其中两个互补部分通过Watson-Crick键 来配对，并通过发夹型结构在一侧共价连接(将这更特异性地称为 shRNA，即"短发夹RNA")，可以认为是si認A的亚类。在整个说明 书中，术语siRNA应当以其宽的含义来理解，包括shRNA，除非另外 指出。在有利的实施方案中，根据本发明的siRNA包括两个互补单链 RNA分子。在另一个有利的实施方案中，根据本发明的siRNA包括单 链RNA的单个分子或由单链RNA的单个分子组成，其中两个互补部 分通过Watson-Crick键来配对，并通过发夹型结构在一侧共价连接， 也就是说是shRNA。此外，正义和/或反义RNA链可以进一步包括2至4个核苷酸的3' 悬垂物，特别是根据本发明的siRNA包括两个互补单链RNA分子时。如在此所用的表述"2至4个核苷酸的3'悬垂片段"理解意思是RNA 双链的至少一条链中存在2至4个核苷酸在所述链的3'远端没有与互 补链配对。3'悬垂片段中所用的核苷酸可以是天然的核苷酸(核糖核酸 或脱氧核糖核酸)，或修饰的核苷酸，如LNA (锁核酸)，其在核糖的 2，和4'位置之间包括亚甲基桥接(Soutschek J.等，Nature. 2004 Nov 11; 432 (7014): 173-8)。 3'悬垂片段还可以经受以下段落中针对根据本发 明的siRNA的正义RNA链和/或反义RNA链所述的各种类型的化学修 饰。有利地，3'悬垂片段由2个核苷酸组成。在这种情况下，3'悬垂片 段的优选序列是"TT"(其中T表示脱氧胸苷)或"UU"(其中U表 示尿嘧啶)。同样有利地，根据本发明的siRNA的两条互补链都包括3， 悬垂片段。在这种情况下，两个3'悬垂片段的长度和序列可以相同或 不同。有利地，根据本发明的siRNA的两条互补链各自包括具有序列 "TT"的2个核苷酸的3'悬垂片段。这样包括对应于每条链具有"TT" 序列3，悬垂片段的SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的RNA 序列的siRNA显示于图1C中并对应于本发明的优选实施方案。它们 对应-包括基因序列SEQ ID NO:2的RNA序列的siRNA MyoVa n。:l ，该链具有以下的特定序列正义链5'画UGACCCUAAGAAGUAUCAATT-3， (SEQIDNO:9) 反义链5，- UUGAUACUUCUUAGGGUCATT-3，(SEQ ID NO:10); -包括基因序列SEQ ID NO:3的RNA序列的siRNA MyoVa n°:2，该链具有以下的特定序列正义链5'國GUAUCAAUCAUAUCGGAUUTT-3， (SEQIDNO:ll) 反义链5，-AAUCCGAUAUGAUUGAUACTT-3， (SEQ ID NO:12); -包括基因序列SEQ ID NO:4的RNA序列的siRNA MyoVa n°:3，该链具有以下的特定序列正义链5'画UCAUAUCGGAUUUCCCUUUTT画3， (SEQ ID NO: 13) 反义链5，-AAAGGGAAAUCCGAUAUGATT-3 ， ( SEQ ID NO: 14 )。 当根据本发明的siRNA是由两个互补部分通过Watson-Crick键配对并且通过发夹型结构在一侧共价连接的单个单链RNA分子构成的shRNA时，也就是说当根据本发明的siRNA是shRNA时，所述shRNA优选包括以下序列或由以下序列组成5'隱GUAUCAAUCAUAUCGGAUUCUCAAGAGAAAUC CGAUAUGAUUGAUAC-3， (SEQ ID NO:17)，其中粗体部分对应于通 过Watson-Crick键配对的两个互补部分，对应于具有siRNAMyoVa n。:2 正义链及其互补链中包括的基因序列SEQIDNO:3的RNA，不是粗体 的部分对应于具有连接两个互补链的发夹结构的序列。此外，在根据本发明的siRNA中，正义RNA链和/或反义RNA链 在它们的糖部分，核碱基或核苷酸间主链中还可以包括至少一个化学 修饰。这样的修饰尤其可以使其抑制体内核酶对siRNA的降解。因此 所有能够提高根据本发明的siRNA的稳定性和体内生物利用率的化学 修饰都包括在本发明的范围内。在糖部分的有利修饰中，必需特别提 及发生在核糖2'位的修饰，如2，-脱氧，2，-氟代，2，-氨基，2，-硫代或2，-0-烷基，特别是2，-0-甲基，替代核糖核苷酸上正常的2'-OH基，或核糖 位置2，和4，之间的亚甲基桥接的存在(LNA)。关于核碱基，可以使用 修饰的碱基，如特别是5-溴-尿苷，5-碘-尿苷，N、甲基-尿苷，2,6-二 氨基嘌呤(DAP)， 5-甲基-2，-脱氧胞苷，5-(1-丙炔)-2'-脱氧-尿苷(pdU)， 5-(l-丙炔)-2'-脱氧胞苷(pdC)，或与胆固醇缀合的碱基。最后，核苷 酸间主链的优选修饰包括由磷硫酰，甲基磷酸酯，磷酸二酰胺基团替 代主链中的磷酸二酯基团，或使用由肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨 酸单体构成的主链(PNA，肽核酸)。显然可以结合各种修饰(碱基， 糖，主链)来获得吗啉代型核酸(碱基固定于吗啉环并通过磷酸二酰 胺基团连接)或PNA (碱基固定于由肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨 酸单体)。根据本发明的siRNA是"分离的"，其意思是它们不处于天然状态， 而是己经通过涉及人干预的任何方法获得的。特别地，通过纯化已经 存在的siRNA，通过化学合成，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所 需的核苷酸序列或通过重组合成来获得根据本发明的siRNA。许多公 司还提供定制的siRNA合成，特别是如Eurogentec， Ambion， Dharmacon 或Qiagen这样的公司。本发明还涉及根据本发明的siRNA，作为化妆品的用途。如在此 所用的表述"化妆品"理解为意思是可以维持或改善人或动物体外部的美学外观的物质。本发明进一步涉及根据本发明的siRNA，作为药物的用途。实际上，根据本发明的siRNA用作药物是新颖的。本发明的另一个目的是包括至少一种根据本发明的siRNA和可接 受载体的组合物。如在此所用的术语"可接受载体"意思是本领域技 术人员已知的任何美容学上或药物学上可接受的载体。打算将根据本发明的组合物用于化妆和/或治疗性处理皮肤，并因 此优选局部使用。可以以局部应用常用的任何盖仑派医学的(galenic)形式来配制 根据本发明的用于局部应用的组合物，如例如水溶液形式，白色或有 色的霜剂，膏剂，乳液，洗液，凝胶，软膏，浆液，糊剂，水包油或 油包水型乳液，或泡沫。可以以气溶胶的形式将其使用于皮肤。还可 以呈现为固体的形式，粉末状或不是，例如，棒状物的形式。还可以 呈现为贴剂，笔，刷和涂药器的形式，用于脸或手上印记的局部应用。根据本发明的组合物可以进一歩包括本领域技术人员已知的任一 种载体，使得可以提高根据本发明的siRNA的传送和生物利用率。可 以和siRNA —起使用的特定载体特别包括脂质体和能够穿过细胞膜的 肽(称为CPP，即"细胞渗透性肽")。如在此所用的术语"脂质体" 理解为意思是人造脂质载体，具有由一个或几个脂质双层都成的膜， 并且其具有包裹和保护蛋白质和核酸并与细胞膜融合的能力，因此可 以将包裹的产物传送至细胞内。因此使用脂质体可以保护siRNA并促 进它们穿透至细胞中。如在此所用的术语CPP理解为意思是能够内在 化然后达到活细胞的细胞质和/或核间隔的肽。这样的CPP实例包括肽 渗透物(Penetratine)，输送物(Transportan)， Tat， MAP禾n SynBl。 一些特别有用的CPP实例由源自病毒的两性肽构成，其与待传送的核 酸直接相互作用，以便形成可以通过质膜扩散的纳米颗粒。因此将根 据本发明的siRNA与任何CPP缀合也可以保护siRNA并在体内促进它 们进入细胞中。根据本发明的组合物还可以包括一种或几种目的在于提高所需效 果的活性物质。在特定的实施方案中，根据本发明的组合物特别地可 以进一步包括至少一种其他色素脱失剂。如在此所用的术语"色素脱失剂"理解为意思是通过抑制活性直接作用于黑素细胞，或黑色素合 成途径步骤之一，或黑素体转运至树突和转移至角化细胞的任何物质。 在适于加入根据本发明的组合物中的已知色素脱失剂中，特别要提及 氢醌及其衍生物，视黄醇或维甲酸，抗坏血酸及其衍生物，胎盘提取物，曲酸，阿魏酸，熊果苷，二羟基苯衍生物(WO00/47045),愈疮 木酚衍生物(WO00/47179 ) ， 4-(2,3-二羟基苯基)-环己醇(WO00/56279 )， 间苯二酚衍生物(WO00/56702),酚酰胺(WO99/32077)。适于加入 根据本发明的组合物的其他色素脱失剂包括针对编码肌球蛋白Va蛋白 基因以外的基因的反义寡核苷酸或siRNA:如涉及编码黑色素合成途 径中的步骤的基因，或黑素体转运至树突和转移至角化细胞中的基因， 特别如耙向酪氨酸酶(参见WO01/58918和WO2005/060536),蛋白质 TRP-1 (参见WO01/58918)或蛋白质PKC(31 (参见WO2005/073243) 的反义寡核苷酸或siRNA。根据本发明的组合物还可以包括针对皮肤护理的局部组合物中常 用的活性物质或赋形剂，如化学和物理滤光剂(如，辛基甲氧基肉桂 酸酯，丁基甲氧基二苯甲酰甲垸，氧化钛和氧化锌)，分开或组合使用 的抗醣化和/或抗氧化剂(如，生育酚及其衍生物，麦角硫因，硫代牛 磺酸，亚牛磺酸，氨基胍，硫胺焦磷酸盐，吡眵胺，赖氨酸，组氨酸， 精氨酸，苯丙氨酸，吡哆醇，三磷酸腺苷)，抗炎剂(如，甘草酸硬脂 酸酯)，光滑剂及其混合物，防腐剂(抗细菌或抗真菌)，增湿剂，pH 调节剂，角质软化剂和/或角质剥离溶解剂(如，水杨酸及其衍生物)， 维生素，增稠剂，润肤剂，矿泉水，表面活性剂，聚合物，硅油，植 物油，精油，芳香剂，着色剂或色素等。本发明还涉及根据本发明的至少一种siRNA或组合物作为用于色 素脱失或漂白皮肤的化妆品的用途。根据本发明的siRNA和组合物可 以用作用于皮肤色素脱失或漂白的化妆品，为了降低整个皮肤的色素 沉着，或色素沉着过度的部分，而不管所述区域的色素沉着过度的来 源。这是因为这样的使用使得可以使皮肤的色素沉着更均匀，因此改 善其外观。此外，甚至不存在色素沉着过度部分的情况下， 一些人也 想要更浅的整体色素沉着，这可以通过根据本发明的化妆品使用来获 得。本发明进一歩涉及根据本发明的至少一种siRNA或组合物在制备 治疗或预防皮肤色素沉着过度的药物中的用途，特别是表皮色素沉着 过度，黑变病和炎症后色素沉着过度。色素沉着过度可以源自许多不同的疾病。特别提及的是脸部和颈部的黑变病，如黄褐斑，Riehl's黑 变病，脸部和颈部的网状色素皮肤异色病，或遗传硬化性皮肤异色病； 雀斑；caft-au-lait斑；Sutton's痣；由代谢引起的色素沉着过度，如血 色病，爱迪生氏病，库欣综合症或甲状腺机能亢进；和由于外来原因 引起的色素沉着过度，如由药物(如氯丙嗪，酚噻嗪，乙内酰脲，无 机砷，抗疟药这些物质)或重金属(银，金，汞)引起的色素沉着过 度；外伤，湿疹，慢性单纯苔藓，红斑狼疮和包括玫瑰糠疹，牛皮癣， 疱疹样皮炎，固定色素性红斑和光接触性皮炎的皮肤病后诱导的炎症 后色素沉着过度；Rothmund-Thomson综合症；良性黑棘皮病或恶性黑 棘皮病。根据本发明的siRNA或组合物用于生产药物的用途使得可以 处理这些不同的病理并使得由这些疾病引起的色素沉着部位消失。还 可以防止由这些不同疾病引起的色素沉着过度部位的出现。本发明还涉及用于皮肤色素脱失和漂白的化妆处理方法，包括局 部使用根据本发明的组合物。本发明进一步涉及皮肤色素沉着过度的治疗性处理的方法，包括 局部使用根据本发明的组合物。以下实施例说明了本发明，但不是以任何方式来限制。


图1. 3种靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA的设计。 A.包括外显子F (包括外显子ADCDEF)的人类肌球蛋白Va蛋白的 转录产物的核苷酸编码序列。对应于外显子F的部分是下划线的。B.外 显子F的序列的详细内容。对应于三个选定siRNA的位置是下划线的 (siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3))或上划线的(overlined) (siRNA MyoVan。:l (SEQIDNO:2)禾口 (MyoVan。:3 (SEQ ID NO:4))。 C. 3 种靶向人类肌球蛋白Va蛋白的siRNA的结构。图2.用2pM siRNA MyoVa n。:2 ( SEQ ID NO:3 )电穿孔的PHEM 细胞中包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录产物量的降低。用2pM负对照siRNA，耙向GAPDH基因的siRNA，或siRNA MyoVa n°:2( SEQ ID NO:3)电穿孔PHEM细胞。通过QPCR测量RNA水平的不同siRNA 的作用。A.与电穿孔siRNA成函数关系的GAPDH基因相对表达水 平。B.与电穿孔siRNA成函数关系的包括外显子F的肌球蛋白Va蛋 白的转录产物的表达水平。图3.包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录产物量的特异性降 低，而不包括外显子F的转录产物没有降低。A.与电穿孔siRNA成 函数关系的包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录产物的相对表达水 平。B.与电穿孔siRNA成函数关系的通过球形部分(GP)检测的肌 球蛋白Va蛋白的所有转录产物的相对表达水平。图4.对si脂A MyoVa n°: 1 (SEQ ID NO:2 )禾口 siRNA MyoVa n° :2 (SEQIDNO:3)测定具有最大功效的最小浓度。测定了靶向人类肌球 蛋白Va蛋白外显子F的siRNA的不同浓度，siRNA为A. MyoVa n°:l (SEQIDNO:2)和B. MyoVa n°:2 (SEQIDNO:3)。对于MyoVan。:2， 以具有标准偏差的平均值的形式给出。图5. SiRNA浓度对细胞活力的影响。对不同浓度的MyoVa n°:2 (SEQ ID NO:3)平行测定包括外显子F的转录产物的相对表达水平和 细胞活力。在X-轴上给出siRNA浓度，在Y-轴上给出包括外显子F 的转录产物的相对表达水平和细胞活力，以直方图(灰色块)和线条 分别表示平均值和标准偏差。图6.耙向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA随时间的功效。 在电穿孔0.5|iM siRNA MyoVa n°: 1 ( SEQ ID NO:2 )或MyoVa n°:2 ( SEQ ID NO:3 )后的不同时间分析PHEM细胞。A. MyoVa n°: 1 (SEQ ID NO:2) 的相对表达水平。B. MyoVan。:2 (SEQIDNO:3)的相对表达水平。图7.通过耙向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA抑制黑素 体从黑素细胞转移至角化细胞的体外测试原理。图8.在用25nM或10nM MyoVa n°:2 (SEQ ID NO:3， exF)或 BLOCK-iTTM荧光寡核苷酸(siNEG)和12或18^1 HiPerFect试剂转染 的PHEM中在GP部分(MyoVa GP转录产物)检测的包括外显子F 的转录产物(MyoVa exF转录产物)和肌球蛋白Va蛋白的总转录产物 的抑制评价。A. MyoVa exF转录产物，12|il HiPerFect试齐U。 B. MyoVaGP转录产物，12|il HiPerFect试剂。C. MyoVa exF转录产物，18pl HiPerFect试剂。D. MyoVaGP转录产物，18jil HiPerFect试剂。图9.长期实验过程中(转染后D2， D4， D6， D8) RNA水平和 蛋白质水平的抑制评价。A.在RNA水平通过定量实时PCR的分析。 B.使用特异性抗包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白亚型的抗体通过蛋 白质印迹分析在蛋白质水平的分析。C.使用Quantity One软件进行定 量，通过微管蛋白标准化，所有都基于原始数据。图10.用siRNAMyoVan。:l (SEQIDNO:2， exF)或BLOCK-iTTM 荧光寡核苷酸(siNEG)和18pl HiPerFect试剂转染的PHEM中包括外 显子F的转录产物的抑制评价。实施例实施例13神激/^A类腐绿宽/^ &歪/^/A^f F游w7WJ游皮仏合成,,秀1.1 3种siRNA的设计和合成图1A中显示了包括外显子F的人类肌球蛋白Va蛋白的剪接变体 的序列(实际上包括外显子ABCDEF)。在外显子F内，使用Eurogentec的siRNA设计和合成服务来设计 和合成三种靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA。图1B中显 示了这些siRNA特异性的外显子F的部分。如图1C中所示的，合成带有序列"TT"的3'悬垂片段的这三种 siRNA。在下文中将这三种siRNA称为MyoVa n°:l(正义链包括SEQ ID NO:2)， MyoVan。:2 (正义链包括SEQ ID NO:3)，或MyoVan。:3 (正 义链包括SEQ ID NO:4)，括号中所示的SEQ ID编号对应于siRNA正 义RNA链中包括的人类肌球蛋白Va蛋白外显子F片段的序列。1.2电穿孔至初级人类表皮黑素细胞(PHEM)后的siRNA功效的测试人2J冶#《荐#游遂,将初级人类表皮黑素细胞(PHEM)生长于补充2.5%胎牛血清 (FCS)， l%Ultroser， 5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)， 10ng/ml内皮素-1 (ET-1)， 0.33nM胆汁毒素(CT)， 0.033mM异丁基-甲基-黄 嘌呤(IBMX)和5.3nM 12-0-四癸酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)的Ham，s F10培养基(Gibco， Invitrogen Ltd, Paisley, UK)中。将细胞生长至 40-70%的汇合并在传代2至5次之间使用。在第一种情况中，使用质粒pMAX-GFP (3pg)来测试黑素细胞 电穿孔的三种不同程序，即程序U16， U20和U24。使用500 000细胞 来电穿孔。用于正常-新生人类表皮黑素细胞的NHEM-Neo Nucleofector试剂盒(Amaxa， #VDP-1 003)用于所有电穿孔。在24_48小时后在配备能够检测pMAX-GFP质粒发出的绿色荧光 信号的荧光滤器的Arcturus显微镜(LCM)下评价T25烧瓶中电穿孔 的细胞。还将电穿孔的细胞生长于载玻片上。电穿孔24小时后，将细胞固 定于冰冷甲醇中并用封固流体(DAKO)封固在载波片上。在蔡司荧 光显微镜下分析表达绿色荧光信号中涉及的细胞。使用活细胞获得的结果显示出在任一个电穿孔程序中观察到等量 的死细胞，但是使用U24程序获得最有效的电穿孔。使用固定细胞获 得的结果证实了 U24程序获得了最有效的电穿孔。因此，在此后的所 有其他实验中使用U24程序。".h/m4My函"。:2 f卿JD脸3J劝资游教,分,使用pMAX-GFP G)ig)质粒和以下的siRNA双链将500 000细 胞电穿孔靶向FAM标记的GAPDH的正对照(3 pg或2 pM， Ambion)， 负对照BLOCK-iTTM Fluorescent Oligo (Invitrogen)以及人类肌球蛋白 Va蛋白基因的外显子F特异性的siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3) 双链体。U24程序用于电穿孔并在电穿孔24小时后收集细胞。然后通过实时定量RT-PCR (QPCR)对RNA进行分析。简而言之， 提取RNA后，用DNase处理样品并使用iScript逆转录酶(Biorad)合 成cDNA。使用PrimerExpress 2.0软^[牛(Applied Biosystems )设计用于 肌球蛋白Va蛋白外显子F的QPCR引物(正义引物5' CAGCCTGCAGCACGAGATC 3'， SEQ ID NO :5 ，反义引物5' TCTTAGGGTCATCTGCATATAATTCCT3'， SEQIDNO:6)和GAPDH， 使用Taqman缺省参数，对于扩增子只改变了最小的大小极限(75bp)。使用两个最佳步骤的SYBR green|RT-PCR测试来测定基因表达的相 对水平。Ct比较方法用于定量。在ABI Prism 7000测序系统(Applied Biosystem)中进行PCR反应。为了校正所提取的RNA含量和cDNA 合成效率中的差异，将基因表达的相对水平相对于三种管家基因 (RPL13a， SDHA禾卩UBC)的几何平均来标准化，这三种管家基因己 经用于黑素细胞分析(Vandesompele J等，Genome Biol.: 3: researchoo34.001 -researc固3 4.001 ， 2002 )。所获得的结果显示出所用的siRNA在PHEM细胞中电穿孔后通过 目标基因导致RNA表达减少。实际上，与负对照相比较，观察到 GAPDH减少75% (图2A)，包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录 产物减少62% (图2B)。7.2.3 Iw7 A^^7k^oFaw0// C五g/Z)M9:2义7k^oFaw02 "￡g/Z) 腊3J或聊函"。:3 f卿/D腊4,冶對^尸服M潘應顿承歪 ^ ^餅基辦录产激游教用单独的Nucleofector试剂(MOCK)，革巴向GAPDH的siRNA (lpM)，负对照siRNA，或肌球蛋白Va蛋白基因的外显子特异性的三 种si腦AMyoVan。:l (SEQIDNO:2)， MyoVan。:2 (SEQIDNO:3)或 MyoVan。:3 (SEQIDNO:4)之一电穿孔500 000PHEM细胞。使用U24 程序进行电穿孔，并在电穿孔后48小时收集细胞。然后按照之前所述的通过PCR对RNA进行分析，对包括外显子F 的转录产物(外显子F检测)或所有转录产物通过肌球蛋白Va蛋白的 球形部分(GP)来检测。按照之前所述的，使用PrimerExpress 2.0 (Applied Biosystems)软件设计肌球蛋白Va蛋白的球形部分(GP)的 QPCR引物(正义引物5'GCAGTCAATTTGATTCCAGGATT3'， SEQ IDNO:7;反义引物5'TGATCATCATTCAGGTAGTCAGCAT3'， SEQ IDNO:8)。对于包括肌球蛋白Va蛋白外显子F的转录产物，对siRNAs MyoVa n。:l (SEQIDNO:2)， MyoVan。:2 (SEQIDNO:3)和MyoVan。:3 (SEQ IDNO:4)各自观察到85%， 94%和60%的抑审1」。使用MyoVa n。:2 (SEQ IDNO:3)获得最大抑制。同样对于使用球形蛋白(GP)检测的肌球蛋白Va蛋白的全部转录产物，对siRNA MyoVa n。: 1 (SEQ ID NO:2)， MyoVa n。:2( SEQ ID NO:3 ) 和MyoVa n。:3 (SEQ ID NO:4)各自观察到39%， 56%和0%的抑制。 这种降低的抑制可特别通过以下的事实来解释所用的siRNA特异性 地靶向外显子F，因此没有导致不包括外显子F的转录产物的分解。 兹论这些初步的结果清楚地显示出使用三种合成的siRNA可以特异性 且显著性地降低包括外显子F的人类肌球蛋白Va蛋白转录产物的含 量，而没有影响不包括外显子F的转录产物。使用siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3)获得最显著的结果。1.3 siRNA浓度的最佳化1.3.1具有最大功效的最小浓度的测定为了测定最大功效的最小siRNA浓度，使用之前所述的相同实验 方案测试0.05至2 liM范围的不同浓度。使用l)aM浓度的负对照siRNA 和耙向GAPDH的siRNA。使用U24程序并在电穿孔后48小时分析细胞。然后按照之前所述的通过QPCR对包括外显子F的转录产物进行 分析(特异性外显子F检测)。对于siRNAMyoVa n。: 1 (SEQ ID NO:2)，与负对照相比较，对0.05; 0.1; 0.25; 0.5和lpM的浓度各自观察到包括外显子F的转录产物降 低47.5%， 31%， 73%， 73%和79% (图4A)。因此使用l(xM的浓度获 得最大的效果，但是使用0.25和0.5pM的浓度获得几乎相同的有效抑 制。对于siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3)，在所有测试浓度观察到 大的降低(图4B)。对于lpM的浓度观察到最大的效果，但使用0.5|iM 浓度获得的抑制几乎一样大。因此，最佳的siRNA浓度为大约0.5-1jiM。7J.2w7 A^浓^^^潘應活力游嚴聘然后使用siRNA MyoVa n。:2 (SEQIDNO:3)分析siRNA浓度对 细胞活力的影响。为此，使用MTS测试(PromegaBenelux)平行测试 相同的浓度范围(0.05至2pM)，该测试测定了活细胞的数量。在使用 U24程序的电穿孔后的48小时分析细胞。18图5中给出了结果并显示出只对于1或2pM的siRNA浓度细胞活 力显著下降(约20%)。低于lpM，细胞活力大于90%。 7."兹论这些结果表明靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA的效果是 剂量依赖性的，并且对于0.5至lpM之间包括的浓度可以获得最大效 果。此外，低于l)aM， siRNA的存在不影响PHEM细胞的活力。 因此0.5pM的浓度看来是最好的，因为该浓度结合了最高功效和 最高活力。在以下所述的所有实验中使用该浓度。 1.4随时间的分析为了分析根据本发明的siRNA随着时间的效果，按照之前所述的 在电穿孔后24， 48 ， 72和96小时通过QPCR分析用0.5(iM siRNA MyoVa n。:l (SEQIDNO:2)或siRNAMyoVa n。:2 (SEQIDNO:3)电穿孔的 PHEM细胞。在电穿孔后48小时分析用正对照或负对照(0.5pM)处 理的细胞。对于siRNAMyoVan。:l (SEQIDNO:2)，在24h时包括外显子F 的转录产物的降低最大(超过90%)，然后在48h (65%)和72h (60%) 时降低，并在96h时表达水平恢复至正常(参见图6A)。对于siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3)，在24和48小时观察到 超过85%的转录产物降低，然后在72和96小时降低，同时与负对照 相比保持显著性(图6B)。因此，这些结果表明在电穿孔后24-48小时获得最大效果，并且随 着时间siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3)的功效超过siRNA MyoVa n。:l (SEQIDNO:2)的。1.5结论因此，以上所呈现的结果清楚地表明可以使用耙向所述外显子F 的siRNA显著降低包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录产物量。 测试了三种不同的siRNA，并且这些siRNA中的每一种都降低了包括 外显子F的肌球蛋白Va蛋白的转录产物量。siRNA MyoVa n。: 1 (SEQ ID NO:2)，尤其是siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3)，都特别有效。此外，靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA的效果是剂量依赖性的，并且在不影响细胞活力的浓度下可以获得最大效果。功效随着时间而改变并在电穿孔后24-48小时达到最大。舰乂鄉體A r"船,/舒F游s麵游存叙/跳氰素沐 A譜潘應鄉至扇/德應條贿2.1测试原理为了测试根据本发明的靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的 siRNA对黑色素从黑素细胞转移至角化细胞的影响，研发了体外测试。 该测试的原理显示于图7中。用0.1pM; 0.25[iM;和0.5pM耙向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F 的siRNA电穿孔正常的人类黑素细胞(MC)，或没有电穿孔。然后， 将电穿孔的(siRNA MC)或非电穿孔的(MC)黑素细胞生长于存在 2[2-14C]硫尿嘧啶的富集TFA培养基中，硫尿嘧啶将引入由MC产生 的黑色素中，使得可以获得含有14C标记的黑色素(MC^或siRNAMC* ) 的黑素细胞。将Me或siRNA MC^放入低钙浓度的无血清角化细胞培养基 (K-SFM， Gibco)中的培养物中，该培养基含有已经在该相同培养基 中经受1次或2次传代的角化细胞。将MC^或siRNA MC^与KC以1 比3的比例放入培养物中。然后任选用UV照射共培养物来刺激黑素体从MC^或siRNAMC* 转移至KC。进行该步骤是因为已知UV照射刺激黑素体从黑素细胞转 移至角化细胞。共培养和任选的UV照射后，角化细胞14C放射性(KC^ ) 是与从Me或siRNA MC^转移的黑色素含量成比例的。然后使用MACS技术(Miltenyi Biotech)通过阴性选择来纯化 KC*，使用结合黑素细胞和抗-PE珠的抗-CD117 PE抗体。最后，测定纯化的KC^的"C放射性。2.2结果所获得的结果表明没有使用靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子F的 siRNA电穿孔的情况中，UV照射可以有效地刺激黑色素从黑素细胞转 移至角化细胞中。相反，使用靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA进行电穿孔时，与没有电穿孔的对照相比较，UV照射后转移至角化细胞的"C放 射性黑色素的含量降低。 2.3结论这些结果清楚地表明使用耙向肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA 使得可以降低黑色素从黑素细胞转移至角化细胞，因此证实了本发明 人所用的降低皮肤色素沉着的策略。叙 舰巡鄉A ^游W扁挤染至微yl凝虎黑 #潘應。服MJ后游微3.1用靶向肌球蛋白Va蛋白外显子F的siRNA转染PHEM 3丄7 ^Z/^wFe" ^^^试,y^^染y^還丝众用siRNA MyoVa n。:2 ( SEQ ID NO:3 )禾Q作为负对照的 BLOCK—iT Fluorescent oligo寡核苷酸(Invitrogen )转染200 OOOPHEM (在0.5ml培养基/6孔平板中)。对于每次转染，将25nM或 10nM siRNA结合12或18(^1 HiPerFect试剂(Qiagen)使用。如以上实施例1.2.2段落中所述的通过定量实时PCR测量RNA水 平的评价抑制，简单地针对包括外显子F的转录产物(MyoVaexF转 录产物)，或针对GP部分中检测的肌球蛋白Va蛋白的所有转录产物 (MyoVaGP转录产物)。对MyoVa exF或MyoVa GP转录产物使用12(il或18fil HiPerFect 试剂获得的结果显示于图8中，并且表明了-对于使用12pl HiPerFect试剂的MyoVaexF转录产物，观察到对 于25nM和10nM的siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )各自为80%和 85%的抑制(图8A)。-对于使用12pl HiPerFect试剂的MyoVaGP转录产物，观察到对 于25nM和10nM的siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )各自为50%和 60%的抑制(图8B)。-对于使用18pl HiPerFect试剂的MyoVaexF转录产物，观察到对 于25nM和10nM的siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )各自为90%和 85%的抑制(图8C)。-对于使用18(xl HiPerFect试剂的MyoVaGP转录产物，观察到对21于25nM和10nM的siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )各自为63%和 58%的抑制(图8D)。潜论这些结果表明通过用siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )和 HiPerFect试剂转染的PHEM显著并特异性地抑制了包括外显子F的肌 球蛋白Va蛋白的转录产物数量。使用25nM siRNA MyoVa n°:2( SEQ ID NO:3)和18)alHiPerFect试剂获得最有效的抑制。这些最佳条件在下述实施例3中所有实验中使用。 3.2用siRNAMyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )转染PHEM后获得的抑 制评价3.27长激实教过荐^^i^4 ^乎,歪A^/7t乎游湫劍伊份 用18pl HiPerFect试剂和25nM siRNA MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 ) 或BLOCK—iTTM Fluorescent oligo寡核苷酸(负对照)转染800 000PHEM (在2.5ml培养基/60孔平板中)。在8天的时间段内评价抑 制的效果。1/3的细胞用于提取RNA， 2/3的细胞用于纯化细胞裂解产 物。按照以上实施例1.2.2段落中所述的通过实时定量PCR测量包括 外显子F的转录产物(MyoVa exF转录产物)在RNA水平的抑制评价。为了使RNA水平观察到的抑制与蛋白质水平的表达相关联，通过 Eurogentec研发了特异性针对包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的亚型 的多克隆抗体。通过蛋白质印迹分析和免疫组织化学测试纯化抗体的 反应性和特异性。然后通过蛋白质印迹分析实验过程中获得细胞裂解产物。RNA水平图9A中给出了结果并表明与负对照相比较，对于不同时间的 MyoVa exF转录产物观察到72%， 81%, 78%和82%的降低(各自在 D2， D4， D6禾卩D8)。蛋白质水平图9B和C中给出了通过蛋白质印迹的细胞裂解产物的分析结果， 各自显示了蛋白质印迹分析的原始结果和使用Quantity One软件 (Biomd)获得的定量结果，用微管蛋白标准化。该结果表明，与负对照相比较，对于不同时间的MyoVa exF转录 产物观察到35%， 40%， 70%和75%的降低(各自在D2， D4， D6和 D8)。.素沐游歸々漆娜微菜以上显示了 MyoVa exF转录产物涉及皮层下肌动蛋白网络中黑素 体的捕获。因此，MyoVa exF转录产物的抑制可以导致黑素细胞树突 远侧黑素体捕获的降低，并可能导致黑素体的核周累积。为了测试这种假设，对涂布于圆形载波片上的300 000 PHEM进行 25nM siRNA MyoVa exF n。:2 (SEQ ID NO:3)和25nM负对照siRNA 的转染。将转染后不同时间的PHEM固定于3。/。仲甲醛中(第3天，第 6天和第8天)。然后，对于组织免疫化学实验，将肌球蛋白Va蛋白外显子F特异 性的抗体(稀释度1/500)(参见上文)与抗(前)-黑素体蛋白w7vw (SanbioB.V.， Uden， The Netherlands)的单克隆抗体NKI-beteb (稀释 度1/40)结合使用。然后通过共焦显微镜进行分析。结果转染后3天对于用负对照siRNA转染的PHEM和用siRNA MyoVa exF n。:2 (SEQIDNO:3)转染的PHEM，观察到黑素体的分布没有差异(存在 于外周和树突远端)。转染后6天使用抗NKI-beteb抗体和抗肌球蛋白Va外显子F抗体的共同标记 显示出用siRNAMyoVaexFn。:2 (SEQIDNO:3)转染的PHEM中黑素 体分布的变化黑素体主要位于核周部分。此外，在树突远端不存在 包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白亚型的标记或者很弱。转染后8天观察到与第6天相同的结果。 结论使用抗NKI-beteb抗体和抗肌球蛋白Va外显子F抗体，用siRNA MyoVa exF n。:2 (SEQ ID NO:3 )或对照siRNA转染的PHEM的免疫组织化学分析使得可以目测黑素体的胞内转运(通过NKI-beteb)，还可 以检测包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白的亚型的表达。所获得的结果可以得出以下结论包括外显子F的肌球蛋白Va蛋 白亚型的抑制在转染后6至8天时导致PHEM中黑素体的异常分布， 也就是说核周分布，而不是存在负对照的外周位置和树突远端。3.3证实了用siRNA MyoVa n。:l (SEQ ID NO:2)转染PHEM后 MyoVa exF转录产物的抑制效果在这些实验中，使用不周的siRNA，即siRNAMyoVan。:l (SEQ ID NO:2)，来转染PHEM，以证实抑制真正是肌球蛋白Va蛋白外显子F 特异性的，并排除非特异性的人为假象。".7长鹏验鹏喊扁/7W〃翻彦W鄉伊份用siRNA MyoVa n。: 1 (SEQ ID NO:2 )替代siRNA MyoVa n。 :2 (SEQ IDNO:3)重复段落3.2.1中的相同实验。图10中给出了 RNA水平的结果并显示出不同时间点的58%， 59%， 41%和51%的降低(各自在D2， D4， D6禾口D8)。此外，在蛋白质水平获得的结果与RNA获得的那些相关(数据未— 显示)。3 M，Fa w"舰g 腊"歹/逸游尸/ffiM 0 微錢/分赫#熟，用siRNA MyoVa n。: 1 (SEQ ID NO:2 )替代siRNA MyoVa n。:2(SEQ IDNO:3)重复段落3.2.2中的相同实验。禾口 siRNAMyoVan。:2 (SEQIDNO:3) —样，与负对照相比较，用 siRNAMyoVan°:l(SEQ IDNO:2)转染后第8天获得的结果表明PHEM 中黑素体的核周分布(数据未显示)。3."薪 论尽管使用siRNAexFMyoVan。:l (SEQIDNO:2)对包括外显子F 的肌球蛋白Va蛋白的亚型(MyoVaexF转录产物)的抑制作用没有使 用siRNA exF MyoVa n。:2 (SEQ ID NO:3 )的那么有效，但使用siRNA MyoVa n。:l (SEQ ID NO:2)仍然显著降低了 MyoVa exF转录产物的 表达，在RNA和蛋白质水平都是如此。此外，对固定转染的PHEM的免疫组织化学分析还揭示了 PHEM中黑素体的位置分布和转运。因此，得出以下结论由使用siRNA MyoVaexFn。:l和2 (SEQ ID NO:2和3)引起的包括外显子F的肌球 蛋白Va蛋白的亚型的抑制和观察到的表型作用是特异性的并且不是人 为假象。if过长扇，^包翁//^^ F游巡艰歪^ ^歪/^游存录产欽a^r緒F綠产激J诱賴曹锁为了获得PHEM中包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白亚型的长期 稳定抑制作用，合成了表达针对肌球蛋白Va蛋白的外显子F的短发夹 RNA (或shRNA)的慢病毒载体。4.1材料和方法从抑制MyoVa exF最有效的siRNA，即siRNA MyoVa n。:2 (包括 具有基因序列SEQ ID NO:3的RNA序列)，的siRNA序列中开发了 shRNA序列。更具体地，合成了由以下序列组成的双链寡核苷酸。- 正 义 链 5 -GATCGTATCAATCATATCGGATTCTCAAGAGAAATCCGA TATGATTGATAC7T7Tr-3， ( SEQ ID NO: 15 )- 反 义 链 5，-AGCT^4A4GTATCAATCATATCGGATTTCTCTTGAGA ATCCGATATGATTGATAC-3 ， ( SEQ ID NO: 16 )其中-粗体部分对应于两个由Watson-Crick键配对的shRNA互补部分， 对应于具有siRNAMyoVa n。:2正义链的基因序列SEQ IDNO:3的RNA 及其互补序列，-正常型序列部分对应于具有连接两个互补链的发夹结构的序列。 -下划线部分对应于5'悬垂片段，使得可以在表达载体中克隆双 链寡核苷酸，和-斜体部分对应于由RNApoffll型HI启动子启动的转录终止序列。然后将该双链寡核苷酸克隆至RNApolIII型Hl启动子控制下的慢病毒载体中。25这使得可以在转染的细胞中产生具有以下序列的shRNA: 5-GUAUCAAUCAUAUCGGAUUCUCAAGAGAAAUCCGAUAUGA UUGAUAC-3， (SEQ ID NO:17)，其中粗体部分对应于两个由 Watson-Crick键配对的互补部分，对应于具有siRNA MyoVa n。:2正义 链的基因序列SEQIDNO:3的RNA序列及其互补序列，正常型部分对 应于具有连接两个互补链的发夹结构的序列。还产生了表达混杂shRNA的慢病毒载体，用作负对照。在这种情 况下，受RNApolin型Hl启动子控制的慢病毒载体中克隆的寡核苷酸 的正义和反义链序列如下- 正 义 链 5，-GATCATTATCTAGGAGATATCACCTCAAGAGAGTGATAT CTCCTAGATAA77T7T-3 ， ( SEQ ID NO: 18 )- 反 义 链 5'- AGCIM ^4爿ATTATCTAGGAGATATCACTCTCTTGAGG TGATATCTCCTAGATAAT-3 ， ( SEQ ID NO: 19 )^中-粗体部分对应于两个由Watson-Crick键配对的shRNA互补部分， 对应于具有siRNA MyoVa n。:2正义链的基因序列SEQ ID NO:3的RNA序列及其互补序列的错配碱基，-正常型序列部分对应于具有连接两个互补链的发夹结构的序列。 -下划线部分对应于5'悬垂片段，使得可以在表达载体中克隆双链寡核苷酸，和-斜体部分对应于由RNApolIII型Hl启动子启动的转录终止序列。这使得可以在转染的细胞中产生具有以下序列的shRNA: 5-AUUAUCUAGGAGAUAUCACCUCAAGAGAGUGAUAUCUCCU AGAUAA-3' (SEQ ID NO:20 )，其中粗体部分对应于两个由 Watson-Crick键配对的shRNA互补部分，(对应于具有siRNA MyoVa n。:2正义链的基因序列SEQIDNO:3的RNA序列及其互补序列的错配 碱基)，正常型部分对应于具有连接两个互补链的发夹结构的序列。4.2转导效率基于上述慢病毒载体中GFP标记的存在通过FACS分析测定 PHEM中的转导效率。用IO感染复数(MOI)的慢病毒转导100 OOOPHEM在两轮感染 后导致90%的转导效率。4.3在RNA水平和蛋白质水平的抑制评价为了评价RNA水平和蛋白质水平的抑制效果，用各自包括shRNA MyoVa exF n。:2或混杂shRNA (负对照)的10 MOI的慢病毒载体转导 600 OOOPHEM。结果显示在RNA水平和蛋白质水平，与负对照相比较，用包括 shRNA MyoVa exF n。:2的慢病毒载体转导的细胞中包括外显子F的肌 球蛋白Va蛋白的亚型得到了很大的抑制。4.4对黑素体转运的抑制效果随后，进行了用包括shRNA MyoVa exF n。:2或混杂shRNA (负对 照)的慢病毒载体转导的PHEM的免疫组织化学分析。结果显示了与 负对照相比较，用包括shRNA MyoVa exF n。:2的慢病毒载体转导的 PHEM中黑素体的核周分布。这些结果证实了以前使用合成siRNA抑制MyoVa exF转录产物中 所观察到的结果。4.5在重建表皮的3D模型中MyoVa exF转录产物对黑色素从黑素 细胞转移至角化细胞的抑制作用用表达shRNA MyoVa exF n。:2的慢病毒载体转导50 000PHEM。 将这些稳定转导的PHEM与500 000角化细胞引入重建的皮肤模型中。 用表达混杂shRNA的慢病毒载体稳定转导的PHEM用作负对照。然后 用模拟阳光的UV照射重建的皮肤或没有照射。重建皮肤的目测显示出包括用表达shRNA MyoVa exF n。:2的慢病 毒载体转导的PHEM的皮肤在照射后没有观察到色素沉着的增加，与 包括用表达混杂shRNA的慢病毒载体转导的PHEM的皮肤相反。然后 通过Fontana-Masson染色和数码彩色成像分析的色素沉着定量评价使 得可以证实这些观察。然后通过电子显微镜检査黑素细胞和角化细胞中黑素体的分布。 这些分析显示出与未照射的相同皮肤相比较，用UV照射的并包括用27表达混杂shRNA的慢病毒载体转导的PHEM的重建皮肤中，色素从黑 素细胞至角化细胞的转移受到了剌激。相反，用UV照射的并包括用 表达shRNA MyoVa exF n。:2的慢病毒载体转导的PHEM的重建皮肤 中，与未照射的对照皮肤相比较，只观察到黑色素转移的降低。 4.6结i仑因此，结果表明了用表达特异性靶向人类肌球蛋白Va蛋白外显子 F的shRNA的慢病毒载体稳定转染PHEM能够显著地干扰MyoVa exF 转录产物和包括外显子F的肌球蛋白Va蛋白亚型的数量，以及干扰黑 素体的转运和从黑素细胞至角化细胞的转移。
权利要求
1.包括一条正义RNA链和一条互补反义RNA链一起形成RNA双链的分离siRNA，其特征在于所述的正义RNA链包括，与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30个连续核苷酸的片段相比，最多有一个不同的核苷酸的序列。
2. 根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于所述的正义RNA 链包括与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30 个连续核苷酸的片段相同的序列。
3. 根据权利要求1或2所述的siRNA，其特征在于编码肌球蛋白 Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列是人类序列SEQ IDNO:l。
4. 根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于所述的人类编码肌 球蛋白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30个连续核苷酸片 段由选自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列 组成。
5. 根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于所述的编码肌球蛋 白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30个连续核苷酸片段由 核苷酸序列SEQ ID NO:3组成。
6. 根据权利要求5所述的siRNA，其特征在于所述siRNA是由单 个单链RNA分子组成的shRNA，该单链RNA分子中两个互补部分通 过Watson-Crick键配对，并通过发夹型结构在一侧共价连接，其中所 述的shRNA包括序列SEQ ID NO: 17或由序列SEQ ID NO: 17组成。
7. 根据权利要求1至5任一项所述的siRNA，其特征在于所述的 正义和/或反义RNA链进一步包括2至4个天然或修饰的LNA型核苷 酸的3'悬垂片段。
8. 根据权利要求1至7任一项所述的siRNA，其特征在于所述的 正义RNA链和/或反义RNA链在其糖部分，其核碱基部分或其核苷酸 间主链中包括至少一种化学修饰。
9. 根据权利要求1至8任一项所述的siRNA，作为化妆品的用途。
10. 根据权利要求l至8任一项所述的siRNA，作为药物的用途。
11. 包括至少一种如权利要求1至8任一项所述的siRNA和可接 受载体的组合物。
12. 根据权利要求ll所述的组合物，其特征在于该组合物是局部 使用的。
13. 根据权利要求11或12所述的组合物，其特征在于进一步包 括至少一种其他色素脱失剂。
14. 至少一种如权利要求1至8任一项所述的siRNA或如权利要 求11至13任一项所述的组合物作为用于皮肤色素脱失或漂白的化妆 品的用途。
15. 至少一种如权利要求1至8任一项所述的siRNA或如权利要 求11至13任一项所述的组合物在制备治疗或预防皮肤色素沉着过度 的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及包括一条正义RNA链和一条互补反义RNA链一起形成RNA双链的新颖的分离siRNA，其特征在于该正义RNA链包括，与编码肌球蛋白Va蛋白基因的外显子F核苷酸序列中14至30个连续核苷酸的片段相比，最多有一个不同的核苷酸的序列，本发明也涉及包括至少一种上述siRNA的组合物，还涉及至少一种上述siRNA作为化妆品或在皮肤色素脱失中作为治疗剂的用途。
文档编号A61K8/30GK101326286SQ200680046511
公开日2008年12月17日 申请日期2006年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者A-M·施米特-米拉斯, J·朗贝尔, M·范热莱, W·韦斯特布鲁克 申请人:皮埃尔·法布尔皮肤化妆品公司