诊断和治疗肿瘤的方法及组合物的制作方法

专利名称：诊断和治疗肿瘤的方法及组合物的制作方法
本分案申请是基于申请号为96199585.8，申请日为1996年11月27日，发明名称为“诊断和治疗肿瘤的方法及组合物”的中国专利申请的分案申请。
发明的背景本申请是1995年11月30日提交的美国临时专利申请序号60/007,810的部分继续申请。上述公开的全部内容没有任何放弃地引入本文作为参考。
A.发明的领域本发明总地涉及肿瘤生物学领域。具体地说，本发明涉及治疗磷状细胞癌的组合物及方法。本发明还提供了检查显微残留肿瘤和将肿瘤植入体腔内的动物模型，及其治疗方法。
B.相关技术细胞增殖和细胞死亡的平衡率对于保持正常组织内环境稳定起重要作用。这种平衡的破坏是多步骤肿瘤发生过程中的一个主要因素，并且对凋亡或编程性细胞死亡的抑制是引起这种破坏的原因之一。这种缺陷的影响是灾难性的，在美国每年造成50多万人死亡。
在许多人类肿瘤的病因学中，有相当多的证据牵涉到肿瘤抑制基因p53基因的突变。有报告证明，包括代表性的结肠癌、胶质细胞瘤、乳腺癌、骨肉瘤和肺癌在内的几种不同的人肿瘤细胞系的生长受到病毒介导的野生型p53基因转移的功能性抑制。已显示诱导野生型p53的外源p53表达可诱导结肠癌细胞系和人肺癌球体细胞的凋亡，提示p53在编程性细胞死亡中的作用。
患头和颈部鳞状细胞癌(SCCHN)的病人受到常常对语言、吞咽和美容产生深远影响之疾病的折磨。此外，由于一直是实施外形手术和放射治疗，所以近30年来这些病人的约50％这一总存活率一直没有改变。与全身性播散相反的主要在局部部位的复发，表明原发性肿瘤部位的微小残余肿瘤是高死亡率的主要原因。基于这些事实，如果能够有效地破坏SCCHN中的微小残留病变将可改善肿瘤治疗的效力。
发明概要因此，本发明的一个目的是提供改良的体内治疗鳞状细胞癌的方法。本发明的另一个目的是提供估测显微残余肿瘤发展及治疗效果和在体腔内显微植入肿瘤的方法。
在实现这些目的中，提供了一种治疗患鳞状细胞癌的病人的方法，其包括(a)提供包含在真核细胞中发挥功能的启动子和编码p53的多核苷酸的表达构建体，其中多核苷酸位于启动子有义方向并在其控制下；以及(b)使该表达构建体与鳞状细胞癌在体内接触。
鳞状细胞癌可以是头和颈部癌瘤。鳞状细胞癌的内源性p53可以是突变或未突变的。表达构建体最好是病毒载体，例如反转录病毒载体和腺病毒载体及腺相关病毒载体，特别是复制缺陷型腺病毒载体。在一特定实施方案中，标记p53基因，以便可以检测从表达载体表达的p53。优选的标记是总疫学标记，如连续的抗体表位。
该方法进一步包括外科手术切除肿瘤，及切除后进一步使肿瘤床或“人工体腔”与表达构建体接触。用于接触肿瘤床的体积约为3ml至10ml。在利用腺病毒载体时，每次接触中投用的腺病毒的量约为107、108、109、1010、1011或1012pfu。
也预期连续灌注表达构建体。将根据通过注射递送的量来确定连续输注中递送的量，以便在给定的时间内达到大约同样的总剂量，但使用连续输注法可能达到稍大些有总剂量。
在另一实施方案中，将表达构建体注射到天然体腔如口、咽、喉、食管、气管、胸腔、腹腔，或包括膀胱、结肠或其他内脏器官在内的中空器官腔。
还提供了确定对微小残留肿瘤之治疗效果的方法，其包括(a)提供带有切割到皮下组织中之切口的啮齿动物；(b)用肿瘤细胞接种切口；(c)用治疗法处理该啮齿动物；以及(d)估计该疗法对肿瘤发育的影响。可在步骤(b)之后和步骤(c)之前封闭切口。另外，所说的处理方法可包括向切口内导入治疗组合物，在封口后再打开切口并在导入所说的治疗组合物后再封闭之。
可从下列详细描述中进一步了解本发明的其他目的、特征和优点。但应明确的是，指出本发明优选实施方案的详细描述和特定实施例只是以举例说明的方式给出的，对于本领域技术人员来说，对该详细描述的各种落入本发明的精神和范围内的改动和改进都将是显而易见的。
附图简要说明下列附图构成本说明书的一个部分并包括在说明书内，其旨在进一步证明本发明的某些方面。可参考一个或多个附图及本文对特定实施方案的详细描述来更好地理解本发明。


图1SCCHN细胞系Tu-138(实心三角)和Tu177(实心方块)的转导效率。以10到100的不同MOI用重组β-gal腺病毒感染细胞。从每个复制平皿上各记500个细胞得出β-gal阳性细胞的百分数。
图2A和图2BSCCHN细胞体外生长的抑制。(图2A)模拟感染的Tu-138细胞(实心圈)、dl312感染细胞(实心三角)，及Ad5CMV-p53感染的细胞(实心方框)的生长曲线。(图2B)模拟感染的Tu-177细胞(空心圈)、dl312感染的细胞(空心三角)和Ad5CMV-p53感染的细胞(空心方块)的生长曲线。在每个指出的时间点，胰酶消化并计数三个平皿的细胞。将感染后每三个重复孔细胞计数的平均值±SEM对感染以来的天数作图。
图3A、图3B、图3C和图3D四个SCCHN细胞系的复合生长曲线。(图3A)Tu-138。(图3B)Tu-177。(图3C)MDA 686-LN。(图3D)MDA886。模拟感染的细胞(实心圈)、dl312感染的细胞(实心三角)和Ad 5CMV-p53感染的细胞(实心方块)。将感染后每三个重复孔的细胞计数平均值对自感染后的天数作图；竖短线为平均标准差(SEM)。
图4正常成纤维细胞系的生长曲线。模拟感染的细胞(实心圈)、dl312感染的细胞(实心三角)和Ad5CMV-p53感染的细胞(实心方块)。
图5A和图5BSCCHN细胞系的复合生长曲线。图5ATu-138；图5BMDA 686LN；模拟感染的细胞(空心方块)、dl312感染的细胞(空心三角)和Ad5CMV-53感染的细胞(实心圈)。在每个指出的时间点上，用胰酶消化并计数三个平皿的细胞。将每三个重复平皿细胞计数的平均值对感染后小时数作图；竖短线为SEM。
图6A和图6B按TUNEL方法用生物素化的dUTP标记凋亡细胞中的DNA断裂。感染后，在一时间过程研究中对细胞凋亡进行流式细胞计数分析。图6A用复制缺陷型腺病毒dl312感染的Tu-138细胞(框1-框4)，用野生型p53腺病感染的Tu-138细胞(框5-框8)。图6B用复制缺陷型腺病毒dl312感染的MDA 686LN细胞(A-D)，用野生型p53腺病毒感染的MDA 686LN细胞(E-H)。Ap代表细胞凋亡。
图7A和图7BSCCHN细胞系的复合生长曲线。图7ATu-138；7BMDA 686LN；模拟感染的细胞(空心圈)，dl312感染的细胞(空心三角)，Ad5CMV-p53感染的细胞(空心方块)和Ad5CMV-p53-FLAG感染的细胞(空心方块)。在每个时间点，用胰酶消化并计数平均值对感染后小时数作图；竖短线代表SEM。
优选实施方案的详细描述迄今的资料提示，治疗SCCHN的主要缺点之一是不能完全根除原发肿瘤部位或紧邻局部或区域组织中的疾病。因此，设计本发明以提供得以更完全和有效地治疗SCCHN，特别是破坏微小残留肿瘤的基因治疗方法学。可以单独使用该方法学或作为更常规的治疗方法如化学或放射治疗或外科介入法的辅助方法使用之。此外，使用针对微小残留肿瘤以及植入体腔内的微小肿瘤而特别设计的动物模型，本发明人已证明了这些方法的效力。本发明的详细内容更全面地描述如下。
总地说来，现已观察到不管肿瘤细胞的p53状态如何，肿瘤p53基因治疗都是有效的。令人惊奇的是，当使用携带野生型p53基因的病毒载体治疗肿瘤时；已观察到对其中细胞表达功能性p53分子的肿瘤的治疗效果。这一结果不能基于目前对肿瘤抑制基因功能的了解预测到。另外，还发现也表达功能性p53分子的正常细胞显然没有受到病毒构建体高水平表达p53的影响。这就提出了这样一种可能性，即p53基因治疗法治疗肿瘤可能比原来预期的有更为广泛的适用性。
A.p53蛋白质和多核苷酸本申请整个文件中使用的术语“p53”是指举例的p53分子以及所有其他种属的p53同系物。“野生型”和“突变体”p53分别指表达正常肿瘤抑制因子活性的p53基因和缺乏或具有降低的抑制因子活性和/或具有转化活性的p53基因。因此p53的“突变体”不仅仅是序列突变体，而且更是显示有改变的功能特征的那些突变体。
目前认为p53是一种肿瘤抑制基因(Montenarh，1992)。发现以化学致癌、紫外光照射及包括SV40在内的几种病毒转化的许多细胞中都有高水平的p53。在许多人类肿瘤中p53基因是突变失活的常见靶，并已证明是常见人肿瘤中的最常见的突变基因(Mercer，1992)。其在50％以上的人NSCLC中(Hollestein等.，1991)和广谱的其他肿瘤中都是突变的。
虽然含有突变的p53基因的肿瘤是根据本发明的优选靶，但权利要求的p53表达载体的应用延伸到治疗具有野生型或功能性p53的肿瘤。尽管目前对有关机理还不完全了解，但本发明人已确定p53表达能限制表达功能性p53产物之肿瘤的生长，甚至诱导这些细胞中的凋亡过程。因此，虽然肿瘤的p53状态可潜在地用于诊断方面，但对于本发明的实践并不是重要的。这种现象不只限于SCCHN肿瘤，而且可应用于包括神经胶质瘤、肉瘤、癌、白血病、淋巴瘤和黑素瘤在内的各种恶性增生，其中包括皮肤、肝脏、睾丸、骨、脑、胰腺、头和颈、胃、肺、卵巢、乳腺、结肠、前列腺和膀胱的肿瘤。
p53多肽p53基因编码可与病毒蛋白质如大T抗原和E1B形成复合物的375氨基酸磷蛋白。该蛋白质见于正常组织和细胞中，但与许多被转化的细胞或肿瘤组织相比，其浓度很小。令人感兴趣的是，野生型p53似乎在调节细胞生长和分化中是很重要的。已显示在某些情况下野生型p53的过量表达在人肿瘤细胞系中是抗增殖的。因此p53可作为细胞生长的负调节剂(Weinberg，1991)，并可直接抑制不受控制的细胞生长，或间接激活抑制这种生长的基因。因此，野生型p53的不存在或活化可能归因于转化作用。然而，有些研究指出，突变体p53的存在对于基因之转化潜能的充分表达是必要的。
虽然野生型p53是认定为许多类型细胞中的特别重要的生长调节因子，但其遗传学和生物化学特征似乎也显示有一定的作用。错义突变对于p53基因是常见的，并且对于癌基因的转化能力是很关键的。由点突变促成的单一基因改变可产生致癌性p53。但与其他癌基因不同，已知p53点突变发生在至少30个不同的密码子中，常常产生导致细胞表型转变的显性等位基因，而没有降低纯合性。此外，这些显性失活的等位基因中有许多似乎在生物体中是被耐受的，并且可在生殖系中传代。各种突变等位基因似乎从小的功能障碍到强的穿透性、显性失活的等位基因排列的(Weinberg，1991)。
Casey和其同事已报导，将编码野生型p53的DNA转导到两个人乳腺癌细胞，恢复了这些细胞中的生长抑制性控制(Casey et al.，1991)。也已证明了将野生型而不是突变体p53转染到人肺癌细胞系中的相似效果(Takahasi et al.，1992)。p53野生型似乎比突变体基因更占优势，并且当转染到带突变型基因的细胞内时将选择性地对抗增殖。转染的p53的表达并不影响带内源性p53之正常细胞的生长。因此，这些构建体可被正常细胞摄入而没有付效应。
因此有可能用野生型p53治疗p53相关肿瘤以降低恶性细胞的数目。然而，如上所述的那些研究远没有达到这样的目的，这至少是因为不能利用DNA转染作用将DNA导入病人体内的肿瘤细胞中。
编码p53的多核苷酸根据本发明的多核苷酸可编码完整的p53基因、功能性p53蛋白区域或任何p53多肽。“互补”多核苷酸是能够按照标准的Watson-Crick互计法则碱基配对的多核苷酸。即较大的嘌呤将与较小的嘧啶碱基配对以形成乌嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T，对DNA来说)，或腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U，对RNA来说)的组合。在杂交序列中包括少见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他碱基并不干扰配对。
本文所使用的术语“互补序列”是指实质在其整个长度上互补的并且只有很少碱基错配的多核苷酸序列。例如，长度为15个碱基的序列当它们有13或14位互补核苷酸时即被称为互补。当然，“完全互补”的序列应是在其整长长度上完全互补并没有错配的序列。
也预期包括有低程序同源性的其他序列。例如，可设计在有限的区域有高度同源性但也含有非同源区的反义构建体(如核酶)。这些分子虽然有少于50％的同源性，但可以在适当条件下与靶序列结合。
多核苷酸可衍生于基因组DNA，即可以直接从特定生物体的基因组中克隆。但在其他实施方案中，多核苷酸可以是互补DNA(cDNA)。cDNA是使用信息RNA(mRNA)作模板制备的DNA。因此，cDNA并不含有任何中断的编码序列，并且通常几乎只含有相应蛋白质的编码区。在另一实施方案中，多核苷酸可以是合成的。
将基因组DNA的一部分与cDNA或合成的序列组合起来产生特定构建体可能是有利的。例如，当期望在最终构建体中有一个内含子时，则需要使用基因组克隆。可从p53以外的其他基因衍生得到内含子。cDNA或合成的多核苷酸可为构建体的保留部分提供更方便的限制性位点，并因此可用于序列的其他部分。
SEQ ID No1和SEQ ID No3分别提供了人和小鼠p53的DNA序列，SEQ ID No2和SEQ ID No4中则分别提供相应的氨基酸序列。
预期存在与本文公开序列不同的p53的天然变异体。因此，本发明不只限于使用所提供的p53的多核苷酸序列，而且还包括使用任何天然存在的变异体。本发明还包括这些序列的化学合成的变异体。
另一类型的序列变异体则得自密码子变异。因为20个正常氨基酸的大多数都有几个密码子，所以p53可由许多不同的DNA编码。参见下表将会识别这样的变异体。
表1
考虑到遗传密码的简并性，优选的是与本文公开的核苷酸序列有大约50％至75％，或有大约76％至99％相同核苷酸的序列。落在“p53编码多核苷酸”范围内的序列是能够在细胞内条件下与上面列出的多核苷酸碱基配对的序列。
如上文指出的，虽然p53编码序列可以是全长度基因组或cDNA拷贝，或其大片段，但本发明也可利用p53的较短的寡核苷酸。17碱基长的序列应在人基因组中只存在一种，并因此而足以确定独特的靶序列。虽然较短的寡聚体更易于制备并增加体内可接近性，但在确定碱基配对的特异性中也包括许多其他因素。寡核苷酸与其互补靶的结合亲合性及序列特异性随长度增加而增加。预期使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的寡核苷酸，例如用于制备p53突变体和用于PCR反应中。
在人基因组中17碱基长的任何序列应只存在一种，并因此而足以确定独特的靶序列。虽然更短的寡聚体更易于制备并增加体内可接近性，但在确定杂交的特异性时还涉及许多其他因素。寡核苷酸与其互补靶的结合亲合性及序列特异性随长度的增加而增加。
在某些实施方案中，可望利用包括其他元件的构建体，例如包括C-5丙炔嘧啶的构建体。已显示含有尿嘧啶和胞嘧啶的C-5丙炔类似物的寡核苷酸以高亲合性结合RNA(Wagner et al.，1993)。
本领域技术人员也十分了解，生物学功能等同物蛋白质或肽的定义意味着一个对可在分子的限定部分内进行的改变数目有限制、并仍产生可接受水平的等同生物学活性之分子的概念。因此生物学功能等同物肽在本文中被限定为其中某些而不是大多数或所有的氨基酸可被取代的那些肽。具体地说，如涉及p16蛋白质的N末端，预期可在给定的肽内只有大约16个或更好有5个氨基酸被改变。当然，可很容易地制得并按照本发明使用多个有不同取代的不同蛋白质/肽。
氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都是相似大小的；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一般都有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在本文中均分别限定为生物学功能等同物。
在进行改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。对每种氨基酸都基于它们的疏水性及电荷特征定出一个亲水指数异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在赋予蛋白质以活性生物学功能中，氨基酸亲水指数的重要性是本领域都了解的(Kyte & Doolittle，1982，引入本文作为参考)。已知某些氨基酸可被其他具有相似亲水指数的并仍保留相似生物学活性的氨基酸取代。在基于亲水指数进行改变时，取代氨基酸的亲水指数较好在±2之内，特别是在±1之内，最好在±0.5之内。
了解到氨基酸可由具有相似亲水值并仍得到生物学等同物蛋白质的另一个氨基酸取代。如美国专利4,554,101中详细描述的，已确定了下列氨基酸的亲水值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于相似亲水值的改变中，取代氨基酸较好是其亲水值在±2之内，特别是在±1之内，最好在±0.5之内。
B表达载体本申请中使用的术语“表达构建体”是指包括任何类型含有编码基因产物之核酸的遗传构建体，其中部分或所有核酸编码序列均能够被转录。转录物可以但不一定被翻译成蛋白质。因此，在某些实施方案中，表达包括p53基因的转录及p53mRBA翻译成p53蛋白质产物。在其他实施方案中，表达只包括转录编码p53的核酸或其互补物。
为了使该构建体实现至少p53转录物的表达，编码p53多核苷酸的多核苷酸将处于启动子的转录控制之下。“启动子”是指由宿主细胞合成机制识别的，或导入到合成机制中的，为启动基因的特异性表达所需的DNA序列。短语“在转录控制下”是指启动子处在与控制RNA聚合酶启动和多核苷酸表达的多核苷酸相关的正确位置上。
本文所使用的术语启动子是指一组围绕RNA聚合酶II起始位点集合的转录控制组件。对启动子如何组织的许多认识源于对包括HSV胸苷激酶(tK)和SV40早期转录单位的几种病毒启动子的分析。尽管最近的工作对其有所争论，这些研究已显示启动子是由不同的功能性组件组成的，其中各包括大约7-20bp的DNA，并包括转录激活因子或抑制因子蛋白质的一个或多个识别位点。
在每个启动子中至少一个组件的功能是确定RNA合成的起始位点。其中了解最清楚的是TATA盒，但在某些缺TATA盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，交迭起始位点本身的分离的元件有助于固定启动部位。
附加启动子元件调节转录起始的频率。一般说来，这些元件都位于起始位点的上游30-110bp区域中，但最近的研究显示许多启动子也都含有起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间隔常常是可变的，这样当元件倒转或相对另一个移动时启动子功能得以保存。在tk启动子中，在活性开始降低之前，启动子元件之间的间隔可增加到间隔50bp。依据启动子的不同，似乎个别元件可协同或单独发挥激活转录作用的功能。
据信对用于控制p53多核苷酸表达的特定启动子的要求并不是绝对的，只要其能够在靶细胞中以足够高的水平表达该多核苷酸即可。因此，当以人细胞为靶时，最好使多核苷酸编码区相邻于能够在人细胞中表达的启动子并在其控制之下。一般说来，这样的启动子包括人或病毒启动子。
在各个不同的实施方案中，可使用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列，以得到p53多核苷酸的高水平表达。本发明还包括使用本领域已知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子以实现多核苷酸的表达，条件是表达水平足以产生生长抑制作用。
利用有已知性质的启动子，可使转染后多核苷酸的表达水平和方式最佳化。例如，选择在特异性细胞中不活性的启动子，如在酪氨酸酶(黑素瘤)、α胎儿蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺癌)和前列腺特异性抗原(前列腺癌)中，将允将组织特异性表达p53多核苷酸。表2列出可用于本发明以调节p53构建体之表达的几种元件/启动子。该表并不是要详尽地给出所有参予促成p53表达的可能的元件，而只是作为举例而已。
增强子原来被检测为增强从位于同一DNA分子上的远距离启动子转录的遗传元件。这种跨越大的距离发挥作用的能力在有关原核生物转录调节作用的传统研究中是几乎没有先例的。继后的工作显示，带增强子活性之DNA区域的组织很象启动子。即是说，它们是由许多个别元件组成的，其中每个部分与一个或多个转录蛋白结合。
增强子和启动子之间的基本区别是操作上的。增强子区总体上必须能够相隔一段距离刺激转录；这一点对于启动子或其组成元件则不必。另一方面，启动子必须有一个或多个在特定位点和特定方向上直接发动RNA合成的元件，而增强子则缺乏这样的特性。启动子和增强子常常是交迭的和连续的，似乎常常有很相似的组织模式。
也可使用其他任何启动子/增强子组合(真核生物启动子数据库EPDB)来驱动p53构建体的表达。使用T3、T7或SP6胞浆表达系统是另一个可能的实施方案。如果提供适当噬菌体聚合酶，作为传送复合体的一部分或作为附加的基因表达载体，则真核细胞可支持从某些噬菌体启动子开始的胞浆转录。
表2
此外，选择在对特异性生理学信号反应中受调节的启动子可产生p53构建体的可诱导表达。例如，在人PAI-1启动子控制下的多核苷酸即是可由肿瘤坏死因子诱导表达的。表3中列举几个启动子/诱导物组合的例子
表3
在本发明的某些实施方案中，通过在表达载体中加入标记可于体外或体内鉴定细胞中表达载体的运送。该标志将使被转化的细胞发生可鉴定的变化，以使易于鉴定表达。通常加入药物选择标志有助于克隆和选择转化体。另外，可利用酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tK)(真核细胞)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)(原核细胞)。也可利用免疫学标志。利用什么选择标志并不重要，只要其能够随编码p53的多核苷酸一起表达即可。选择性标志的其他例子是本领域技术人员熟知的。
表达构建体中典型地还包括实现转录物适当聚腺苷酸化的聚腺苷酸化信号。据信聚腺苷酸化信号的性质对于实践本发明并不是关键的，任何这样的序列均可使用。本发明人利用了SV40聚腺苷酸化信号，已知其在靶细胞中可方便地使用并充分发挥功能。另外，作为表达构建体的一个元件还包括终止子。这些元件可用于提高信号水平并使从构建体读成其他序列的可能性减至最小。
在本发明的优选实施方案中，表达构建体包括病毒或衍生于病毒基因组的工程构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞、并且在某些情况下整合到宿主染色体中的能力，已使它们成为将基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的侯选载体。然而，因为已证明可直接摄入裸DNA，以及可经受体介导摄入DNA复合物(见下文的讨论)，所以表达载体不一定是病毒，而可以是能够支持在哺乳动物细胞中表达编码基因的任何质粒、粘粒或噬菌体构建体，例如pUC或BluescriptTM质粒系列。
反录病毒反录病毒是一组以能够在被感染的细胞中通过反转录过程将其mRNA转变成双链DNA为特征为单链RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA作为原病毒稳定地整合到细胞染色体中并直接合成病毒蛋白质。整合导致病毒基因序列在受体细胞和其子代中的保留。反录病毒基因组合有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和被膜成分的三个基因gag、pol和env。见于gag基因上游的称为ψ的序列具有在病毒粒子中包装基因组的信号功能。在病毒基因组的5′和3′端存在两个长的末端重复(LTR)序列。这些序列含有强启动子和增强子序列，并且也是在宿主细胞基因组中整合所必需的(Coffin，1990)。
为了构建反录病毒载体，将编码p53的核酸插入到病毒基因组中取代某些病毒序列，以产生有复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建含有gag、pol和env基因但没有LTR和ψ成分的包装细胞系(Mann etal.，1983)当含有人cDNA、连同反录病毒LTR和ψ序列的重组质粒被导入该细胞系(例如用磷酸钙沉淀法)时，ψ序列促使重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后后者被分泌到培养基内(Nicolas andRubenstein，1988；Temin，1986；Marn et al.，1983)。然后收集含有重组反录病毒的培养基，可以进一步浓缩并用于基因转移。反录病毒能够感染许多不同类型的细胞。然而，整合和稳定地表达还需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.，1975)。
最近已发展了一种基于向病毒被膜中化学加入乳糖残基的化学修饰，从而特异地导向反录病毒的新方法。这种修饰可能允许通过唾液酸糖蛋白受体特异性地感染肝细胞。
在所设计的定向运送重组反录病毒的另一方法中，使用抗反录病毒被膜蛋白和抗特异性细胞受体的生物素化的抗体。使用链霉抗生物素，通过生物素成分偶联抗体(Roux et al.，1989)。使用抗主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，证明可在体外用亲嗜性病毒感染各种带有那些表面抗原的人细胞。
腺病毒人腺病毒是有约36kb大小基因组的双链DNA肿瘤病毒(Tooze，1981)。作为真核基因表达的模式系统，已对腺病毒进行了广泛研究和充分鉴定，使之成为发展腺病毒为基因转移系统的一个具有吸引力的系统。这一组病毒易于生长和操纵，并且在体外和体内表现出有宽的宿主范围。在裂解性感染的细胞中，腺病毒能够切断宿主蛋白质合成，指引细胞机器合成大量的病毒蛋白质，并产生大量病毒。
基因组的E1区包括E1A和E1B，其编码负责病毒基因组的转录调节作用的蛋白质，及少数细胞基因。E2(包括E2A和E2B)表达允许病毒复制功能蛋白质的合成，例如DNA结合蛋白质、DNA聚合酶及引导复制之末端蛋白质。E3基因产物防止因细胞毒性T细胞及肿瘤坯死因子引起的细胞溶解，并且似乎对病毒增殖很重要。与E4蛋白质相关的功能包括DNA复制、晚期基因表达以及宿主细胞关闭蛋白质合成。晚期基因产物包括大多数病毒粒子衣壳蛋白，并且这些蛋白质只在从主要晚期启动子转录的单一初级转录物进行大部分加工后才表达。在感染的晚期，主要晚期启动子(MLP)表现出高效率(Stratford-Perricaudet andPerricaudet，1991a)。
因为只有小部分病毒基因组要求是顺式的(Tooze，1981)，所以腺病毒衍生的载体当与细胞系如293细胞结合使用时，可提供极好的取代大DNA片段的可能。已建立了Ad5转化的人胚肾细胞系(Graham，et al.，1977)，以提供呈反式的基本病毒蛋白质。因此本发明人有理由认为，腺病毒的特征使之成为用于体内导向肿瘤细胞的良好候选病毒载体(Grunhaus & Horwitz，1992)。
腺病毒系统向细胞传送外来蛋白质的特别优点包括(i)能够由外来DNA取代相对大块的病毒DNA；(iii)重组腺病毒的结构稳定性，(iii)腺病毒给人服用的安全性，和(iv)腺病毒感染与肿瘤或恶性增生没有任何已知的联系；(v)能够获得高深滴度的重组病毒；以及(vi)腺病毒的高感染性。
与反录病毒相比，腺病毒载体的其他优点包括更高水平的基因表达。另外与反录病毒序列不同，腺病毒复制不依赖于宿主基因复制。由于E1区中的腺病毒转化基因可以很容易地缺失，并仍提供有效的表达载体，所以一般认为由腺病毒载体造成的致癌危险可以略不计(Grunhaus& Horwitz，1992)。
一般说来，腺病毒基因转移系统是基于重组的、工程化的腺病毒，因缺失其部分基因组例如E1而使之成为复制功能不全的，并且仍保留其感染能力。当腺病毒基因组中还有另外的缺失时，编码更大的外来蛋白质的序列可被表达。例如，E1和E3区均有缺失的腺病毒能够携带达10Kb的外源DNA，并可以在293细胞中生长至高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。令人惊奇的是，也有关于在腺病毒感染之后持续表达转基因的报导。
近年，已作为一种介导向真核细胞和整体动物中转移基因的手段，研究了腺病毒介导的基因转移。例如，在治疗有罕见的隐性遗传性疾病鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺陷的小鼠中，发现可使用腺病毒构建体提供正常的OTC酶。遗憾的是，在17例中只有4例实现了OTC的正常水平表达(Stratford-Perricaudet et al.1991b)。因此，大多数小鼠的缺陷只得到部分纠正，并且没有导致生理或表型改变。因此这些类型的结果难于鼓励在肿瘤治疗中使用腺病毒载体。
使用腺病毒向cotton大鼠的肺上皮中转移节性纤维化跨膜转导调节蛋白(CFTR)的尝试也已取得了部分成功，但还不能评定被转移的基因在动物上皮中的生物学活性(Rosenfeld等.，1992)。这些研究再次证明了基因转移和CFTR蛋白质在肺呼吸道细胞中的表达，但没有显示生理学效应。Rosenfeld等人(Science，1991)证明了α1-抗胰蛋白酶的肺内表达，但也没有显示生理学效应。事实上，他们推测所观察到的表达水平只是为保护人肺细胞所需水平的大约2％，即远低了发挥生理学效应所需的水平。
经门脉内注射将人α1抗胰蛋白酶基因导入到正常大鼠的肝脏中，其被表达并使被导入的人蛋白质分泌到这些大鼠的血浆中(Jaffe et al.，1992)。然而，所获得的产物水平不足以带来治疗价值。
这些结果不能证明腺病毒可以指导蛋白质在重组体细胞中达到足以发挥生理学作用的表达，因此也没有提示腺病毒系统在用于肿瘤治疗方面的适用性。再者，在本发明之前，认为p53不能被掺入到包装细胞中，如用以制备腺病毒的细胞中(因其会产生毒性)。因为腺病毒的E1B与p53结合，所以认为这也是不可能合用腺病毒和p53技术的另一个基因。
作为表达构建体的其他病毒载体可利用其他病毒载体作为本发明中的表达构建体。可使用衍生于病毒如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Couparet al.，1988)、腺相关病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal andSugden，1986；Hermonat and Muzycska，1984)和疱疹病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供几种有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar et al.，1988；Horwich et al.，1990)。
随着目前对缺陷型乙型肝类病毒的了解，已对不同的病毒序列的结构-功能关系有了新的认识。体外研究显示，既使缺失高达其基因组的80％，病毒仍保留辅助病毒依赖性包装和反转录能力(Horwich et al.，1990)。这提示大部分基因组都可被外来遗传材料所取代。趋肝性和持久性(整合)是肝导向性基因转移的特别有吸引力的性质。最近Chang等人将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入鸭乙型肝类病毒基因组以代替聚合酶、表面和前表面编码序列。将其与野生型病毒共转染到鸟肝细胞瘤细胞系中。使用含有高滴度重组病毒的培养基感染初级鸭系肝细胞。转染后检测到稳定地CAT基因表达至少24天(Chang et al.，1991)。
C.基因输送的替代方法为了实现p53构建体的表达，必须将表达载体输送到细胞中。如上所述，递送的优选机制是将表达载体包裹在感染性腺病毒颗粒中并通过病毒感染实现之。
本发明还包括几种向培养的哺乳动物细胞中转移表达载体的非病毒方法。这些方法包括磷酸钙沉淀法(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖法(Copal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接微量注射(Harland and Weintraub，et al.，1985)、装载DNA的脂质体法(Nicolau and Sene，1982；Fraley et al.，1979)、脂转染胺试剂-DNA复合物法、细胞超声处理法(Fechheimer et al.，1987)、使用高速度微粒的基因轰击法(Yang et al.，1990)、聚阳离子法(Boussif etal.，1995)和受体介导的转染法(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。其中有些技术可成功地适用于体内、离体或体外应用。
在本发明的一个实施方案中，腺病毒表达载体可简单地由裸重组载体组成。可用上文提到任何一种物理或化学可透过细胞膜的方法完成构建体的转移。例如，Dubensky等人(1984)将多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝和脾脏中，证明了病毒可主动复制并造成急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明，直接腹腔内注射CaPO4淀淀的质粒导致转染基因的表达。可以预见，也可以用相似方法体内转移编码p53构建体的DNA。
本发明向细胞内转移裸DNA表达载体的另一个实施方案可包括颗粒轰击。这种方法取决于将DNA包被的微粒加速到一定的高速度使之透过细胞膜并在不杀死细胞的情况下进入细胞的能力(Kleim et al.，1987)。已发展了几种加速小颗粒的装置。一种这类装置依赖于高电压放电以产生可提供动力的电流(Yang et al.，1990)。所用的微粒由生物学惰性物质如钨或金微球组成。
体内轰击的器官包括大鼠和小鼠的肝脏、皮肤和肌肉组织(Yang etal.，1990；Zelenin et al.，1991)。可能需要手术暴露组织或细胞，以消除枪和靶器官之间的干扰组织。可通过这种方法递送编码p53构建体的DNA。
在本发明的再一个实施方案中，可将表达载体截留在脂质体内。脂质体是以磷脂双层膜和内部含水介导为特征的泡囊结构。多层脂质体具有由含水介质分离开的多个脂质层。当将磷脂悬浮于过量含水溶液中时它们即自动形成。在形成封闭的结构并截留脂质双层之间的水和溶解的溶质之前，脂质成分进行自身重排(Ghosh and Bachhawat，1991)。本发明还试图包括脂转染胺试剂-DNA复合物。
脂质体介导的多核苷酸输送和外来DNA的体外表达已获得了很大成功。Wong等人(1980)证明了脂质体介导的送递和外来DNA在培养的鸡胚、Hela和肝癌细胞中表达的可行性。Nicolau等人(1987)成功地完成了于大鼠体内静脉注射后脂质体介导的基因转移。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。这一现象表明有利于与细胞膜融合和促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda et al.，1989)。在其他实施方案中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)复合或用于与之联合(Kato et al.，1991)。在另外的实施方案中，脂质体可与HVJ和HMG-1复合或用于与两者结合。其中已将这样的表达载体成功地用于在体外和体内转移和表达多核苷酸，从而可应用于本发明。如在DNA构建体中利用噬菌体启动子，亦可望在脂质体内包括这样的启动子和适当的噬菌体聚合酶。
向细胞内转移表达载体的另一个机制是受体介导的送递。这种方法的优点是几乎在所有真核细胞中都可借助受体介导的细胞摄粒作用选择性地摄入大分子。由于各种受体的细胞类型特异性分布，所以送递可能是高度特异性的(Wu and Wu，1993)。受体介导的基因靶向载体一般由两成分组成细胞受体特异性配体和DNA结合剂。已使用了几种配体进行受体介导的基因转移。鉴定最清楚的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu and Wu，1981)和转铁蛋白(Wagner et al.，1993)。最近，已使用识别如ASOR的相同受体的合成的神经糖蛋白作为基因送递载体(Ferkol et al.，1193；Perales et al.，1994)也已使用表皮生长因子(EGF)向鳞状癌细胞送递基因(Myers，EPO 0273085)。
在其他实施方案中，送递载体可包括配体和脂质体。例如。Nicolau等人(1987)利用掺入到脂质体中的乳糖基神经酰胺(一种有末端半乳扩的脱唾液酸神经节苷酯)，并观察到肝细胞内胰岛素基因摄入的增加。因此，也可使用有或没有脂质体的任何数目的受体-配体系统，将腺病毒表达载体特异地送递到不同类型的细胞如肺、表皮或肿瘤细胞中。例如可使用表皮生长因子(EGF)作为在表现下调EGF受体的许多肿瘤细胞中介导p53构建体送递的受体。可使用甘露糖将其导向肝细胞上的甘露糖受体。另外，同样也可使用抗CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T细胞白血病)及MAA(黑素瘤)的抗体作为导向部分。
在某些实施方案中，可在离体条件下更容易地完成基因转移。离体基因治疗是指从动物体内分离细胞，于体外向细胞内送递多核苷酸，然后将经过修饰的细胞回输到动物体内。其可包括从动物体内手术除去组织/器官细胞和组织的初级培养物。Anderson等人(美国专利5,399,346)公开了离体治疗方法。在离体培养期间，表达载体可表达p53构建体。最后，可将细胞重新导入原动物体内，或借助下述以医学上可接受的形式投用于不同的动物体内。
D.药物组合物和给药途径在考虑到根据本发明的腺病毒表达载体的临床应用时，有必要制备作为适于所需应用之药物组合物的复合物。这一般包括制备基本上没有热原以及其任对人或动物有害的杂质的药物组合物。另外一般可期望利用适当的盐和缓冲液使复合物更稳定并有利于靶细胞对复合物的摄入。
本发明的含水组合物包括溶解或分散于医药上可接受的载体或含水介质中的有效量的表达载体。这样的组合物也称为接种体。术语“医药上或药理学上可接受的”是指当投用于动物或人体时不产生有害的、变应性的或其他不希望有的反应的分子单位和组合物。本文所说的“医药上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。在药物活性物质中使用这些介质和制剂是本领域已知的。除了与活性不相容者外，任何常规介质或制剂均可用于治疗组合物中。也可以在组合物中掺入辅助活性成分。
可以在适合与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液态聚乙二醇、其混合物及油中制备分散体。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有阻止微生物生长的防腐剂。
本发明的表达载体和送递载体可包括传统的药物制剂。可通过任何常规途径投用本发明的治疗组合物，只要能通过该途径使靶组织得到即可。其中包括口服、含服、直肠、阴道和局部给药。另外，也可通过原位、皮内、眼内、皮下、肌肉内、腹腔内或静脉内注射给药。正常情况下，其可作为包括生理学上可接受的载体、缓冲剂或其他赋形剂的医药上可接受的组合物给药。
本发明的治疗组合物可优选以可注射的组合物的形式，如溶液或悬浮液形式给药；也可以固体形式存在，在注射前制成水溶液或悬浮液。这些制剂可以是乳化的。用于这些目的的典型组合物包括某种药学上可接受的载体。例如，组合物可含有溶于每毫升磷酸盐缓冲盐水中的10mg、25mg、50mg或多达100mg的人血清白蛋白。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒性赋形剂，其中包括盐、防腐剂、缓冲剂等。无毒性赋形剂的例子包括聚乙二醇、丙二醇、植物油及可注射的有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠道外载体如氯化钠、林格氏右旋糖等。静脉内载体包括液体和营养添加剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧剂、络合剂及惰性气体。按照已知的参数调整药物组合物中各种成分的pH和准确浓度。
其他配方适用于口服给药。口服配方包括例如药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等典型的赋形剂。组合物可以是溶液、悬液、片剂、药丸、胶囊、缓释配方或粉末等剂型。当局部给药时，剂型可以是霜剂、软膏、油膏、液体或喷雾剂。
基于预期的使用目的确定治疗剂的有效量，例如用于(i)抑制肿瘤细胞增殖或(ii)排除肿瘤细胞。术语“单位剂量”是指适用于治疗对象的物理上分离的单位，每个单位均含有经过计算足以产生所需的上述反应的、与其给药途径和治疗方式相关的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，给药量取决于待治疗之对象的状况及所期望的保护作用。治疗组合物的精确量也取决于医生的判断和病人的个体差异。
在某些实施方案中，可能希望向病人提供可连续给药的治疗组合物。就静脉内或动脉内途径来说，可借用于点滴系统完成之。就局部应用来说，可利用反复施用法。对于各种方法，均可使用缓释配方以在长时间内提供有限但恒定量的治疗剂。为了内部应用，最好在局部区域上进行连续输注。在某些情况下可于手术后经导管插入进行输注，然后连续投用治疗剂。由临床医生根据特定病人的情况来选定输注时间，但时间一般为从约1-2小时到约2-6小时，约6-10小时，约10-24小时，约1-2天，约1-2周或更长时间。一般说来，通过连续输注投用的治疗组合物的剂量将相当于单一或多次注射给定的、根据注射时间调整的剂量。但相信可通过输注达到较高的剂量。
治疗SCCHN的临床方案已发展了有利于使用下文实施例中所述的腺病毒构建体治疗SCCHN疾病的临床方案。按照这个方案，选择有头颈部鳞状细胞癌病史的病人。病人以前可能但不一定接受过化学、放射或基因治疗。病人最好有足够的骨髓功能(限定为外周血绝对粒细胞数＞2,000/mm3，血小板数为100,000/mm2)，足够的肝功能(胆红素≤1.5mg/dl)以及足够的肾功能(肌酸酐＜1.5mg/dl)。
该方案要求通过肿瘤内注射单剂投用含有106至109p53腺病毒表达构建体之感染性颗粒的药物组合物。对于≥4cm的肿瘤，将使用4-10ml体积的制剂(最好10ml)，而对于＜4cm的肿溜，则投用1-3ml(优选3ml)。也可以0.1-0.5ml体积在相隔约1cm左右的部位进行多部位注射。
疗程约为两周内进行6次注射。可根据临床医生的决定，每两周连续的6次治疗，或者以较小频率(每月、每两个月、每季度等)给药。
对于适合于外科切除的病人，可按上述方法至少给予两个连续的两周疗程的治疗。在完成第二(或更多个如第三、第四、第五、第六、第七、第八等)疗程的一周内，病人接受外科切除手术。在封闭切口前，向手术部位送递10ml含有p53腺病毒表达构建体的药物组合物(106-109感染性颗粒)，并使之保持接触至少60分钟。封闭伤口并在其中放入引流导管。在手术后第三天通过引流管再投用10ml药物组合物并使之与手术床保持接触至少2小时。然后抽吸除去，并在临床上的适当时间去掉引流。
人工和天然体腔的处理复发性SCCHN的基本来源之一是肿瘤切除后仍在原发部位以及局部残留的显微镜下可见的病变。此外，当天然体腔移值有微量肿瘤细胞时也会出现类似情况。有效地治疗这样的细微病变应是肿瘤治疗方面的一个重要进步。
因此，在某些实施方案中，可手术切除肿瘤，造成一个“腔”。在外科手术时及手术之后(定期地或连续地)，向体腔内投用本发明的治疗组合物。实质上就是“局部”处理腔的表面。组合物的体积应足以保证腔的整个表面与表达构建体接触。
在一个实施方案中，给药仅为向肿瘤切除后形成的腔内注射治疗组合物。在另一个实施方案中，可以通过海绵、试子或其他装置进行机械施用。这些方法均可在去除肿瘤之后及初次外科手术期间使用。在另一个实施方案中，在封闭手术切口部位之前将导管插入腔内。然后连续向腔内灌注一定时间。
这种治疗方法的另一种形式是，在口、咽、食管、喉、气管、胸腔、腹腔或包括膀胱、结肠或其他内脏器官在内的空器官腔等天然体腔内定向“局部”施用治疗组合物。在这种情况下，腔中可能有或没有明显的原发性肿瘤。定向治疗腔中的微小病变，但如果预先没有除去可能存在于该腔内的原发性肿瘤块或恶性病变前损伤，则有时也可能对其发挥作用。另外，可以利用各种方法在这些内脏器官或腔表面进行“局部施用”。例如，可以用溶液简单地嗽口来进行咽部口腔施用。但在喉和气管内局部治疗时可能需要使用内窥镜观察并局部送递治疗组合物。膀胱或结肠粘膜等内脏器官可能需要用内导管灌注，或再次用内窥镜直接观察。对于胸腔和腹腔，可使用内导管或外科方法接近这些区域。
给药后监测p53表达本发明的另一个方面包括在投用治疗组合物后监测p53表达。因为不能观察到微小肿瘤的破坏，所以确定靶部位是否已有效地接触到表达构建体是很重要的。为此，可鉴定其中表达构建体主动产生p53产物的细胞。但重要的是，能够区分外源性p53和存在于治疗区域中的肿瘤和非肿瘤细胞中的p53。用微量示踪元素标记外源性p53将为该分子而非内源性等同体的表达提供明确的证据。
一种这样的示踪元素是由PLAG biosystem提供的(Hopp et al.，1988)。FLAG多肽是一种八肽(AspTyrLysAspAspAspAspLys)，其小体积不能破坏所送递的基因治疗蛋白质的表达。使用抗FLAG蛋白质抗体跟踪FLAG和感兴趣的蛋白质的共表达。
也可使其他免疫学标志系统，例如6XHis系统(Qiagen)。为此，可使用任何线性抗原表位产生与p53的融合蛋白质，只要(i)没有因融合而损害抗原表位的免疫学完整性，(ii)没有因融合而损害p53的功能完整性即可。
E.联合治疗方案肿瘤细胞对DNA损伤剂的抗性代表了临床肿瘤学一大问题。当前肿瘤研究的一个目的是找到通过与基因治疗合用来改善化疗和放疗效果的途径。例如，当借助逆转录载体系统将单纯性疱疹胸苷激酶(HS-tK)基因送递到脑中时，成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的敏感性(Culver，et al.，1992)。在本发明中，试图包括与化学或放射治疗干预联合使用的p53治疗。
为了使用本发明的方法和组合物杀死细胞，例如恶性或转移细胞，一般可使“靶”细胞与表达载体和至少一种DNA损伤因子接触。这些组合物应以杀死或抑制细胞的合并的有效量提供。这种方法可包括使细胞与表达载体及DNA损伤剂或因子在同一时间接触。为此，使细胞与包括两种因子的单一组合物或药物制剂接触，或者使细胞同时与两种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包括p53表达载体，而另一种包括DNA损伤剂。
另外，p53治疗也可以在DNA损伤剂治疗之前或之后，其间隔时间从几分钟到几周。在将DNA损伤剂和p53表达载体分别施用于细胞的实施方案中，一般应确保间隔时间不超过各自的送递时间，这样可使DNA损伤剂和表达载体仍能够对细胞发挥联合作用。在这种情况下，可期望使细胞与两种药剂在彼此给药的大约6小时至1周内，较好在大约24-72小时内，最好以仅仅约48小时的延迟时间接触。在某些情况下，希望延长治疗时间，但各自的给药间隔时间不超过几天(2，3，4，5，6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还希望一次以上投用p53构建体或DNA损伤剂。可利用各种组合方式，其中p53是“A”，DNA损伤剂是“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BA/B/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/BB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A B/A/A/B为了杀死细胞，以有效杀死细胞的合并剂量将两种药剂送递给细胞。
DNA损伤剂或因子在本文中限定为当施用于细胞时诱导DNA损伤的任何化合物或治疗方法。这样的制剂和因子包括诱导DNA损伤的幅射和波，例如γ幅射，X射线，UV幅射，微波，电发射等。各种化学化合物，也描述为“化学治疗剂”，有诱导DNA损伤的功能，并可用于本文公开的联合治疗方法中。预期使用的化学治疗剂包括例如阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、麦鬼臼毒吡喃糖苷(VP-16)、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)和过氧化氢。本发明还包括联合使用一种或多种DNA损伤剂，包括基于幅射的或真正的化合物，例如X射线和顺铂或使用顺铂与表鬼臼毒吡喃糖苷。在某些实施方案中，特别优选的是联合使用顺铂和p53表达载体。
在按照本发明的肿瘤治疗中，可使肿瘤细胞除与表达载体接触外还与DNA损伤因子接触。为此可用DNA损伤性幅射如X射线、UV光、g射线或微波照射面部肿瘤部位。另外，也可给病人投用治疗有效量的含有DNA损伤化合物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、表鬼臼素吡喃糖苷、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C，或更好是顺铂的药物组合物，以使肿瘤细胞与DNA损伤剂接触。可以制备DNA损伤剂并与上述p53表达载体合并，作为联合治疗组合物或试剂盒。
这里设计并显示直接交联多核苷酸特别是DNA的因子，以实现DNA损伤，产生协同抗肿瘤的组合。可使用顺铂和其他DNA烷化剂等药剂。已将顺铂广泛用于治疗肿瘤，临床上所用有效剂量为20mg/m2，每三周用5天，共3个疗程。顺铂口服不吸收，因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹腔内送递。
损伤DNA的药剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这样的化学治疗化合物包括阿霉素、表鬼臼素吡喃糖苷、维拉帕米、鬼臼毒素等。广泛用于临床治疗肿瘤，通过静脉内注射投用这些化合物，阿霉素的剂量范围为25-75mg/m2，间隔期为21天；表鬼臼素吡喃糖苷的静脉内剂量为35-50mg/m2，或口服双倍静脉内给药剂量。
破坏多核苷酸前体和亚单位的合成和精确性的药剂也导致DNA损伤。为此已发展了许多这样的多核苷酸前体。特别有用的是已进行了广泛试验并容易得到的药剂。因为5-氟尿嘧啶(5-FU)等药剂优先作用于恶性增生组织，所以这种药剂特别适用于定向杀伤肿瘤细胞。虽然毒性很大的5-FU可以在许多载体中应用(包括局部应用)，但通常使用静脉内给药，剂量为3-15mg/kg/天。
引起DNA损伤并已广泛使用的其他因子包括已知的γ射线、X射线和/或向肿瘤细胞定向送递的放射性同位素。还希望包括其他形式的DNA损伤因子如微波和紫外照射。很可能所有的这些因子都影响广泛的DNA损伤或DNA前体、复制及DNA修复，并影响染色体的组装和保留。X射线长期使用(3-4周)的每日剂量为50至200伦琴，单一剂量为2000到6000伦琴。放射性同位素的剂量范围很宽，并取决于同位素的半寿期、发出幅射的的强度与类型和恶性细胞摄入。
有关问题技术人员可参见“Remington药物科学”第15版，第33章，特别是624-652页。依据被治疗的病人的条件可适当改动剂量。负责给药的人在任何情况下都要针对具体病人确定适当的剂量。另外，在给人用药时，制剂应符合FDA对生物制品所规定的无菌性、热原性及一般安全性要求。
发明人提议，向有p53相关肿瘤的病人体内区域性送递p53表达载体将是为对抗临床疾病而送递治疗有效基因的有效方法。同样，也可以对病人身体特定的、受累的区域定向施加化学或放射治疗。另外，在某些情况下，例如在已发生了广泛转移的情况下，全身送递表达载体或DNA损伤剂可能是适合的。
也已证明细胞因子治疗是联合治疗的有效部分。联合治疗也可利用多种不同的细胞因子。细胞因子的例子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDFG、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。按照下述标准给药方法投用细胞因子，给药方法应与病人的状况及细胞因子的相对毒性等临床指征一致。
除了合用p53定向疗法和化学、放射及细胞因子疗法外，还期望合用其他基因疗法。例如，同时定向K-ras和p53突变可改善抗肿瘤治疗效果。可以想象以这种方式定向送递其他肿瘤相关基因，例如p21、p16、p27、E2F、Dp基因家族、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEM-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC，其他ras分子，myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl。也可能希望联合使用p53治疗和基于抗体的基因治疗，包括使用单链抗体构建体(其中抗体可与上述任何分子结合)，或联合使用编码以上列出的一种或多种细胞因子的基因。联合使用p53与涉及细胞凋亡过程的其他基因如腺病毒E1A、Bax、Bd-Xs等也可能是有利的。
F、试剂盒可将抑制肿瘤细胞增殖所需的基本材料和试剂组装在试剂盒中。其一般将包括选择的腺病毒表达载体。还可包括用于表达载体复制的和用于这种复制的宿主细胞的各种培养基。这样的试剂盒将包括各种试剂的不同容器。
当以一种或多种液体溶液形式提供试剂盒的成分时，溶液最好是水溶液，特别是无菌水溶液。为了体内使用，可将表达载体配制成药学上可接受的可注射组合物。在这种情况下，容器可以是吸入器、注射器、吸移管、滴眼器或其他类似装置，可从容器中将配制品施用于身体的患区例如肺，注射到动物体内，甚至与试剂盒的其他成分混合施用。
也可以以干燥的或冻干的形式提供试剂盒的成分。当以干燥的形式提供试剂或成分时，一般可加入适当的溶剂来重新溶解。可以想到，也可将溶剂加在另一个容器内并提供。
本发明的试剂盒典型地还包括一个容纳为了市场出售而密封的小瓶的工具，例如其中放有所需小瓶的注射或吹气成模的塑料容器。不管容器的数目或类型，本发明的试剂盒还都可能包括或装有一个帮助注射/给药或在动物体内置入最终的复合组合物的装置。这样的装置可以是吸入器、注射器、吸移管、镊子、计量匙、滴眼器或任何这类医学上批准使用的送递工具。
G.显微肿瘤种植和残留病变的动物模型本发明的另一个方面包括建立用于分析显微残留肿瘤和肿瘤细胞在体腔内的显微植入的动物模型。本文所说的“肿瘤”可以指单个细胞或多细胞肿瘤块。在显微病变中，“肿瘤”将由一个或少数几个肉眼不能观察到的瘤细胞组成。
本文所述的动物模型是特别有利地模拟(i)头和颈部肿瘤病人的手术后环境，特别是在疾病的后期阶段，以及(ii)已建立了显微肿瘤的病人的体腔。与其他肿瘤动物模型相似，该模型是经在动物体内接种肿瘤细胞而得到的。但区别在于在皮下造成一个生理学上相当于天然体腔或因手术切除瘤块而产生之手术后空腔的袋。
本发明以裸鼠作为模型动物举例。但实质上根据本发明，任何动物都可利用。特别优选的动物是常规用于实验室研究的小的哺乳动物。最好是啮齿类动物，如小鼠、大鼠、豚鼠及仓鼠。兔子也是优选的实验动物。选择动物的标准在很大程度上将取决于研究人员的特别爱好。
第一步是在实验动物身上造成一个组织瓣。术语“组织瓣”是指动物身上接触到靶组织的肉中的任何切割口。一般优选的切割部位是在动物的背部侧翼，因为这代表了一个容易接近的部位。但应明确的是，可以在动物身上的其他位点切开，并且可依据例如所研究的特殊类型的治疗方法等因素来选择组织部位。
一旦暴露出靶组织，便使单个的或微小肿瘤中的癌细胞与组织部位接触。向组织部位内种植瘤细胞的最方便的方式是将含有细胞的组织培养基的悬液施于暴露的组织上。可以使用无菌吸移管或其他方便的涂敷器简单地进行瘤细胞施加。一般该过程在无菌条件下进行。
在一个实施方案中，在裸鼠的暴露的组织瓣内接种2.5×106个SCCHN细胞。为此目的，本领域技术人员将能很容易地确定细胞的适当数目。细胞数目将取决于例如动物大小、切口大小、瘤细胞本身的复制能力、肿瘤生长的时间、待试验的抗肿瘤治疗等多种因素。虽然建立适于特定类型肿瘤的最佳模型系统可能需要对所投用的细胞数目作出某些判断，但这并不代表要进行过多的实验摸索。动物试验领域中的技术人员会理解到所需的这种最佳化条件。
例如，可以向动物输送不同数目的细胞并在重新封闭组织瓣后监测细胞生长，以进行初步研究。自然，投予的细胞数目较大，则将形成显微残留肿瘤细胞的较大群体。
本研究中使用褥式缝线有效地封闭组织瓣。但本领域技术人员可以根据预期的特殊应用方式使用粘结、钳夹、缝合等各种常规方法来封闭切口。
H.实施例下列实施例只是举例说明某些特定实施方案，并且不应以任何方式构成对本发明范围的限制。
实施例1通过重组腺病毒导入野生型p53基因抑制人头和颈部肿瘤细胞生长材料和方法细胞系和培养条件。人SCCHN细胞系Tu-138和Tu-177均由M.D.Anderson肿瘤中心的头颈外科部建立。Tu-138和Tu-177是分别由龈唇中度分化的鳞癌和咽部分化不良的鳞癌建立的。两细胞系通过初级外植块技术培育的，并在无胸腺裸鼠和SCID小鼠中是细胞角蛋白阳性和肿瘤原性的。这些细胞生长于添加有10％热失活胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中。
重组腺病毒制备和感染。重组p53腺病毒(Ad5CMV-p53)(Zhanget al.，1994)含有插入到经修饰的5型腺病毒(Ad5)之E1缺失区域中的巨细胞病毒(CMV)启动子、野生型p53cDNA，和小基因盒中的SV 40聚腺苷酸化信号。在293细胞中增殖病毒原种。感染后36-40小时收获细胞，离心，重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水中、裂解细胞，并经CsC1梯度纯化除去细胞碎片。透析浓缩的病毒，分成若干等份并于-80℃保存。感染如下进行将DMEM/F12培养基和2％FBS中的病毒加于细胞单层上，恒定搅拌下37℃培养细胞60分钟，然后加入完全培养基(DMEM/F12/10％FBS)并将细胞37℃保温预定长的时间。
Northern印迹分析。用酸-硫氰酸胍法(Chomozynski and Aacchi，1987)分离总RNA。对20μg总RNA进行Northern分析。在5×SSC/5×Denhardt′s溶液/0.5％SDS/变性鲑鱼精子DNA(20μg/ml)中以随机引物方法使膜与p53cDNA探针杂交。剥离膜并也用RNA上样对照的GAPDHcDNA探查。用密度仪(Molecular Dynamics Inc，Sunnyvale，CA)测定表达的p53的相对量。
Western印迹分析。感染后24小时在PIPA缓冲液(15mM NaCl、1.0％NP-40、0.5％DOC、0.1％SDS、50mM Tris，pH8.0)中超声处理细胞5秒钟，以制备总细胞溶胞产物。对样品中的50μg蛋白质进行10％SDS-PAGE并转移到Hybond-ECL膜(Amersham)上。用Blotto/Tween(5％无脂干奶粉、0.2％Tween 20，0.02％叠氮钠(在PBS中))封闭膜并用第一抗体即小鼠抗人p53单克隆抗体PAb1801和小鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体(Amersham)，以及第二抗体即辣过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行探测。按制造商提出的方法处理膜并显色。
免疫组织化学分析。用3.8％甲醛固定被感染的细胞单层并用甲醇中的3％H2O2处理5分钟。使用Vectastain Elite试剂盒(Vector，Burlingame，CA)进行免疫组化染色。所用的第一抗体是抗p53抗体PAb1801，第二抗体是抗生物素蛋白标记的抗小鼠IgG(Vector)。使用生物素化的辣根过氧化物酶ABC复合物试剂检测抗原-抗体复合物。各免疫染色实验中使用吸附前对照。然后使用Harris苏木精(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)对细胞进行复染。
细胞生长检测法。以2×104细胞/ml的密度将细胞一式三份铺敷在6孔板中。用野生型(Ad5CMV-p53)或复制缺陷性腺病毒(作为对照)感染细胞。每2天收获细胞，计数并用锥虫兰排除法确定存活率。
体内肿瘤生长抑制。在限定的无病原体环境中，检测Ad5CMV-p53对裸鼠体内已建立的皮下肿瘤结节的影响。实验是由动物保护和利用及重组DNA研究学会委员会审查并批准的。简单地说，在吸入乙酰丙嗪/氯胺酮麻醉后，提起各动物身上的三个分立的皮下瓣，并使用钝针头皮下注射悬浮在150ml完全培养基中的5×106个细胞；细胞保留在带水平褥式缝线的袋内。每个细胞系使用四只动物。4天后，再次麻醉动物并提起皮瓣，以送递100ml 1)在右前瓣注入的Ad5CMV-p53(50MOI)；2)在右后瓣中注入复制缺陷性病毒(50MOI)；以及3)在左后瓣中注入的单独的输入介质。在给药治疗前所有注射部位都发展了皮下可见的和可触到的结节。每天观察动物并在第20天处死。按计算横截直径之乘积的方根方法计算平均肿瘤直径，按球形估算出体内肿瘤体积。处死动物后，用千分尺测量切除之肿瘤的三维大小，以确定肿瘤体积。用非参数Friedman′s 2向ANOVA试验法检验样品之平均值间的差异显著性；使用SPSS/PC+软件包(SPSS Inc.，Chicago，I1)。
结果SCCHN细胞的腺病毒感染。用表达大肠杆菌β-gal基因的腺病毒感染T-138和Tu-177细胞，以确定这些细胞的最佳腺病毒转导的条件。X-gal染色后计算蓝色细胞的数目以估计转导效率。被感染细胞的数目和所用的腺病毒颗粒的数目之间似乎存在线性关系。接种单一剂量100MOIβ-gal腺病毒的细胞表现60％为兰色细胞(图1)，而经多次感染则这一比例改善为100％。该载体在SCCHN细胞中的转导效率与先前检查的其他细胞系有很大差异与30至50MOI β-gal腺病毒保温后，Hela、HepG2、LM2和人非小细胞肺癌细胞系显示有97％至100％的感染效率(Zhang et al.，1994)。
外源p53mRNA在腺病毒感染的SCCHN细胞中的表达。选择两个人SCCHN细胞系进行这项研究两细胞系Tu-138和Tu-177均具有突变的p53基因。使用最近创制的重组野生型p53腺病毒，即Ad5CMV-p53感染Tu-138和Tu-177细胞。感染后24小时，分离总RNA并进行Northern印迹分析。用被转化的初级人胚肾细胞系293作为阳性对照，因为其可高水平表达p53基因产物，而以具有纯合p53基因缺失的淋巴瘤细胞系K562作为阴性对照。所检测到的模拟感染之细胞和复制缺陷型腺病毒dl312感染之细胞样品中的2.8Kb内源性p53mRNA的水平相似。存在于Ad5CMV-p53之细胞内的内源性1.9Kb p53mRNA水平高达10倍，表明内源性p53cDNA被成功地转导到这些细胞中，并得到有效地转录。令人感兴趣的是，这些细胞中内源性p53mRNA的水平比实验对照中的水平高5倍。Northern印迹没有显示Ad5CMV-p53(DNA)污染RNA的证据。
p53蛋白质在腺病毒感染的SCCHN细胞中的表达。进行Western印迹分析以比较p53mRNA水平与所产生的p53蛋白质的量。在从除K562细胞外的所有样品中分离的细胞提取物中观察到由单特异性抗p53抗体pAb1801识别的p53带。细胞系293显示有高水平的p53蛋白质。从模拟感染的Tu-138和Tu-177细胞中分离的样品表现低水平的p53蛋白质。那些dl312腺病毒感染的细胞系中p53表达水平是相似的。在Ad5CMV-p53感染的细胞中测得的p53抗原的水平明显高于两细胞系中内源性突变蛋白质的水平。这一结果证明，由Ad5CMV-p53感染的细胞中产生的内源性p53mRNA被有效地转译成免疫反应性p53蛋白质。此外，对Ad5CMV-p53感染的细胞所作免疫组化分析提示了p53蛋白质的特征性核染色，而模拟感染的细胞则没有显示相似的染色，尽管这些细胞中也存在p53蛋白质。这种不能检测到蛋白质的原因，可能是由于检测方法的敏感性不足。
外源性p53对SCCHN细胞体外生长的影响。用对照病毒dl312感染的细胞生长速率与模拟感染之细胞的生长速率相似，而Ad5CMV-p53感染的Tu-138(图2A)和Tu-177(图2B)细胞的生长则受到显著抑制。感染后24小时，发生了明显的形态学改变，部分细胞群体围绕起来并且它们的外膜形成疱。这些改变是可预测的构成编程性细胞死亡的一系列组织学过程的一部分。对Tu-138的影响比Tu-177细胞更大。用复制缺陷型腺病毒dl312感染的细胞证明了没有细胞形态学异常的正常生长特征。生长试验在4次重复的实验中是可重现的。
体内肿瘤生长的抑制作用。各细胞系均用4只动物试验。Tu-177组中的一只动物在第二次瓣手术和送递治疗药物后死亡，估计是由于深度麻醉和继后笼内交配引起损伤所致。尸体剖检未发现转移或全身性影响的证据。在动物的后侧瓣上(即没有接受Ad5CMV-p53的部位)见有适当大的肿瘤。在接受了Ad5CMV-p53的动物的右前瓣中未见明显的肿瘤增大(p＜.04)。以前已在这些动物上确证Tu-177细胞生长速率较慢。早期杀死Tu-138组中的两只动物，这是因为它们表现出生长迅速和对照肿瘤部位的溃疡形成。在干预之前所有手术部位都出现了至少9mm3的损伤。表4中显示了尸检时所见的肿瘤体积。在Tu-177组中肿瘤体积没有明显的统计学差异，这可能反映样本大小有限。
表4Ad5CMV-p53对裸鼠a肿瘤生长的影响
a以5×106细胞/瓣皮下注射细胞。处理后第20天测肿瘤大小。括号中的数字代表被测的动物数。
bAd5CMV-p53缩写为p53；dl312为Ad5(dl312)的缩写。
实施例2用p53腺病毒体内分子治疗残留的显微头和颈鳞状细胞癌材料和方法细胞系和培养条件。所有确定的人SCCHN细胞系Tu-138、Tu-177、MDA 686-LN和MDA 886均在以前作过性质鉴定(Clayman etal.，1993；Sacks et al.，1988)。这些细胞生长在添加了10％热灭活胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM/F12)中。
重组腺病毒制备和感染；细胞生长检测；Western印迹分析。所有方法均已在实施例1中描述过。细胞生长试验都按三份重复样品进行。
用β-半乳糖苷酶腺病毒进行体内转异。对O.C.T.冷冻组织切片进行标本的X-gal染色，以确定转导效率。在冷PBS中洗8微米厚标本并于室温下在0.5％戊二醛中固定5分钟。然后用4℃PBS将玻片洗两次，并在X-gal溶液(1.3mM MgCl2、15mM NaCl、44mM Hepes缓冲液(pH7.4)、3mM高铁氰化钾、3mM亚铁氰化钾、2％X-gal(溶于DMF))中保温4小时。用苏木精和伊红复染。
免疫组织化学分析。将甲醛固定并石蜡包埋的体内动物实验组织切成4-5μm厚度，于60℃干燥，脱蜡并用蒸馏水水合。然后用溶于蒸馏水中的0.5％皂苷处理切片并用蒸馏水淋洗几次；用加在甲醇中的3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，然后再用蒸馏水淋洗几次。使用Sharp ModelR9M81微波炉(700瓦，2450MHz频率)将切片在蒸馏水中微波照射3分钟。冷却后，换几次蒸馏水洗切片并放在PBS中；使用如下所述的Hsa等人(1981)的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)方法进行免疫化学研究用正常马血清封闭切片并于4℃下加兔抗人p53多克隆抗体(克隆OM-1，180(Signet Laboratories，Denham，MA)保温过夜。然后用抗兔IgG Elite试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)施加生物素化的抗兔IgG和ABC复合物，各保温45分钟。使用溶于含0.01％过氧化氢之PBS(pH7.6)中的0.5％DAB显现免疫染色反应结果，用0.01％甲苯胺兰复染，脱水，清洗并固定在Permount中。为了确定免疫染色反应的特异性，使用如用于试验样品的同样方法，对鳞状细胞癌细胞系的组织培养物的已知阳性cytospin及阴性兔单克隆抗体对照进行免疫过氧化物酶染色。
体内肿瘤生长的抑制作用。该方法步骤同实施例1中所述。对所有手术切割部位进行病理学评估，并就全身性毒性进行尸检分析。
结果外源性p53对体外SCCHN细胞生长的影响。实施例1描述了具有内源性突变p53之SCCHN细胞系中Ad5CMV-p53对细胞生长的体外抑制作用。本实施例是确定是否具有内源性野生型p53的SCCHN细胞系也受到相似的影响。还研究了Ad5CMV-p53对非恶性生长的成纤维细胞的作用。
本研究选用4个人SCCHN细胞系Tu-138和Tu-177具有突变的p53基因，而MDA 686-LN和886两细胞系则是野生型p53基因纯合性的。使用衍生于正常成纤维细胞赘疣衍生的核型正常且非肿瘤原性的成纤维细胞系作为非恶性对照细胞系。对照病毒dl312感染的细胞具有与模拟感染的细胞相似的生长速率，而Ad5CMV-p53感染肿瘤细胞的生长则受到显著地抑制(图3A、3B、3C和3D)。感染后24至48小时，所有肿瘤细胞都出现明显可见的形态学改变，部分细胞群体环绕起来并且其外膜形成疱。这些构成可预见的编程性细胞死亡的一系列组织学过程的一部分。有内源性突变p53的细胞中比有野生型p53的细胞较早出现这种影响。复制缺陷性腺病毒dl312感染的细胞证明了没有形态学异常的正常生长特征。生长检测是可在四次重复实验中再现的。
外源性p53蛋白质在腺病毒感染的正常成纤维细胞中的表达及其对生长速率的影响。此外，还研究了Ad5CMV-p53对核型正常且为非肿瘤原性的成纤维细胞系的影响。在建立初级肿瘤细胞系期间分离这些细胞。感染后24小时，进行Western印迹分析以比较不同类型的被感染细胞所产生之蛋白质的水平。在从所有Ad5CMV-p53感染之样品中分离的细胞提取物中观察到由单特异性抗p53抗体PAb1801识别的p53带。如实施例1中已描述的，p53腺病毒感染的细胞系Tu-138在转导后显示出可产生高水平的p53蛋白质，并用作对照。模拟感染的和dl312感染的细胞中保持相似的p53表达水平。Ad5CMV-p53感染的成纤维细胞显示有比对照细胞更高水平的p53蛋白质。这一结果表明，正如由免疫反应性p53蛋白质的产生所证明的p53基因被有效地转译到Ad5CMV-p53感染的正常成纤维细胞中。免疫组织化学分析进一步证明Ad5CMV-p53感染之成纤维细胞的cytospin的蛋白质表达和转导效率。该成纤维细胞系表现有正常生长速率和形态学，而不依赖于外来干预(模拟、复制缺陷型病毒或Ad5CMV-p53)(图4)。这些实验重复进行两次并且也在他正常人成纤维细胞系中得到验证。
体内转导效率。为了检测体内基因转移的效率，于分子或对照干预后72小时切开皮下瓣部位。用腺病毒β-半乳糖苷酶标志载体进行剂量-效应实验，说明该模型中的剂量-效应转导效率。用Ad5CMV-p53感染后4天进行免疫组化分析以进一步证实之。两实验组均表现出以前已在体外实验中描述的(实施例1)体内剂量反应。在包括脑、肝、肺、心脏、腹腔内脏器官及皮肤在内的其他器官系统中，超过1010PFU的病毒剂量均没有影响p53的表达。这些实验举例说明了病毒滴度与转导效率之间的剂量-效应关系，以及被转导的基因在所需的外科模型领域内达到广泛暂时表达的可能性。
体内肿瘤生长的抑制作用。设计这些实验以确定是否体内Ad5CMV-p53介导的基因转移会影响植入到皮下瓣中之SCCHN的建立或生长。为此目的，造成一个显微残留病变模型。在该模型中，提起无胸腺雌性裸鼠身上的三个皮下瓣并吸移接种2.5×106个肿瘤细胞。不使肿瘤细胞形成结节(一般是在4天内出现)，而是在接种肿瘤细胞后48小时进行单剂量分子干预。以这种方式，虽然没产生肉眼可见的肿瘤，但在手术部位形成显微肿瘤细胞，供以模拟外科切除所有肉眼可见肿瘤后的临床难题。肿瘤的发育与肿瘤细胞的数目、指定的移植时间，以及Ad5CMV-p53的剂量直接相关。在接受显微移植的肿瘤细胞(2.5×106)并用108或更多噬斑形成单位(PFU)的Ad5CMV-p53处理的小鼠中，只有两只有肿瘤发育，两动物均植入了野生型p53细胞系(MDA 886-LN)。所有其他细胞系都未见肿瘤发育(表5)。这些实验清楚地证明，如果与Ad5CMV-p53接触，显微肿瘤细胞的生长可在体内受到有效地抑制。在第12周末时对外科部位进行大体和组织学分析以估测肿瘤形成(在过多肿瘤负重的情况下则较早处死动物)。表5中总结了肿瘤定居的数据。
表5Ad5CMV-p53对SCCHN的显微残留病变模型中肿瘤发生能力的影响
对实验动物的肿瘤切片进行免疫化学分析。该细胞系具有野生型内源性p53基因。用活的MDA 686-LN肿瘤没有没有明显的基础免疫染色(模拟感染)。107PFU Ad5CMV-p53表现有外周肿瘤坏死，同时在肿瘤的更中心部分出现免疫染色。108PFUAd5CMV-p53显示肿瘤的总体坏死，在具有包括基质和浅肌层在内的表达蛋白质的多层的整个外科袋中见有免疫染色。109PFUAd5CMV-p53显示出与108PFU Ad5CMV-p53相似的结果，但整个外科部位增加了外源性p53表达并且水肿显著。
使用作为其自身内部对照的动物，即使在接种后用Ad5CMV-p53处理外科手术部位，移植4.0×106个更多个细胞与移植2.5×106个肿瘤细胞相比明显地提高了皮下移植物的定居率(P＜0.01)。在Ad5CMV-p53干预之前使移植的细胞定居72或96小时，同样也增加肿瘤发生。剂量反应实验确定，108和109PFUAd5CMV-p53在抑制移植了98小时的2.5×106个细胞的肿瘤积存中是同样有效的(图6)。被移植的肿瘤细胞系的内源性p53状况(无论是突变的还是野生型的p53)对Ad5CMV-p53阻止肿瘤发育的效力影响很小。
实施例3在头和颈部鳞状细胞癌中转移野生型p53腺病毒基因介导的凋亡诱导作用材料和方法细胞系和培养条件；重组腺病毒制备和感染。按实施例1和2所述步骤完成所有方法并维持细胞系。
DNA片段化分析。以不同的时间间隔与野生型p53腺病毒及复制缺陷型腺病毒对照物保温后，收获细胞，重新悬浮于300μl PBS并加入3ml提取缓冲液(10mM Tris，pH8.0，0.1M EDTA、20μg/ml RNAse，0.5％SDS)，并于37℃保温1-2小时。保温结束时，加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，并将溶液在50℃水浴中放置至少3小时。用等体积0.5M Tris(pH8.0)饱和的苯酚提取DNA一次，然后用苯酚/氯仿重复提取。在1％琼脂糖凝胶中分析沉淀的DNA。
细胞固定。就TUNEL方法来说，在溶于PBS(pH7.4)中的1％甲醛中，于冰上将细胞固定30分钟。然后用3mlPBS洗细胞，并将悬浮于70％冰冷的乙醇中并于-20℃储存备用。为进行细胞周期分析，只在70％冰冷的乙醇中固定细胞。
末端脱氧核苷转移酶试验。按照Gorczyca等人的方法(Gorczyca et al.，1993)进行试验。简单地说，在经过固定和洗涤之后，将细胞重新悬浮于50μl含有0.2M卡可酸钠(pH7.0)、2.5mM Tris-HCl、2.5mM CoCl2(Sigma Chemical Company，st.Louis，MO)、0.1mM DTT(Sigma Chemical Company)、0.25mg/ml BSA(Sigma Chemical Company)、5单位末端转移酶(Boehringer Mannheim Biochemicals Indianapolis，IN)以及0.5mM生物素-16-dUTP及浓度各为20μM的dATP、dGTP和dCTP的TdT缓冲液中。将细胞在此溶液中37℃保温30分钟，用PBS淋洗，并重新悬浮于100μl FITC，即含有4×SSC、0.1％Triton X-100和2.5μg/ml荧光素化的抗生物素蛋白(VectorLabs.Inc.，Burlingame，CA)的染色溶液。在室温下暗处将试管保温30分钟。用含有0.1％Triton X-100的PBS淋洗细胞并重新悬浮于含有碘化丙锭(5μg/ml)和70μl(1mg/ml)RNAse的0.5mlPBS中。将试管于暗处在水上保温30分钟，然后进行流式细胞计数分析。
流式细胞计数分析。所有样品均使用带标准光学构型的EPICSProfile II流式细胞仪(Coulter Corp.，Mialeah，FL)进行分析。各份样品至少收集5,000计数。使用Elite工作站软件的immuno-4程序(Coulter Corp.，Hialeah，FL)从试验直方图中减去对照直方图以确定TdT末端标记阳性率。
细胞生长试验。在培养基平板上铺敷细胞并按实施例1中所述方法监测生长情况。
体内凋亡分析。实施例2中已描述了SCCHN的显微残留病变模型的基因治疗。
原位末端标记。按以前描述的方法进行(Wijsman et al.，1993)。简单地说，在二甲苯中将石蜡切片脱蜡3次(每次5分钟)，并将玻片浸入100％、90％、70％和30％乙醇溶液中各3分钟，以水合。将玻片在0.75％H2O2(V/V，在100％甲醇中)浸渍20分钟以失活内源性过氧化物酶。在PBS中洗玻片后，用加在0.1NHCl中的0.1％(W/V)胃蛋白酶(Fisher Scientific，Houston，TX)将切片37℃消化5分钟，并用PBS彻底清洗。然后在湿箱内将切片与包括下列成分的末端标记混合物37℃保温1小时0.5单位/μl末端脱氧核苷转移酶、0.06mM生物素化的dUTP、10μl 5Xtdt缓冲液，加双蒸水至50μl。将玻片浸入含有300mM NaCl和30mM柠檬酸钠(滴于双蒸水中)的缓冲液中终止反应。在PBS中洗玻片后，在湿箱中将切片与辣根过氧化物酶连接的抗生物素蛋白37℃保温1小时。使用3，3′-二氨基联苯胺染色并用甲基绿复染切片。
结果
p53腺病毒对SCCHN细胞系的生长抑制作用。上述实施例证明，重组腺病毒载体可将野生型p53基因有效地转导到SCCHN细胞系中。结果，受攻击的肿瘤细胞失去其体外和体内增殖的能力。这种抑制作用不依赖于细胞系的内源性p53状态。在一周期间进行上述生长速率分析。本实施例研究野生型p53对SCCHN细胞生长的早期作用(即较早的时间间隔，小时)。
本研究中使用两个有代表性的细胞系。细胞系Tu-138携带突变的p53基因，而细胞系MDA 686LN则具有野生型p53基因。用复制缺陷型病毒dl312感染的细胞具有与模拟感染的细胞相似的生长速率(图5A和5B)。另一方面，Ad5CMV-p53感染的Tu138(图5A)和MDA 686LN(图5B)细胞的生长受到显著抑制。与MDA 686LN相比，似乎外源性p53蛋白质对Tu138具有更早和更深远的生长抑制作用。观察到明显的形态学改变，部分细胞群体围绕起来并且其外膜形成水疱状，出现相似于细胞凋亡的与开始生长抑制同时发生的改变。复制缺陷型腺病毒dl312感染的细胞证明有正常生长特征，且没有组织形态学异常。重要的是，如上文实施例2中详细描述的，在p53腺病毒感染核型正常的成纤维细胞、以及人口腔角质细胞(无限增殖化的但非致瘤的)之后没有感察到这些作用。
DNA片段化分析。细胞凋亡区别于坏死的特征性标志之一是生物化学上可观察到的DNA片段梯的出现。为了进一步证实在p53腺病毒感染之后细胞经受了凋亡这一见解，进行了DNA片段化分析。对经过复制缺陷型或野生型p53腺病毒感染后从活细胞中提取的染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳。在两细胞系中出现相当于约200bp的DNA片段并注意到它们的整倍体。在Tu-138细胞系中于p53腺病毒感染后22小时出现片段化的DNA，而在MDA 686LN细胞系中，则在野生型p53感染后30小时，更明显的是在48小时可见到片段化的DNA。模拟感染的和dl312感染的细胞中没有见到可检测的断裂的DNA。
体外末端脱氧核苷转移酶试验。凋亡的另一个特征是形态学改变和导致染色质浓聚的核结构组织的破坏。已使用电子显微镜深入检查了这些超微细胞改变。然而，由于最近的鉴定凋亡细胞的流式细胞仪方法能够扫描和分析细胞群体，所以比电子显微镜受到了更多欢迎(Goorczyca et al.，1993)。本发明人利用于基于检测延伸的DNA断裂的TUNEL(末端脱氧核苷转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记)方法(Gorczyca et al.，1993)，以鉴定凋亡细胞。p53腺病毒感染后15小时，4.4％活的Tu-138细胞群体处于凋亡阶段，而相比之下MDA 686LN细胞则没有(图6A图6B)。p53腺病毒保温后，随着观察时间的延长凋亡细胞数目也成比例地增加。在22小时，近31％的Tu-138细胞已发生凋亡。虽然凋亡的初始诱发时间延迟，但在p53腺病毒感染后48小时约有60％的MDA 686LN细胞处于凋亡阶段。值得注意的是，用Tunel方法确定的凋亡细胞的比例可能被显著地低估了，因为这种方法只是分析存活的细胞。这些数据与生长速度及DNA片段化分析密切相关。在使用模拟感染及复制缺陷型病毒对照物(100M.O.I)进行的对照实验中，没有检测到经受凋亡的细胞群体。因此，凋亡并不是转导的腺病毒基因产物本身的功能。
体内凋亡分析。上述实施例表明p53腺病毒抑制体外肿瘤形成。设计本实施例是为了显示是否体内肿瘤生长抑制为凋亡的后果。进行原位末端标记分析以检测实施例2中得到的石蜡包埋的切片中的凋亡细胞。很清楚，从已接受PBS处理(作为对照)的带有MDA 686LN的动物体内分离的组织切片中没有观察到染色。另一方面，从用野生型p53腺病毒处理的带有MDA 686LN的小鼠体内分离的组织切片则显示出高度阳性染色，证明细胞凋亡确实参予了体内肿瘤生长的抑制过程。
在进一步的研究中，发明人力图确定是否生长抑制作用的部分原因是由于诱导的p21蛋白质造成细胞周期受阻或主要因凋亡所致。Western印迹分析显示，p21蛋白质在野生型p53腺病毒感染的SCCHN细胞中被诱导。然而，细胞周期分析显示，尽管p21蛋白质在p53腺病毒感染的细胞中增加了，但与S期相比，在G1期细胞中并没有该蛋白质的大量积聚。
实施例4p53-FLAG对头和颈部鳞状细胞的生长抑制作用基因治疗试验的有效标志材料和方法细胞系和培养条件。重组腺病毒制备和感染；Northern印迹分析；Western印迹分析；细胞生长试验；细胞层体外免疫组织化学染色。按实施例1中所述步骤完成所有这些方法并维持细胞系。
p53-FLAG腺病毒的产生。用BamHI消化以从pC53-SN中切下p53cDNA序列，并克隆到pGEM7Z的BamHI位点中。然后用Accl和Kpn 1消化有正确插入方向的重组质粒，以从p53cDNA的3′端除去22氨基酸编码序列。然后将含有FLAG肽(包括终止密子)之编码序列之Accl-Kpn 1相容性末端的接头连接到经过消化的质粒中以产生p53-FLAG融合基因。将所得p53-FLAG融合基因克隆到带有人CMV启动子和SV聚腺苷酸化信号的表达载体中。然后再将最后的构建体插入到穿梭载体pXCTL.1(Zhanget al.，1994)中，以得到重组p53-FLAG腺病毒。
体内显微残留病变实验。使用如实施例1中所述的无胸腺裸鼠模型系统、在限定的无病原体环境中进行研究。完成两组不同的重复实验。第一组是使用AdCMV-p53-FLAG病毒在三个瓣中以下降浓度(1010pfu、109pfu、108pfu)进行的剂量-反应实验。第4个瓣作为对照并随机分为PBS或复制缺陷型腺病毒(DL 312)对照。第二组研究是使用1010pfu的AdCMV-p53-FLAG、AdCMV-p53和复制缺陷型腺病毒在三个分立的瓣中进行的。第4个瓣接种同样体积(100μl)的无菌PBS。处理后48小时，杀死其中的两只动物并取组织瓣进行免疫组化分析。其余的动物则观察到第21天，然后处死。使用千分尺测量肿瘤大小以进行比较。
结果用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG病毒感染后mRNA的表达。检查Tu-138和MDA 686-LN的p53mRNA表达。腺病毒感染后分离总RNA。进行Northern印迹分析。测得AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的细胞间有相似水平的AdCMV-p53mRNA。用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染后，Tu-138和MDA 686-LN的p53mRNA表达水平差不多。探知强度的变异与负载剂量有关。突变的p53细胞系Tu-138中p53mRNA的内源性表达见于道2和3中。在p53基因为野生型的MDA 686-LN细胞系中没有显著的内源性p53mRNA表达。这些数据提示，AdCMV-p53-FLAG与AdCMV-p53病毒一样，也得到成功地转导和有效地表达。Northern分析没有发现AdCMV-p53DNA污染的证据。
外源性p53蛋白质在AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的SCCHN细胞系中的表达。进行Western印迹分析以比较由AdCMV-p53感染的和AdCMV-p53-FLAG感染细胞表达的蛋白质量。在两个同时进行电泳的凝胶上使用单特异性p53抗体(PAb180)和抗FLAG M2抗体(IB73025)鉴定蛋白质带。使用p53抗体(pAB 1801)检测，可见用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的两细胞系有同样高水平的p53蛋白质表达。另试验了用AdCMV-p53感染的Tu-138和MDA 686-LN细胞。在复制缺陷型腺病毒感染的细胞或模拟感染组中没有观察到p53蛋白质表达的改变。当用小鼠抗FLAG M2抗体探查相似地进行电泳的凝胶时，p53-FLAG蛋白质表达的水平似乎相似于p53抗体探查得到的表达水平，但在那些用AdCMV-p53病毒感染的细胞中则没见到可检测的带。在各细胞系中，模拟和DL312感染的细胞没有显现可检测水平的免疫反应性p53或FLAG蛋白质。
AdCMV-p53和ADCMV-p53-FLAG对SCCHN细胞体外生长的影响。上文已详细描述了在Tu-138和MDA686-LN细胞系中野生型p53治疗的细胞毒性作用。Tu-138细胞系具有内源突变的p53基因，MDA686-LN细胞系则具有野生型p53基因。本研究试图确定在通过插入FLAG序列重组AdCMV-p53病毒后是否可见到效率上的差异。
复制缺陷型腺病感染的细胞与模拟感染细胞具有相似的生长速率。用复制缺陷型腺病毒感染可见有弱细胞毒性作用(图7A)。相反，用AdCMV-p53或AdCMV-p53-FLAG感染的那些细胞到第3天时则肿瘤细胞基本上全部死亡。组织学检查显示浆膜的水疱形成，其为凋亡的特征性改变，并已鉴定为Ad CMV-p53感染的SCCHN细胞系中细胞死亡的机制(实施例1)。如上文提到的，该作用对于Tu-138细胞系(突变的p53)比MDA 686-LN细胞系(野生型p53)更为突出。生长曲线分析在三次重复研究中是可以再现的，在AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG病毒之间没有观察到明显的差异，这提示加入FLAG肽并不影响p53的抑制细胞生长的能力。
腺病毒感染的SCCHN细胞系的免疫组织化学染色。使用标准免疫组织化学技术比较被感染细胞单层的p53和p53-FLAG蛋白质的表达。在MDA 686-LN细胞系中，DL312感染细胞的模拟感染中未能明确鉴定出p53和FLAG蛋白质。然而，在具有突变的p53基因的Tu-138中，内源染色则为p53阳性。当AdCMV-p53病毒感染细胞时，两细胞系中均呈现强染色。肉眼观察AdCMV-p53-FLAG病毒感染的细胞，可见染色强度和与抗体PAb1801呈阳性反应的细胞细胞数目与AdCMV-p53病毒感染的细胞相同。用AdCMV-p53-FLAG病毒感染的细胞也显示与M2FLAG抗体呈强的免疫组化阳性。虽然染色质量不同，但两者都是在核内，并且胞浆中染色程度较小。
体内生长抑制作用。使用108、109和1010噬斑形成单位(pfu)的AdCMV-p53-FLAG病毒，按实施例1中所述的显微模型方法对Tu-138细胞系进行剂量研究，并与PBS或DL312处理的对照瓣进行比较。模拟感染的平均肿瘤大小为1205±205mm3。随着分子干预中所用病毒浓度的增加，肿瘤大小以线性方式减小。那些用108、109和1010pfu AdCMV-p53-FLAG处理的瓣的平均肿瘤大小分别为637±113mm3、392±109mm3、193±74mm3。使用成对t检验将每只动物对自身进行比较，并在除用109和1010pfu处理瓣之间外，所有比较中都有显著性剂量反应效果(p＜0.05)。很清楚，病毒的量越大，见到的肿瘤生长抑制作用越大。在进一步的研究中，将AdCMV-p53的效果与AdCMV-p53-FLAG的效果进行了比较。两者活性上没有明显差异。
免疫组织化学证明显微残留病变动物模型中的外源肿瘤抑制作用。在证明AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG的差不多的体外和体内活性后，发明人应用了免疫化学技术证明体内p53-FLAG融合蛋白质产物。使用Tu-138和MDA 686-LN细胞系，于处理后48小时收获显微残留病变瓣，在甲醛中固定并用石蜡包埋。用AdCMV-p53-FLAG病毒处理肿瘤细胞的相邻切片，对p53和FLAG施加染色。染色强度和阳性染色的细胞数目与感染中所用病毒的量直接成正比。MDA 686LN细胞中对照组为p53和FLAG抗体染色阴性。在Tu-138肿瘤细胞中记录到p53的内源性染色。组织学标本分别用苏木精和伊红、p53抗体和FLAG抗体染色。FLAG M2抗体显示特征性胞浆染色，相反p53抗体则显示核内核色。此实验第一次证明FLAG M2抗体对石蜡包埋的固定组织是有效的。染色证明外源性治疗定向于肿瘤抑制作用，并且在体内模型中可使用FLAG系统鉴定外源性治疗效果。
总之，可以看出共送递FLAG蛋白质连同所需的基因治疗提供了作为基因治疗标志物的潜在实用性。本发明清楚地显示其为与p53基因一起同时被启动的，并且信息RNA和蛋白质的表达没有降低。更重要的是，所送递的肿瘤抑制基因的生物学活性没有改变。当对甲醛固定石蜡包埋的组织进行免疫组化分析时，第一次证明FLAG抗体是有效的。这些因数提示，这种新的蛋白质在未来基因治疗研究中作为示踪剂的实用性。
实施例5使用p53腺病毒治疗头和颈部鳞状细胞癌病人A患有不能手术的头部SCCHN肿瘤的53岁男性病人。肿瘤块直径为6.5cm。检查骨髓功能、血小板计数和肾功能后，病人通过8个不同的肿瘤内注射部位接受第一次在无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释的108个腺病毒-p53表达构建体的感染性颗粒来治疗(总体积10ml)。每隔3天接受一次同样的治疗，总共给予6次治疗。
第6次治疗后3天，检查肿瘤并发现其直径大于4.0cm。组织学检查显示在肿瘤边缘处有相当多的细胞断片。进行第二疗程的6个治疗，其后发现肿瘤直径大于2.0cm并有坏死。病人继续接受每周一次的3个月治疗，这时肿瘤已不明显。
病人B患有可手术的颈部SCCHN肿瘤的44岁女性病人。肿瘤块直径为2.5cm。检查骨髓功能、血小板计数的肾功能后，病人通过3个不同的肿瘤内注射部位第一次接受在无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释的5×107腺病毒-p53表达构建体的感染性颗粒来治疗(总体积3ml)。每三天接受同样治疗，共给予6次治疗。
第6次治疗后3天切除肿瘤。将肿瘤床在6ml无菌磷酸盐缓冲盐水中浸浴60分钟。去除接种物，关闭伤口并在瘤床内留一引流。在外科切除后4、7、10和14天，通过引流灌注在无菌磷酸盐缓冲盐水(总体积3ml)中稀释的5×107腺病毒-p53表达构建体的感染颗粒。接触肿瘤床两小时后，抽吸除去接种物。治疗终止后6个月观察不到原发的、局部的或区域性的肿瘤。
实施例6在患有晚期再发性头和颈鳞状细胞癌病人的I期试验中通过腺病毒载体转移野生型p53基因在有活检证实的再发性头和颈部鳞状细胞癌的病人中以对数增加剂量送递含有正常“野生型”p53基因的腺病毒载体。在连续两周内每周三次进行直接肿瘤注射。将病人分为两类1)可切除的复发疾病，2)不可切除的复发疾病。
对那些归为可切除疾病组的病人，在2周期间里的第6次基因转移后72小时总地大体切除其再发肿瘤。手术期内及手术后72小时通过逆行导管灌送递腺病毒载体。对不能切除的病人则在两周周期内通过每月直接肿瘤注射反复进行基因转移尝试，直至观察到病情进展或病人行为状态恶化。对病人进行封闭式住院观察以监视该治疗方法的安全性，进行活组织检查以估计基因转移效率，对流出的载体进行体液分析，并进行尸检分析。
方法研究对象。21名患有晚期复发性上通气消化道鳞状细胞癌的病人，符合东方合作肿瘤学研究组行为状态2，将病人分入由患可切除(1组)或不可切除(2组)复发肿瘤病人组成的两组研究对象中，表6和7中分别显示了研究对象的特征和腺病毒载体的剂量。所有妇女都是妊娠试验阴性并且所有病人都使用避孕方法。在加入研究之前得到了所有病人的书面同意。
基因转移载体。本研究利用定名为Ad5CMVp53的带有增强子(巨细胞病毒)-启动子的复制缺陷型腺病毒血清型5载体。按Magenta，Inc.和Introgen Therapeutics，Inc.的良好制造规程生产噬斑形成单位范围为109至1011的三批腺病毒载体，并冷冻(-70℃)运输到University of Texas，M.D.Anderson Cancer Center。每一批对于利用Western印迹分析转导及体外肿瘤细胞抑制生长试验都是有效的。临基因转移前融解载体并在磷酸盐缓冲盐水(载体)中稀释，并在4℃下送到病人房间内。
表6病人特征
表6(续)
表7治疗期间载体剂量及血清或尿中存在或没有腺病毒载体核苷酸
剂量。以对数增加的剂量将腺病毒载体投用于每组5个病人。在观察以前述剂量治疗的最后一个病人两周后确定剂量增加。在前6个病人进入研究后，3个病人在独立于可切除或不可切除组的各剂量水平上进入。所述的生物学载体的剂量是就总剂量而言的(噬斑形成单位)。每个恶性上皮细胞投用的估计的载体数目是不接近的。表7中显示了给药的总体积。注射到实体肿瘤中的腺病毒载体的体积是由临床和放射显影估计的肿瘤体积决定的。在直接观察下并借助手工触诊将载体直接注射到复发的鳞状细胞癌中。以肿块上的1厘米增量间隔注射。基因转移后，密切观察治疗对象至少1-1/2小时。在最后一次载体的基因转移后保持72小时呼吸和体分泌分离。
载体的检查。利用293细胞的病毒培养物以及聚合酶链反应(PCR)监测尿和血清样品中播散的腺病毒载体。PCR中使用的引物是扩增对载体特异的腺病毒E1b区域和野生型p53基因5′末端的引物。然后Southern转移PCR产物，以改善病毒检测达到1-5个病毒颗粒，以及验证PCR产物特异性。每反应中均检测阳性和阴性对照物。
安全性。监测症状、生命信号及血细胞计数，并且每天对病人进行生理学检查和记录照象资料。在各个治疗周期开始时进行胸部放射线照相、血液化学试验及行为状态分析。在每个基因转移周期之前和之后检测腺病毒抗体的血清滴度。在第一周期的第6次基因转移后3天，得到肿瘤活检组织(或外科切除)。每种情况下的标本均作为速冻的、病理学包埋的标本、以及甲醛固定的标本储存之。
从血清或尿中提取核酸。用Cunningham等人(1995)改良的方法从0.5ml等份的血清或尿中提取Ad5CMV-p53腺病毒DNA。简单地说，加入蒸馏水至1ml并用30％聚乙二醇(PEG)沉淀之。因为单用SDS不足以从其颗粒中释出病毒DNA，所以在用PEG沉淀后向SDS溶液中加入蛋白酶K于50℃处理2-16小时(Norder et al.，1990)。用苯酚提取样品，并于糖元存在下用乙醇沉淀之(Cunningham et al.，1995)。以14000g离心10分钟(4℃)回收DNA，重新悬浮于0.3ml蒸馏水中，并再次用乙醇沉淀。用70％乙醇淋洗DNA沉淀物，真空干燥并溶解于10μl蒸馏水中。直接分析样品或于-20℃储存备用。在生物学安全性小室罩下进行核酸提取以防止标本的可能的交叉污染。
对从血清样品中分离的DNA进行PCR反应。设计用于特异性地从腺病毒载体扩增p53基因的引物。上游引物(5′-CACTGCCCAACAACACCA-3′，SEQ ID No5)相当于p53基因的3′末端，下游引物(5′-GC CACGCCCACACATTT-3′，SEQ ID No6)相当于腺病毒5型的E 1B区域(野生型序列的核苷酸3517至3533)。各PCR反应试管均含有0.2mM各寡核苷酸，0.4mM dNTP、1XTaqPlus Long低盐缓冲液(购自Stratagene)，0.6μl TagPlus Long(5U/ml)(购自Stratagene)和5μl试验DNA。将样品放在93℃3分钟编程的、并有下列三步骤分布型的MJ Research Peltier热循环仪(PTC-200)中93℃，30秒；65℃，45秒和72℃，45秒，共进行30或35次循环。在PCR循环结束时向各试管内加入5μl 6X加样缓冲液(0.25％溴酚兰，0.25％二甲苯青FF和15％Ficoll(400型；Pharmacia)，溶于水中)，并在1％琼脂糖、含有溴乙锭(6μg/ml)的1XTBE凝胶上加样。样品以100V电泳1-1.5小时，然后在紫外光下照相。
聚合酶链反应(PCR)。在单一聚合酶链反应中只可使用5μl已制备好的DNA。对血清来说，PCR在含有2mM MgCl2、50mMKCl、0.1％Tritox X-100，200μM各种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、5μM各种引物和1.7单位TagDNA聚合酶(Promega)的20μl体积进行PCR。反应在94℃进行30秒，58℃30秒，和72℃60秒，共35次循环，然后于72℃延伸10分钟。从Ad5CMV-p53的序列中选择PCR引物，其中有义引物位于p53cDNA的3′末端(5′-GCCTGTCCTGGGAGAGACCG-3′，SEQ ID No7)，反义引物则选自腺病毒5型的E1B区域(5′-CCCTT AAGCCACGCCCACAC-3′，SEQ ID No8)。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物(838bp片段)。将同样的PCR产物亚克隆到pCR-Script载体(Stratagene)中，测序，并用凝胶纯化的插入段作为探针以检测PCR产物。对于尿液，则在含有2mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、0.1％Triton X-100、20mMTris-HCl(pH8.8)、0.1％mg/ml牛血清白蛋白、200μM各种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、5μM各种引物及2.5单位Tag Plus LongDNA聚合酶(Stratagene)的20μl体积中进行PCR。反应于93℃进行60秒，然后是93℃30秒，65℃45秒，和72℃45秒，共进行35次循环，然后于72℃延伸10分钟。从Ad5CMV-p53的序列中选择PCR引物，其中有义引物定位于p53cDNA的3′末端(5′-CACTGCCCAACAACACCA-3′，SEQ ID NO9)，反义引物则选自腺病毒5型的E1B区域(5′-GCCACGCCCACACATTT-3′SEQ ID No10)。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物(724bp片段)。
Southern印迹分析。在用于证实PCR产物之特异性的Southern印迹分析中，将凝胶中的DNA变性并中和，然后以毛细吸收法转印到尼龙膜(Hybond-H+，Amersham)上。在Rapid-hyb缓冲液(Amersham)中将膜于65℃预杂交15分钟，并在含有32P标记的探针的同样缓冲液中杂交1-2小时。于室温下在0.1×SCC和0.1％SDS中将膜洗两次，再于65℃下洗两次(每次15分钟)。于-70℃下将洗过的膜用增感屏对X光胶片曝光1-16小时。
对照组和试验样品的评价。伴随每批样品都包括下列对照组。在DNA分离步骤中，利用两种“阴性”血清对照(合并的并等分的Introgen雇员的血清)和由10pfu或100pfu AdCMV-p53病毒强化的阴性血清组成的两份阳性对照物。据此得到一个敏感性窗口，其中10(和100)pfu对照物为阳性，但阴性对照物为阴性。如果阴性对照物为阳性，则PCR只重复30次循环。如果10pfu对照为阴性，则再次用乙醇沉淀以进一步纯化DNA，并重复进行PCR。上述两个步骤总是将实验参数放入适当的敏感性窗中。
在PCR阶段，利用1ng AdCMV-p53DNA为阳性对照物(分离自临床批量材料)，及水为阴性对照物。如果任何一对照物是不可靠的，则重复该批的PCR。实验中没有错误的阴性PCR对照物。
为了证实假定的阳性，重新从血清(连同几种暂时相邻的样品)中分离DNA，并重复进行该DNA的PCR。只有当结果能够再现时才将样品评定为阳性。报告时，将两次样品分析中有一次为阳性的样品看作是阴性。从数据中删掉不能重复再现的(由于缺乏另外的未加工的样品)假定阳性。
基因转移的检测效率。将外科切除的组织标本放在冷冻瓶内，立即快速冷冻，然后在液氮中保存备有。将冷冻样品倒入已在液氮中预冷却的不锈钢Bessman组织粉碎器(Spectrum，Houston，TX)的室口内。用带有钢锤的Bessman杵锤击5至10次，将组织粉粹成细粉末。将粉碎的组织移入每50mg组织含1ml TR1试剂(Molecular Research，Cincinnati，OH)的玻璃组织匀浆器中，并用Teflon杵上下击打5-10次以匀浆化。
匀浆后，按TR1试剂生产商提供的说明书分离RNA。简单地说，将匀浆移入聚丙烯离心管(Molecular Research)中并于室温下储存5分钟，然后加入氯仿(每1ml TR1试剂加0.2ml)。强列混合样品，室温下继续保温15分钟，并以12,000g 4℃离心15分钟以从苯酚-氯仿相中分离出含RNA的水层。向水层中加入异丙醇并在室温下保温15分钟以沉淀RNA。4℃下以12,000g离心15分钟以回收RNA沉淀物，用75％乙醇洗一次，干燥，溶解于聚碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中并检测260mm吸光率以进行定量。将50μg RNA与60单位DNA酶I(Pharmacia，Piscataway，NJ)以260μl的总反应体积37℃保温25分钟，以除去污染的DNA。然后用苯酚-氯仿提取RNA，乙醇沉淀，用75％乙醇洗1次，在离心管中以最大速度4℃离心15分钟以沉淀之，风干，重新悬浮于DEPC-水中并于-80℃储存。在常规非变性0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离样品以估测RNA质量，并经溴乙锭染色观察28S和18S核糖体带。为了排除样品间的交叉污染并减少RNA酶活性，所有可再使用的RNA分离器具均在2％Liqui-Nox(FisherScientific)去污剂溶液中至少浸泡5分钟，擦洗，移至10％漂白溶液中处理3分钟，用去离子水彻底淋洗，用100％乙醇喷雾，干燥，浸入氯仿中，并在使用前再次干燥之。
在含有111ng随机六聚体(Gibco BRL，Grand Island，NY)、40单位RNA酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、0.4mM各d NTP(Perkin Elmer，Foster City，CA)和在1×RT缓冲液(50mM Tris pH8.3，75mM氯化钾、3mM氯化镁、和20mM二硫苏糖醇)中的30单位Superscript IIRNA酶H-逆转录酶(Gibco BRL)的23.5μl反应混合物中，使用1.5μg总细胞RNA进行逆转录。将RNA和随机六聚体于70℃加热10分钟并在冰上冷却，然后加入其余的反应混合物。将反应混合物与200单位逆转录酶于25℃保温5分钟，在加入另外100单位逆转录酶后于25℃继续保温10分钟，以有利于引物退火，然后于42℃保温50分钟。于70℃加热15分钟失活逆转录酶以终止逆转录反应。于37℃用1单位RNA酶H(BoehringerMannheim)消化20分钟以去除与cDNA互补的RNA。使用从感染了重阻腺病毒Ad5CMV-p53(100∶1感染复数)的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系Tu 167中提取的RNA作为阳性对照，以检测病毒转录的p53，并用不含p53转录单位的变异腺病毒载体dl312(1)感染的Tu 167细胞作为阴性对照。
为了检测Ad5CMV-p53转录物，在含有溶于1×PCR缓冲液(50mM氯化钾、10mM Tris pH9.0，0.1％Triton X-100)中的0.2mM各dNTP、15mM氯化镁、1单位Tag聚合酶(Promega，Madison，WI)和各0.5mM各引物CMV2(5′GGTGCATTGGAACGCGGATT，SEQ ID No11)与P53EX3(5′GGGGACAGAACGTTGTTTTC，SEQ ID No12)的30μl反应体积中进行PCR。引物CMV2和P53EX3扩增与腺病毒衍生的p53转录物特异的295碱基片段。检测Ad5CMV-p53转录物的PCR条件如下
94℃1分钟，然后94℃，30秒，58℃40秒，70℃1分钟，重复35次循环，以及70℃延伸10分钟。
为确保PCR期间扩增的产物是要检测的mRNA而不是RNA制剂中污染的DNA，还使用从其中未加逆转录酶的平行反应中得到的逆转录产物进行PCR。
为了检查逆转录反应的完全性，进行对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)特异的RT-PCR。在溶于1×PCR缓冲液中含有0.2mM各种dNTP、2mM氯化镁、1单位taq聚合酶及0.5mM各种引物GATDH1(5′ACGGATTTGGTCGTATTGGG，SEQ IDNo13)和GAPDH2(5′TGATTTTGGAGGGATCTCGC，SEQ IDNO14)的30μl PCR混合物中稀释3μl体积的逆转录反应物。GAPDH引物跨越人GAPDH基因中的3个外显子并扩增对mRNA特异的231碱基产物。检测GAPDH的PCR条件是94℃1分钟，然后94℃30秒，60℃12秒，72℃1分钟，进行35次循环，并于72℃延伸7分钟。
使用Perkin Elmer Gene Amp 9600热循环仪进行PCR，并且所有引物均为商业化合成的(Genosys，Woodlands，TX)。
免疫组织化学检测肿瘤内基因。使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)方法(1)对甲醛固定的石蜡包埋的组织切片进行免疫过氧化物酶研究。将标本切成3-4μm厚，在二甲苯中脱石蜡，并在递降浓度(100-70％)的乙醇中再水合。用溶于甲醇中的3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。在蒸馏水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗几次后，将切片与1∶10稀释的正常马血清保温以尽可能地减少本底染色。然后于4℃下与抗p53单克隆抗体(DO-1，Oncogene Science，Inc.，Uniondale，NY；1∶80稀释)和抗p21单克隆抗体(Oncogene Science，Inc.，1∶100)过夜保温。使用ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories，Brulingane，CA)完成过氧化物酶染色。使用含0.01％过氧化氢pH7.6的Tris-HCl缓冲液中的0.05％3，3′-二氨基联苯胺显现免疫染色反应结果。经两次独立的感察对200个细胞在10个连续高电场中的阳性核染色计数，进行结果评估。
DNA片段化的TUNEL检测法。按照制造商提供的说明书，使用ApoptagTMPlus试剂盒(Oncor，Gaithersburg，M.D.)进行TUNEL检测。用0.4％亚甲基绿复染玻片。估测相应苏木精和伊红染色的玻片中炎性细胞浸润液的存在，并分为1-4级。
细胞病变效应检测法。使用其中样品内的任何病毒都可感染接受体细胞单层的检测法监测病人尿样品中Ad5p53的存在。监测那些出现细胞病变效应(CPE)的细胞它们围绕起来并从表面脱离。用于CPE分析的病人尿样品得自在第一疗程的第二周期间，及在第0和第1天(预治疗)收集的早晨第一次尿。将各约15ml样品于-80℃下保存在15ml无菌锥形管中备用。在该检测中形成接受体细胞单层的IT293细胞维持在37℃湿的10％CO2保温箱中的加有10％FBS的DMEM中。对病人样品试验前2天，将细胞以2×105/孔的浓度放在12孔平板中。
检测时，在冰浴中融化尿样品，按1∶1比例将等分的样品与DMEM混合，并使用0.22μm针筒式滤器无菌过滤。去除生长培养基后向各孔内缓慢加入350μl等分的1∶1混合物。然后将平板轻轻摇动15分钟。30分钟后，向各孔内加入2.0mis DMEM+10％FBS，以稀释样品。于检测的第3天(72小时后)和第6天，向各孔内加入0.5ml等分的新鲜培养基，以尽可能地将细胞单层维持最多6-7天。
按一式三份检测病人样品。检测稀释的治疗前样品，并且每孔也用105pfu Ad5p53强化之，以检测可能干扰用该方法进行检测的任何尿液成分。对照孔接种分别用105、104、103、102或101pfu强化的单独DMEM，不同的对照样品各为一式两份。在这些条件下105pfu强化于检测的第2天引起CPE；每个后继的天数里，下一个强化的对照也将显示CPE。因此，检测每份病人样品中的CPE的时间就表明该样品中Ad5p53的水平。
重组活性腺病毒。使用Biotechnology Services Division ofMicrobiological Associates，Inc.，(Rockville，Maryland)提供的A549细胞检验用于临床试验的腺病毒p53的RCA的存在。
统计学分析。使用单侧研究设计。为了防止在过度毒性的试验中涉及尽可能少的病人，补充一个Bayesian早期终止规则。使用WILCOXON信号等级检验和指配检验分别对治疗前后显示TUNEL和免疫组化染色之细胞的百分比进行比较。使用SurvpacSPSS统计学软件包进行统计学分析。
反应和毒性。在该暂时分析中估测存活率和反应，但这些不视为分析的目的。该暂时分析的目的是确定该基因转移策略的转导潜力。可以在一周期基因治疗后经过30天观察来估计病人的反应和毒性。按照国家肿瘤研究所(National Cancer Institute)的通用毒性标准(Xref.)来估计治疗的毒性作用。每个疗程之前经CT扫描或颈部超声检查来估计对治疗的反应。如果病人至少接受了一个疗程的治疗，后又作了适当的反应记录，即可以估计病人的反应。那些外科切除其再发肿肿瘤的病人不可能作出反应估计，因为外科手术是在30天观察其之前完成的。所有的CT扫描是由一位放射科专家评价的，而超声图由另一专家评估。部分反应限定为可检测肿瘤之直径乘积总和减小50％或更多；小反应限定为可检测损伤的直径乘积总和减小25％至＜50％。病情进展限定为直径乘积之总和增大25％或更大。
检测从治疗开始到终止的存活时间。每个病人的反应均由包括头和颈部外科肿瘤学家、放射医学家和医学肿瘤学家的数据管理委员会审查。
结果载体的检查。基因转移后达48小时，以PCR方法检查病人血清和尿样品中的腺病毒-载体DNA。载体的检测限是1-5个病毒颗粒。从经受每种病毒剂量的基因转移的病人中分离病毒DNA，但基因转移48小时后则不作检查。病毒剂量在107pfu以上时，病毒DNA的血清检查随病毒剂量增加而增加，但在基因转移后48小时也检测不到。
在PCR核苷酸分析之前，通过检测细胞单层的CPE，首先分析尿样品的感染性病毒。按上述方法将存在于尿中的病毒加于293细胞上，以监测CPE(CPE是作为细胞围绕起来并离开平皿壁这一现象而观察到的)。很少在标本中鉴定出CPE。其后在敷层培养物中(大于6天)见到CPE，并且这些结果被认为是模糊不清的。在任何情况下CPE都不是通过PCR和Southern印迹转移同一尿样品中的被检测的腺病毒核苷酸证实的。
其他器官系统的病毒DNA分析。PCR分析证明，在109Ad5CMVp53基因转移后2个月以上，在小心取样以防止组织间交叉污染的快速冷冻尸体解剖标本中，发现皮肤、心肌、肝和睾丸组织有病毒DNA。肾实质、肾上腺和胰腺组织则未显示有对该载体特异的病毒DNA序列。对这些尸体解剖标本进行免疫组化分析(没有提示野生型p53蛋白质产物过表达的证据)。
对基因转移的估计。在组织与载体接触后至少1小时进行所有的分析。于4小时和48小时通过RT-PCR检测到mRNA产物。相反，暴露于载体后1小时或更短时间冷冻的活检标本中则没显示有p53mRNA。另外，从未经受基因转移的手术部位得到的阴性对照样品对PCR产物也是阴性的。以RT-PCR技术分析从四个病人得到的未转导或转导的活检标本，以检查Ad5CMVp53转录的mRNA的存在。得自两个病人的被转导的标本在EtBr染色的凝胶上为阳性，而在所有未被转导的标本中则没有检测到Ad5CMVp53产物-尽管事实上可从所有标本中扩增出GAPDH。用Southern印迹法证实得自两个阳性病人的295bp PCR产物的特异性。因为当从RT反应中除掉逆转录酶时没有观察到PCR产物，所以此处检测到的259bp产物一定是从mRNA而不是污染DNA产生的。
免疫组化分析。在每个实验中，所有病人的基因转移前和转移后标本与阳性和阴性对照同时分析。每个标本分析多个切片并与苏木精和伊红染色的以及TDT末端标记的标本相比较。在三个病人的注射载体后的活检标本中证实了基因转移，这些病人的转移前活检标本则没有显示内源性过表达的p53产物。在21个病人中的5人中(27％)，没有显著地内源性表达的p21(C1P/WAF1)；这一点证明了在病人基因转移后的活检标本中的基因转移信息。在肿瘤相关的淋巴细胞及基质肿瘤细胞中也见到p53核蛋白的过表达，从而表明非肿瘤细胞也发生了转导。
血清抗体反应。在反复注射载体后，所有病人中都诱导产生了腺病毒血清型5抗体。但初次基因转移周期和继后基因转移疗程相比，没有发现转导效率的明显改变。以3×109pfu注射开始时可见有中度注射部位红斑，但这些局部反应并不限制载体耐受性。在109pfu治疗的病人中，尽管给予长达连续6个月的反复病毒注射，但任何病人中部没有找到全身性过敏反应的证据。
病理学观察。大部分活检标本中都可辨识出针迹，并且在注射部位后的深部组织中证明有基因产物表达。同样，在转导区域中发现有末端标记细胞，提示在肿瘤细胞中诱导了凋亡，而基质或炎性细胞中则没有凋亡。在病人中观察到了炎性细胞，并且在接受109pfu或更多病毒剂量的病人中成为主要组织发现。令人感兴趣的是，取样的7号病人表达了内源野生型p53，证明一个疗程基因转移后，在其复发性2cm颈部肿块的一系列切片的外科标本中有出血性坏死，而没有存活肿瘤的证据。在标本中常常观察到坏死及凋亡诱导作用的病理学现象。
临床观察。病人耐受了载体的直接肿瘤注射，其中最常见的不良反应是注射部位不适感。109pfu及更高滴度的载体注射证明有局部注射部位红斑，尽管有全身性抗体滴度升高的证据，但未见有全身性超敏反应。5、10和16号病人在七个月的半随访期内没有疾病证据。7和13号病人分别在其标示损伤区域表现有3和5个月的病情稳定。经CAT扫描和超声波证实，20号病人表现有部分反应，但由于病情进展即脊髓和胸腔转移而需从研究中去掉。
总之，对于患有头和颈部复发性鳞状细胞癌的病人，腺病毒介导的野生型p53基因转移是安全的，并可通过直接肿瘤内注射或手术期内输注载体来有效地转导肿瘤和正常细胞。所有病人都未表现出可能限制载体投用或剂量升高的毒性。尽管出现全身性抗体反应，但没有改变转基因产物的表达。事实上，在切除的肿瘤标本内病理学所见的局部炎性反应可能是有益的。
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序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OFTEXAX SYSTEM(B)街道201 WEST 7TH STREET(C)城市AUSTIN(D)州TEXAS(E)国家USA(F)邮政编码(ZIP)78701(ii)发明名称肿瘤诊断的方法和组合物(iii)序列数目14(iv)计算机可读形式(A)介体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前申请数据(A)申请号未知(B)申请日本文并附(C)分类未知(vi)在先申请数据(A)申请号US 60/007,810(B)申请日30-NOV-1995(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)长度2066碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1CAAAACCTAC CAGGGCAGCT ACGGTTTCCG TCTGGGCTTC TTGCATTCTG GGACAGCCAA 60GTCTGTGACT TGCACGTACT CCCCTGCCCT CAACAAGATG TTTTGCCAAC TGGCCAAGAC 120CTGCCCTGTG CAGCTGTGGG TTGATTCCAC ACCCCCGCCC GGCACCCGCG TCCGCGCCAT 180GGCCATCTAC AAGCAGTCAC AGCACATGAC GGAGGTTGTG AGGCGCTGCC CCCACCATGA 240GCGCTGCTCA GATAGCGATG GTCTGGCCCC TCCTCAGCAT CTTATCCGAG TGGAAGGAAA 300TTTGCGTGTG GAGTATTTGG ATGACAGAAA CACTTTTCGA CATAGTGTGG TGGTGCCCTA 360TGAGCCGCCT GAGGTTGGCT CTGACTGTAC CACCATCCAC TACAACTACA TGTGTAACAG 420TTCCTGCATG GGCGGCATGA ACCGGAGGCC CATCCTCACC ATCATCACAC TGGAAGACTC 480CAGTGGTAAT CTACTGGGAC GGAACAGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAG 540AGACCGGCGC ACAGAGGAAG AGAATCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACGAGCTGCC 600CCCAGGGAGC ACTAAGCGAG CACTGCCCAA CAACACCAGC TCCTCTCCCC AGCCAAAGAA 660GAAACCACTG GATGGAGAAT ATTTCACCCT TCAGATCCGT GGGCGTGAGC GCTTCGAGAT 720GTTCCGAGAG CTGAATGAGG CCTTGGAACT CAAGGATGCC CAGGCTGGGA AGGAGCCAGG 780
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(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度293氨酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys20 25 30Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp35 40 45Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys50 55 60Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu65 70 75 80Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg85 90 95Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe100 105 110Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp115 120 125Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly130 135 140
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(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度2066碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3CAAAACTTAC CAGGGCAACT ATGGCTTCCA CCTGGGCTTC CTGCAGTCTG GGACAGCCAA 60GTCTGTTATG TGCACGTACT CTCCTCCCCT CAATAAGCTA TTCTGCCAGC TGGCGAAGAC 120GTGCCCTGTG CAGTTGTGGG TCAGCGCCAC ACCTCCAGCT GGGAGCCGTG TCCGCGCCAT 180GGCCATCCAC AAGAAGTCAC AGCACTTGAC GGGGGTCGTG AGACGCTGCC CCCACCATGA 240GCGCTGCTCC GATGGTGATG GCCTGGCTCC TCCCCAGCAT CTTATCCGGG TGGAAGGAAA 300TTTGTATCCC GAGTATCTGG AAGACAGGCA GACTTTTCGC CACAGCGTGG TGGTACCTTA 360TGAGCCACCC GAGGCCGGCT CTGAGTATAC CACCATCCAC TACAAGTACA TTTGTAATAG 420CTCCTGCATG GGGGGCATGA ACCGCCGACC TATCCTTACC ATCATCACAC TGGAAGACTC 480CAGTGGGAAC CTTCTGGGAC GGGACAGCTT TGAGGTTCGT GTTTGTGCCT GCCCTGGGAG 540AGACCGCCGT ACAGAAGAAG AAAATTTCCG CAAAAAGGAA GTCCTTTGCC CTGAACTGCC 600CCCAGGGAGC GCAAAGAGAG CGCTGCCCAC CTGCACAAGC GCCTCTCCCC CGCAAAAGAA 660AAAACCACTT GATGGAGAGT ATTTCACCCT CAAGATCCGC GGGCGTAAAC GCTTCGAGAT 720GTTCCGGGAG CTGAATGAGG CCTTAGAGTT AAAGGATGCC CATGCTACAG AGGAGTCTGG 780AGACAGCAGG GCTCACTCCA GCTACCTGAA GACCAAGAAG GGCCAGTCTA CTTCCCGCCA 840TAAAAAAACA ATGGTCAAGA AAGTGGGGCC TGACTCAGAC TGACATTCTC CACTTCTTGT 900TCCCCACTGA CAGCCTCCCA CCCCCATCTC TCCCTCCCCT GCCTTTTGGG TTTTGGGTCT 960TTGAACCCTT GCTTGCAATA GGTGTGCGTC AGAAGCACCC AGGACTTCCA TTTGCTTTGT 1020
CCCGGGGCTC CACTGAACAA GTTGGCCTGC ACTGGTGTTT TGTTGTGGGG AGGAGGATGG 1080GGAGTAGGAC ATACCAGCTT AGATTTTAAG GTTTTTACTG TGAGGGATGT TTGGGAGATG 1140TAAGAAATGT TCTTGCAGTT AAGGGTTAGT TTACAATCAG CCACATTCTA GGTAGGGGCC 1200CACTTCACCG TACTAACCAG GGAAGCTGTC CCTCACTGTT GAATTTTCTC TAACTTCAAG 1260GCCCATATCT GTGAAATGCT GGCATTTGCA CCTACCTCAC AGAGTGCATT GTGAGGGTTA 1320ATGAAATAAT GTACATCTGG CCTTGAAACC ACCTTTTATT ACATGGGGTC TAGATGACCC 1380CCTTGAGGTG CTTGTTCCCT CTCCCTGTTG GTCGGTGGGT TGGTAGTTTC TACAGTTGGG 1440CAGCTGGTTA GGTTGAGGTA GTTGTCAGGT CTCTGCTGGC CCAGCGAAAT TCTATCCAGC 1500CAGTTGTTGG ACCCTGGCAC CTCAAATGAA ATCTCACCCT ACCCCACACC CTGTAAGATT 1560CTATCTCTTG TATAGATGAT CTGGATCCAC CAAGACTTGT TTTAGCTCAG GGTCCAATTT 1620CTTTTTTCTT TTTTTTTTTT TTTTTCTTTT TCTTTGAGAC TGGGTCTCTT TGTTGCCCCA 1680GGCTGGAGTG GAGTGGCGTG ATCTGGCTTA CTGCAGCCTT TGCCTCCCCG GCTCGAGCAG 1740TCCTGCCTCA GCCTCCGGAG TAGCTGGGAC CACAGGTTCA TGCCACCATG GCCAGCCAAC 1800TTTTGCATGT TTTGTAGAGA TGGGGTCTCA CAGTGTTGCC CAGGCTGGTC TCAAACTCCT 1860GGGCTCAGGC GATCCACCTG TCTCAGCCTC CCAGAGTGCT GGGATTACAA TTGTGAGCCA 1920CCACGTCCAG CTGGAAGGGC CTACTTTCCT TCCATTCTGC AAAGCCCTGC TGCATTTATC 1980CACCCCACCC TCCACCTGTC TCCCTCTTTT TTTCTTACCC CTTTTTATAT ATCAATTTCT 2040TATTTTACAA TAAAATTTTG TTATCA 2066
(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度293氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Thr Tyr Gln Gly Asn Tyr Gly Phe His Leu Gly Phe Leu Gln Ser1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Ser Val Met Cys Thr Tyr Ser Pro Pro Leu Asn Lys20 25 30Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Ser35 40 45Ala Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Met Ala Ile His Lys50 55 60Lys Ser Gln His Met Thr Gly Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu65 70 75 80
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(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO5ACTGCCCAAC AACACCA 17(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO6GCCACGCCCA CACATTT 17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCTGTCCTG GGAGAGACCG 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO8CCCTTAAGCC ACGCCCACAC 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO9CACTGCCCAA CAACACCA18(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO10GCCACGCCCA CACATTT 17(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO11
GGTGCATTGG AACGCGGATT 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO12GGGGACAGAA CGTTGTTTTC 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO13ACGGATTTGG TCGTATTGGG 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO14TGATTTTGGA GGGATCTCGC 20
权利要求
1.病毒载体用于制备治疗人受试者口中恶性病变前损伤或癌损伤的药物的用途，其中所述治疗包括通过漱口用腺病毒载体接触损伤，所述腺病毒载体包含编码功能性p53的核酸节段，所述节段在人细胞中有功能的启动子的转录控制下。
2.权利要求1的用途，其中所述损伤为恶性病变前损伤。
3.权利要求1的用途，其中所述损伤为癌损伤。
4.权利要求3的用途，其中所述癌损伤为鳞状细胞癌损伤。
5.权利要求1的用途，其还包括对所述受试者施用第二种抗癌疗法。
6.权利要求5的用途，其中所述第二种抗癌疗法施用于所述口中。
7.权利要求5的用途，其中所述第二种抗癌疗法为辐照、化疗、细胞因子疗法、手术或基因治疗。
8.权利要求5的用途，其中所述第二种抗癌疗法在所述腺病毒载体之前施用。
9.权利要求5的用途，其中所述第二种抗癌疗法在所述腺病毒载体之后施用。
10.权利要求5的用途，其中所述第二种抗癌疗法与所述腺病毒载体同时施用。
11.权利要求1的用途，其中所述腺病毒载体为复制不能型。
12.权利要求11的用途，其中所述腺病毒载体带有E1缺失。
13.权利要求12的用途，其中所述腺病毒载体带有E3缺失。
14.权利要求1的用途，其中所述启动子为CMV IE、SV40早期或RSV LTR。
全文摘要
公开了使用表达p53的病毒载体治疗鳞状细胞癌的方法。在特定实施方案中，载体是复制缺陷的腺病毒。此外，还提供了在外科手术环境下和体腔中检查显微残留病变的发展和治疗效果的方法。
文档编号A61P1/02GK101028523SQ20071000512
公开日2007年9月5日 申请日期1996年11月27日 优先权日1995年11月30日
发明者G·L·克雷曼 申请人:德克萨斯州立大学董事会